EA027229B1 - Пептид, который является фрагментом фактора viii, и композиция для подавления или предупреждения вырабатывания антител-ингибиторов к фактору viii in vivo - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к пептиду, который является фрагментом фактора VIII, который подавляет или предупреждает образование антител-ингибиторов к фактору VIII in vivo и который состоит из последовательности EDNIMVTFRNQASR. Кроме того, изобретение относится к композиции для подавления или предупреждения образования антител-ингибиторов к фактору VIII in vivo, содержащей данный пептид. Настоящее изобретение также относится к применению данного пептида или данной композиции для предупреждения или подавления образования антител-ингибиторов к фактору VIII in vivo. Изобретение позволяет снизить количество FVIII, которое необходимо для его введения в целях улучшения свертываемости крови у пациента.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к пептиду. В частности, настоящее изобретение относится к пептидам, у которых, по меньшей мере, коровая последовательность происходит от фактора VIII (РУШ).

Этот пептид может быть использован для подавления или предупреждения образования антителаингибитора против фактора VIII, например, при лечении гемофилии А и приобретенной гемофилии.

Предшествующий уровень техники

Гемофилия

Гемофилия принадлежит к группе наследственных болезней крови, которые включают гемофилию А, гемофилию В (болезнь Кристмаса) и болезнь фон Виллебранда.

При гемофилии, свертываемость крови является очень низкой, поскольку, при этом заболевании, главный фактор свертывания крови частично или полностью отсутствует, что приводит к увеличению времени кровотечения. Гемофилия А характеризуется дефицитом фактора свертывания крови VIII, а гемофилия В характеризуется дефицитом фактора свертывания крови IX. При этих заболеваниях, на хромосоме X присутствует аномальный ген, а поэтому эти состояния являются Х-сцепленными. Гемофилия А встречается в пять раз чаще, чем гемофилия В.

Гемофилия представляет собой наследственное и продолжающееся всю жизнь генетическое заболевание; при этом, женщины являются лишь носительницами гена гемофилии, а болеют гемофилией только мужчины, которые наследуют этот ген. Примерно у трети пациентов с недавно диагностированным заболеванием не было выявлено этого заболевания в семейном анамнезе. Указанное заболевание встречается: во всем мире и у людей всех расовых групп. В Великобритании гемофилией страдают примерно 6000 человек.

При гемофилии, кровотечение, возникающее в результате повреждения ткани, продолжается в течение длительного периода времени. Внешние повреждения, такие как порезы и царапины, обычно не создают серьезных проблем, поскольку такое кровотечение легко остановить путем надавливания на кожу и наложения повязки на пораженный участок (например, наложения пластыря).

Главной проблемой является внутреннее кровоизлияние в суставы, мышцы и мягкие ткани, которое может происходить спонтанно. Внутреннее кровоизлияние, такое как кровоизлияние в головной мозг, очень трудно поддается лечению и может приводить к летальному исходу. Повторное кровоизлияние в суставы вызывает острую боль и может приводить к артриту и/или к длительному поражению суставов и, в конечном счете, к инвалидности.

Лечение гемофилии обычно проводят путем введения отсутствующего фактора свертывания крови. В случаях легкой гемофилии и гемофилии средней тяжести, инъекции могут быть введены во время кровотечения (экстренная терапия). Однако, в случае тяжелой гемофилии, необходимо регулярное профилактическое введение инъекций для стимуляции свертывания крови и минимизации вероятности хронического поражения суставов.

При гемофилии А, возможным серьезным осложнением заместительной терапии, проводимой путем введения фактора свертывания крови, является образование антител, которые нейтрализуют прокоагулирующую функцию фактора VIII. Ингибиторы фактора VIII вырабатываются приблизительно у 25% пациентов с тяжелой гемофилией А. Поскольку у пациентов с врожденной гемофилией А может наблюдаться дефицит ΡΥΠΊ на генетическом уровне, то синтез ингибиторов представляет собой аллоиммунный ответ на чужеродный белок, вводимый в целях предупреждения или устранения кровотечения.

СГО4'-Т-клетки играют центральную роль в вырабатывании иммунного ответа на фактор ΡΎΣΗ. ΡΎΣΗ, после его захвата антигенпрезентирующими клетками (АПК), подвергается протеолитическому расщеплению с образованием пептидных фрагментов (Кейшд с1 а1. (2006) НаеторЫНа 12 (кирр 6) 30-36).

Затем эти пептиды презентируются на поверхности АПК в ассоциации с молекулами МНС класса II. Затем этот комплекс распознается Т-клеточным рецептором СГО4'-клеток. специфичных к РМШ. В присутствии соответствующих ко-стимулирующих сигналов, такое распознавание, в конечном счете, приводят к СГО4'-клеточной регуляции синтеза антител В-клетками.

Степень образования ингибиторов сначала возрастает в зависимости от количества вводимого фактора VIII, но после 50-100 дней терапии, такая кривая зависимости обнаруживает плато. Образование ингибиторов чаще наблюдается при тяжелой гемофилии, чем при заболевании в умеренной или в легкой форме, и очевидно, что предрасполагающим фактором образования ингибиторов могут служить некоторые молекулярные дефекты, а, по всей вероятности, крупные делеции и нонсенс-мутации в легкой цепи фактора VIII. На вероятность продуцирования антитела могут также влиять такие параметры, как концентрация, тип вводимого фактора (очищенного или рекомбинантного) и проводимое ранее лечение.

В настоящее время, лечение пациентов, страдающих гемофилией, с применением ингибиторов представляет серьезную проблему. Индуцирование иммунной толерантности (ИИТ) с применением метода десенсибилизации было с успехом проведено у некоторых пациентов путем введения аллоантител против фактора VIII. Такой терапевтический подход требует проведения заместительной терапии с непрерывным введением отсутствующего фактора свертывания крови, а поэтому такой подход является стратегией долгосрочного лечения.

Хотя ИИТ может оказаться успешной, однако, у значительного числа пациентов (примерно, у 30%)

- 1 027229 не наблюдалось ответа на ИИТ. Очевидно, что пациенты с высокими титрами ингибиторов являются гораздо менее восприимчивыми к лечению. Другим значительным фактором является возраст, при котором было начато ИИТ, и вероятность успеха такого лечения у пациентов старше 20 лет значительно снижается (Нау с1 а1. (2005) §еттатк ίη ТкготЬок1К аиб Неток!аык 32:15-21).

При безуспешной ИИТ-терапии, ингибитор обычно присутствует в кровотоке пациентов в течение всей их жизни, а поскольку такие пациенты являются в высокой степени восприимчивыми к образованию ингибиторов, то для остановки кровотечений у этих пациентов необходимо вводить продукты шунтирующих путей, то есть продукты, действующие в обход путей действия РУШ, например, такие как концентраты комплекса активированного протромбина (РЕ1ВА™), и рекомбинантно активированный РУ11. Однако, использование таких агентов ассоциируется с побочными эффектами, такими как диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, острый инфаркт миокарда, эмболия и тромбоз легких (Аскагуа аиб ΌίΜίαΙκΕ (2006) Век! РтасИсе & Кекеагск Скшса1 Наета!о1оду 19:51-66).

Иногда, пациентам, у которых не наблюдается ответа на ИИТ, проводят иммуносупрессорную терапию. Такая терапия включает введение иммунодепрессантов, таких как циклофосфамид, преднизон, азатиоприн и циклоспорин, которые оказывают неспецифическое действие на иммунную систему. Такое лечение может вызывать побочные эффекты, ассоциированные с общей иммуносупрессией.

В настоящее время вновь появился интерес к селективному истощению В-клеток с использованием ритуксимаба™, то есть гуманизованного моноклонального антитела против В-клеточного антигена СЭ20. Однако у некоторых детей, которым было введено такое лекарственное средство, наблюдались реакции на переливание крови, сывороточная болезнь и развитие условно-патогенных инфекций (ΌίМюке1е (2007) 1. ТкготЬ. Наеток!. 5:143-50).

Приобретенная гемофилия

Приобретенная гемофилия представляет собой редкое аутоиммунное состояние, которое встречается у 1-4 человек на миллион. При этом состоянии, у пациентов, у которых гемофилия не является врожденной, вырабатываются антитела против одного из факторов свертывания крови, такого как фактор VIII. Существует мнение, что беременность и аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит и рак, могут повышать риск развития приобретенной гемофилии. Хотя в иммунных механизмах, лежащих в основе развития гемофилии, существуют различия, однако клинические манифестации, вызываемые ингибиторами РУШ, продуцируемыми в ответ на проводимую заместительную терапию путем введения фактора свертывания крови, и клинические манифестации, наблюдаемые при приобретенной гемофилии, являются аналогичными.

Смертность пациентов с приобретенной гемофилией составляет приблизительно 25%, что частично обусловлено взаимосвязью продуцируемых ингибиторов с осложнениями в виде сильных кровотечений. Терапия ингибиторной приобретенной гемофилии с продуцированием аутоантител основана, главным образом, на необходимости устранения или предупреждения острых геморрагических осложнений, которые часто представляют собой опасность для жизни и поражают конечности, а также на необходимости удаления аутоантител для восстановления нормальной функции свертывания крови.

Некоторые виды кровотечений, ассоциирующиеся с низким титром ингибиторов аутоантител (<5 единиц Бетесда), могут быть с успехом устранены с использованием концентратов РУШ, вводимых в высоких дозах. Концентрат свиного РУШ раньше рассматривался как средство первого ряда для интенсивной терапии по устранению кровотечений, ассоциированных с приобретенной гемофилией, поскольку только такая заместительная терапия, фактически, дает возможность проводить лабораторное измерение уровней активности свертывания крови после вливания РУШ. Этот продукт был снят с продаж в 2004, поскольку пулы свиной плазмы были заражены свиным парвовирусом. В настоящее время чаще всего используются агенты шунтирующих путей, однако в данном случае существует риск образования тромбов, и эффективность каждого из этих продуктов составляет только примерно 80%. В некоторых случаях могут потребоваться замена плазмы посредством плазмофереза и экстракорпоральная иммуносорбция, которые будут достаточными для снижения титра ингибиторов при введении агентов шунтирующих путей или фактора РУШ в целях достижения адекватного гемостаза.

Удаление ингибиторов аутоантител зависит от степени иммуносупрессии, такой как (1) введение кортикостероидов с 30-50% эффективностью в течение 3-6 недель; (2) применение цитотоксических и миелосупрессорных химиотерапевтических средств, например, циклофосфамида, циклоспорина, 2-хлордезоксиаденозина; (3) иммуномодуляция внутривенно вводимым иммуноглобулином и (4) селективное истощение В-лимфоцитов с использованием ритуксимаба. Пациентам, отвечающим на действие ритуксимаба™, может потребоваться одновременное введение стероидов, а рецидивы могут возникать в ответ на повторно проводимое лечение.

Таким образом, все существующие в настоящее время способы снижения уровней продуцирования аллоантител, ассоциированного с лечением гемофилии А, и продуцирования аутоантител при приобретенной гемофилии, имеют определенные недостатки. Поэтому существует необходимость в разработке усовершенствованных способов, направленных на решение проблем, связанных с продуцированием анти-РУШ антител при гемофилии А и при приобретенной гемофилии.

- 2 027229

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что образование антител-ингибиторов РУШ можно предупредить путем предварительного сообщения пациенту толерантности путем введения пептидов, происходящих от РУШ.

Краткое описание аспектов настоящего изобретения

Таким образом, в своем первом аспекте, настоящее изобретение относится к пептиду, у которого по меньшей мере часть последовательности происходит от РУШ, и который способен индуцировать или восстанавливать толерантность к РУШ.

В своем первом варианте, настоящее изобретение относится к пептиду, включающему одну из следующих последовательностей, происходящих от РУШ:

СТЬМУРРСМУО§§С1

ТОТЬНКИЬЬРЛУРО

БЬУКРРПМУБЬПе

ΡΡΙΙΑΗΥΊΗΡΙ1ΡΊΊ1Υ’

ΙΨΙ.Ι.ΤΗΥΙ.ΗΙΙΙΡΟ5\Υ

ΜΗΤΥΝΟΥΥΝΡδΕΡΟΕ

ГС.С)РГГРСШ551Ю11

ΟΤΕΕΙΙΕΚΝΟΑδΡΡΥ

ΡΚС^ΤΚΥΥ88РУNМΕ

ΤΕNI^ΡР^ΡNΡΑСУ^ ^NIМУΤРΡN^ΑЗΡΡΥ

ΚΥΕΚΙΗΡρδνΥΗρίΑ где в указанных последовательностях были сделаны одна или несколько из следующих модификаций:

(ί) удаление одной или нескольких гидрофобных аминокислот;

(ίί) замена одной или нескольких гидрофобных аминокислот заряженными гидрофильными аминокислотами; и (ш) введение заряженной аминокислоты у одного конца или у обоих концов, где указанный модифицированный пептид обладает способностью связываться с молекулой МНС класса II без последующего процессинга антигена, и распознается Т-клетками, специфичными к фактору УШ.

Родительский (немодифицированный) пептид может представлять собой ΡΚС^ΤΚΥΥЗЗРУNМΕ или ^NIМУΤРΡN^ΑЗΡΡΥ.

Во втором своем варианте настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность

Х(аа)_п-коровая последовательность-(аа)_т, где X представляет собой заряженный гидрофильный остаток;

аа представляет собой аминокислоту;

п равно целому числу от 0 до 5; т равно целому числу от 0 до 5; и коровая последовательность выбрана из нижеследующей группы пептидов, происходящих от

РУШ

ΕΥΙ8ΟΕΙΙΜ

ΕΙΙΜΥδΕΩΟ

ΙΑΒΥΙΡΣΗΡ ί-ΙΙΕΚΝΟΑδ ^ΤΚΥΥЗЗРУ \1\ΊΤΗΝΟΑδ

ΡΗΙΙΙΡΟδΥΥΥ где указанный пептид обладает способностью связываться с молекулой МНС класса ΙΙ без последующего процессинга антигена и распознается Т-клетками, специфичными к фактору УШ.

Так, например, пептид может содержать последовательность ХО№МУТРРКрА§.

В своем третьем варианте настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность:

Υ (аа)_п-коровая последовательность-(аа)_т2, где Υ и Ζ представляют собой заряженные аминокислоты, имеющие обратную полярность; аа представляет собой аминокислоту; п равно целому числу от 0 до 5; т равно целому числу от 0 до 5; и коровая последовательность выбрана из нижеследующей группы пептидов, происходящих от

РУШ

РХЫОРПМ

РП\ААР1)С.

ΙΑΒΥΙΡΣΗΡ

- 3 027229

ΜΙΡΚΝΟΆδ

ЬТКУУЗЗРУ

ΜνΤΡΚΝΟΆδ

1.КП1РО5\\А.

где указанный пептид обладает способностью связываться с молекулой МНС класса II без последующего процессинга антигена и распознается Т-клетками, специфичными к фактору VIII.

Так, например, пептид может содержать последовательность Υ^NIΜVΤЕКN^А§Ζ.

В третьем варианте, например, Υ может представлять собой положительно заряженную аминокислоту, а Ζ может представлять собой отрицательно заряженную аминокислоту. Альтернативно, Υ может представлять собой отрицательно заряженную аминокислоту, а Ζ может представлять собой положительно заряженную аминокислоту.

Заряженной гидрофильной аминокислотой может быть, например, Ό, Е, Κ, Н или К. Положительно заряженной аминокислотой может быть, например, Κ, Н или К. Отрицательно заряженной аминокислотой может быть, например Ό или Е.

