CN101889024B

CN101889024B - Fviii肽和它们用于耐受化血友病患者的用途

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Publication number: CN101889024B
Application number: CN200880119313.1A
Authority: CN
Inventors: 戴维·赖思
Original assignee: Hasselt Universiteit
Current assignee: Baimingxinkang Biotechnology Zhejiang Co ltd
Priority date: 2007-12-04
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2028-12-03
Also published as: CN103709234A; MX2010006084A; EP2227488B3; IL205780A; CY1115168T1; DK2227488T6; JP6063402B2; ES2458315T7; PT2227488E; IL205780A0; CA2707559A1; AU2008332968B2; EP2227488A1; GB0723712D0; CA3005013A1; DK2227488T3; HK1144292A1; EA019370B1; HRP20140344T4; US20100323966A1

Abstract

本发明提供一种肽，其包含可衍生自人FVIII的核心残基序列，所述肽能够结合II类MHC分子而没有进一步的抗原加工。本发明还涉及这样的肽用于防止或阻遏A型血友病和/或获得性血友病中抑制剂抗体形成的用途。

Description

FVIII肽和它们用于耐受化血友病患者的用途

技术领域

本发明涉及一种肽。具体地说，本发明涉及可衍生自因子VIII(FVIII)的肽。这些肽可以用来减少或阻止因子VIII抑制物抗体(factor VIII inhibitorantibody)的形成，例如在A型血友病治疗和获得性血友病中。

发明背景

血友病

血友病(haemophilia)属于一类遗传性血液病症，包括A型血友病、B型血友病(克里斯马斯病(Christmas disease))和血管性血友病(Von Willebrand′sdisease)。

在血友病中，血液凝集能力由于某种关键的凝血因子的部分或全部缺失而严重降低，导致出血时间增加。A型血友病是一种因子VIII缺陷，而B型血友病是一种凝血因子DC缺陷。在这两种疾病中，出问题的基因存在于X染色体上，所以这些症候是X连锁的。A型血友病的常见程度是B型血友病的五倍。

血友病是一种终身性、遗传性的基因疾病，影响女性(作为携带者)和遗传了这种症候的男性。大约三分之一的新确诊病例没有过往家族史。这种疾病在全世界都有出现，在所有种族中均有发生。在英国大约有6000人患有血友病。

血友病人(haemophiliacs)在受伤后发生长时间的出血。外伤，如切割伤或擦伤，通常不会造成严重问题：往往可以通过施加一定程度的压力和包覆伤处(例如用石膏)。

主要的问题是向关节、肌肉和软组织中的内出血，这些可能自发发生。内出血，例如向脑中的出血，非常难以处理，且可能致命。关节中的重复出血会导致剧烈疼痛，并可导致关节炎和/或致残的长期性关节损伤。

血友病的治疗通常是通过补充(replacement)缺失的凝血因子。在轻度或中度的血友病中，可以在发生出血时进行注射(应求式(on-demand)疗法)。但是，在严重血友病中，则有规律地进行预防性注射，以帮助血液凝集并最大程度地减小长期性关节损伤的可能性。

A型血友病凝血因子补充疗法的一个潜在的严重麻烦是会产生可中和因子III的促凝血功能的抗体。因子III抑制物在大约25％的严重A型血友病人中出现。由于先天性A型血友病人可能具有FVIII基因缺陷，抑制物的合成是一种针对为了预防或治疗出血事件而施用的外来蛋白的同种异体免疫应答。

CD4+T细胞在针对FVIII的免疫应答中扮演着中枢角色。FVIII被抗原呈递细胞(APC)摄取后，经过蛋白酶降解成为肽片段(Reding et al(2006)Haemophilia 12(supp 6)30-36)。然后这些肽以与Ⅱ类MHC分子结合的形式被提呈在APC的表面。然后，这样的复合物被对FVIII特异性的CD4+细胞的T细胞受体所识别。在合适的共刺激信号的存在下，这种识别作用最终导致CD4+细胞去指导B细胞合成抗体。

抑制物形成的频度最开始随着因子VIII治疗的次数增加而增加，但是在暴露50-100天后似乎达到平台。抑制物形成在严重血友病中比在轻度或中度血友病中常见得多，而且某些分子缺陷，最明显的是因子VIII轻链中的大段缺失和无义突变，似乎引起抑制物形成的倾向。补充因子的浓度、类型(纯化的或重组的)、以及治疗历史等参数也会影响抗体生成的可能性。

如何管理携带抑制物的血友病患者是人们正面临的挑战。使用脱敏(desensization)技术的免疫耐受诱导(ITI)在一些携带抗因子VIII同种抗体的患者身上获得了成功。这种治疗手段要求患者正在接受因子补充疗法，因此是一种长期性的策略。

虽然ITI可能取得成功，但有相当一部分(大约30％)的患者对ITI无应答。抑制物效价高的患者对治疗应答的可能性低得多。另一个明显起作用的因素是开始ITI时的年龄，当患者大于20岁时成功率大大降低(Hay et at(2005)Seminars in Thrombosis and Hemostasis 32：15-21)。

当ITI疗法不成功时，抑制物一般会终身存在，而由于这样的患者通常是高应答者，需要使用FVIII旁路产品，如活化的凝血酶原复合物浓缩剂(FEIBA^TM)和重组-活化的FVII，来治疗出血事件。然而，使用此类药剂会带来弥散性血管内凝血、急性心肌梗塞、肺栓塞和血栓等不良事件(Acharyaand DiMichele(2006)Best Practice & Research Clinical Haematology19：51-66)。

对于不应答ITI的患者有时使用免疫抑制疗法。治疗包括使用非特异性地靶向免疫系统的免疫抑制药如环磷酰胺(cyclophosphamide)、泼尼松(prednisone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、和环孢菌素(cyclosporine)等。这些治疗可能造成与普遍性免疫抑制相关的副作用。

人们对利用利妥昔单抗(Rituximab^TM)——一种针对B细胞CD20抗原的人源化单克隆抗体——进行的选择性B细胞耗竭又产生了兴趣。但是，用这种药物治疗一些儿童时，发生了输注反应、血清病和机会性感染(DiMichele(2007)J Thromb Haemost 5：143-50)。

获得性血友病(acquired haemophilia)

获得性血友病是一种罕见的自身免疫病症，在每100万人中有1至4人罹患此病。在此病中，生来不具有血友病的受试者产生对抗一种凝血因子如因子VIII的抗体。人们认为妊娠和自身免疫疾病如类风湿性关节炎及癌症可能增加发生获得性血友病的风险。虽然在导致其产生的免疫机制有所不同，但应答于凝血因子补充疗法而产生的FVIII抑制物与获得性血友病中产生的FVIII抑制物的临床表现是相似的。

获得性血友病患者的死亡率接近25％，部分地是由于获得的抑制物与严重的出血并发症有关联。针对获得性自身抗体抑制物的治疗，主要是根据控制或阻止急性出血性并发症的需要(这些并发症常常危及生命和四肢健全)，其次是去除自身抗体以恢复正常凝血的需要。

对于某些伴随有低效价自身抗体抑制物(＜5个Bethesda单位)的出血，可以通过高剂量施用FVIII浓缩剂来有效治疗。先前，猪FVIII浓缩剂被看作针对获得性血友病相关出血的关键的一线药物，因为只有它是唯一一种使人们有机会在实验室中对输注后FVIII凝血活性水平进行实际测量的补充疗法。由于猪血浆池被猪细小病毒污染，该产品于2004年下市。目前，最常用的是“旁路”(bypassing)药物，但存在产生血栓的潜在风险，而且每种产品的效力仅有约80％。对于旁路药物或FVIII补充法而言，为了提供充分的止血，可能需要通过血浆去除术和体外免疫吸附进行血浆交换，以暂时性地充分降低抑制物效价。

自身抗体抑制物的根除取决于免疫抑制措施，如：(1)施用皮质类固醇，在3-6周内的效力为30％-50％；(2)使用细胞毒性和骨髓抑制性化疗剂，例如环磷酰胺、环孢菌素、2-氯脱氧腺苷；(3)用静脉注射免疫球蛋白进行免疫调节；和(4)借助利妥昔单抗进行选择性B细胞耗竭。利妥昔单抗(Rituximab^TM)应答者可能需要同时使用类固醇，复发(relapse)可对再次治疗(retreatment)有应答。

因此，目前所有可用来减少伴随着A型血友病治疗的同种异体抗体产生、以及获得性血友病中自身抗体产生的方法，都存在着缺点。因此需要更好的方法来解决A型血友病和获得性血友病中抗-VIII抗体的问题。

本发明人们发现，通过用FVIII衍生肽预耐受化(pre-tolerize)患者，来阻止FVIII抑制物抗体生成是可能的。

本发明的优选方面

因此，本发明涉及可从FVIII衍生的、能够诱导或恢复针对FVIII的耐受性的肽。

本发明人已经鉴定了FVIII中的数个免疫显性区域，预测它们会产生HLA-DR2结合肽(表1)。在这些肽中，因子VIII的545-559和1788-1803区域被认为是针对人因子VIII的HLA-DR2限制性T细胞应答的免疫显性T细胞表位区域。已经证明，用这些肽处理小鼠可实质性地抑制针对因子VIII的免疫应答。

在第一个方面，本发明提供一种肽，其包含下列核心残基序列之一：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

所述肽能够在没有进一步抗原加工的条件下结合II类MHC分子，并被因子III特异性T细胞所识别。

所述肽可以，例如，具有序列PRCLTRYYSSFVNME或DNIMVTFRNQASRPY。

在第二个方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其包含本发明第一个方面的肽。所述组合物可包含多个这样的肽。具体地，所述组合物可包含下述肽：PRCLTRYYS SFVNME和DNIMVTFRNQASRPY。

组合物可以是试剂盒的形式，其中分别地提供所述多个肽，以便进行分立(separate)、继起(subsequent)、顺序(sequential)或同时(simultaneous)施用。

本发明的肽或组合物可用于阻遏、减少、或阻止因子VIII抑制物抗体的产生(development)。

本发明还提供这样的肽或组合物在制备用于阻遏、减少或防止因子VIII抑制物抗体产生的药物中的用途。

本发明还提供一种用于阻遏、防止或减少受试者中因子VIII抑制物抗体产生的方法，包括对所述受试者施用这样的肽或组合物的步骤。

受试者可以是FVIII缺陷的。特别地，受试者可患有A型血友病，并且可能接受，或者即将接受因子VIII补充疗法。

或者，受试者可能患有获得性血友病，或者具有患上获得性血友病的风险。

因子VIII抗体在表达HLA-DR2的个体中更常见。用本发明的方法治疗的受试者因此可以是HLA-DR2阳性的。

附图说明

图1：用rhFVIII/CFA初始刺激(prime)的FVIII+DR2+小鼠的淋巴结细胞(LNC)的回忆应答

a)针对FVIII肽1-6的LNC增殖

b)针对FVIII肽7-12的LNC增殖

c)针对FVIII肽1、3和11的LNC增殖

图2：对FVIII衍生肽特异性的FVIII+DR2+T细胞杂交瘤克隆的代表例

图3：用rhFVIII/CFA初始刺激的FVIII-DR2+小鼠的淋巴结细胞的回忆应答

图4：对FVIII衍生肽特异性的FVIII-DR2+T细胞杂交瘤克隆的代表例

图5：对a)DNIMV和b)PRCLT特异性的FVIII-/-克隆

图6：用肽3x i.p.处理后用rhFVIII/CFA初始刺激的FVIII+DR2+小鼠的LNC对FVIII的回忆应答。

图7：利用针对FVIII衍生的重叠肽特异性的FVIII-DR2+T细胞杂交瘤克隆确定能够起apitope作用的肽表位的范围。原始肽称为0。向N末端移动一个氨基酸是-1，向N末端移动两个氨基酸是-2，等等。向C末端移动一个氨基酸是+1，等等。

图8：用FVIII衍生肽PRCLT、DNIMV或二者的混合物处理的FVIII-DR2+小鼠响应于FVIII的淋巴结细胞IFN-γ产生。

详述

肽

本发明涉及一种肽。

术语“肽”使用其普通意义，意指一系列残基，典型的是L-氨基酸，它们相互连接，典型地是通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间形成的肽键连接。该术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。

本发明的肽可以使用化学方法来制备(Peptide Chemistry，A practicalTextbook.Mikos Bodansky，Springer-Verlag，Berlin.)。例如，可以用固相技术合成肽(Roberge JY et al(1995)Science 269：202-204)，再将其从树脂上切下，用制备型高效液相色谱来纯化(例如Creighton(1983)Proteins Structures AndMolecular Principles，WH Freeman and Co，New York NY)。可以使用例如ABI431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)，按照制造商提供的指导来实现自动化合成。

肽还可以通过重组手段，或者通过切割因子VIII来制备。肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解方法)来确认。

为了实际目的，所述肽可以表现多种其他的特征。例如，所述肽可以在容许其体内应用的浓度下是可溶的。所述肽可以在最高达0.5mg/ml、1mg/ml，或5mg/ml的浓度下是可溶的。

另外重要的是，所述肽在体内足够稳定，以使得它在治疗上有用。肽在体内的半寿期可以为至少10分钟、30分钟、4小时或24小时。

所述肽还可在体内表现良好的生物利用度。所述肽可在体内维持这样的构象，使得它能够结合细胞表面的MHC分子而没有应有的阻碍(duehinderance)。

核心残基(core residues)

在适应性免疫应答(adaptive immune response)中，T淋巴细胞能够识别蛋白质抗原的内部表位。抗原呈递细胞(APC)摄取蛋白质抗原并把它们降解成短的肽片段。肽可与细胞内的Ⅰ类或Ⅱ类主要组织相容性复合物(MHC)分子结合，并被带到细胞表面。当与MHC分子结合的肽被提呈于细胞表面时，该肽可被T细胞(通过T细胞受体(TCR))所识别，在这种情况下该肽是T细胞表位。

因此表位是这样一种肽，它能够从抗原衍生而来，能够结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子的肽结合沟(peptide-binding groove)并被T细胞所识别。

最小表位(minimal epitope)是能够从表位衍生而来的、能够结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子的肽结合沟并被T细胞所识别的最短片段。对于给定的免疫原性区域，通常能够产生一组“套叠的”(nested)重叠肽，这些肽发挥表位作用，都包含最小表位，但它们的旁侧区域不同。

类似地，对于特定的MHC：T细胞组合，可以通过测量针对截短的肽的应答来鉴定最小表位。例如，如果获得了针对重叠文库中包含残基1-15的肽的应答，那么可以使用两端截短的肽组(例如1-14、1-13、1-12等，及2-15、3-15、4-15等)来鉴定最小表位。

本发明提供包含FVIII的“核心残基”序列的肽。通过使用HLA-DR2结合算法预测，这些核心残基序列代表或包含了每个区域的最小表位。

Apitopes

本发明人先前已确定，肽在无需进一步抗原加工的条件下结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子并被呈递给T细胞的能力，与该肽诱导体内耐受性的能力之间存在关联(WO 02/16410)。如果肽过长，以至于其不经过进一步加工就无法结合MHC分子的肽结合沟，或者结合时采取的构象不合适，则它不会在体内具有致耐受性。而另一方面，如果肽具有合适的大小和构象以直接结合MHC肽结合沟并呈递给T细胞，则可预计该肽可用于诱导耐受性。

因此，有可能通过考察肽在体外能否不经进一步抗原加工而结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子并被呈递给T细胞，来考察该肽的致耐受能力(tolerogeniccapacity)。

本发明的肽是apitopes(Antigen Processing-Independent Epitopes，不依赖抗原加工的表位)，因为它们无需进一步抗原加工就能够结合Ⅱ类MHC分子并刺激来自因子VIII特异性T细胞的应答。可以预计，依照WO 02/16410中描述的基于规则的(rule-based)方法，这样的apitope会导致针对FVIII的耐受。

本发明肽可以为任何能够无需进一步加工即结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子的长度。典型地，本发明的肽能够结合Ⅱ类MHC。

结合Ⅰ类MHC分子的肽典型地为7-13个，更通常为8-10个氨基酸长。在肽的两端，肽主链中的原子与所有Ⅰ类MHC分子的肽结合沟中的不变位点之间的接触使得肽的结合稳定化。在所述沟的两端均有不变位点，它们结合肽的氨基和羧基末端。肽主链中产生扭转(kinking)以适应肽长度的变化，扭转常常在脯氨酸或甘氨酸残基处发生，这些残基容许所需的柔性。

结合Ⅱ类MHC分子的肽典型地为8到20个氨基酸长，更通常为10到17个氨基酸长，并且可以更长(例如长达40个氨基酸)。这些肽沿着MHCII肽结合沟采取伸展的构象，这种沟(和Ⅰ类MHC肽结合沟不同)两端是开放的(open at both ends)。肽主要通过主链原子与肽结合沟内表面上的保守残基之间的接触被固定到位(held in place)。

肽序列

本发明的第一个方面设计一种肽，其包含下列核心残基序列之一：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV。

例如，所述肽可包含下列核心残基序列之一：

IARYIRLHP

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV.