Пептид согласно первому аспекту изобретения может, например, включать последовательность Е^NIΜVΤЕКN^А§К, либо он может состоять из этой последовательности.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, такой как фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько пептидов согласно первому аспекту изобретения. Указанная композиция может содержать множество пептидов, которые полностью или частично происходят от ЕЩИ, и которые обладают способностью индуцировать или восстанавливать толерантность к ЕЩП.

Указанная композиция может быть приготовлена в форме набора, в котором множество пептидов представлены по отдельности для раздельного, непрерывного, последовательного или одновременного введения.

Пептид или композиция согласно изобретению могут быть использованы для подавления, снижения или предупреждения образования антител-ингибиторов фактора VIII.

Настоящее изобретение также относится к применению такого пептида или такой композиции в целях приготовления лекарственного препарата для подавления, снижения или предупреждения образования антител-ингибиторов фактора VIII.

Настоящее изобретение также относится к способу подавления, предупреждения или снижения образования антител-ингибиторов фактора VIII у индивидуума, где указанный способ включает стадию введения указанного пептида или указанной композиции индивидууму.

У индивидуума может наблюдаться дефицит ΕΎΉ! В частности, указанный индивидуум может страдать гемофилией А и может быть подвергнут заместительной терапии, или он может быть направлен на проведение заместительной терапии путем введения фактора VIII.

Альтернативно, указанный индивидуум может заболеть приобретенной гемофилией, либо он может быть подвержен риску развития у него приобретенной гемофилии.

Ингибиторы фактора VIII чаще обнаруживаются у индивидуумов, у которых экспрессируется ЕГОА-ОКЬ Поэтому индивидуум, подвергаемый лечению способом согласно изобретению, может иметь положительную реакцию на НЬА-ОК2.

Описание графического материала

Фиг. 1: вторичный ответ клеток лимфоузлов (ΡΝΟ) у ЕЩИ+ИКУ-мышей, примированных тЬЕЩП/СЕА.

a) пролиферация ΕΝΟ в ответ на пептиды ЕЩП 1-6,

b) пролиферация ΕΝΟ в ответ на пептиды ЕЩП 7-12,

c) пролиферация ΕΝΟ в ответ на пептиды ЕЩП 1, 3 и 11.

Фиг. 2: репрезентативные примеры клонов ЕЩИ+ИКУ-Т-клеточной гибридомы, специфичных к пептидам, происходящим от ЕЩИ.

Фиг. 3: вторичный ответ ΕΝΟ у ЕЩП^-ПК2+-мышей, примированных тЬЕЩП/СЕА.

Фиг. 4: репрезентативные примеры клонов ЕЩИ^-ПК2+-Т-клеточной гибридомы, специфичных к пептидам, происходящим от ЕЩИ.

Фиг. 5: ЕЩП^-/^--клоны, специфичные к а) ^NIΜV и Ь) РКСЬТ.

Фиг. 6: вторичный ответ ЬНС на ЕЩП у ЕЩИ+ИКУ-мышей, 3 раза обработанных ί.ρ. пептидом перед примированием этих мышей тЬЕ^П/СЕА.

Фиг. 7: определение набора пептидных эпитопов, способных функционировать как апитопы, с использованием клонов ЕЩИ^-ПК2+-Т-клеточной гибридомы, специфичных к перекрывающимся пептидам, происходящим от ЕЩИ. Исходный пептид обозначается 0. Пептид с модификацией одной аминокислоты у Ν-конца обозначается -1, а пептид с модификацией двух аминокислот у Ν-конца обозначается -2 и т.п. Пептид с одной модификацией у С-конца обозначается +1 и т.п.

Фиг. 8: продуцирование ΓΡΝ-гамма в клетках лимфоузлов в ответ на ЕЩИ у ЕЩИ^-ПК2+-мышей, обработанных происходящими от ЕЩИ пептидами РКСЬТ, ^NIΜV или их смесями.

Фиг. 9: ответы у мышей, которые ранее не были обработаны или которым была сообщена толерантность, после стимуляции этих мышей либо пептидом ЕИОТМ^ЕКИОАЗК (ЕИ№М^, либо контроль- 4 027229 ным пептидом (ΌΝΙΜν).

Подробное описание изобретения

Пептиды

Настоящее изобретение относится к пептидам.

Термин пептид, употребляемый здесь в своем общепринятом смысле, означает серию остатков, обычно Ь-аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями, соединяющими α-амино- и карбоксильные группы смежных аминокислот. Этот термин включает модифицированные пептиды и их синтетические аналоги.

Пептид согласно изобретению может быть получен химическими методами (Рер1тПе СНспиДгу. А ргаейеа1 Тех!Ьоок. Μί1<05 Вобапзку, §ргшдег^ег1ад, Вегйи.). Так, например, пептиды могут быть синтезированы методами твердофазного синтеза (КоЬегде ΊΥ е! а1. (1995). §с1епсе 269: 202-204), а затем отделены от смолы и очищены с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, Сге1дй!оп (1983) РгоЮпъ §!гис!иге8 Апб Мо1еси1аг Ргшщркз, νΗ Ргеетап апб Со, №ν Уогк ΝΥ). Автоматизированный синтез может быть проведен, например, на пептидном синтезаторе АВ1 431А (Регкш Е1тег) в соответствии с инструкциями производителей.

Альтернативно, пептид может быть получен рекомбинантными методами или путем отщепления пептида 1а от фактора VIII с последующей модификацией одного или обоих концов. Состав пептида может быть подтвержден с помощью аминокислотного анализа или секвенирования (например, в соответствии с процедурой расщепления по Эдману).

Для практических целей могут быть использованы и другие различные свойства, которые может обнаруживать данный пептид. Так, например, важным свойством пептида, с точки зрения его терапевтического применения, является его высокая стабильность ш νίνο. Время полужизни пептида ш νίνο может составлять по меньшей мере 10 мин, 30 мин, 4 или 24 ч.

Этот пептид может также обладать хорошей биологической доступностью ш νίνο. Такой пептид может сохранять конформацию щ νίνο, что позволяет ему связываться с молекулой МНС на клеточной поверхности без каких-либо явных стерических затруднений.

Остатки коровой последовательности

При адаптивном иммунном ответе Т-лимфоциты способны распознавать внутренние эпитопы белкового антигена.

Антигенпрезентирующие клетки (АПК) захватывают белковые антигены и разлагают их на короткие пептидные фрагменты. Пептид может связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I или II внутри клеток и на клеточной поверхности. При презентации на клеточной поверхности в комбинации с молекулой МНС, пептид может распознаваться Т-клетками (посредством Тклеточного рецептора (ТСК)), а в данном случае, таким пептидом является Т-клеточный эпитоп.

Таким образом, эпитопом является пептид, происходящий от антигена, который обладает способностью связываться с пептид-связывающей бороздкой молекулы МНС класса I или II и распознается Тклетками.

Минимальным эпитопом является самый короткий фрагмент, происходящий от эпитопа, где указанный фрагмент обладает способностью связываться с пептид-связывающей бороздкой молекулы МНС класса I или II и распознается Т-клетками. Для данной иммуногенной области обычно получают гнездовую серию перекрывающихся пептидов, которые действуют как эпитопы, где каждый из этих пептидов содержит минимальный эпитоп, но отличается по своим фланкирующим областям.

Кроме того, можно идентифицировать минимальный эпитоп для конкретной комбинации молекула МНС:Т-клетка путем измерения ответа на усеченные пептиды. Так, например, если вырабатывается ответ к пептиду, содержащему остатки 1-15 в перекрывающейся библиотеке, то серии, усеченные по обоим концам (то есть 1-14, 1-13, 1-12 и т.п. и 2-15, 3-15, 4-15 и т.п.), могут быть использованы для идентификации минимального эпитопа.

Настоящее изобретение относится к пептидам, включающим последовательность коровых остатков ΡνΊΠ, выбранную из следующего списка последовательностей:

Ь-У^ОЕИМ

ЕПМУЕТНС

МКУЩЕНР

ЬПРК^АЗ

ΕΤΚΥΥδδΡν

ΜνΤΕΚΝΟΛδ

ΕΜΗΡρδνν

Такие последовательности коровых остатков были предсказаны с помощью алгоритмов связывания НЬА-ОК2, и было обнаружено, что эти последовательности представляют собой или включают минимальный эпитоп для каждой области, как описано в примерах.

Апитопы

Авторами настоящего изобретения ранее было определено, что существует взаимосвязь между способностью пептида связываться с молекулой МНС класса I или II, и презентироваться Т-клеткам без по- 5 027229 следующего процессинга антигена, и способностью такого пептида индуцировать толерантность ίη νίνο (\νϋ 02/16410). Если пептид является слишком длинным, для того, чтобы связываться с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС без последующего процессинга (например, отщепления), или если он связывается в несоответствующей конформации, то он не будет обладать толерогенными свойствами ίη νίνο. С другой стороны, если пептид имеет размер и конформацию, подходящие для его прямого связывания с пептид-связывающей бороздкой МНС и для его презентации Т-клеткам, то такой пептид, как предполагается, может быть использован для индуцирования толерантности.

Таким образом, исследование на толерогенную способность пептида может быть проведено путем определения его способности связываться с молекулой МНС класса I или II и презентироваться Тклеткам без последующего процессинга антигена ίη νίίτο.

Пептиды согласно изобретению представляют собой апитопы (эпитопы, независимые от процессинга антигена) (Άηίί^βη Ргосс551пд-1пбсрсп1 βρίΤΟΡΕδ), которые способны связываться с молекулой МНС класса II и стимулировать ответ в Т-клетках, специфичных к фактору VIII, без последующего процессинга антигена. Способность таких апитопов вызывать толерантность к РУШ может быть предсказана с применением стандартного метода, описанного в νΟ 02/16410.

Пептид согласно изобретению может иметь любую длину, которая позволяет ему связываться с молекулой МНС класса I или II без последующего процессинга. Обычно, пептид согласно изобретению обладает способностью связываться с молекулой МНС класса II.

Пептиды, которые связываются с молекулами МНС класса I, обычно имеют длину в 7-13, а чаще всего 8-10 аминокислот. Связывание пептида стабилизируется по его двум концам посредством контактов между атомами в главной цепи пептида и в инвариантных сайтах в пептид-связывающей бороздке всех молекул МНС класса I. Инвариантные сайты имеются на обоих концах бороздки, которые связываются с амино- и карбоксиконцами пептида. Изменение длины пептида обусловлено изгибами пептидного остова, часто в положениях пролиновых или глициновых остатков, которые обеспечивают требуемую гибкость.

Пептиды, которые связываются с молекулами МНС класса II, обычно имеют длину в 8-20 аминокислот, а чаще всего 10-17 аминокислот, а могут быть и еще длиннее (например, они могут содержать до 40 аминокислот). Эти пептиды имеют протяженную конформацию вдоль бороздки, связывающейся с пептидом МНС класса II, которая (в отличие от бороздки, связывающейся с пептидом МНС класса I) является открытой с обоих концов. Локализация этого пептида определяется, главным образом, контактами атомов главной цепи с консервативными остатками, которые образуют пептид-связывающую бороздку.

Пептидные последовательности

В своем первом варианте, настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему одну из нижеследующих последовательностей, происходящих от РУШ

ΟΤ^ΜVΡΡΟNV^δδΟI

ΤΟΤΕΗΚΗΕΡΡΛνΡΌ δ^ΥIδ^ΡIIΜΥδ^^Ο

РРПАКУЖЬНРТНУ

ΡΡΕΕΤΚΥΕΚΙΗΡρδν

ΜΗΤνΝΟΥνΝΚδΕΡΟΕ

ЕООНЛЕСНкбНОН

ΌΤΕΕΠΡΚΝρΑδΚΡΥ

ΡΚΟΕΤΚΥΥδδΡνΝΜΕ

ΤΕNI^ΚΡ^ΡNΡΑΟV^ ^NIΜVΤΡΚN^ΑδΚΡΥ

ΚΥ^ΚIΗΡ^δVVΗ^IΑ в которых были сделаны одна или несколько из следующих модификаций, а именно:

(ί) удаление одной или нескольких гидрофобных аминокислот;

(ίί) замена одной или нескольких гидрофобных аминокислот заряженными гидрофильными аминокислотами; и (ш) введение заряженной аминокислоты у одного конца или у обоих концов, где указанный модифицированный пептид обладает способностью связываться с молекулой МНС класса II без последующего процессинга антигена и распознается Т-клетками, специфичными к фактору VIII.

Список стандартных аминокислот, а также их полярность и заряд боковой цепи и гидропатические индексы представлены в табл. 1.

- 6 027229

Таблица 1

Амино-	3-	1-	Полярность	Заряд	Гидро-
кислота	буквен-	буквен-	боковой	боковой	патиче-
	ный код	ный код	цепи	цепи (рН 7)	ский индекс
Аланин	А1а	А	неполярная	нейтральный	1,8
Аргинин	Агд	К	полярная	Положитель- ный	-4,5
Аспарагин	Азп	N	полярная	нейтральный	-3,5
Аспараги- новая кислота	Азр	ϋ	полярная	Отрицатель- ный	-3,5
Цистеин	Суз	С	неполярная	нейтральный	2,5
Глутамино -вая кислота	С1и	Е	полярная	Отрицатель- ный	-3,5
Глутамин	С1п	<2	полярная	нейтральный	-3,5

Глицин	61у	О	неполярная	нейтральный	-0,4
Гистидин	Пз	н	полярная	Положитель- ный	-3,2
Изолейцин	Не	I	неполярная	нейтральный	4,5
Лейцин	Ьеи	ц	неполярная	нейтральный	3, 8
Лизин	Ьуз	к	полярная	Положитель- ный	-3, 9
Метионин	Меб	м	неполярная	нейтральный	1, 9
Фенилала- нин	РПе	Е	неполярная	нейтральный	2,8
Пролин	Рго	Р	неполярная	нейтральный	-1, 6
Серин	Зег	3	полярная	нейтральный	-0,8
Треонин	ТПг	Т	полярная	нейтральный	-0,7
Триптофан	Тгр		неполярная	нейтральный	-0, 9
Тирозин	Туг	Υ	полярная	нейтральный	-1,3
Валин	Уа1	V	неполярная	нейтральный	4,2

Гидрофобными аминокислотами являются: Θ, С, М, А, Р, I, Ь, V, а ароматическими аминокислотами являются Т и Гидрофобные аминокислоты могут быть удалены с концов данной последовательности или из ее середины.

Заряженными гидрофильными аминокислотами являются К, К, Ώ, Н и Е. Гидрофобные аминокислоты могут быть заменены заряженными гидрофильными аминокислотами по концам данной последовательности или в ее середине.

Одна или несколько заряженных аминокислот могут быть встроены у Ν-конца данной последовательности. Положительно заряженную аминокислоту преимущественно встраивают или заменяют у одного конца, а отрицательно заряженную аминокислоту встраивают/заменяют у другого конца с образованием заряженного диполя.

Модификация родительской последовательности не должна оказывать значительного влияния на связывание пептида с пептид-связывающей бороздкой молекулы МНС и на его способность распознаваться Т-клетками или действовать как апитоп (то есть связываться с молекулой МНС и презентироваться Т-клеткам без последующего процессинга антигена). Это может быть легко определено с помощью известных анализов на презентацию антигена и с использованием Т-клеточных гибридом.