特别地，所述肽可包含下列核心残基序列之一：

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS。

所述肽可包括核心残基序列中的一种，以及附加的位于N末端和/或C末端的侧翼序列，只要所得的肽能够无需进一步抗原加工即结合Ⅱ类MHC分子即可。

侧翼的N和/或C末端序列可以是能够从人FVIII核心残基序列的侧翼序列衍生的。

例如，所述肽可选自下组：

SLYISQFIIMYSLDG

PPIIARYIRLHPTHY

DTLLIIFKNQASRPY

PRCLTRYYSSFVNME

DNIMVTFRNQASRPY

RYLRIHPQSWVHQIA。

已知某些衍生自FVIII的肽是apitope(例如PRCLTRYYSSFVNME和DNIMVTFRNQASRPY)。除了这些肽之外，还可以有其它的肽，它们具有相同的核心残基序列，但有一个或多个侧翼残基不同。

为了测试这一点，可以制备一组重叠肽(a panel of overlapping peptides)。典型地，该组中的一群(cluster)肽能够产生免疫应答，因为它们包含最小表位。在这些肽中，可以通过考察肽在无抗原加工的呈递系统(antigen processfree presentation system)中结合Ⅱ类MHC并刺激合适的T细胞的能力，来考察该肽是否也表现为apitope。

可以针对针对下表中所示的肽，测试它们充当apitope的能力：

SLYISQFIIMYSLDG
	LYISQFIIMMYSLDGK
RQKFSSLYISQFIIM
	QKFSSLYISQFIIMY
KFSSLYISQFIIMYS

FSSLYISQFIIMYSL
	SSLYISQFIIMYSLD
YISQFIIMYSLDGKK
	ISQFIIMYSLDGKKW
SQFIIMYSLDGKKWQ
	QFIIMYSLDGKKWQT
FIIMYSLDGKKWQTY

IARYIRLHPTHYSIR
	IIARYIRLHPTHYSI
PIIARYIRLHPTHYS
	PPIIARYIRLHPTHY
NPPIIARYIRLHPTH
	FNPPIIARYIRLHPT
IFNPPIIARYIRLHP

LIIFKNQASRPYNIY
	LLIIFKNQASRPYNI
TLLIIFKNQASRPYN
	DTLLIIFKNQASRPY
GDTLLLIIFKNQASRP
	VGDTLLLIIFKNQASR
EVGDTLLLIIFKNQAS

KSDPRCLTRYYSSFV
	SDPRCLTRYYSSFVN
DPRCLTRYYSSFVNM
	PRCLTRYYSSFVNME

RCLTRYYSSFVNMER
	CLTRYYSSFVNMERD
LTRYYSSFVNMERDL

EVEDNIMVTFRNQAS
	VEDNIMVTFRNQASR
EDNIMVTFRNQASRP
	DNIMVTFRNQASRPY
NIMVTFRNQASRPYS
	IMVTFRNQASRPYSF
MVTFRNQASRPYSFY

LRIHPQSWVHQIALR
	YLRIHPQSWVHQIAL
RYLRIHPQSWVHQIA
	TRYLRIHPQSWVHQI
LTRYLRIHPQSWVHQ
	LLTRYLRIHPQSWVH
PLLTRYLRIHPQSWV

此外，比上表中给出的15聚体肽稍长或稍短的肽有可能充当apitope并能够使受试者对因子VIII耐受。所述肽可以为例如10-25个氨基酸长，特别是12-18个氨基酸长。

APIPS

已知有多种不依赖抗原加工的呈递系统(antigen processing independentpresentation systems，APIPS)，包括：

a)固定(fixed)的APC(有或无针对CD28的抗体)；

b)含有Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子的脂质膜(有或无针对CD28的抗体)；和

c)以结合于平板的形式存在的、经纯化的天然或重组MHC(有或无针对CD28的抗体)。

这些系统都能够呈递与MHC分子结合的抗原，但不能加工抗原。在所有这些系统中，加工功能或者阙如，或者被失能化。这就为研究某种肽是否能在不经过进一步抗原加工的条件下结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子并被呈递给T细胞提供了可能。

使用固定的APC来研究T细胞应答在本领域是众所周知的，例如，通过测量针对截短型的肽的应答来考察多肽内的最小表位的研究Fairchild etal(1996)Int.Immunol.8：1035-1043)。APC可以使用例如甲醛(通常是多聚甲醛)或戊二醛来固定。

脂质膜(可以是平面膜或者脂质体)可以用人工脂质来制备，或者可以是来自APC的质膜/微粒体级分。

在使用中，可以将APIPS施加到组织培养板的孔中。然后加入肽抗原，通过添加所选的T细胞系或克隆检测所述肽与APIPS的MHC部分的结合。T细胞的活化可以用本领域中已知的任何方法来测量，例如通过³H-胸苷摄取或细胞因子分泌。

因子VIII

本发明的肽可以是能够从因子VIII衍生的。因子VIII参与内在的血液凝固通路；因子VIII是因子IXa的辅因子，后者在Ca+2和磷脂的存在下将因子X转化为活化形式Xa。

因子VIII的基因产生两个可变剪接的转录本。转录本变体1编码一种大的糖蛋白，亚型a，其在血浆中循环并与von Willebrand因子缔合成非共价的复合物。该蛋白质经历多个切割事件。转录本变体2编码一种推定的小蛋白，亚型b，其主要由因子VIIIc的磷脂结合域组成。该结合域对凝血活动来说是关键的。

在1980年代中期人们阐明了人因子VIII基因的186,000个碱基对的全序列(Gitschier et al(1984)Nature 312326-330)。同时，人们在经培养的哺乳动物细胞中使用了编码全部2351个氨基酸序列的DNA克隆来产生生物学活性的因子VIII(Wood et al(1984)Nature 312：330-337)。人因子VIII的全部2,351个氨基酸的序列在SEQ ID NO：1中给出。

本发明的肽可以是能够从因子VIII衍生的。肽可以，例如，由来自因子VIII序列的毗邻氨基酸的序列构成。所述肽可以是能够从因子VIII序列的切割获得的，或者是从因子VIII序列的切割获得的。

所述肽相对于野生型序列可以有一个或多个突变，例如添加、取代或缺失，只要该肽保留无需进一步抗原加工即可结合MHC分子的肽结合沟并且被相关T细胞识别的能力。所述肽可以，例如，与野生型序列相比，在其全长范围内具有5个、3个、2个或1个突变。

可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或双亲性质来进行有计划的氨基酸取代，只要保留所述肽的结合活性即可。可以进行保守取代，例如根据下表进行。位于第二列中同一格中，且优选第三列中同一行中的氨基酸，可以相互取代：

本发明还涵盖可能发生的同源取代(取代(substitution)和替换(replacement)在本文中都用来意指现有的氨基酸残基与替代的氨基酸残基的交换)，即同等取代(like-for-like substitution)，如碱性换碱性，酸性换酸性，极性换极性等等。也可能发生非同源取代，即由一类残基变为另一类残基，或者涉及非天然残基如鸟氨酸(本文中用Z表示)，二氨基丁酸鸟氨酸(本文中用B表示)，正亮氨酸鸟氨酸(本文中用O表示)，吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。

还可以用非天然氨基酸进行替换，它们包括：α*和α-双取代*的氨基酸N-烷基氨基酸*、乳酸、天然氨基酸的卤素衍生物如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸^#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜^#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸^#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)^#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸^#和L-Phe(4-苄基)*。使用符号*是为了上面的讨论(有关同源或非同源取代)，用来表示衍生物的疏水性质，而#是用来表示衍生物的亲水性质，#*表示两亲性特征。

另一种变化形式涉及一个或多个呈拟肽(peptoid)形式的氨基酸残基的存在，这是本领域技术人员熟知的。为了避免疑问，“拟肽形式”用来指这样的变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子而不是α-碳上。制备拟肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134

耐受性(tolerance)

T细胞表位在针对任何抗原(自身的或外来的)的适应性免疫应答中扮演着中枢性的角色。人们已经利用实验模型展现了T细胞表位在过敏性疾病(包括变态反应、自身免疫疾病和移植物排斥)中的中枢性作用。通过注射合成肽(基于T细胞表位的结构)和佐剂的组合，可以诱导炎症性或变态性疾病。

与之形成对照的是，已经证明，通过施用可溶形式的肽表位来诱导针对特定抗原的免疫耐受是可能的。有人证明，在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，一种多发性硬化(MS)的模型)(Metzler and Wraith(1993)Int.Immunol.5：1159-1165；Liu and Wraith(1995)Int.Immunol.7：1255-1263；Anderton and Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28：1251-1261)、以及关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)(Anderton and Wraith(1998)，同上中有综述)中，施用可溶性肽抗原是有效的疾病抑制手段。还证明它是治疗EAE中的正在进行的疾病的手段。