В своем втором варианте, настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность

Х(аа)_п-коровая последовательность-(аа)_т, где

X представляет собой заряженный гидрофильный остаток; аа представляет собой аминокислоту; п равно целому числу от 0 до 5; т равно целому числу от 0 до 5; и коровая последовательность выбрана из нижеследующей группы пептидов, происходящих от ΤνΐΙΙ:

ьушртпм

ΤΙΙΜΥ8ΤΏΘ

ΙΆΒΥΙΒΓΗΡ

ЬПТК^Л8

- 7 027229

Ι.ΤΗΥΥΑΙ'Ύ

ΜνΤΡΡΝΟΛδ

ЬК1НРР8АУ, где указанный пептид обладает способностью связываться с молекулой МНС класса II без последующего процессинга антигена и распознается Т-клетками, специфичными к фактору VIII.

Последовательность (аа)_п или (аа)_т может представлять собой любую последовательность, состоящую из 4 и 5 аминокислот. Так, например, указанный пептид может иметь последовательность:

.ΥΙΙΝΊΜνΊΤΗΝΟΑΥ где п=3, а т=0.

В своем третьем варианте, настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность:

Υ (аа)_п-коровая последовательность-(аа)_т2, где Υ и Ζ представляют собой заряженные аминокислоты, имеющие обратную полярность; аа представляет собой аминокислоту; п равно целому числу от 0 до 5; т равно целому числу от 0 до 5; и коровая последовательность выбрана из нижеследующей группы пептидов, происходящих от ΡΥΠΕ

БУ^ОРИМ

ΙΠΜΥδΡΠΟ [А^КЬНР

ЬПРК^ЛЗ

Ι.ΤΗΥΥΑΙΆ

ΜνΤΙΒΝΟΛδ

ЬК1НРР8АА где указанный пептид обладает способностью связываться с молекулой МНС класса II без последующего процессинга антигена и распознается Т-клетками, специфичными к фактору VIII.

Так, например, для пептида ЕЭММУГЕРКрАЗК,

Υ=Ε; (аа)_п==ϋΝΊ т= 0 и Ζ Н.

Указанный пептид может содержать последовательность коровых остатков вместе с дополнительными фланкирующими последовательностями, расположенными у N и/или С-конца ((аа)_п и (аа)_т соответственно), при условии, что полученный пептид будет обладать способностью связываться с молекулой МНС класса II без последующего процессинга антигена.

Фланкирующие Ν- и/или С-концевые последовательности могут происходить от последовательностей, фланкирующих последовательности коровых остатков в человеческом ΡνίΠ.

АРРЗ

Различные системы презентации, не зависимые от процессинга антигена (АРШЗ), являются известными и включают:

a) фиксированные АПК (в присутствии или в отсутствие антител против СЭ28);

b) липидные мембраны, содержащие молекулы МНС класса I или II (в присутствии или в отсутствие антител против СЭ28) и

c) очищенные природные или рекомбинантные МНС, связанные с планшетом (в присутствии или в отсутствие антител против С.П28).

Все эти системы способны презентировать антиген в комбинации с молекулой МНС, но не способны процессировать антиген. Во всех этих системах, функция процессинга либо отсутствует, либо нарушена. Это дает возможность определить, может ли пептид связываться с молекулой МНС класса I или II и презентироваться Т-клеткам без последующего процессинга антигена.

Применение фиксированных АПК для изучения Т-клеточных ответов хорошо известно; так, например, они применялись в исследовании минимального эпитопа в полипептиде, проводимого путем измерения ответов на усеченные пептиды (РайсЫШ е! а1. (1996) Ш!. Iттиηο1. 8:1035-1043). АПК могут быть фиксированы с использованием, например, формальдегида (обычно параформальдегида) или глутаральдегида.

Липидные мембраны (которые могут представлять собой плоские мембраны или липосомы) могут быть получены с использованием искусственных липидов, либо они могут представлять собой плазматические мембранные/микросомные фракции АПК.

При таком применении, АРРЗ могут быть нанесены на лунки планшетов для культивирования тканей. Затем в эти лунки добавляют пептидные антигены и связывание пептида с МНС-частью АРРЗ детектируют путем добавления отобранных Т-клеточных линий или клонов. Активация Т-клеточных линий или клонов может быть определена любым из известных методов, например, посредством включения ³Н-тимидина или секреции цитокинов.

- 8 027229

Фактор VIII

Коровая последовательность пептида согласно изобретению происходит от фактора VIII. Одна или две фланкирующих последовательности ((аа)_п и (аа)_т) также могут происходить от фактора VIII.

Фактор VIII участвует во внутреннем пути свертывания крови; причем фактор VIII является кофактором для фактора Ка, который в присутствии Са'² и фосфолипидов превращает фактор X в активированную форму Ха.

Ген фактора VIII продуцирует два альтернативно сплайсированных транскрипта. Вариант транскрипта 1 кодирует крупный гликопротеин, изоформу а, который циркулирует в плазме и ассоциируется с фактором фон Виллебранда в нековалентном комплексе. Этот белок подвергается множеству событий расщепления. Вариант транскрипта 2 кодирует предполагаемый небольшой белок, изоформу Ь, который состоит, главным образом, из фосфолипид-связывающего домена фактора УШе. Этот связывающий домен играет главную роль в активности свертывания крови.

Полноразмерная последовательность гена человеческого фактора VIII, состоящая из 186000 пар оснований, была выявлена в середине 1980-х годов (СйзсЫег с1 а1. (1984). Ыа1иге 312:326-330). В это же самое время, клоны ДНК, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность, состоящую из 2351 аминокислот, были использованы для продуцирования биологически активного фактора VIII в культивированных клетках млекопитающих (\7ооб е1 а1. (1984). №-11иге 312:330-337). Полноразмерная аминокислотная последовательность человеческого фактора VIII, состоящая из 2351 аминокислоты, представлена в 8ЕО ГО Νο. 1.

Коровью остатки пептида согласно изобретению происходят от фактора VIII. Фланкирующая(ие) последовательность(и) также может (могут), но необязательно, происходить от фактора VIII, если она (они) является(ются) такой(ими) же, как последовательности, фланкирующие коровую последовательность в нативном полипептиде ΡΎΣΗ. Эта последовательность была получена или может быть получена в результате расщепления последовательности фактора VIII.

Растворимость

Пептид согласно первому варианту изобретения представляет собой модифицированную форму одного из следующих пептидов:

СТ^МVΡΡСNV^88СI

Τ^Τ^ΗΚΡI^^ΡΑVΡ^

ЗЬУВрРПМУЗШС

РРПАКУЖЬНРТНУ ρρι ,ι ,ίήυι ,нп ιρο8\υ МНТVNСΥVNΚ8^РС^

ЬеррЬЬРСШББНрН

ЦТЬЬПРК^АЗКРУ

ΡΡ('ΡΤΡΥΥ88ΓΎΝ\1Ρ

ТΕNI^ΚΡ^ΡNΡАСV^ ^NIМVТΡΚN^А8ΚРΥ ΡΥΡΡΡ 1РС)8\\'\! ГОРА

Уже было показано, что эти пептиды действуют как апитопы и являются толерогенными ίη νίνο (см. примеры и Международную патентную заявку № РСТ/СВ 2008/003996).

В последнее время стало очевидным, что растворимость имеет важное значение для индуцирования пептидопосредованной толерантности. Растворимость может быть улучшена одним или несколькими способами, а именно путем:

(ί) удаления одного или нескольких гидрофобных остатков;

(ίί) добавления/замены одного или более заряженных гидрофильных остатков, (ίίί) введения положительно или отрицательно заряженных аминокислот у любого конца для создания заряженного диполя.

Модифицированный пептид может иметь лучшую растворимость, чем родительский (немодифицированный) пептид. Модифицированный пептид может иметь растворимость, которая в 2, 3, 4 или 5 раз превышает растворимость родительского пептида. Пептид может быть растворимым при концентрациях до 0,5, 1 или 5 мг/мл.

Толерантность

Т-клеточные эпитопы играют центральную роль в адаптивном иммунном ответе на любой антиген, как на свой, так и на чужеродный. Центральная роль, которую играют Т-клеточные эпитопы в развитии заболеваний, ассоциированных с гиперчувствительностью (например, аллергии, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантата), была продемонстрирована на экспериментальных моделях. Воспалителные или аллергические заболевания могут быть индуцированы путем инъекции синтетических пептидов (полученных на основе структуры Т-клеточных эпитопов) в комбинации с адъювантом.

В противоположность этому было показано, что может быть индуцирована иммунологическая толерантность по отношению к конкретным антигенам путем введения пептидных эпитопов в растворимой форме. Введение растворимых пептидных антигенов было продемонстрировано как эффективное сред- 9 027229 ство подавления симптомов заболевания у экспериментальной модели аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ - модели рассеянного склероза (РС) (МеШет аиб УтайН (1993) Ιηΐ. 1ттипо1. 5:1159-1165; Ьш аиб Угайй (1995) Ιηΐ. 1ттиио1. 7:1255-1263; ЛибегЮи аиб Утайй (1998) Еиг. 1. 1ттиио1. 28:1251-1261); и у экспериментальных моделей артрита, диабета и увеоретинита (см. выше, в обзоре Аибейои аиб Утайй (1998)). Было также продемонстрировано, что указанные растворимые пептидные антигены могут быть использованы как средства для лечения хронического заболевания у моделей с ЭАЭ (Либепои аиб Утайй (1998), см. выше).

Толерантность означает отсутствие ответа на антиген. Толерантность к аутоантигенам является главным свойством иммунной системы, и при потере такой толерантности может развиваться аутоиммунное заболевание. Адаптивная иммунная система должна поддерживать способность организма отвечать на воздействие огромного количества инфекционных агентов, но, при этом, избегать аутоиммунной атаки на аутоантигены, присутствующие в собственных тканях организма. Этот процесс в значительной степени контролируется восприимчивостью незрелых Т-лимфоцитов к апоптотической гибели клеток в тимусе (центральная толерантность). Однако, не все аутоантигены детектируются в тимусе, а поэтому аутореактивные тимоциты полностью не уничтожаются. Существуют также механизмы, посредством которых толерантность может приобретаться благодаря зрелым аутореактивным Т-лимфоцитам в периферических тканях (периферическая толерантность). Описание механизмов центральной и периферической толерантности приводится в публикации ЛибегЮи еΐ а1. (1999) (1ттиио1од1еа1 РеОе\\ъ 169:123-137).

При гемофилии А, у пациентов наблюдается дефицит гена фактора VIII. Это означает, что фактор VIII не распознается иммунной системой как свой антиген. Если фактор VIII связывания крови вводят во время проведения заместительной терапии, то против этого фактора вырабатывается аллоиммунный ответ как на чужеродный белок, что приводит к продуцированию антител-ингибиторов РУШ.

Пептиды согласно изобретению обладают способностью индуцировать толерантность к фактору VIII, в результате чего, при терапевтическом введении РУШ, иммунный ответ на него не индуцируется, а следовательно, и не продуцируются ингибиторы РУН!

Приобретенная гемофилия представляет собой аутоиммунное заболевание, при котором нарушается толерантность к фактору VIII. В этом случае, пептиды согласно изобретению могут быть введены для восстановления толерантности к этому аутологичному белку и для ослабления патогенного иммунного ответа.

Толерантность может развиваться в результате индуцирования или характеризоваться индуцированием анергии, по меньшей мере, во фракции СЭ4⁺-Т-клеток. Для активации Т-клеток, пептид должен ассоциироваться с профессиональными АПК, способными передавать Т-клеткам два сигнала. Первый сигнал (сигнал 1) передается комплексом МНС-пептид, присутствующим на поверхности АПК, и принимается Т-клетками через ТСР. Второй сигнал (сигнал 2) передается ко-стимулирующими молекулами, присутствующими на поверхности АПК, такими как СЭ80 и С.П86. и принимается молекулой 0028, присутствующей на поверхности Т-клеток. Очевидно, что если Т-клетки принимают сигнал 1 в отсутствие сигнала 2, то они не активируются и, фактически, становятся анергическими. Анергические Т-клетки являются невосприимчивыми к последующей антигенной стимуляции и могут обладать способностью подавлять другие иммунные ответы. Считается, что анергические Т-клетки участвуют в опосредованном сообщении Т-клеточной толерантности.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения лишь высказывают предположение, что пептиды, которые требуют процессинга перед их презентацией в комбинации с молекулами МНС, не будут индуцировать толерантность, поскольку они процессируются зрелыми антигенпрезентирующими клетками. Зрелые антигенпрезентирующие клетки (такие как макрофаги, В-клетки и дендритные клетки) способны осуществлять процессинг антигена, а также передавать сигналы 1 и 2 Тклеткам, что будет приводить к активации Т-клеток. С другой стороны, апитопы способны связываться с МНС класса II на незрелых АПК. Таким образом, они будут презентироваться Т-клеткам без костимуляции, что будет приводить к анергии Т-клеток и сообщению им толерантности.

Совершенно очевидно, что апитопы также способны связываться с молекулами МНС на клеточной поверхности зрелых АПК. Однако, в иммунной системе, количество незрелых АПК значительно превышает количество зрелых АПК (было высказано предположение, что активированными являются менее чем 10% дендритных клеток, §иттет8 еΐ а1. (2001) Ат. 1. Райо1. 159: 285-295). Поэтому состояние дефицита апитопов будет скорее указывать на анергию/толерантность, чем на активацию. Мониторинг индуцирования толерантности к РУШ ш уйо может быть проведен путем определения снижения уровня: (ί) РШЦ-ингибирующих антител, (ίί) РVШ-специфических СО4⁺-Т-клеток, (ίίί) В-клеток, способных секретировать РVШ-ингибирующие антитела, методами, известными специалистам.

Было показано, что если толерантность индуцируется введением пептидов, то способность ангигенспецифических СП4'-Т-клеток к пролиферации снижается. Кроме того, продуцирование Ш-2, ΣΕΝ-γ и Ш4 этими клетками ингибируется, а продуцирование Ш-10 повышается. Было показано, что нейтрализация Ю-10 у мышей с толерантностью, индуцированной пептидом, приводит к полному восстановлению восприимчивости к заболеванию. Было высказано предположение, что популяция регуляторных клеток в толерантном состоянии сохраняется, что приводит к продуцированию Ю-10 и к опосредованию иммун- 10 027229 ной регуляции (ВигкЬай е! а1. (1999) Ιηί. 1ттипо1. 11:1625-1634).

Поэтому мониторинг индуцирования толерантности может быть также проведен различными способами, включая:

(a) индуцирование анергии СИ4⁺-Т-клеток (которое может быть детектировано путем последующей стимуляции фактором РУШ ίη νίίτο);

(b) изменение популяции СО4'-Т-клеток. включая:

(ί) снижение пролиферации клеток;

(ίί) ингибирование продуцирования 1Ь-2, ΙΡΝ-γ и 1Ь-4; и (ίίί) повышение уровня продуцирования 1Ь-10.

Используемый здесь термин толерогенный означает способный индуцировать толерантность.

Композиция

Настоящее изобретение также относится к композиции, такой как фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько пептидов согласно изобретению.

Указанный пептид может содержать множество пептидов, например, два, три, четыре, пять или шесть пептидов.

Композиция согласно изобретению может быть использована в профилактических или терапевтических целях.