耐受是对抗原的不应答(failure to respond to an antigen)。对自身抗原的耐受是免疫系统的一个关键特征，如果丧失了这种耐受，就可能导致自身免疫疾病。适应性免疫系统必须保持这样的能力：对千差万别的致病原产生应答，同时避免对其自己组织中的自身抗原发起自身免疫攻击。这一点在很大程度上是由未成熟T淋巴细胞对胸腺中的细胞凋亡性死亡的敏感性(中枢耐受)所调控的。然而，不是所有的自身抗原都在胸腺中被检测到，所以自身反应性胸腺细胞的死亡仍然是不完全的。因此还存在这样的机制，使得外周组织中成熟的自身反应性T淋巴细胞可以获得耐受(外周耐受)。Anderton et al(1999)(Immunological Reviews 169：123-137)综述了中枢耐受和外周耐受的机制。

在A型血友病中，患者的因子VIII基因中有缺陷。这意味着因子VIII不被免疫系统识别为“自身”抗原。因此，当在凝血因子补充治疗中施用因子VIII时，针对该外来蛋白产生同种异体免疫应答，导致FVIII抑制物抗体的产生。

本发明的肽能够诱导对因子VIII的耐受，这样，当为治疗目的施用FVIII时，它不会诱导免疫应答，也不会产生FVIII抑制物。

获得性血友病是一种对因子VIII的耐受被破坏的自身免疫疾病，在这种情况下，可以施用本发明的肽来恢复针对这种自身蛋白的耐受并减少病原性的免疫应答。

耐受可能是至少一部分CD4+T细胞被诱导出无反应性(anergy)的结果，或者以至少一部分CD4+T细胞被诱导出无反应性为特征。为了活化T细胞，肽必须与“专职”APC结合；“专职”APC能够把两种信号传递给T细胞。第一种信号(信号1)由APC细胞表面上的MHC-肽复合物传递，T细胞通过TCR接受该信号。第二种信号(信号2)是由APC表面上的共刺激分子如CD80和CD86传递的，被T细胞表面的CD28所接受。人们认为，当T细胞在没有信号2的情况下接受到信号1时，它不被活化，并且，事实上，变成无反应性。无反应性T细胞对接下来的抗原刺激无反应，并且可能能够阻遏其它免疫应答。无反应性T细胞被认为与介导T细胞耐受有关。

不希望受理论束缚，本发明人预测，需要加工后方可与MHC分子一起呈递的肽不诱导耐受，是因为它们需要由成熟的抗原呈递细胞来处理。成熟的抗原呈递细胞(如巨噬细胞、B细胞和树突细胞)能够进行抗原加工，但是也能够同时传递信号1和信号2给T细胞，导致T细胞活化。另一方面，apitope却能结合未成熟APC上的Ⅱ类MHC。因此它们会在无需共刺激的条件下被呈递给T细胞，从而导致T细胞无反应性和耐受。

当然，apitope也能够结合成熟APC的细胞表面上的MHC分子。然而，免疫系统所含的未成熟APC的丰度高于成熟APC(有人提出少于10％的树突细胞是活化的Summers et al.(2001)Am.J.Pathol.159：285-295)。因此，apitope的默认立场应该是无反应性/耐受，而不是活化。

针对FVIII的耐受的诱导，可以在体内通过利用本领域已知的技术寻找下列各项的水平的降低来加以监测：

(i)FVIII抑制性抗体：

(ii)针对FVIII的CD4+T细胞

(iii)能够分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。

已经有人证明，当通过施用肽诱导了免疫耐受时，抗原特异性CD4+T细胞的增殖能力降低。同时，这些细胞的IL-2、IFN-γ及IL-4的产生下调，但IL-10的产生增加。已经证明，在处于肽诱导的免疫耐受的小鼠中，中和IL-10可完全恢复对疾病的易感性。有人提出，在耐受状态下仍然存在某个调节细胞群体，它们产生IL-10并介导免疫调节(Burkhart et al(1999)Int.Immunol.11：1625-1634)。

因此，耐受性的诱导可以通过包括下述在内的多种技术来监测：

(a)CD4+T细胞的无反应性的诱导(这可以通过后续的体外FVIII刺激来检测)；

(b)CD4+T细胞群体中的变化，包括

(i)增殖的减少；

(ii)IL-2、IFN-γ和IL-4产生的下调；和

(iii)IL-10的产生的增加。

如本文中使用的，术语“致耐受性”(tolerogenic)意指能够诱导耐受。

组合物

本发明还涉及一种组合物，例如药物组合物，其包含根据本发明的肽。

所述肽可包括多个本发明的肽，例如两个，三个，四个，五个或六个本发明的肽。

所述组合物的肽可以各自包含不同的最小表位。例如，这些肽可以各自包含来自表1给出的肽的最小表位。

所述组合物可包含肽PRCLTRYYS SFVNME和DNIMVTFRNQASRPY。

本发明的组合物可以用于预防或治疗用途。

当施用所述组合物用于预防时，所述组合物可减少或防止针对FVIII的免疫应答的产生。免疫应答的水平低于若不使用该组合物处理时该患者中本应得到的免疫应答。术语“减少”表示观察到免疫应答的部分减少，例如若不使用该组合物处理时患者中观察到的应答(或在同一时间段中未处理患者中观察到的应答)的50％、70％、80％或90％的减少。术语“防止”表示没有观察到可觉察的针对FVIII的免疫应答。

当施用所述组合物用于治疗时，所述组合物可阻遏正在进行的针对FVIII的免疫应答。术语“阻遏”(suppress)表示与肽处理之前的水平，或若同一患者不接受处理时于同一时间点上可观察到的水平相比，正在进行的免疫应答的水平下降。

用本发明的组合物治疗可导致下列各项中任一项或全部的水平减少：

(i)FVIII抑制性抗体

(ii)FVIII特异性CD4+T细胞

(iii)分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。

所有这些因素的检测都可以通过本领域已知的技术如ELISA、FACS等来实施。

并且/或者，用本发明的组合物治疗可导致针对FVIII特异性的CD4+T细胞的无反应性。无反应性可以例如通过后续的体外FVIII刺激来检测。

重要的是不能忘记，不是所有的针对FVIII的免疫应答都是致病性的。在没有抑制物的血友病患者中(Moreau et al(2000)Blood 95：3435-41)和大约15％的健康献血者中(Algiman et al(1992)89：3795-9)可以发现非抑制性的抗FVIII抗体。

FVIII抑制物可以利用凝血Bethesda测定法的Nijmegen改变版本来检测，该方法中测试患者血浆对正常血浆中的FVIII的灭活能力。一个Bethesda单位定义为中和50％的血浆FVIII活性的抗体量，且0.6BU或更高的效价提示抗体的存在。

一般而言，抑制物若水平＜5BU则归类为低效价，若≥5BU则归类为高效价。

循环中的FVIII抑制性抗体的水平可以减少到若患者不经过治疗时可观察到的抗体水平的90％、75％、50％、20％、10％、5％。

循环中的FVIII抑制性抗体的水平可以被减少到5、4、3、2、1、或0.5BU。

本发明的肽和组合物可以增加治疗性施用的FVIII中可用于帮助患者凝血的量或比例。这是因为减少了FVIII抑制物，后者可能有效地使一部分FVIII不能发挥其治疗功能。本发明的肽或组合物可以使可用FVIII的量增加，例如，10％、25％、50％、75％或100％。

因此本发明的肽和组合物可以减少为了帮助患者凝血而需要施用的FVIII的量。

制剂

所述组合物可以制备为可注射制剂，作为液体溶液或悬浮液；还可以制备适于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。制备物还可以乳化，或者将肽包埋在脂质体中。可以将活性成分与可药用且与该活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂有，例如，水、盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、葡萄糖、甘油、乙醇、等等，以及它们的组合。

此外，如果期望，组合物可以含有次要量的辅助物质如润湿剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。缓冲性盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐。可以使用盐酸和/或氢氧化钠调节pH。稳定化可以使用二糖，如蔗糖或海藻糖。

如果组合物含有多个肽，各个肽的相对比例可以是大致相等的。或者可以改变各个肽的相对比例，例如，可以改变各个肽的相对比例以便将致耐受性应答集中于某一特定的自身反应性T细胞亚群，或者若发现在特定HLA类型中某个肽的作用好于其他肽，可改变各个肽的相对比例。

制剂后，可以将组合物装入无菌容器中，然后密封，于低温(例如4℃)保存，或者可以冻干。

方便地，组合物制备为冷冻干燥(冻干)粉末。冷冻干燥允许稳定状态下的长期保存。冷冻干燥方法是本领域众所周知的，例如参见http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html。在冻干前通常加入填充剂，如甘露醇、右旋糖酐或甘氨酸。