Указанная композиция, при ее введении в профилактических целях, может снижать или предотвращать вырабатывание иммунного ответа на РУШ. Уровень такого иммунного ответа должен быть меньше уровня иммунного ответа, наблюдаемого у пациента, который не был подвергнут лечению указанной композицией. Термин снижать указывает на частичное снижение наблюдаемого иммунного ответа, а именно на 50, 70, 80 или 90% снижение иммунного ответа у пациента, по сравнению с пациентом, который не был подвергнут лечению указанной композицией (или ответа, наблюдаемого у пациента, который не подвергался лечению в тот же самый период времени). Термин предупреждать означает устранить вырабатывание какого-либо заметного иммунного ответа на РУШ.

Указанная композиция, при ее введении в терапевтических целях, может подавлять уже имеющийся иммунный ответ на РУШ. Термин подавлять означает уменьшить уровень уже имеющегося иммунного ответа по сравнению с уровнем, наблюдаемым до лечения указанным пептидом, или уменьшить уровень иммунного ответа, наблюдаемого у пациента, не подвергавшегося лечению в тот же самый период времени.

Лечение композицией согласно изобретению может приводить к снижению уровней любого или всех из нижеследующих антител или клеток:

(ί) РУШ-ингибирующих антител, (ίί) РУШ-специфических СИ4⁺-Т-клеток, (ίίί) В-клеток, способных секретировать РУШ-ингибирующие антитела.

Детектирование всех этих факторов может быть осуществлено методами, известными специалистам, такими как ЕЫ§А, РАС8 и т.п.

Лечение с применением композиции согласно изобретению может также, или альтернативно, вызывать анергию СИ4⁺-Т-клеток, специфичных к РУШ. Анергия может быть детектирована, например, путем последующей стимуляции фактором РУШ ίη νίίτο.

Важно иметь в виду, что не все иммунные ответы на РУШ являются патогенными. Неингибирующие анти-РУШ антитела могут присутствовать у пациентов с неингибиторной гемофилией (Могеаи е! а1. (2000) В1ооб 95:3435-41) и приблизительно у 15% здоровых доноров крови (А1§1тап е! а1. (1992) 89:37959).

Ингибиторы РУШ могут быть детектированы с помощью теста Нимеджен (№)тедеп), который является модификацией Бетезда-теста на свертывание крови, и в котором оценивают способность РУШ, взятого из плазмы пациента, инактивироваться в нормальной плазме. Единица Бетезда (ВИ) определяется как количество антитела, которое нейтрализует 50% активности РУШ в плазме, и титры 0,6 ВИ или более, предположительно, указывают на присутствие антитела.

Ингибиторы обычно классифицируются как ингибиторы с низким титром, если их уровень составляет <5 ВИ, и ингибиторы с высоким титром, если их уровень составляет >5 ВИ.

Уровень РУШ-ингибирующих антител в кровотоке может быть снижен на 90%, 75%, 50%, 20%, 10%, 5% по сравнению с уровнем антител, наблюдаемых у пациента, не проходившего лечение.

Уровень РУШ-ингибирующих антител в кровотоке может быть снижен до 5, 4, 3, 2, 1 или 0,5 ВИ.

Пептиды и композиция согласно изобретению могут повышать количество или уровень терапевтически вводимого РУШ, который способствует улучшению свертываемости крови у пациента. Это обусловлено снижением уровня ингибиторов РУШ, которые могут эффективно инактивировать часть РУШ в результате воздействия на его терапевтическую функцию. Указанные пептиды или композиции согласно изобретению могут повышать количество имеющегося РУШ, например, на 10, 25, 50 75 или 100%.

Пептиды и композиция согласно изобретению позволяют также снижать количество РУШ, которое необходимо для его введения в целях улучшения свертываемости крови.

- 11 027229

Препараты

Композиция может быть получена в виде жидкого раствора или суспензии для инъекций, а также в твердой форме, подходящей для получения раствора или суспензии в жидкой форме перед инъекцией. Полученный препарат может быть эмульгирован, либо пептиды могут быть инкапсулированы в липосомах. Активные ингредиенты могут быть смешаны с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, физиологический раствор (например, забуференный фосфатом физиологический раствор), декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации.

Кроме того, при желании, указанная композиция может содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты и/или рН-забуферивающие агенты. Забуферивающими солями являются фосфат, цитрат, ацетат. Для коррекции рН могут быть использованы соляная кислота и/или гидроксид натрия. Для стабилизации могут быть использованы дисахариды, такие как сахароза или трегалоза.

Если композиция содержит множество пептидов, то относительное содержание таких пептидов может быть приблизительно одинаковым. Альтернативно, относительное содержание каждого пептида может быть изменено, например, в соответствии с толерогенным ответом на конкретную субпопуляцию аутореактивных Т-клеток, или в случае, когда было обнаружено, что один пептид действует лучше, чем другие пептиды в НЬА конкретного типа.

Композиция, после ее приготовления, может быть введена в стерильный контейнер, который затем герметично закрывают или хранят при низкой температуре, например, при 4°С, либо подвергают лиофилизации.

Обычно, композицию получают в виде лиофилизованнного (осушенного вымораживанием) порошка. Лиофилизация позволяет осуществлять длительное хранение препарата в стабилизированной форме. Процедуры лиофилизации хорошо известны специалистам, см., например, ййр://№№№.беу1сейпк.сот/туф/агсЙ1уе/97/01/006.й1т1. Перед лиофилизацией обычно вводят наполнители, такие как маннит, декстран или глицин.

Композиция может быть введена стандартным методом, например, перорально, внутривенно (в случае растворимого в воде препарата), внутримышечно, подкожно, подъязычно, интраназально, внутрикожно или в виде суппозиториев или имплантатов (например, в случае молекул пролонгированного высвобождения).

Композиция может быть преимущественно введена интраназально, подкожно или внутрикожно.

Пептид и композиция согласно изобретению могут быть использованы для лечения человека. Указанный индивидуум может страдать гемофилией А, а в частности гемофилией А в тяжелой форме. У такого индивидуума может наблюдаться дефицит РУШ на генетическом уровне. Указанный индивидуум может страдать приобретенной гемофилией. Указанный индивидуум может иметь ингибирующие антиРУШ антитела.

Указанный индивидуум может быть подвергнут заместительной терапии с введением коагулянта РУШ или он может быть направлен на проведение такой терапии.

Указанный индивидуум может быть подвергнут генной терапии с введением гена РУШ или он может быть направлен на проведение такой терапии.

Указанный индивидуум может иметь НЬА-гаплотип, который ассоциируется с предрасположенностью к вырабатыванию ингибирующих анти-РУШ аллоантител или аутоантител. У такого индивидуума может экспрессироваться НЬА-ОК2. Методы определения НЬА-гаплотипа у индивидуума известны специалистам.

Обычно, врач может самостоятельно определить фактическую дозу, которая будет наиболее подходящей для данного индивидуума, и такая доза может варьироваться в зависимости от возраста, массы тела и ответа данного пациента.

В предпочтительном варианте изобретения может быть использована схема увеличения доз, в которой пациенту вводят множество доз в возрастающих концентрациях. Такой подход был применен, например, для пептидов фосфолипазы А2 при иммунотерапии, направленной на лечение аллергии на пчелиный яд (Мийет е! а1. (1998) 1. Айетду Сйп 1ттипо1. 101:747-754 и ΛΜί8 е! а1. (1998) 1. Сйп. 1пуе81. 102:98-106).

Наборы

Обычно, если композиция содержит множество пептидов, то они могут быть введены в комбинации друг с другом в форме смешанной композиции или коктейля. Однако в некоторых случаях предпочтительнее получать пептиды по отдельности в виде набора, предназначенного для одновременного, раздельного, последовательного или комбинированного введения.

Набор может также включать приспособления для смешивания и/или введения (например, паровой ингалятор для интраназального введения или шприц и иглу для подкожного/интрадермального введения доз). Указанный набор может также содержать инструкции по его применению.

Фармацевтическая композиция или набор согласно изобретению могут быть использованы для лечения и/или предупреждения заболевания.

- 12 027229

В частности, указанная композиция/указанный набор могут быть использованы для лечения и/или предупреждения гемофилии А или приобретенной гемофилии.

Гемофилия А

Гемофилия А (классическая гемофилия) вызывается дефицитом фактора VIII.

По оценкам специалистов, гемофилией А страдает один из 10000 мужчин, а гемофилией В страдает один из 40000 мужчин. Кроме того, одна из 5000 женщин является носителем гена гемофилии А, и одна из 20000 женщин является носителем гена гемофилии В.

Гемофилия, в зависимости от уровня фактора свертывания крови, обычно подразделяется на три класса: тяжелая гемофилия, гемофилия средней тяжести и гемофилия в легкой форме. При тяжелой форме гемофилии, уровень фактора свертывания крови составляет менее, чем 1%. Степень тяжести такого заболевания имеет тенденцию передаваться от поколения к поколению.

Вопреки широко распространенному мнению, небольшие порезы и раны обычно не представляют серьезной угрозы для больных гемофилией. Наибольшую опасность представляют спонтанные кровотечения в суставы и мышцы. Такие явления чаще всего возникают в период быстрого роста организма, обычно у детей в возрасте от 5 до 15 лет.

Повторные спонтанные кровотечения в суставы могут вызывать артрит, в результате чего соседние мышцы становятся более слабыми. Сдавливание нервов, вызываемое накоплением крови, может приводить к возникновению болей, к окоченению и к временной обездвиженности пораженных участков.

Гемофилию А обычно диагностируют путем взятия пробы крови для того, чтобы определить эффективность свертывания крови и выявить, являются ли уровни факторов свертывания крови аномальными.

Получение очищенных факторов свертывания крови в 1970-х годах, выделенных у доноров крови, значительно улучшает долгосрочный прогноз развития гемофилии. Гемофилия в легкой форме или гемофилия средней тяжести может быть подвергнута лечению фактором ΡνΐΙΙ на аД йос-основе, тогда как тяжелая гемофилия может требовать регулярного постоянного лечения.

Ранее пациентам вводили концентраты фактора VIII, собранные у нескольких тысяч доноров плазмы. Это лечение было связано с серьезными проблемами заражения вирусными патогенами, а в частности вирусом иммунодефицита и гепатита. Методы очистки моноклональных антител, термоинактивация и обработка вирицидными детергентами позволяют получить относительно безопасные концентраты плазмы.

Современные методы рекомбинантных ДНК позволяют получить серию синтетических продуктов, таких как рекомбинат™ и когенат™. Когенат получают из клеток почек детенышей хомячка, экспрессирующих человеческий фактор VIII. Полученный фактор имеет высокую степень очистки, что исключает любую вероятность переноса вируса из плазмы.

Пептид или композиция согласно изобретению могут быть введены до и/или во время проведения заместительной терапии с введением фактора VIII.

Гемофилия А является идеальной мишенью для проведения генотерапии, поскольку ί) она вызывется мутациями в одном идентифицированном гене, и) небольшое увеличение уровней фактора свертывания крови ίη νίνο может превращать тяжелую форму гемофилии в более легкую форму и ίίί) современные методы заместительной терапии являются недостаточно эффективными. Кроме того, для обеспечения достаточно надежной безопасности необходимо, чтобы уровень коагулирующей активности превышал желаемый уровень такой активности.

К сожалению, в настоящее время многообещающие перспективы генной терапии как способа лечения гемофилии пока еще не были реализованы, что, главным образом, обусловлено трудностями получения системы доставки генов, которая была бы достаточно неиммуногенной и позволяла бы осуществлять длительную экспрессию фактора свертывания крови.

Пептиды согласно изобретению могут быть также использованы для сообщения индивидууму толерантности перед проведением генотерапии путем введения фактора VIII и/или предотвращение образования ингибитора РЩП у пациента после проведения генотерапии.

Приобретенная гемофилия

Приобретенная гемофилия характеризуется присутствием РЩП-ингибирующих аутоантител, направленных против, у индивидуумов, у которых ранее наблюдалось нормальное свертывание крови. Приобретенная гемофилия представляет собой редкое заболевание, которое, по оценкам специалистов, ежегодно диагностируется у 1-3 человек на миллион. Смертность пациентов с приобретенной гемофилией, характеризующейся присутствием аутоантител-ингибиторов, составляет почти 25%, по сравнению со значительно более низким риском летального исхода у пациентов, у которых обнаруживаются аллоантитела.

По сравнению с гемофилией, при которой продуцируются аллоантитела-ингибиторы, приобретенная гемофилия характеризуется: (1) более тяжелой формой кровотечений; (2) более частой встречаемостью этого заболевания у пожилых людей; (3) взаимосвязью с неидентифицированными аутоиммунными заболеваниями, лимфопролиферативными заболеваниями или злокачественными солидными опухолями, с беременностью и с применением некоторых антибиотиков, таких как пенициллин и сульфонамиды,

- 13 027229 приблизительно в 50% случаях; и (4) с ΐη νΐίΓο ингибиторной активностью, которая соответствует фармакокинетическому профилю типа II с неполной нейтрализацией активности нужного фактора свертывания крови под действием аутоантител, обычно обусловленной остаточными уровнями фактора VIII в плазме пациента, варьирующимися в пределах 2-18%.

Пептид или композиция согласно изобретению могут быть введены пациенту с приобретенной гемофилией или пациенту с риском развития у него приобретенной гемофилии, вызываемой, например:

ΐ) вынужденным лечением, например, пенициллином или сульфонамидом, ΐΐ) прогрессированием опухоли или другого злокачественного образования, ΐΐΐ) беременностью с угрозой ее прерывания или беременностью на ранних сроках.

Настоящее изобретение более подробно описано в примерах, которые могут служить дополнительной информацией для среднего специалиста в данной области, и которые не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Примеры

Пример 1. Отбор пептидов фактора VIII по связыванию с ПРА-ОП2

Серию 15-мерных пептидов РОУШ сравнивали с использованием трех алгоритмов связывания с 1П.А-1Ж: δΥΡΡΕΓΓΗΣ (1Шр:/Лу\у\у.8у1реП1ч.с1е/Иоте.1Дт) РгоРгеб (Иир:/Лу\у\у.пШес1тгс8.пР1лу1к1Уа/ргоргсс1Л и ΠΉΒ (Иир:/Лу\у\у.пптш1еерПоре.о1'шИоте.с1о). Были отобраны пептиды, которые, предположительно, связываются с НЬА-ОК2, как было определено с помощью более, чем одной программы, и были сконструированы фланкирующие последовательности для предполагаемых коровых остатков (табл. 2).

Таблица 2

Пептид №	Положение первой аминокислоты Р\/1П	Аминокислотная последовательность, записанная однобуквенным кодом	Также обозначаемая здесь как
1	2140	ΟΤΕΜνΡΡΟΝνϋδδΟΙ	СПАМУ
2	0208	ТрТЬНКРЦАРАУРО	тртьн
3	2114	δΡΥϊδρριίΜΥδΡϋο	δίΥΙδ
4	2161	ΡΡΙΙΑΚ.ΥΙΚΕΗΡΤΗΥ	РРПА
5	2318	ΡΡΙΑΤΚΥΡΚΙΗΡρδΨ	РР1АТ
6	250	ΜΗΤνΝΟΥνΝΚδΡΡΟΡ	ΜΗΤΥΝ
7	322	ΕΟρΡΙΑΡϋΗΙδδΗρΗ	ЕОЦРЕ
8	478	ϋΤΕΕΙΙΡΚΝ(2ΑδΚΡΥ	ОТЬЫ
9	545	ΡΚΧΧΤΚΎΥδδΡνΝΜΕ	РКСЬТ
10	607	ΤΕΝΙ(2ΚΡΡΡΝΡΑ0νρ	ΤΕΝΚ}
11	1788	ϋΝΙΜνΤΡΚΝρΑδΚΡΥ	ϋΝΙΜν
12	2322	КУЫПНРС^УХАКДА	КАЬК.!

Пример 2. Исследование ответа НЬА-ОК2-рестриктированных клеток, взятых у мышей, иммунизованных фактором VIII, на введение пептидов

НЬА-ОК2-трансгенных мышей иммунизовали человеческим фактором VIII в адъюванте. Затем брали дренирующие клетки лимфоузлов и повторно стимулировали ΐη νΐίΐΌ различными концентрациями 12 пептидов, представленными в табл. 2. Результаты приводятся на фиг. 1.

НЬА-ОК2-рестриктированные клетки мышей, иммунизованных фактором VIII, давали явно выраженный сильный ответ на пептид ОШМУ (положение 1-ой аминокислоты 1788). Эти мыши также давали ответ на пептиды РПСРТ (545) и РРПА (2161).

Пример 3. Исследование ответа Т-клеток НЬА-ОК2-мышей на пептиды

Сначала, НЬА-ОК2-мыши были иммунизованы фактором VIII в адъюванте. Клетки селезенки, взятые у иммунизованных мышей, повторно стимулировали ΐη νΐίΐΌ фактором VIII, и полученные лимфобласты подвергали слиянию с тимомой В^5147 с использованием полиэтиленгликоля.

Т-клеточные гибридомы отбирали в среде НАТ, а затем эти гибридомы клонировали и тестировали на их ответ на фактор VIII. Затем гибридомы скринировали на их ответ на 12 предсказанных пептидов. Из 27 скринированных гибридом, 11 гибридом отвечали на ОШМУ, 3 гибридомы отвечали на РРСРТ и 3 гибридомы отвечали на РРПА, хотя ответ на РРПА был более слабым и менее специфичным. Ответ двух гибридом, специфичных к ОШМУ и РКСЬТ, показан на фиг. 2.

Пример 4. Исследование ответа клеток лимфоузлов, взятых у ΡVΠI-^Κ2⁺-мышей, на пептиды

НЬА-0К2-трансгенных мышей скрещивали с мышами, дефицитными по фактору VIII, в результате чего получали животных с моделью гемофилии, у которых экспрессировалась молекула МНС человеческого НЬА класса II.

Этих ΡVΠI-^Κ2⁺-животных иммунизовали фактором VIII в адъюванте. Дренирующие лимфоузлы выделяли и тестировали на их ответ на серию пептидов. Как показано на фиг. 3, эти клетки давали явно выраженный ответ на РРСРТ и ОШМУ. Ответ на ОТРМУ был слабо выраженным, а ответ на РУ1.Р! был более ярко выраженным.

Пример 5. Исследование ответа Т-клеток, взятых у ΡVΠI-^Κ2⁺-мышей, на пептиды

Дефицитных по фактору VIII мышей, у которых экспрессировались НЬА-ЭК2, иммунизовали фактором VIII в адъюванте. Клетки селезенки, взятые у иммунизованных мышей, повторно стимулировали

- 14 027229 ίη νίίΓΟ фактором VIII, и полученные лимфобласты подвергали слиянию с В^5147, как описано выше. Тклеточные гибридомы скринировали на их ответ на 12 предсказанных пептидов. И в этом случае, большинство гибридом отвечали на пептиды ΌΝΙΜν и РКСЬТ. Из 19 гибридом, специфичных к фактору VIII, 10 гибридом отвечали на ΌΝΙΜν, 6 гибридом отвечали на РКСЬТ, 1 гибридома отвечала на ΡΡΙΙΑ, 1 гибридома отвечала на ГОУГО и 1 гибридома отвечала на ОТЬЫ Примеры ответов этих гибридом представлены на фиг. 4.

На основе этих экспериментов был сделан вывод, что два пептида ΌΝΣΜν (положение первой аминокислоты 1788) и РКСЬТ (положение первой аминокислоты 545) составляют иммунодоминантные Тклеточные эпитопы в НЬА-ОК2-рестриктированных Т-клетках, отвечающих на человеческий фактор VIII.

Пример 6. ΌΜΜν и РКСЬТ действуют как апитопы

Апитопом считается такой пептид, который должен обладать способностью связываться с молекулой МНС класса I или II без последующего процессинга антигена (то есть, без его усечения) и презентироваться Т-клеткам. В данном случае была исследована способность пептидов презентироваться фиксированными АПК.

Клетки Мдаг использовали либо в свежем виде, либо в виде препарата, фиксированного 1% параформальдегидом. Клоны тестировали на антигенную специфичность путем культивирования 100 мкл гибридомных клеток с 5х 10⁴ клеток Мдаг в отсутствие и в присутствии 20 мкг/мл тЬРУШ или пептидных эпитопов в течение ночи. Затем супернатанты собирали и оценивали на продуцирование ГО-2 с помощью ЕЬГОА. Тот факт, что тЬРУШ должен презентироваться живыми клетками Мдаг, указывал на то, что интактному белку, для его презентации, необходим процессинг антигена. С другой стороны, пептиды ΌΝΕΜν и РКСЬТ презентируются живыми и фиксированными клетками Мдаг, что указывает на то, что эти пептиды действуют как апитопы (фиг. 5).

Пример 7. Определение серии пептидных эпитопов, способных действовать как апитопы

Серию пептидных эпитопов, способных действовать как апитопы в последовательностях, окружающих ΌΝ!Μν. РКСЬТ и другие пептиды, идентифицировали путем получения серии перекрывающихся пептидов (как показано на стр. 36-37) и скрининга этих пептидов с использованием Т-клеточных гибридом методом, описанным в примере 5 (фиг. 7).

Пример 8. ΌΜΜν и РКСЬТ индуцируют толерантность ко всему белку фактора VIII

НЬА-ОК2-трансгенных мышей, перед их иммунизацией фактором VIII в адъюванте, обрабатывали либо двумя растворимыми пептидами, либо РВ§, используемым в качестве контроля. Затем дренирующие лимфоузлы выделяли, и клетки повторно стимулировали ίη νίίτο белком фактора VIII для оценки иммунного статуса мышей. Как показано на фиг. 6, обработка мышей пептидами ΌΜΜν или РКСЬТ приводила к значительному подавлению иммунного ответа на фактор VIII.

Пример 9. Исследование на способность ΌΜΜν и РКСЬТ индуцировать толерантность у мышей с дефицитом фактора VIII

Как видно из примера 8, эти два пептида обладают способностью предупреждать вырабатывание иммунного ответа на фактор VIII у мышей, у которых экспрессируется эндогенный фактор VIII. Этот эксперимент повторяли на РУ1П-ОК2⁺-животных для того, чтобы определить, могут ли такие пептиды также предупреждать вырабатывание иммунного ответа на фактор VIII у мышей, дефицитных по фактору VIII.

Пример 10. Исследование на способность пептидов ΌΝΙΜν и РКСЬТ, взятых в комбинации друг с другом, индуцировать толерантность у мышей с дефицитом фактора VIII

Два пептида, каждый из которых, как было показано в примере 9, снижает иммунный ответ на фактор VIII у мышей, дефицитных по фактору VIII, объединяли. Как показано на фиг. 8, обработка мышей пептидами ΌΜΜν и РКСЬТ приводила к значительному подавлению иммунного ответа на фактор VIII, на что указывало снижение уровня продуцирования ГОК-гамма. ГОК-гамма представляет собой главный лимфокин класса белков-переключателей, и необходим для нейтрализации антител у мышей. Полученный эффект значительно превышал эффект, наблюдаемый с использованием любого одного пептида.

Пример 11. Индуцирование толерантности с использованием модифицированного пептида

Пептид ΌΜΜν является частично, но не полностью растворимым. Для улучшения растворимости этого пептида был сконструирован его модифицированный вариант, который имел следующую последовательность: Ε^NIΜVТΡКN^Α§К.

Этот пептид был удлинен у его Ν-конца путем добавления заряженного гидрофильного остатка. Он был также усечен по С-концу путем удаления пролиновых и тирозиновых остатков. Кроме того, путем введения положительно и отрицательно заряженных аминокислот у любого конца пептида был получен заряженный диполь, который, как сообщалось, способствовал повышению растворимости.

Этот модифицированный пептид обладает лучшей растворимостью, чем пептид ΌΝ^ν, и растворимостью, достаточной для его интраназальной доставки. Для оценки индуцирования толерантности с использованием такого пептидного эпитопа, были взяты мыши, дефицитные по ΡΥΠΕ и половина из них была обработана модифицированным пептидом ΕΌΜΜν (называемым далее толерогенным и показанным на фиг. 9). Затем мышей иммунизовали пептидом ΌΝ!Μν в СРА, и через 10 дней брали дрени- 15 027229 рующие лимфоузлы, после чего их стимулировали ίη νίίτο пептидом или БЭ^МХ. На фиг. 9 представлены результаты исследования ответов у ранее не обработанных мышей или у мышей, которым была сообщена толерантность после стимуляции пептидами ^NIМV или Ε^NIМV ίη νίίτο.

Полученные результаты продемонстрировали, что пептид Ε^NIМV способен продуцировать вторичный иммунный ответ у мышей, иммунизованных пептидом ^NIМV. Кроме того, полученные результаты со всей очевидностью продемонстрировали, что у мышей с толерантностью, сообщенной пептидом Ε^NIМV. не вырабатывался иммунный ответ на ^NIМV ίη νίνο, как было выявлено по отсутствию ответа на □N^'7 или Ε^NIМV ίη νίίτο после примирования мышей пептидом □N^'7 в СРА.

Пример 12. Ε^NIМV индуцирует толерантность ко всему белку фактора VIII

Эксперимент, описанный в примере 8, повторяли для модифицированного пептида Ε^NIМV. в результате чего было продемонстрировано, что пептид Ε^NIМV способен подавлять иммунный ответ на весь белок фактора VIII.

Методы (ί) Вторичные ответы у ОК2'-мышей, примированных гИРМЮ

Мышей с дефицитом мышиного НЬА-ЭК2⁺-локуса молекулы МНС класса II иммунизовали путем подкожного введения в основание хвоста 40 мкг гНРМШ, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда, в который было добавлено 400 мкг термоинактивированного штамма МЛиЪегси1о515 Н37Ка. Через 10 дней мышей умерщвляли и брали дренирующие лимфоузлы. Затем получали моноклеточные суспензии, и лимфоциты инкубировали при плотности 4-5х10⁵ клеток на лунку в 96-луночных плоскодонных планшетах в течение 72 ч с указанными концентрациями пептидного или контрольного антигенов, после чего на них подавали импульсы 0,5 мкКи меченного тритием тимидина/лунку в течение еще 16 ч. После этого, планшеты замораживали, а затем клетки собирали на стеклянных подушках-фильтрах и измеряли радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном β-счетчике.

(ίί) Специфичность Т-клеточных гибридом, полученных от ОК2'-мышей, к пептиду РМШ

Мышей с дефицитом мышиного НЬА-ЭК2⁺-локуса молекулы МНС класса II иммунизовали как описано выше. Через 10 дней брали дренирующие лимфоузлы, и лимфоциты культивировали при плотности 2,5x10 клеток/мл, 1 мл/лунку в 24-луночных планшетах в присутствии 20 мкг/мл ^ЙΡVIII в течение 3 дней. После такой стимуляции, лимфоциты выделяли, промывали и подвергали слиянию с клетками ТСКа'Р' Β\ν, которые являются партнерами по слиянию, в отношении 4 клетки Β\ν на 1 лимфоцит, с использованием полиэтиленгликоля, как описано в публикации №1κοη еί а1. (1980) ΡΝΑδ 77(5):2866. Слитые клетки осторожно промывали, а затем на 2 дня помещали в плоскодонные 9 6-луночные планшеты, после чего добавляли НАТ для отбора Т-клеточных гибридом. Затем проводили мониторинг клеток на их рост, и приблизительно через 10 дней после слияния, отдельные клоны отбирали и переносили в 24-луночные планшеты в среду НАТ. Клоны поддерживали в течение по меньшей мере 2 недель в среде НАТ, после чего их переносили в среду НТ, а затем в полную среду. Клоны тестировали на антигенную специфичность путем культивирования 100 мкл клеток гибридомы с 5х10⁴ клеток Мдаг в отсутствие и в присутствии 20 мкг/мл гНРМШ в течение ночи. Затем супернатанты собирали и оценивали на продуцирование ГЕ-2 с помощью ΕΕίδΑ, причем клоны, продуцирующие ГЕ-2 в ответ на гИРМШ, рассматривались как позитивные по ΡVШ-специфичности. Для определения репертуара предсказанных пептидов РАШ, РАШ-специфичные клоны снова тестировали на продуцирование ГО-2 после инкубирования в течение ночи с 20 мкг/мл каждого из 12 пептидов.

(ίίί) Вторичные ответы у Р¥ПГ^/--мышей, примированных гИРМШ

Осуществляли метод, описанный в (ί), за исключением того, что были использованы мыши с дефицитом ΡVШ, НЬА-ЭК2⁺-мышей и мыши с дефицитом мышиного МНС класса II.

(ίν) Специфичность Т-клеточных гибридом, полученных от ΡVШ^-/--мышей, к пептиду РТт

Осуществляли метод, описанный в (ίί), за исключением того, что были использованы мыши с дефицитом РVIII и НЬА-ЭК2⁺-мышей.

(ν) Сообщение толерантности к ΡVШ-специфическим ответам у ЭК2'-мышей путем предварительной обработки этих мышей иммунодоминантными пептидами РТт

Мышей с дефицитом мышиного НЬА-ЭК2⁺-локуса молекулы МНС класса II три раза обрабатывали 100 мкг пептидов ^NIМV. РКСЬТ или РРПА, растворенных в ΡΒδ, или эквивалентным объемом отдельно взятого ΡΒδ. Пептиды вводили внутрибрюшинно с интервалом между каждой дозой в 3-4 дня. После последнего введения, мышей примировали фактором ^ЙΡVIII. эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда, как описано в стадии (ί). Через 10 дней, дренирующие лимфоузлы выделяли, а затем лимфоциты культивировали ίη νίίτο с гНРМШ, или с каждым из толерогенных пептидов, а также с контрольными антигенами в течение 72 ч с последующим добавлением меченного тритием тимидина, как описано в стадии (ί).

(νί) Сообщение толерантности к ΡVШ-специфическим ответам у ЭК2'-мышей путем предварительной обработки этих мышей комбинацией иммунодоминантных пептидов РТт

Мышей с дефицитом мышиного НЬА-ЭК2⁺-локуса молекулы МНС класса II три раза обрабатывали пептидом ^NIМV. пептидом РКСЬТ или комбинацией пептидов ^NIМV и РКСЬТ, растворенных в ΡΒδ,

- 16 027229 или эквивалентным объемом отдельно взятого РВЗ. Пептиды вводили внутрибрюшинно в течение 8 дней. После последнего введения, мышей примировали фактором гкРУШ, эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда, как описано в стадии (ΐ). Через 10 дней собирали дренирующие лимфоузлы, и лимфоциты повторно стимулировали ΐη уйго фактором гкРУШ. После этого супернатанты собирали и измеряли уровень ΙΓΝ-гамма.