组合物可以以方便的方式施用，如通过口服、静脉(当可水溶时)、肌肉内、皮下、舌下、鼻内、皮内或置栓途径，或植入(例如利用缓释分子)。

组合物优选地可以通过鼻内、皮下或皮内途径施用。

本发明的肽和组合物可以用来治疗人类受试者。受试者可患有A型血友病，尤其是严重型A型血友病。受试者可以是FVIII基因缺陷的。受试者可患有获得性白血病。受试者可具有抑制性抗FVIII抗体。

受试者可正在接受或即将接受使用FVIII的凝血补充疗法。

受试者可正在接受或即将接受使用FVIII基因的基因治疗。

受试者可以是与产生抗FVIII同种抗体或自身抗体的倾向相关的HLA单体型。受试者可表达HLA-DR2。测定个体的HLA单体型的方法是本领域已知的。

典型地，医师会为每个受试者确定最合适的实际剂量，该剂量将随着特定患者的年龄、体重和应答情况而变化。

在一个优选的实施方案中，可遵循“剂量提升”方案，其中以递增的浓度给患者施用多个剂量。这种手段已经在例如磷酸脂酶A2肽对蜂毒变态反应的免疫治疗应用中得到了使用(Müller et al(1998)J.Allergy ClinImmunol.101：747-754，以及Akdis et al(1998)J.Clin.Invest.102：98-106)。

试剂盒

方便地，如果所述组合物包含多个肽，它们可以作为混合的组合物或鸡尾酒(cocktail)的形式一起施用。但是，可能在有些情况下优选以试剂盒的形式各别地提供所述肽，用于同时、分开、顺序或联合施用。

试剂盒还可包含混合和/或施用手段(例如用于鼻内施用的雾化器；或用于皮下/皮内定量给药的注射器和针头)。试剂盒还可包含使用说明。

本发明的药物组合物或试剂盒可以用来治疗和/或预防疾病。

特别地，所述组合物/试剂盒可以用来治疗和/或预防A型血友病或获得性血友病。

A型血友病

A型血友病(经典血友病)是由因子VIII缺乏造成的。

A型血友病的估计发病率在男性中是每10,000人中有1人，B型血友病估计是每40,000名男性中有1人。A型血友病大约每5,000名女性中有1人是携带者，B型血友病每20,000名女性中有1人是携带者。

根据血液中凝血因子的水平，血友病通常分为3类：严重、中度和轻度。在严重血友病中，正常凝血因子少于1％。严重程度在世代之间倾向于保持一致。

与许多人的想法相反，对于血友病患者而言，轻微的切割伤口通常没有威胁。最大的危险来自于可能发生于关节和肌肉中的自发出血。这在快速生长的年龄最容易发生，典型地在5到15岁之间。

关节中重复的自发出血可造成关节炎和相邻肌肉弱化。血液累积压迫神经可导致疼痛、麻木、以及患处暂时性移动不能。

A型血友病通常用血检来诊断，该检查测定凝血效率并考察凝血因子水平是否异常。

在1970年代，纯化的凝血因子(从捐献的血液中分离的)的开发显著改善了血友病患者的长期远景。轻度到中度的血友病患者可以应需要使用FVIII治疗，而严重血友病患者可能需要规律性的、无期限的治疗。

从前，患者施用的因子VIII浓缩物是从数千份血浆捐献品汇集而来的。这样造成了严重的病毒性病原体，尤其是人免疫缺陷病毒和肝炎病毒污染的问题。单克隆抗体纯化技术、热灭活和杀病毒去污剂处理已经使得血浆来源的浓缩物相对安全。

重组DNA技术现在已经提供了一系列合成产品，如Recombinate^TM和Kogenate^TM。Kogenate是利用表达人因子VIII的幼仓鼠肾细胞制备的。所得的因子是高度纯化的，排除了任何从血浆中带入病毒的可能。

本发明的肽或组合物可以在因子VIII补充疗法之前和/或之中施用。

A型血友病是基因治疗的理想目标疾病，因为i)它是在单个已鉴定的基因中的突变造成的，ii)体内凝血因子水平的稍许提高即可以将严重血友病转化为更轻微的病情，和iii)现有的补充疗法被认为差强人意。此外，如果期望的凝血活性水平“过火”的话，有很宽的安全范围。

不幸的是，迄今为止通过基因治疗治愈血友病的承诺尚未实现，这主要是因为难以找到一种具有充分的非免疫原性以容许长期表达凝血因子的基因投递系统。

本发明的肽还可以适用于在用因子VIII进行基因治疗之前使受试者耐受化和/或在基因治疗之后应对患者体内的FVIII抑制物生成。

获得性血友病

获得性血友病的特征是，在先前凝血正常的个体中抗FVIII的自身抗体抑制物的存在。它是一种少见的病症，估计发病率为每年每百万人中1-3人。获得性自身抗体抑制物的相关死亡率接近25％，而相比之下具有同种异体抗体的个体中的死亡风险显著更低。

与同种抗体抑制物患者相比，获得性血友病的特征在于：(1)更严重的出血模式；(2)在年龄较大的人群中的发生率更高；(3)其发生伴随着可查明的原因性(identifiable underlying)自身免疫疾病、淋巴增殖性或实体瘤恶性肿瘤、妊娠、以及在大约50％的病例中使用特定的抗生素如青霉素和磺胺；和(4)呈II型药代动力学模式的体外抑制物活性，自身抗体对目标凝血因子活性中和不完全，典型地造成患者血浆中残留因子VIII水平为2％-18％不等。

本发明的肽或组合物可以施用于患有获得性血友病的患者，或者被认为有风险患上获得性血友病的患者，例如由于

i)即将进行例如青霉素或磺胺治疗，

ii)肿瘤或其他恶性肿瘤

iii)即将开始或早期妊娠。

下面将借助实施例进一步说明本发明，这些实施例仅仅意在用来帮助本领域技术人员实施本发明，绝不意在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：HLA-DR2因子VIII肽的选择

使用3种HLA-DR结合算法比较了一系列FDVIII 15聚体肽：

SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm)

ProPred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)和

IEDB(http://www.immuneepitope.org/home.do)。

选择根据超过一种上述程序被预测为能结合HLA-DR2的肽，并为预测的核心残基(表1)设计侧翼序列。

肽编号	FVIII第一个氨基酸	单字母氨基酸符号表示的序列	本文中又称：
				1	2140	GTLMVFFGNVDSSGI	GTLMV
2	0208	TQTLHKFILLFAVFD	TQTLH

3	2114	SLYISQFIIMYSLDG	SLYIS
				4	2161	PPIIARYIRLHPTHY	PPIIA
5	2318	PPLLTRYLRIHPQSW	PPLLT
				6	250	MHTVNGYVNRSLPGL	MHTVN
7	322	LGQFLLFCHISSHQH	LGQFL
				8	478	DTLLIIFKNQASRPY	DTLLI
9	545	PRCLTRYYSSFVNME	PRCLT
				10	607	TENIQRFLPNPAGVQ	TENIQ
11	1788	DNIMVTFRNQASRPY	DNIMV
				12	2322	RYLRIHPQSWVHQIA	RYLRI

实施例2：考察来自用因子VIII免疫的小鼠的HLA-DR2限制性细胞对肽的应答

用含有人因子VIII的佐剂免疫HLA-DR2转基因小鼠。收集引流淋巴结细胞，用不同浓度的来自表1的12种肽进行体外再刺激。结果示于图1

来自用VIII免疫的小鼠的HLA-DR2限制性细胞明显地对肽DNIMV(第一个氨基酸为1788)强应答。对肽PRCLT(545)和PPIIA(2161)也有应答。

实施例3：考察来自HLA-DR2小鼠的T细胞对肽的应答

首先用含因子VIII的佐剂免疫HLA-DR2小鼠。在体外用因子VIII对来自经免疫小鼠的脾细胞进行再刺激，使用乙二醇将所得的淋巴母细胞与BW5147胸腺瘤融合。

T细胞杂交瘤在HAT培养基中选择，克隆杂交瘤并测试它们对因子VIII的应答。然后以杂交瘤对12种预测肽的应答为条件对它们进行筛选。在被筛选的27个杂交瘤中，11个对DNIMV应答，3个对PRCLT应答，3个对PPIIA应答，尽管对PPIIA的应答较弱且特异性较低。两个对DNIMV和PRCLT特异性的杂交瘤的应答如图2所示。

实施例4-考察来自FVIII-DR2+小鼠的淋巴结细胞对肽的应答

将HLA-DR2小鼠与因子VIII缺陷小鼠杂交以产生表达人Ⅱ类MHC分子的血友病模型。

用含因子VIII的佐剂免疫这些FVIII-DR2+动物。分离引流淋巴结并测试它们对肽组的应答。如图3所示，这些细胞对PRCLT和DNIMV应答良好。对GTLMV有弱应答，对RYLRI应答显著。