Все вышеупомянутые публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Как очевидно для специалистов в данной области, в описанные способы и системы согласно изобретению могут быть внесены различные модификации и изменения, не выходящие за рамки существа и объема изобретения. Хотя настоящее изобретение описано на конкретных предпочтительных вариантах его осуществления, однако следует отметить, что заявленное изобретение не должно ограничиваться указанными конкретными вариантами. Действительно, различные модификации описанных здесь способов осуществления изобретения, которые являются очевидными для специалистов в области молекулярной иммунологии или в смежных областях, входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Последовательность ЗЕС) ΙΌ ΝΟ: 1 ιηςίθίδίοίΐ 1с11г1с1за 1ггуу1дауе 1з\л/6утдзс11 ρβίρνόθΐίρ ргуркзТрТп 61 (зуууккШ νθίΐόήΐίηί акргрр\л/тд1 (дрЦдаеуу 6Е/уШкпт азИрузНзау

121 дузуу/казед аеубф^яг екеббкуГрд дзН1у\л/уду| кепдртазбр 1с11узу1зИ 181 убкксИпзд НдаНусге дз1акек1д! ЦзкЛНТау Тбедкзм/пзе 1кпз1тдс1гс1 241 аазага\л/ркт НР/пдуупгз 1рдПдс1чгк зуу\л/|-мдтд ΐΐρβνήδΐί! едНОЪ/гпб 301 гдаз1е!зр! ЙИацШт сПддЯНсИ 18зпдМс1дте ауукубзсре ерд1гткппе

361 еаебус!с1сЛ1 όδθΓΠόννιίά ΰάηβρείΐςί гз7аккИрк! )лл/Иу1ааеее скл/буарМа 421 рббгзукзяу 1ппдряпдг куккуЦтау 1бейк1геа 1яКездНдр НудеудбИ 481 ШТкпяазг ругпурНдЦ бугр1узгг1 ркдукМкб! рНрде|Гку к\?/Муебдр 541 1кзбргс11г ууззЬ/птег сНаздНдр! Псукезубд гдпр1тзбкг ηνϊΐίδνΐόθ 601 пгз\л/у11еп1 ягЯрпраду д1ебре1яаз П1тпз!пдуу 16δΙρΙδνοΙ Иеуаум/уПз 661 1дад1б1157 ЯздубкИк тууебШИ рГздеМтз тепрд1\лл1д сИпзсНгпгд 721 т1а11кУ55С бкп!дбууеб зуесйзауН зкппа1ергз ТздпзгИрз! гдкд1па№

781 репб1ек!бр \л4а1и1ртрк ίςηνδδδ6ΙΙ т11гдзр1рИ д!з1зс11деа куейес!с1р5 841 рдак!зппз1 δθΓηΙΜτρςΙ бпздбтуйр ебд1д1г1пе к1дНаа!е1 кк1б1к73з1 901 зппНзйрз бп1аад!бп1 бз1дррбтру 6убзд1бН11дккззр11е зддрЫзее 961 ппбзкПезд 1тпбдезз\л/д кпузз1ездг НкдкгаИдр аШкбпаН ΚνδϊδΙΙΜ:η 1021 к1зппза1пг кИлбдрбН ίθηδρδνννςη НезсНеТкк νίρΙϊΗ6πτιΙ тбкпа1а1г1 1081 пптзпкйзз кптегт/ддкк едр|ррбадп рбтзИктН 1резаг\лляг 16дкпз1пзд 1141 ядрбркдкб 1дрек57едя пПзекпкуу удкдеТСкск д1кету!рбб τηΙίΙΙηΙϋη 1201 ΙήθηηΙΗηςθ кк1дее1екк θίΙίηθηννΙ ρςίΐιΡφΨ пТткпНИб Рдт/едзуб 1261 дауар71дб! гз1пбз1пЦ ккМаМзкк деееп1ед1д г^кдкеку асНпзрп!

1321 δςςηίνίςΓδ кга1кя1г1р 1ее1е1екп ίνόόϊδίηννδ кпткКНрз! Ид1бупеке 1381 кдаКдзр1з όοΙΐΓδήδϊρ дапгзр1р1а кУЗзТрзкр |у11гл/11дб пззЫраазу 1441 гккбздудез зИЯддаккп п1з1аНЧе пДдфгеудз 1д1ба1пзу1 уккуепМр 1501 крб!рк1здк νθΙΙρΙ<νΚΐγ дкб11р1е!з пдзрдЫбк едз11дд!ед а1к\л/пеапгр 1561 дкурЯп/а! еззакфзк! 1с1р1а\л/с1пИу д1д|ркее\л/к здекзрек!а ТккксИПз!

1621 пасезппа1а а1педдпкре ϊβνΐν/акддг 1ег1сзяпрр у|кгИдгеИ ДИдзфее 1681 ΐ6γ66ίΐδνθ тккебкйуб ебепязргз! яккЧИуЛа амег1\ллЗудт зззрЫгпг 1741 адздзурд!к кууТдеИбд зфр1угде 1пеИ1д11др у1гаеуебпн ггкИгпдазг 1801 рузкуззНз уеефгддае ргкпЛ/крпе 1к1уТ\л/к7я1з Итар1кбе1б скамауТзск 1861 сПекскпзд! |др!1усИ1п ΙΙηρβφΓςν ΙνςθίθΙίίΙ Нбе1кз\/уу11ептегпсга 1921 ροηίςιτίθόρί 1кепуг1Иа1 пду1тсП1рд ΙνιτίθςφπΓ \л/у11зтдзпе гиНзО-НедИ 1981 71Ь/гккееу кта1уп1урд νίβΙνθΓηΙρδ кад|\л/гуес11де61Иадтз Шкузпкс 2041 д1р1дтаздИ 1г0Тдйазд дудя\л/арк1а г16уздз1па ууз1кер1зш1 кусШарти 2101 Ид1к1ддагд к!зз1у1зд! Нтуз1с1дкк \л/д1угдпз1д ΐίΓηνφηνό ззд1кИпИп 2161 ррнагуИ 6р№уз1гз11гте\л/тдсб1 пзсзтр1дте зка15бадН аззу!1пт1а 2221 кУзрзкаИИ 1ддгзпа\л/гр ςνηΓ^βννΙς ν6ίςΜΓηΜ дуфдукз! ИзтуукеИ 2281 ίδδδηφφνν Ифпдкук уТддпябзИ ρννηδΙΰρρΙ ИгуΙπήρς δνννφϊθΐιτη 2341 еу|дсеадб! у

Наборы перекрывающихся пептидов, полученные в примере 7

Серия перекрывающихся пептидов для ΌΤΕΕΙΙΕΚΝΡΑ3ΚΡΥ

1. 473-488

2. 474-489

3. 475-490

4. 476-491

5. 477-492

6. 478-493

7. 479-494

8. 480-495

9. 481-496

10. 482-497

Н. 483-498

Υ0Πν00ΤΙΧΙΙΡΚΝ(2

0Εν00ΤΈΙ2ΙΠ<Ν(2Α

ΕνθϋΤΕΕΠΡΚΝΟΑ3 νθϋΤΕΕΙ1ΡΚΝ(2Α8Κ

ΟΟΤΕΕΙΙΡΚΝΟΑ3Κ.Ρ

ΟΤΕΕΙΙΡΚΝζ)Α8ΚΡΥ

ΤΕΕΙΙΡΚΝ(2Α5ΚΡΥΝ

ΕΕΠΡΚΝΡΑ8ΚΡΥΝΪ

ΕΠΕΚΝ(2Α8ΚΡΥΝΙΥ

ΠΡΚΝζ)Α8Κ.ΡΥΝ1ΥΡ

ΙΡΚΝΟΑ8ΚΡΥΝΙΥΡΗ

- 17 027229

Серия перекрывающихся пептидов для РКСиГК-ΥΥδδΡνΝΜΕ

1. 540-554

2. 541-555

3. 542-556

4. 543-557

5. 544-558

6. 545-559

7. 546-560

8. 547-561

9. 548-562

10. 549-563

11. 550-564

ΡΤΚδϋΡΚΟΕΤΚΥΥδδ τκδϋΡΚίχτκγγδδΡ

ΚδϋΡΚΟΕΤΚΥΥδδΡν δϋΡΚΟΕΤΚΥΥδδΡνΝ ϋΡΚΟΕΓΚΥΥδδΡνΝΜ

ΡΚΟΡΤΚΎΥδδΡνΝΜΕ

ΚΟΙ/ΓΚΎΥδδΡνΝΜΕΚ ερτκγγδδρνΝΜΕΚϋ

ΕΓΚΥΥδδΡνΝΜΕΚΟΡ

ΤΚΥΥδδΡνΝΜΕΚΌΡΑ

ΚΥΥδδΡΥΝΜΕΚϋΕΑδ

Серия перекрывающихся пептидов для ΌΝΙΜνΤΡΚΝΡΑδΚΡΥ

1. 1783-1797

2. 1784-1798

3. 1785-1799

4. 1786-1800

5. 1787-1801

6. 1788-1802

7. 1789-1803

8. 1790-1804

9. 1791-1805

10. 1792-1806

11. 1793-1807

ΚΑΕνΕϋΝΙΜνΤΓΚ-Νφ

ΑΕνΕΟΝΙΜνΤΡΚΝΟΑ

ΕνΕϋΝΙΜνΤΡΚΝΟΑδ νΕΟΝΙΜνΤΡΚΝΟΑδΚ

ΕϋΝΙΜνΤΡΚΝΟΑδΚΡ ϋΝΙΜνΤΡΕΝςΑδΚΡΥ

ΝΙΜνΤΡΚΝ(}ΑδΚΡΥδ

ΙΜνΤΡΚΝςΑδΚΡΥδΡ

ΜνΤΡΚΝΟΑδΚΡΥδΡΥ νΤΡΚ-ΝΟΑδΚΡΥδΡΥδ

ΤΡΚΝ(}ΑδΚΡΥδΡΥδδ

Серия перекрывающихся пептидов для δΕΥΙδρΡΙΙΜΥδΕΌΟ

1.2109- 2123

2.2110- 2124 κρκρδδίχίδΟΡΠΜ ςκΡδδΕΥίδΟΡΠΜΥ

3.2111- 2125

4.2112- 2126

5.2113- 2127 6. 2114-2128 7.2115-2129

8. 2116-2130

9. 2117-2131

10. 2118-2132 11.2119-2133 κΡδδΕΥίδΟΡΠΜΥδ

ΡδδΕΥΙδΟΡΙΙΜΥδΕ δδΕΥΙδρΡΙΙΜΥδΕϋ δΕΥίδοπίΜΥδίοο ΐΑΐδ(9ΡΠΜΥδπχ}κ

ΥΙδρΡΙΙΜΥδΕϋΟΚΚ

ΙδΟΠΙΜΥδίΟΟΚΚλΥ δΟΡΙΙΜΥδΠΧΪΚΚΛνρ

ОРПМУЗЬЭСККЛУОТ

Серия перекрывающихся пептидов для ΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥ

1. 2156-2170

2. 2157-2171

3. 2158-2172

4. 2159-2173

5. 2160-2174

6. 2161-2175

7. 2162-2176

8. 2163-2177

9. 2164-2178

10. 2165-2179 11.2166-2180

ΗΝΙΡΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕ

ΝΙΡΝΡΡΠΑΚΥΙΚΕΗ

ΙΡΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡ

ΡΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤ

ΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗ

ΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥ

ΡΙΙΑΚΥΙΚίΗΡΤΗΥδ

ΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥδΙ

ΙΑΚΥ1ΚΕΗΡΤΗΥ8ΙΚ

ΑΚΥΙΚΕΗΡΤΡΓΥδΙΚδ

ΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥδΙΚδΤ

Серия перекрывающихся пептидов для ΚΥΕΚΙΙ ΙΡρδΥΥΑΊ 1Ц)Е\

I. 2156-2170

2. 2157-2171

3. 2158-2172

4. 2159-2173

5. 2160-2174

6. 2161-2175

7. 2162-2176

8. 2163-2177 9.2164-2178 10.2165-2179

II. 2166-2180

ΗΝΙΡΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕ

ΝΙΡΝΡΡΠΑΚΥΙΚΕΗ

ΙΡΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡ

ΡΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤ

ΝΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗ

ΡΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥ

ΡΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥδ

ΙΙΑΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥδΙ

ΙΑΚΥΙΚίΗΡΤΗΥδΙΚ

ΑΚΥΙΚΕΗΡΤΡΓΥδΙΚδ

ΚΥΙΚΕΗΡΤΗΥδΙΚδΤ

- 18 027229

Список последовательностей <110> АрТСоре ТесПпо1оду (Вг1зСо1) ЫтТСеД <120> ПЕПТИДЫ <130> Р036475ЫА <140> РСТ/СВ2010/000997 <141> 2010-05-17 <150> СВ 0908515.0 <151> 2009-05-18 <160> 83 <170> РаСепСЬп νе^з^оη 3.5 <210> 1 <211> 2351 <212> РЕТ <213> Ното зарТепз <400> 1

МеС 1

С1п

11е

С1и

Ьеи 5

Зег

ТПг

Суз

РПе

РПе 10

Ьеи

Суз

Ьеи

Ьеи

Агд 15

РПе

Суз

РПе

Зег

А1а

ТПг

Агд

Агд

Туг

Туг

Ьеи

С1у

А1а

Уа1

С1и

Ьеи

Зег

20

25

30

Тгр

Азр

Туг

МеС

С1п

Зег

Азр

Ьеи

С1у

С1и

Ьеи

Рго

Уа1

Азр

А1а

Агд

35

40

45

РПе

Рго

Рго

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Зег

РПе

Рго

РПе

Азп

ТПг

Зег

Уа1

Уа1

50

55

60

Туг

Ьуз

Ьуз

ТПг

Ьеи

РПе

Уа1

С1и

РПе

ТПг

Азр

Н1з

Ьеи

РПе

Азп

11е

65

70

75

80

А1а

Ьуз

Рго

Агд

Рго

Рго

Тгр

МеС

С1у

Ьеи

Ьеи

С1у

Рго

ТПг

11е

С1п

85

90

95

А1а

С1и

Уа1

Туг

Азр

ТПг

Уа1

Уа1

11е

ТПг

Ьеи

Ьуз

Азп

МеС

А1а

Зег

100

105

110

Н1з

Рго

Уа1

Зег

Ьеи

Н1з

А1а

Уа1

С1у

Уа1

Зег

Туг

Тгр

Ьуз

А1а

Зег

115

120

125

С1и

С1у

А1а

С1и

Туг

Азр

Азр

С1п

ТПг

Зег

С1п

Агд

С1и

Ьуз

С1и

Азр

130

135

140

Азр

Ьуз

Уа1

РПе

Рго

С1у

С1у

Зег

Н1з

ТПг

Туг

Уа1

Тгр

С1п

Уа1

Ьеи

145

150

155

160

- 19 027229

Ьуз

С1и

Азп

С1у

Рго 165

МеЬ

А1а

Зег

Азр

Рго 170

Ьеи

Суз

Ьеи

ТЬг

Туг 175

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Н1з

Уа1

Азр

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Ьеи

Азп

Зег

С1у

Ьеи

11е

180

185

190

С1у

А1а

Ьеи

Ьеи

Уа1

Суз

Агд

С1и

С1у

Зег

Ьеи

А1а

Ьуз

С1и

Ьуз

ТЬг

195

200

205

С1п

ТЬг

Ьеи

Н1з

Ьуз

РЬе

11е

Ьеи

Ьеи

РЬе

А1а

Уа1

РЬе

Азр

С1и

С1у

210

215

220

Ьуз

Зег

Тгр

Н1з

Зег

С1и

ТЬг

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

МеЬ

С1п

Азр

Агд

Азр

225

230

235

240

А1а

А1а

Зег

А1а

Агд

А1а

Тгр

Рго

Ьуз

МеЬ

Н1з

ТЬг

Уа1

Азп

С1у

Туг

245

250

255

ναι

Азп

Агд

Зег

Ьеи

Рго

С1у

Ьеи

11е

С1у

Суз

Н1з

Агд

Ьуз

Зег

Уа1

260

265

270

Туг

Тгр

Н1з

Уа1

11е

С1у

МеЬ

С1у

ТЬг

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

Н1з

Зег

11е

275

280

285

РЬе

Ьеи

С1и

С1у

Н1з

ТЬг

РЬе

Ьеи

Уа1

Агд

Азп

Н1з

Агд

С1п

А1а

Зег

290

295

300

Ьеи

С1и

11е

Зег

Рго

11е

ТЬг

РЬе

Ьеи

ТЬг

А1а

С1п

ТЬг

Ьеи

Ьеи

МеЬ

305

310

315

320

Азр

Ьеи

С1у

С1п

РЬе

Ьеи

Ьеи

РЬе

Суз

Н1з

11е

Зег

Зег

Н1з

С1п

Н1з

325

330

335

Азр

С1у

МеЬ

С1и

А1а

Туг

Уа1

Ьуз

Уа1

Азр

Зег

Суз

Рго

С1и

С1и

Рго

340

345

350

С1п

Ьеи

Агд

МеЬ

Ьуз

Азп

Азп

С1и

С1и

А1а

С1и

Азр

Туг

Азр

Азр

Азр

355

360

365

Ьеи

ТЬг

Азр

Зег

С1и

МеЬ

Азр

Уа1

Уа1

Агд

РЬе

Азр

Азр

Азр

Азп

Зег

370

375

380

Рго

Зег

РЬе

11е

С1п

11е

Агд

Зег

Уа1

А1а

Ьуз

Ьуз

Н1з

Рго

Ьуз

ТЬг

385

390

395

400

Тгр

Уа1

Н1з

Туг

11е

А1а

А1а

С1и

С1и

С1и

Азр

Тгр

Азр

Туг

А1а

Рго

- 20 027229

405 410 415

Ьеи

ναι

Ьеи

А1а 420

Рго

Азр

Азр

Агд

Зег 425

Туг

Ьуз

Зег

С1п

Туг 430

Ьеи

Азп

Азп

С1у

Рго

С1п

Агд

11е

С1у

Агд

Ьуз

Туг

Ьуз

Ьуз

Уа1

Агд

РЬе

МеЬ

435

440

445

А1а

Туг

ТЬг

Азр

С1и

ТЬг

РЬе

Ьуз

ТЬг

Агд

С1и

А1а

11е

С1п

Н1з

С1и

450

455

460

Зег

С1у

11е

Ьеи

С1у

Рго

Ьеи

Ьеи

Туг

С1у

С1и

Уа1

С1у

Азр

ТЬг

Ьеи

465

470

475

480

Ьеи

11е

11е

РЬе

Ьуз

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Азп

11е

Туг

Рго

485

490

495

Н1з

С1у

11е

ТЬг

Азр

Уа1

Агд

Рго

Ьеи

Туг

Зег

Агд

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

500

505

510

С1у

Уа1

Ьуз

Н1з

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Рго

11е

Ьеи

Рго

С1у

С1и

11е

РЬе

515

520

525

Ьуз

Туг

Ьуз

Тгр

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

С1и

Азр

С1у

Рго

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

530

535

540

Рго

Агд

Суз

Ьеи

ТЬг

Агд

Туг

Туг

Зег

Зег

РЬе

Уа1

Азп

МеЬ

С1и

Агд

545

550

555

560

Азр

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Ьеи

11е

С1у

Рго

Ьеи

Ьеи

11е

Суз

Туг

Ьуз

С1и

565

570

575

Зег

Уа1

Азр

С1п

Агд

С1у

Азп

С1п

11е

МеЬ

Зег

Азр

Ьуз

Агд

Азп

Уа1

580

585

590

11е

Ьеи

РЬе

Зег

Уа1

РЬе

Азр

С1и

Азп

Агд

Зег

Тгр

Туг

Ьеи

ТЬг

С1и

595

600

605

Азп

11е

С1п

Агд

РЬе

Ьеи

Рго

Азп

Рго

А1а

С1у

Уа1

С1п

Ьеи

С1и

Азр

610

615

620

Рго

С1и

РЬе

С1п

А1а

Зег

Азп

11е

МеЬ

Н1з

Зег

11е

Азп

С1у

Туг

Уа1

625

630

635

640

РЬе

Азр

Зег

Ьеи

С1п

Ьеи

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

Н1з

С1и

Уа1

А1а

Туг

Тгр

645 650 655

- 21 027229

Туг

11е

Ьеи

Зег 660

11е

С1у

А1а

С1п

ТЬг 665

Азр

РЬе

Ьеи

Зег

Уа1 670

РЬе

РЬе

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

Ьуз

Н1з

Ьуз

МеЬ

Уа1

Туг

С1и

Азр

ТЬг

Ьеи

ТЬг

675

680

685

Ьеи

РЬе

Рго

РЬе

Зег

С1у

С1и

ТЬг

Уа1

РЬе

МеЬ

Зег

МеЬ

С1и

Азп

Рго

690

695

700

С1у

Ьеи

Тгр

11е

Ьеи

С1у

Суз

Н1з

Азп

Зег

Азр

РЬе

Агд

Азп

Агд

С1у

705

710

715

720

МеЬ

ТЬг

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Уа1

Зег

Зег

Суз

Азр

Ьуз

Азп

ТЬг

С1у

Азр

725

730

735

Туг

Туг

С1и

Азр

Зег

Туг

С1и

Азр

11е

Зег

А1а

Туг

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьуз

740

745

750

Азп

Азп

А1а

11е

С1и

Рго

Агд

Зег

РЬе

Зег

С1п

Азп

Зег

Агд

Н1з

Рго

755

760

765

Зег

ТЬг

Агд

С1п

Ьуз

С1п

РЬе

Азп

А1а

ТЬг

ТЬг

11е

Рго

С1и

Азп

Азр

770

775

780

11е

С1и

Ьуз

ТЬг

Азр

Рго

Тгр

РЬе

А1а

Н1з

Агд

ТЬг

Рго

МеЬ

Рго

Ьуз

785

790

795

800

11е

С1п

Азп

Уа1

Зег

Зег

Зег

Азр

Ьеи

Ьеи

МеЬ

Ьеи

Ьеи

Агд

С1п

Зег

805

810

815

Рго

ТЬг

Рго

Н1з

С1у

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Азр

Ьеи

С1п

С1и

А1а

Ьуз

Туг

820

825

830

С1и

ТЬг

РЬе

Зег

Азр

Азр

Рго

Зег

Рго

С1у

А1а

11е

Азр

Зег

Азп

Азп

835

840

845

Зег

Ьеи

Зег

С1и

МеЬ

ТЬг

Н1з

РЬе

Агд

Рго

С1п

Ьеи

Н1з

Н1з

Зег

С1у

850

855

860

Азр

МеЬ

Уа1

РЬе

ТЬг

Рго

С1и

Зег

С1у

Ьеи

С1п

Ьеи

Агд

Ьеи

Азп

С1и

865

870

875

880

Ьуз

Ьеи

С1у

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

С1и

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Азр

РЬе

Ьуз

885

890

895

Уа1

Зег

Зег

ТЬг

Зег

Азп

Азп

Ьеи

11е

Зег

ТЬг

11е

Рго

Зег

Азр

Азп

900

905

910

- 22 027229

Ьеи	А1а	А1а 915	С1у	ТЬг Азр Азп ТЬг 920	Зег Зег Ьеи С1у Рго 925	Рго	Зег	МеЬ
Рго	ναι	Н1з	Туг .	Азр Зег С1п Ьеи	Азр ТЬг ТЬг Ьеи РЬе	С1у	Ьуз	Ьуз
	930			935	940
Зег	Зег	Рго	Ьеи	ТЬг С1и Зег С1у	С1у Рго Ьеи Зег Ьеи	Зег	С1и	С1и
945				950	955			960
Азп	Азп	Азр	Зег	Ьуз Ьеи Ьеи С1и	Зег С1у Ьеи МеЬ Азп	Зег	С1п	С1и
				965	970		975
Зег	Зег	Тгр	С1у	Ьуз Азп Уа1 Зег	Зег ТЬг С1и Зег С1у	Агд	Ьеи	РЬе
			980		985	990
Ьуз	С1у	Ьуз	Агд .	А1а Н1з С1у Рго	А1а Ьеи Ьеи ТЬг Ьуз Азр Азп А1а
		995		1000	1005
Ьеи	РЬе	Ьуз	Уа1	Зег 11е Зег Ьеи Ьеи Ьуз ТЬг Азп	Ьуз	ТЬг	Зег
	1010			1015	1020
Азп	Азп	Зег	А1а	ТЬг Азп Агд Ьуз ТЬг Н1з 11е Азр	С1у	Рго	Зег
	1025			1030	1035
Ьеи	Ьеи	11е	С1и	Азп Зег Рго Зег Уа1 Тгр С1п Азп	11е	Ьеи	С1и
	1040			1045	1050
Зег	Азр	ТЬг	С1и	РЬе Ьуз Ьуз Уа1 ТЬг Рго Ьеи 11е	Н1з	Азр	Агд
	1055			1060	1065
МеЬ	Ьеи	МеЬ	Азр	Ьуз Азп А1а ТЬг А1а Ьеи Агд Ьеи	Азп	Н1з	МеЬ
	1070			1075	1080
Зег	Азп	Ьуз	ТЬг	ТЬг Зег Зег Ьуз Азп МеЬ С1и МеЬ	Уа1	С1п	С1п
	1085			1090	1095
Ьуз	Ьуз	С1и	С1у	Рго 11е Рго Рго Азр А1а С1п Азп	Рго	Азр	МеЬ
	1100			1105	1110
Зег	РЬе	РЬе	Ьуз	МеЬ Ьеи РЬе Ьеи Рго С1и Зег А1а	Агд	Тгр	11е
	1115			1120	1125
С1п	Агд	ТЬг	Н1з	С1у Ьуз Азп Зег Ьеи Азп Зег С1у	С1п	С1у	Рго
	1130			1135	1140
Зег	Рго	Ьуз	С1п	Ьеи Уа1 Зег Ьеи С1у Рго С1и Ьуз	Зег	Уа1	С1и
	1145			1150	1155