实施例5-考察来自HLA-DR2小鼠的T细胞对肽的应答

用含因子VIII的佐剂免疫表达HLA-DR2的因子VIII缺陷小鼠。来自经免疫小鼠的脾细胞体外用因子VIII再刺激，将所得的淋巴母细胞与BW5147融合，如上所述。以针对12种预测肽的应答为条件筛选T细胞杂交瘤。同样，大部分杂交瘤对DNIMV和PRCLT肽有应答。在19个对因子VIII特异性的杂交瘤中，10个对DNIMV有应答，6个对PRCLT有应答，1个对SLYIS有应答，1个对DTLLI有应答。这些杂交瘤的应答的实例如图4所示。

基于这些实验，很明显两种肽DNIMV(第一个氨基酸为1788)和PRCLT(第一个氨基酸为545)是针对人因子VIII的HLA-DR2限制性T细胞应答中的免疫显性T细胞表位。

实施例6-DNIMV和RPCLT表现为apitope

要成为apitope，肽必须有这样的能力：在不经过进一步抗原加工(即修剪(trimming))的条件下即能结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子，并被呈递给T细胞。在本案中，考察了肽被固定的APC呈递的能力。

Mgar细胞是新鲜的或者用1％多聚甲醛固定的。通过将100μl杂交瘤细胞与5x10⁴个Mgar细胞在有或无20μg/ml rhFVIII或肽表位的存在下一起培养过夜来考察克隆的抗原特异性。然后收集上清液，通过ELISA测定IL-2生成。rhFVIII必须由活的Mgar细胞呈递的事实表明，完整蛋白的呈递需要抗原加工。另一方面，肽DNIMV和PRCLT既被活Mgar细胞呈递，又被固定的Mgar细胞呈递，表明这些肽有apitope的功能(图5)。

实施例7-能够发挥apitope功能的肽表位的范围的确定

制备一组重叠肽(如28-29页所示)，按照与实施例5相同的方法使用T细胞杂交瘤来筛选它们，以鉴定DNIMV、PRCLT及其他肽周围的序列中能够发挥apitope功能的肽表位的范围(图7)。

实施例8-DNIMV和PRCLT诱导针对完整因子VIII蛋白的耐受

用两种可溶肽中的任一种或对照PBS处理HLA-DR2转基因小鼠，然后用含因子VIII的佐剂进行免疫。分离引流淋巴结并用因子VIII蛋白对细胞进行体外再刺激，以评估小鼠的免疫状态。如图6所示，用DNIMV或PRCLT处理小鼠导致针对因子VIII的免疫应答的显著阻遏。

实施例9-考察DNIMV和PCRLT能否在因子VIII敲除小鼠中诱导耐受

从实施例8可知，这两种肽在表达内源性因子VIII的小鼠中能够防止针对因子VIII的免疫应答。用FVIII-DR2+动物重复该实验以确定这些肽是否也阻止因子VIII缺陷小鼠中针对因子VIII的免疫应答。

实施例10-考察DNIMV和PCRLT的组合能否在因子VIII敲除小鼠中诱导耐受

将这两种已在实施例9中被证明能够单独降低因子VIII缺陷小鼠中针对因子VIII的免疫应答的肽组合起来。如图8所示，用DNIMV和PRCLT二者处理小鼠导致针对因子VIII的免疫应答的显著阻遏，表现为IFN-γ产生的减少。IFN-γ是小鼠中中和性抗体所需的主要类别转换淋巴因子。显示的效果比任何一种肽单独使用时观察到的效果都要高。

方法

(i)用rhFVIII初次刺激的DR2+小鼠的回忆应答

用40μg rhFVIII免疫HLA-DR2+鼠II类MHC缺失小鼠，其中rhFVIII乳化在加有400μg热灭活的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Ra的完全弗氏佐剂中，在尾根部皮下接种。10天后处死小鼠，取出引流淋巴结。制备单细胞悬液，将在96孔平底平板中将4-5x10⁵个细胞/孔的淋巴细胞与标示浓度的肽或对照抗原一起温育72小时，然后再用0.5μCi/孔的氚标记胸苷冲激(pulse)16小时。然后冷冻平板，再将细胞收集到玻璃过滤垫片(glassfilter mat)上，使用液体闪烁计数器测量放射性掺入。

(ii)产自DR2+小鼠的T细胞杂交瘤的FVIII肽特异性

如上所述免疫HLA-DR2+鼠II类MHC缺失小鼠。在第10天取出引流淋巴结，在24孔平板中以1ml/孔、2.5x10⁶个细胞/ml在20μg/ml rhFVIII存在下培养3天。在这样刺激之后，回收淋巴细胞，洗涤，并如Nelson et al(1980)PNAS77(5)：2866所述，使用聚乙二醇将淋巴细胞与TCRα^-β^-BW融合对象细胞以4个BW细胞对1个淋巴细胞的比例融合。将融合的细胞小心洗涤后铺在96孔平底平板上，2天后加入HAT培养基以选择T细胞杂交瘤。监控细胞生长，在实施融合后大约10天时，选择单个克隆，转移到24孔板中的HAT培养基中。将克隆保持在HAT培养基中至少2周，然后转换为HT培养基，再转换为完全培养基。将100μl杂交瘤细胞与5x 10⁴个Mgar细胞在有或无20μg/ml rhFVIII存在下培养过夜来测试克隆的抗原特异性。然后收集上清液，通过ELISA评估IL-2产生，其中将响应于rhFVIII而产生IL-2的克隆视为FVIII特异性阳性。为了考察预测的FVIII肽的库(repertoire)，将FVIII特异性克隆与20μg/ml的12种肽中的每一种分别温育过夜后，再次测试IL-2产生。

(iii)用rhFVIII初次刺激的FVIII-/-小鼠的回忆应答

采用与(i)相同的方法，只是小鼠为FVIII缺陷、HLA-DR2+且鼠Ⅱ类MHC缺失的。

(iv)自FVIII-/-小鼠产生的T细胞杂交瘤的FVIII肽特异性

按照(ii)同样的方法，只是小鼠为FVIII缺陷和HLA-DR2+的。

(v)通过利用免疫显性FVIII肽预处理使DR2+小鼠中FVIII特异性应答耐受化

HLA-DR2+鼠Ⅱ类MHC缺失小鼠用溶于PBS的100μg DNIMV、PRCLT或PPIIA或等体积的单独PBS处理3次。腹膜内施用肽，每两剂之间间隔3-4天。最后一次施用后，如(i)所述用在完全弗氏佐剂中乳化的rhFVIII初次刺激小鼠。10天后，回收引流淋巴结，然后将淋巴细胞在体外与rhFVIII或每种耐受化肽或对照肽一起培养72小时，再如(i)所述加入氚标记的胸苷。

(vi)通过用免疫显性FVIII肽的组合预处理使DR2+小鼠中FVIII特异性应答耐受化

用溶于PBS的DNIMV、PRCLT、或DNIMV与PRCLT的组合，或等体积的单独PBS处理HLA-DR2+鼠Ⅱ类MHC缺失小鼠3次。在8天时间内腹膜内施用肽。最后一次施用之后，如(i)所述用乳化在完全弗氏佐剂中的rhFVIII初次刺激小鼠。10天后，回收引流淋巴结，然后用rhVIII体外再刺激淋巴细胞。然后收集上清液，测量IFN-γ。

本文通过提述并入本说明书中提及的所有出版物。本领域技术人员在不背离本发明的范围和精髓的前提下可以容易地想到本文所述方法和系统的各种修改和变化。虽然结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解的是，不应将要求保护的发明过分地限制到这些具体实施方案。事实上，对于使用流式细胞术进行细胞学研究或其它相关领域的技术人员容易想到的、对本文描述的本发明的实施模式的各种修改，都是下文所述的权利要求的范围所意图涵盖的。

SEQ ID No.1

1 mqielstcff lcllrfcfsa trryylgave lswdymqsdl gelpvdarfp prvpksfpfn

61 tsvvykktlf veftdhlfni akprppwmgl lgptiqaevy dtvvitlknm ashpvslhav

121 gvsywkaseg aeyddqtsqr ekeddkvfpg gshtyvwqvl kengpmasdp lcltysylsh

181 vdlvkdlnsg ligallvcre gslakektqt lhkfillfav fdegkswhse tknslmqdrd

241 aasarawpkm htvngyvnrs lpgligchrk svywhvigmg ttpevhsifl eghtflvrnh

301 rqasleispi tfltaqtllm dlgqfllfch isshqhdgme ayvkvdscpe epqlrmknne

361 eaedydddlt dsemdvvrfd ddnspsfiqi rsvakkhpkt wvhyiaaeee dwdyaplvla

421 pddrsyksqy lnngpqrigr kykkvrfmay tdetfktrea iqhesgilgp llygevgdtl

481 liifknqasr pyniyphgit dvrplysrrl pkgvkhlkdf pilpgeifky kwtvtvedgp

541 tksdprcltr yyssfvnmer dlasgligpl licykesvdq rgnqimsdkr nvilfsvfde

601 nrswylteni qrflpnpagv qledpefqas nimhsingyv fdslqlsvcl hevaywyils

661 igaqtdflsv ffsgytfkhk mvyedtltlf pfsgetvfms menpglwilg chnsdfrnrg

721 mtallkvssc dkntgdyyed syedisayll sknnaieprs fsqnsrhpst rqkqfnatti

781 pendiektdp wfahrtpmpk iqnvsssdll mllrqsptph glslsdlqea kyetfsddps

841 pgaidsnnsl semthfrpql hhsgdmvftp esglqlrlne klgttaatel kkldfkvsst

901 snnlistips dnlaagtdnt sslgppsmpv hydsqldttl fgkkssplte sggplslsee

961 nndskllesg lmnsqesswg knvsstesgr lfkgkrahgp alltkdnalf kvsisllktn

1021 ktsnnsatnr kthidgpsll ienspsvwqn ilesdtefkk vtplihdrml mdknatalrl

1081 nhmsnkttss knmemvqqkk egpippdaqn pdmsffkmlf lpesarwiqr thgknslnsg

1141 qgpspkqlvs lgpeksvegq nflseknkvv vgkgeftkdv glkemvfpss rnlfltnldn

1201 lhannthnqe kkiqeeiekk etliqenvvl pqihtvtgtk nfmknlflls trqnvegsyd

1261 gayapvlqdf rslndstnrt kkhtahfskk geeenleglg nqtkqiveky acttrispnt

1321 sqqnfvtqrs kralkqfrlp leetelekri ivddtstqws knmkhltpst ltqidyneke

1381 kgaitqspls dcltrshsip qanrsplpia kvssfpsirp iyltrvlfqd nsshlpaasy

1441 rkkdsgvqes shflqgakkn nlslailtle mtgdqrevgs lgtsatnsvt ykkventvlp

1501 kpdlpktsgk vallpkvhiy qkdlfptets ngspghldlv egsllqgteg aikwneanrp

1561 gkvpflrvat essaktpskl ldplawdnhy gtqipkeewk sqekspekta fkkkdtilsl

1621 nacesnhaia ainegqnkpe ievtwakqgr terlcsqnpp vlkrhqreit rttlqsdqee

1681 idyddtisve mkkedfdiyd edenqsprsf qkktrhyfia averlwdygm sssphvlrnr

1741 aqsgsvpqfk kvvfqeftdg sftqplyrge lnehlgllgp yiraevedni mvtfrnqasr

1801 pysfysslis yeedqrqgas prknfvkpne tktyfwkvqh hmaptkdefd ckawayfsdv

1861 dlekdvhsgl igpllvchtn tlnpahgrqv tvqefalfft ifdetkswyf tenmerncra

1921 pcniqmedpt fkenyrfhai ngyimdtlpg lvmaqdqrir wyllsmgsne nihsihfsgh

1981 vftvrkkeey kmalynlypg vfetvemlps kagiwrvecl igehlhagms tlflvysnkc

2041 qtplgmasgh irdfqitasg qygqwapkla rlhysgsina wstkepfswi kvdllapmii

2101 hgiktqgarq kfsslyisqf iimysldgkk wqtyrgnstg tlmvffgnvd ssgikhnifn

2161 ppiiaryirl hpthysirst lrmewmgcdl nscsmplgme skaisdaqit assyftnmfa

2221 twspskarlh lqgrsnawrp qvnnpkewlq vdfqktmkvt gvttqgvksl ltsmyvkefl

2281 isssqdghqw tlffqngkvk vfqgnqdsft pvvnsldppl ltrylrihpq swvhqialrm

2341 evlgceaqdl y

实施例7中制备的重叠肽组

对于DTLLIIFKNQASRPY的重叠组

1.473-488 YGEVGDTLLIIFKNQ

2.474-489 GEVGDTLLIIFKNQA

3.475-490 EVGDTLLIIFKNQAS

4.476-491 VGDTLLIIFKNQASR

5.477-492 GDTLLIIFKNQASRP

6.478-493 DTLLIIFKNQASRPY

7.479-494 TLLIIFKNQASRPYN

8.480-495 LLIIFKNQASRPYNI

9.481-496 LIIFKNQASRPYNIY

10.482-497 IIFKNQASRPYNIYP

11.483-498 IFKNQASRPYNIYPH

对于PRCLTRYYSSFVNME的重叠组

1.540-554 PTKSDPRCLTRYYSS

2.541-555 TKSDPRCLTRYYSSF

3.542-556 KSDPRCLTRYYSSFV

4.543-557 SDPRCLTRYYSSFVN

5.544-558 DPRCLTRYYSSFVNM

6.545-559 PRCLTRYYSSFVNME

7.546-560 RCLTRYYSSFVNMER

8.547-561 CLTRYYSSFVNMERD

9.548-562 LTRYYSSFVNMERDL

10.549-563 TRYYSSFVNMERDLA

11.550-564 RYYSSFVNMERDLAS

对于DNIMVTFRNQASRPY的重叠组

1.1783-1797 RAEVEDNIMVTFRNQ

2.1784-1798 AEVEDNIMVTFRNQA

3.1785-1799 EVEDNIMVTFRNQAS

4.1786-1800 VEDNIMVTFRNQASR

5.1787-1801 EDNIMVTFRNQASRP

6.1788-1802 DNIMVTFRNQASRPY

7.1789-1803 NIMVTFRNQASRPYS

8.1790-1804 IMVTFRNQASRPYSF

9.1791-1805 MVTFRNQASRPYSFY

10.1792-1806 VTFRNQASRPYSFYS

11.1793-1807 TFRNQASRPYSFYSS

对于SLYISQFIIMYSLDG的重叠组

1.2109-2123 RQKFSSLYISQFIIM

2.2110-2124 QKFSSLYISQFIIMY

3.2111-2125 KFSSLYISQFIIMYS

4.2112-2126 FSSLYISQFIIMYSL

5.2113-2127 SSLYISQFIIMYSLD

6.2114-2128 SLYISQFIIMYSLDG

7.2115-2129 LYISQFIIMYSLDGK

8.2116-2130 YISQFIIMYSLDGKK

9.2117-2131 ISQFIIMYSLDGKKW

10.2118-2132 SQFIIMYSLDGKKWQ

11.2119-2133 QFIIMYSLDGKKWQT

对于PPIIARYIRLHPTHY的重叠组

1.2156-2170 HNIFNPPIIARYIRL

2.2157-2171 NIFNPPIIARYIRLH

3.2158-2172 IFNPPIIARYIRLHP

4.2159-2173 FNPPIIARYIRLHPT

5.2160-2174 NPPIIARYIRLHPTH

6.2161-2175 PPIIARYIRLHPTHY

7.2162-2176 PIIARYIRLHPTHYS

8.2163-2177 IIARYIRLHPTHYSI

9.2164-2178 IARYIRLHPTHYSIR

10.2165-2179 ARYIRLHPTHYSIRS

11.2166-2180 RYIRLHPTHYSIRST

对于RYLRIHPQSWVHQIA的重叠组

1.2317-2331 PPLLTRYLRIHPQSW

2.2318-2332 PLLTRYLRIHPQSWV

3.2319-2333 LLTRYLRIHPQSWVH

4.2320-2334 LTRYLRIHPQSWVHQ

5.2321-2335 TRYLRIHPQSWVHQI

6.2322-2336 RYLRIHPQSWVHQIA

7.2323-2337 YLRIHPQSWVHQIAL

8.2324-2338 LRIHPQSWVHQIALR

9.2325-2339 RIHPQSWVHQIALRM

10.2326-2340 IHPQSWVHQIALRME

11.2327-2341 HPQSWVHQIALRMEV

序列表

<110>艾匹托普技术(布里斯托尔)有限公司(Apitope Technology(Bristol)Limited)

<120>FVIII肽和它们用于耐受化血友病患者的用途

<130>P031150CN

<140>PCT/GB2008/003996

<141>2008-12-03

<150>GB 0723712.6

<151>2007-12-04

<160>96

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2351

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro

755 760 765

Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp

770 775 780

Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys

785 790 795 800

Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser

805 810 815

Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr

820 825 830

Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn

835 840 845

Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly

850 855 860

Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu

865 870 875 880

Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys

885 890 895

Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn

900 905 910

Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met

915 920 925

Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys

930 935 940

Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu

945 950 955 960

Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu

965 970 975

Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe

980 985 990

Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala

995 1000 1005

Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser

1010 1015 1020

Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser

1025 1030 1035

Leu Leu Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu

1040 1045 1050

Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg

1055 1060 1065

Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met

1070 1075 1080

Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln

1085 1090 1095

Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met

1100 1105 1110

Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile

1115 1120 1125

Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro

1130 1135 1140

Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu

1145 1150 1155

Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys

1160 1165 1170

Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro

1175 1180 1185

Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu

1190 1195 1200

Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu

1205 1210 1215

Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile

1220 1225 1230

His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu

1235 1240 1245

Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr

1250 1255 1260

Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn

1265 1270 1275

Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu

1280 1285 1290

Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu

1295 1300 1305

Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln

1310 1315 1320

Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg

1325 1330 1335

Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp

1340 1345 1350

Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro

1355 1360 1365

Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala

1370 1375 1380

Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser

1385 1390 1395

Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser

1400 1405 1410

Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe

1415 1420 1425

Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys

1430 1435 1440

Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys

1445 1450 1455

Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly

1460 1465 1470

Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser

1475 1480 1485

Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp

1490 1495 1500

Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His

1505 1510 1515

Ile Tyr Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser

1520 1525 1530

Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr

1535 1540 1545

Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val

1550 1555 1560

Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser

1565 1570 1575

Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln

1580 1585 1590

Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys

1595 1600 1605

Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys

1610 1615 1620

Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys

1625 1630 1635

Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg

1640 1645 1650

Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu

1655 1660 1665

Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr

1670 1675 1680

Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile

1685 1690 1695

Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys

1700 1705 1710

Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr

1715 1720 1725

Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser

1730 1735 1740

Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

1745 1750 1755

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu

1760 1765 1770

His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp

1775 1780 1785

Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser

1790 1795 1800

Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly

1805 1810 1815

Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr

1820 1825 1830

Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu

1835 1840 1845

Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu

1850 1855 1860

Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His

1865 1870 1875

Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln

1880 1885 1890

Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp

1895 1900 1905

Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn

1910 1915 1920

Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His

1925 1930 1935

Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met

1940 1945 1950

Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser

1955 1960 1965

Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr

1970 1975 1980

Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr

1985 1990 1995

Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly

2000 2005 2010

Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly

2015 2020 2025

Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro

2030 2035 2040

Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala

2045 2050 2055

Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His

2060 2065 2070

Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser

2075 2080 2085

Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile

2090 2095 2100

Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser

2105 2110 2115

Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr

2120 2125 2130

Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn

2135 2140 2145

Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile

2150 2155 2160

Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg

2165 2170 2175

Ser Thr Leu Arg Met Glu Trp Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys

2180 2185 2190

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln

2195 2200 2205

Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser

2210 2215 2220

Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp

2225 2230 2235

Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe

2240 2245 2250

Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys

2255 2260 2265

Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser

2270 2275 2280

Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys

2285 2290 2295

Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val

2300 2305 2310

Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His

2315 2320 2325

Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu

2330 2335 2340

Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

2345 2350

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>2

Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>3

Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly

1 5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>4

Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro

1 5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>5

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>6

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val

1 5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>7

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser

1 5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>8

Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val

1 5

<210>9

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>9

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu

1 5 10 15

<210>10

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>10

Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr

1 5 10 15

<210>11

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>11

Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly

1 5 10 15

<210>12

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>12

Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr

1 5 10 15

<210>13

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>13

Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr

1 5 10 15

<210>14

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>14

Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1 5 10 15

<210>15

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>15

Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys

1 5 10 15

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>16

Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met

1 5 10 15

<210>17

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>17

Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr

1 5 10 15

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>18

Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser

1 5 10 15

<210>19

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>19

Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu

1 5 10 15

<210>20

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>20

Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp

1 5 10 15

<210>21

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>21

Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys

1 5 10 15

<210>22

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>22

Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp

1 5 10 15

<210>23

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>23

Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln

1 5 10 15

<210>24

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>24

Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr

1 5 10 15

<210>25

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>25

Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr

1 5 10 15

<210>26

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>26

Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg

1 5 10 15

<210>27

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>27

Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile

1 5 10 15

<210>28

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>28

Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser

1 5 10 15

<210>29

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>29

Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His

1 5 10 15

<210>30

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>30

Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr

1 5 10 15

<210>31

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>31

Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro

1 5 10 15

<210>32

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>32

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr

1 5 10 15

<210>33

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>33

Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile

1 5 10 15

<210>34

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>34

Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn

1 5 10 15

<210>35

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>35

Gly Asp Thr Leu Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro

1 5 10 15

<210>36

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>36

Val Gly Asp Thr Leu Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln A1a Ser Arg

1 5 10 15

<210>37

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>37

Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser

1 5 10 15

<210>38

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>38

Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val

1 5 10 15

<210>39

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>39

Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn

1 5 10 15

<210>40

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>40

Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met

1 5 10 15

<210>41

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>41

Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

1 5 10 15

<210>42

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>42

Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp

1 5 10 15

<210>43

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>43

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu

1 5 10 15

<210>44

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>44

Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser

1 5 10 15

<210>45

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>45

Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg

1 5 10 15

<210>46

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>46

Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro

1 5 10 15

<210>47

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>47

Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser

1 5 10 15

<210>48

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>48

Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe

1 5 10 15

<210>49

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>49

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr

1 5 10 15

<210>50

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>50

Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg

1 5 10 15

<210>51

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>51

Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu

1 5 10 15

<210>52

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>52

Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile

1 5 10 15

<210>53

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>53

Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln

1 5 10 15

<210>54

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>54

Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His

1 5 10 15

<210>55

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>55

Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val

1 5 10 15

<210>56

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>56

Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile

1 5 10 15

<210>57

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>57

Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp

1 5 10 15

<210>58

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>58

Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp

1 5 10 15

<210>59

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>59

Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu

1 5 10 15

<210>60

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>60

Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

1 5 10 15

<210>61

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>61

Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln

1 5 10 15

<210>62

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>62

Gly Thr Leu Met Val

1 5

<210>63

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>63

Thr Gln Thr Leu His

1 5

<210>64

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>64

Ser Leu Tyr Ile Ser

1 5

<210>65

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>65

Pro Pro Ile Ile Ala

1 5

<210>66

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>66

Pro Pro Leu Leu Thr

1 5

<210>67

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>67

Met His Thr Val Asn

1 5

<210>68

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>68

Leu Gly Gln Phe Leu

1 5

<210>69

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>69

Asp Thr Leu Leu Ile

1 5

<210>70

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>70

Pro Arg Cys Leu Thr

1 5

<210>71

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>71

Thr Glu Asn Ile Gln

1 5

<210>72

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>72

Asp Asn Ile Met Val

1 5

<210>73

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>73

Arg Tyr Leu Arg Ile

1 5

<210>74

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>74

Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln

1 5 10 15

<210>75

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>75

Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala

1 5 10 15

<210>76

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>76

Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser

1 5 10 15

<210>77

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>77

Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg

1 5 10 15

<210>78

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>78

Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro

1 5 10 15

<210>79

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>79

Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

1 5 10 15

<210>80

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>80

Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His

1 5 10 15

<210>81

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>81

Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser

1 5 10 15

<210>82

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>82

Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe

1 5 10 15

<210>83

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>83

Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

1 5 10 15

<210>84

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>84

Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser

1 5 10 15

<210>85

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>85

Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln

1 5 10 15

<210>86

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>86

Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala

1 5 10 15

<210>87

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>87

Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

1 5 10 15

<210>88

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>88

Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser

1 5 10 15

<210>89

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>89

Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys

1 5 10 15

<210>90

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>90

His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu

1 5 10 15

<210>91

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>91

Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His

1 5 10 15

<210>92

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>92

Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser

1 5 10 15

<210>93

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>93

Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr

1 5 10 15

<210>94

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>94

Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met

1 5 10 15

<210>95

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>95

Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu

1 5 10 15

<210>96

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>96

His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val

1 5 10 15

Claims

1.一种肽，其由下列序列之一组成：

VEDNIMVTFRNQASR

DNIMVTFRNQASRPY

IMVTFRNQASRPYSF

MVTFRNQASRPYSFY

VTFRNQASRPYSFYS。

2.一种组合物，其包含多种如权利要求1所述的肽。

3.权利要求1的肽或权利要求2的组合物在制备用于在阻遏或防止体内因子VIII抑制物抗体的产生的方法中使用的药物中的用途。

4.权利要求1的肽或权利要求2的组合物在制备用于在治疗受试者中血友病的方法中使用的药物中的用途。

5.权利要求4所述的用途，其中所述受试者患有A型血友病，并且正在接受或即将接受因子VIII补充治疗。

6.权利要求4所述的用途，其中所述受试者患有获得性血友病，或者有患上获得性血友病的风险。

7.权利要求4所述的用途，其中所述受试者为HLA-DR2。