- 23 027229

С1у

С1п 1160

Азп

РЬе

Ьеи

Зег

С1и 1165

Ьуз

Азп

Ьуз

Уа1

Уа1 1170

Уа1

С1у

Ьуз

С1у

С1и

РЬе

ТЬг

Ьуз

Азр

Уа1

С1у

Ьеи

Ьуз

С1и

МеЬ

Уа1

РЬе

Рго

1175

1180

1185

Зег

Зег

Агд

Азп

Ьеи

РЬе

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

Азр

Азп

Ьеи

Н1з

С1и

1190

1195

1200

Азп

Азп

ТЬг

Н1з

Азп

С1п

С1и

Ьуз

Ьуз

11е

С1п

С1и

С1и

11е

С1и

1205

1210

1215

Ьуз

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

11е

С1п

С1и

Азп

Уа1

Уа1

Ьеи

Рго

С1п

11е

1220

1225

1230

Н1з

ТЬг

Уа1

ТЬг

С1у

ТЬг

Ьуз

Азп

РЬе

МеЬ

Ьуз

Азп

Ьеи

РЬе

Ьеи

1235

1240

1245

Ьеи

Зег

ТЬг

Агд

С1п

Азп

Уа1

С1и

С1у

Зег

Туг

Азр

С1у

А1а

Туг

1250

1255

1260

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

С1п

Азр

РЬе

Агд

Зег

Ьеи

Азп

Азр

Зег

ТЬг

Азп

1265

1270

1275

Агд

ТЬг

Ьуз

Ьуз

Н1з

ТЬг

А1а

Н1з

РЬе

Зег

Ьуз

Ьуз

С1у

С1и

С1и

1280

1285

1290

С1и

Азп

Ьеи

С1и

С1у

Ьеи

С1у

Азп

С1п

ТЬг

Ьуз

С1п

11е

Уа1

С1и

1295

1300

1305

Ьуз

Туг

А1а

Суз

ТЬг

ТЬг

Агд

11е

Зег

Рго

Азп

ТЬг

Зег

С1п

С1п

1310

1315

1320

Азп

РЬе

Уа1

ТЬг

С1п

Агд

Зег

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

Ьуз

С1п

РЬе

Агд

1325

1330

1335

Ьеи

Рго

Ьеи

С1и

С1и

ТЬг

С1и

Ьеи

С1и

Ьуз

Агд

11е

11е

Уа1

Азр

1340

1345

1350

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

С1п

Тгр

Зег

Ьуз

Азп

МеЬ

Ьуз

Н1з

Ьеи

ТЬг

Рго

1355

1360

1365

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

С1п

11е

Азр

Туг

Азп

С1и

Ьуз

С1и

Ьуз

С1у

А1а

1370

1375

1380

11е

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Азр

Суз

Ьеи

ТЬг

Агд

Зег

Н1з

Зег

- 24 027229

1385 1390 1395

11е

Рго 1400

С1п

А1а

Азп

Агд

Зег 1405

Рго

Ьеи

Рго

11е

А1а 1410

Ьуз

Уа1

Зег

Зег

РЬе

Рго

Зег

11е

Агд

Рго

11е

Туг

Ьеи

ТЬг

Агд

Уа1

Ьеи

РЬе

1415

1420

1425

С1п

Азр

Азп

Зег

Зег

Н1з

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Зег

Туг

Агд

Ьуз

Ьуз

1430

1435

1440

Азр

Зег

С1у

Уа1

С1п

С1и

Зег

Зег

Н1з

РЬе

Ьеи

С1п

С1у

А1а

Ьуз

1445

1450

1455

Ьуз

Азп

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

11е

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1и

МеЬ

ТЬг

С1у

1460

1465

1470

Азр

С1п

Агд

С1и

Уа1

С1у

Зег

Ьеи

С1у

ТЬг

Зег

А1а

ТЬг

Азп

Зег

1475

1480

1485

ναι

ТЬг

Туг

Ьуз

Ьуз

Уа1

С1и

Азп

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

Ьуз

Рго

Азр

1490

1495

1500

Ьеи

Рго

Ьуз

ТЬг

Зег

С1у

Ьуз

Уа1

С1и

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьуз

Уа1

Н1з

1505

1510

1515

11е

Туг

С1п

Ьуз

Азр

Ьеи

РЬе

Рго

ТЬг

С1и

ТЬг

Зег

Азп

С1у

Зег

1520

1525

1530

Рго

С1у

Н1з

Ьеи

Азр

Ьеи

Уа1

С1и

С1у

Зег

Ьеи

Ьеи

С1п

С1у

ТЬг

1535

1540

1545

С1и

С1у

А1а

11е

Ьуз

Тгр

Азп

С1и

А1а

Азп

Агд

Рго

С1у

Ьуз

Уа1

1550

1555

1560

Рго

РЬе

Ьеи

Агд

Уа1

А1а

ТЬг

С1и

Зег

Зег

А1а

Ьуз

ТЬг

Рго

Зег

1565

1570

1575

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Ьеи

А1а

Тгр

Азр

Азп

Н1з

Туг

С1у

ТЬг

С1п

1580

1585

1590

11е

Рго

Ьуз

С1и

С1и

Тгр

Ьуз

Зег

С1п

С1и

Ьуз

Зег

Рго

С1и

Ьуз

1595

1600

1605

ТЬг

А1а

РЬе

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Азр

ТЬг

11е

Ьеи

Зег

Ьеи

Азп

А1а

Суз

1610 1615 1620

- 25 027229

Θΐυ

Зег 1625

Азп

Н1з

А1а

11е

А1а 1630

А1а

11е

Азп

С1и

С1у 1635

С1п

Азп

Ьуз

Рго

С1и

11е

С1и

Уа1

ТЬг

Тгр

А1а

Ьуз

С1п

С1у

Агд

ТЬг

С1и

Агд

1640

1645

1650

Ьеи

Суз

Зег

С1п

Азп

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Ьуз

Агд

Н1з

С1п

Агд

С1и

1655

1660

1665

11е

ТЬг

Агд

ТЬг

ТЬг

Ьеи

С1п

Зег

Азр

С1п

С1и

С1и

11е

Азр

Туг

1670

1675

1680

Азр

Азр

ТЬг

11е

Зег

Уа1

С1и

МеЬ

Ьуз

Ьуз

С1и

Азр

РЬе

Азр

11е

1685

1690

1695

Туг

Азр

С1и

Азр

С1и

Азп

С1п

Зег

Рго

Агд

Зег

РЬе

С1п

Ьуз

Ьуз

1700

1705

1710

ТЬг

Агд

Н1з

Туг

РЬе

11е

А1а

А1а

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

Тгр

Азр

Туг

1715

1720

1725

С1у

МеЬ

Зег

Зег

Зег

Рго

Н1з

Уа1

Ьеи

Агд

Азп

Агд

А1а

С1п

Зег

1730

1735

1740

С1у

Зег

Уа1

Рго

С1п

РЬе

Ьуз

Ьуз

Уа1

Уа1

РЬе

С1п

С1и

РЬе

ТЬг

1745

1750

1755

Азр

С1у

Зег

РЬе

ТЬг

С1п

Рго

Ьеи

Туг

Агд

С1у

С1и

Ьеи

Азп

С1и

1760

1765

1770

Н1з

Ьеи

С1у

Ьеи

Ьеи

С1у

Рго

Туг

11е

Агд

А1а

С1и

Уа1

С1и

Азр

1775

1780

1785

Азп

11е

МеЬ

Уа1

ТЬг

РЬе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Зег

1790

1795

1800

РЬе

Туг

Зег

Зег

Ьеи

11е

Зег

Туг

С1и

С1и

Азр

С1п

Агд

С1п

С1у

1805

1810

1815

А1а

С1и

Рго

Агд

Ьуз

Азп

РЬе

Уа1

Ьуз

Рго

Азп

С1и

ТЬг

Ьуз

ТЬг

1820

1825

1830

Туг

РЬе

Тгр

Ьуз

Уа1

С1п

Н1з

Н1з

МеЬ

А1а

Рго

ТЬг

Ьуз

Азр

С1и

1835

1840

1845

РЬе

Азр

Суз

Ьуз

А1а

Тгр

А1а

Туг

РЬе

Зег

Азр

Уа1

Азр

Ьеи

С1и

1850

1855

1860

- 26 027229

Ьуз

Азр 1865

Уа1

Н1з

Зег

С1у

Ьеи 1870

11е

С1у

Рго

Ьеи

Ьеи 1875

Уа1

Суз

Н1з

ТЬг

Азп

ТЬг

Ьеи

Азп

Рго

А1а

Н1з

С1у

Агд

С1п

Уа1

ТЬг

Уа1

С1п

1880

1885

1890

Θΐυ

РЬе

А1а

Ьеи

РЬе

РЬе

ТЬг

11е

РЬе

Азр

С1и

ТЬг

Ьуз

Зег

Тгр

1895

1900

1905

Туг

РЬе

ТЬг

С1и

Азп

МеЬ

С1и

Агд

Азп

Суз

Агд

А1а

Рго

Суз

Азп

1910

1915

1920

11е

С1п

МеЬ

С1и

Азр

Рго

ТЬг

РЬе

Ьуз

С1и

Азп

Туг

Агд

РЬе

Н1з

1925

1930

1935

А1а

11е

Азп

С1у

Туг

11е

МеЬ

Азр

ТЬг

Ьеи

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

МеЬ

1940

1945

1950

А1а

С1п

Азр

С1п

Агд

11е

Агд

Тгр

Туг

Ьеи

Ьеи

Зег

МеЬ

С1у

Зег

1955

1960

1965

Азп

С1и

Азп

11е

Н1з

Зег

11е

Н1з

РЬе

Зег

С1у

Н1з

Уа1

РЬе

ТЬг

1970

1975

1980

Уа1

Агд

Ьуз

Ьуз

С1и

С1и

Туг

Ьуз

МеЬ

А1а

Ьеи

Туг

Азп

Ьеи

Туг

1985

1990

1995

Рго

С1у

Уа1

РЬе

С1и

ТЬг

Уа1

С1и

МеЬ

Ьеи

Рго

Зег

Ьуз

А1а

С1у

2000

2005

2010

11е

Тгр

Агд

Уа1

С1и

Суз

Ьеи

11е

С1у

С1и

Н1з

Ьеи

Н1з

А1а

С1у

2015

2020

2025

МеЬ

Зег

ТЬг

Ьеи

РЬе

Ьеи

Уа1

Туг

Зег

Азп

Ьуз

Суз

С1п

ТЬг

Рго

2030

2035

2040

Ьеи

С1у

МеЬ

А1а

Зег

С1у

Н1з

11е

Агд

Азр

РЬе

С1п

11е

ТЬг

А1а

2045

2050

2055

Зег

С1у

С1п

Туг

С1у

С1п

Тгр

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Н1з

2060

2065

2070

Туг

Зег

С1у

Зег

11е

Азп

А1а

Тгр

Зег

ТЬг

Ьуз

С1и

Рго

РЬе

Зег

2075

2080

2085

Тгр

11е

Ьуз

Уа1

Азр

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

МеЬ

11е

11е

Н1з

С1у

11е

2090 2095 2100

- 27 027229

Ьуз

ТЬг 2105

С1п

С1у

А1а

Агд

С1п 2110

Ьуз

РЬе

Зег

Зег

Ьеи 2115

Туг

11е

Зег

С1п

РЬе

11е

11е

МеЬ

Туг

Зег

Ьеи

Азр

С1у

Ьуз

Ьуз

Тгр

С1п

ТЬг

2120

2125

2130

Туг

Агд

С1у

Азп

Зег

ТЬг

С1у

ТЬг

Ьеи

МеЬ

Уа1

РЬе

РЬе

С1у

Азп

2135

2140

2145

Уа1

Азр

Зег

Зег

С1у

11е

Ьуз

Н1з

Азп

11е

РЬе

Азп

Рго

Рго

11е

2150

2155

2160

11е

А1а

Агд

Туг

11е

Агд

Ьеи

Н1з

Рго

ТЬг

Н1з

Туг

Зег

11е

Агд

2165

2170

2175

Зег

ТЬг

Ьеи

Агд

МеЬ

С1и

Тгр

МеЬ

С1у

Суз

Азр

Ьеи

Азп

Зег

Суз

2180

2185

2190

Зег

МеЬ

Рго

Ьеи

С1у

МеЬ

С1и

Зег

Ьуз

А1а

11е

Зег

Азр

А1а

С1п

2195

2200

2205

11е

ТЬг

А1а

Зег

Зег

Туг

РЬе

ТЬг

Азп

МеЬ

РЬе

А1а

ТЬг

Тгр

Зег

2210

2215

2220

Рго

Зег

Ьуз

А1а

Агд

Ьеи

Н1з

Ьеи

С1п

С1у

Агд

Зег

Азп

А1а

Тгр

2225

2230

2235

Агд

Рго

С1п

Уа1

Азп

Азп

Рго

Ьуз

С1и

Тгр

Ьеи

С1п

Уа1

Азр

РЬе

2240

2245

2250

С1п

Ьуз

ТЬг

МеЬ

Ьуз

Уа1

ТЬг

С1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

С1п

С1у

Уа1

Ьуз

2255

2260

2265

Зег

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Зег

МеЬ

Туг

Уа1

Ьуз

С1и

РЬе

Ьеи

11е

Зег

Зег

2270

2275

2280

Зег

С1п

Азр

С1у

Н1з

С1п

Тгр

ТЬг

Ьеи

РЬе

РЬе

С1п

Азп

С1у

Ьуз

2285

2290

2295

ναι

Ьуз

Уа1

РЬе

С1п

С1у

Азп

С1п

Азр

Зег

РЬе

ТЬг

Рго

Уа1

Уа1

2300

2305

2310

Азп

Зег

Ьеи

Азр

Рго

Рго

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Агд

Туг

Ьеи

Агд

11е

Н1з

2315

2320

2325

Рго

С1п

Зег

Тгр

Уа1

Н1з

С1п

11е

А1а

Ьеи

Агд

МеЬ

С1и

Уа1

Ьеи

- 28 027229

2330

2335

2340

С1у Суз

С1и

ι А1а С1п Азр

> Ьеи

Туг

2345

2350

<210>

2

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

2

ТПг С1п

ТПг

Ьеи Н1з

Ьуз

РПе

11е

Ьеи

Ьеи

РПе

А1а

Уа1

РПе

Азр

1

5

10

15

<210>

3

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

3

Зег Ьеи

Туг

11е Зег

С1п

РПе

11е

11е

МеС

Туг

Зег

Ьеи

Азр

С1у

1

5

10

15

<210>

4

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

4

Рго Рго

11е

11е А1а

Агд

Туг

11е

Агд

Ьеи

Н1з

Рго

ТПг

Н1з

Туг

1

5

10

15

<210>

5

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

5

Рго Рго

Ьеи

Ьеи ТПг

Агд

Туг

Ьеи

Агд

11е

Н1з

Рго

С1п

Зег

Тгр

1

5

10

15

<210>

6

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

6

МеС Н1з

ТПг

Уа1 Азп

С1у

Туг

Уа1

Азп

Агд

Зег

Ьеи

Рго

С1у

Ьеи

1

5

10

15

<210> 7

- 29 027229 <211> 15 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 7

Ьеи С1у 1

С1п

РЬе Ьеи 5

Ьеи

РЬе

Суз

Н1з

11е 10

Зег

Зег

Н1з

С1п

Н1з 15

<210>

8

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

8

Азр ТЬг

Ьеи

Ьеи 11е

11е

РЬе

Ьуз

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

1

5

10

15

<210>

9

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

9

Рго Агд

Суз

Ьеи ТЬг

Агд

Туг

Туг

Зег

Зег

РЬе

Уа1

Азп

МеЬ

С1и

1

5

10

15

<210>

10

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

10

ТЬг С1и

Азп

11е С1п

Агд

РЬе

Ьеи

Рго

Азп

Рго

А1а

С1у

Уа1

С1п

1

5

10

15

<210>

11

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

11

Азр Азп

11е

МеЬ Уа1

ТЬг

РЬе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

1

5

10

15

<210>

12

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

12

Агд Туг

Ьеи

Агд 11е

Н1з

Рго

С1п

Зег

Тгр

Уа1

Н1з

С1п

11е

А1а

1

5

10

15

- 30 027229

<210> <211> <212> <213> <400> С1у ТАг 1	13 15 РЕТ Ното 13 Ьеи	зар±епз	РАе С1у
МеЕ Уа1 5	РАе
<210>	14
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	14
Ьеи Туг	11е	Зег С1п	РАе	11е	11е
1		5
<210>	15
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	15
РАе 11е	11е	МеЕ Туг	Зег	Ьеи	Азр
1		5
<210>	16
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	16
11е А1а	. Агд	Туг 11е	Агд	Ьеи	Н1з
1		5
<210>	17
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	17
Ьеи 11е	11е	РАе Ьуз	Азп	С1п	А1а
1		5
<210>	18
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зар1епз
<400>	18

МеЕ

С1у

Рго

Зег

Азп ναΐ Азр Зег Зег С1у 11е 10 15

- 31 027229

Ьеи ТЬг 1	Агд	Туг Туг 5	Зег	Зег	РЬе	Уа1
<210>	19
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	19
МеЬ Уа1	ТЬг	РЬе Агд	Азп	С1п	А1а	Зег
1		5
<210>	20
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	20
Ьеи Агд	11е	Нтз Рго	С1п	Зег	Тгр	Уа1
1		5

<210>	21
<211>	13
<212>	РЕТ
<213>	Ното зартепз

<220>
<221>	МЬЗС.	_ЕЕАТЬЕЕ
<222>	(1) .	. (1)

<223> Хаа представляет собой заряженный гидрофильный остаток <400> 21 аминокислотный

Хаа Азр Азп 1

11е МеЬ Уа1

ТЬг РЬе Агд Азп С1п А1а Зег 10 <210> 22 <211> 14 <212> РЕТ <213> Ното зартепз <220>

<221> МЬЗС_ЕЕАТЬЕЕ <222> (1) .. (1) <223> Хаа представляет собой заряженную аминокислоту отличающейся от полярности Хаа в положении 14 <220>

<221> МЬЗС_ЕЕАТЬЕЕ <222> (14)..(14) <223> Хаа представляет собой заряженную аминокислоту отличающейся от полярности Хаа в положении 1 с полярностью, с полярностью,

- 32 027229 <400> 22

Хаа Азр 1

Азп

11е МеС 5

Уа1

ТПг

РПе

Агд

Азп 10

С1п

А1а

Зег

Хаа

<210>

23

<211>

14

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

23

С1и Азр

Азп

11е МеС

Уа1

ТПг

РПе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

1

5

10

<210>

24

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

24

Туг С1у

С1и

Уа1 С1у

Азр

ТПг

Ьеи

Ьеи

11е

11е

РПе

Ьуз

Азп

С1п

1

5

10

15

<210>

25

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

25

С1у С1и

Уа1

С1у Азр

ТПг

Ьеи

Ьеи

11е

11е

РПе

Ьуз

Азп

С1п

А1а

1

5

10

15

<210>

26

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

26

С1и Уа1

С1у

Азр ТПг

Ьеи

Ьеи

11е

11е

РПе

Ьуз

Азп

С1п

А1а

Зег

1

5

10

15

<210>

27

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

27

Уа1 С1у

Азр

ТПг Ьеи

Ьеи

11е

11е

РПе

Ьуз

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

1

5

10

15

<210> 28 <211> 15

- 33 027229 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 28

С1у Азр ТЬг 1

Ьеи Ьеи 5

11е

11е

РЬе

Ьуз

Азп С1п А1а 10

Зег Агд

Рго 15

<210>

29

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

29

ТЬг Ьеи

Ьеи

11е 11е

РЬе

Ьуз

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Азп

1

5

10

15

<210>

30

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

30

Ьеи Ьеи

11е

11е РЬе

Ьуз

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Азп

11е

1

5

10

15

<210>

31

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

31

Ьеи 11е

11е

РЬе Ьуз

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Азп

11е

Туг

1

5

10

15

<210>

32

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

32

11е 11е

РЬе

Ьуз Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Азп

11е

Туг

Рго

1

5

10

15

<210>

33

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

33

11е РЬе

Ьуз

Азп С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Азп

11е

Туг

Рго

Н1з

1

5

10

15

- 34 027229 <210> 34 <211> 15 <212> РЕТ

<213> <400> Рго ТЬг 1	Ното 34 Ьуз	зар±епз	Агд	Суз	Ьеи
Зег Азр 5	Рго
<210>	35
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	35
ТЬг Ьуз 1	Зег	Азр Рго 5	Агд	Суз	Ьеи	ТЬг
<210>	36
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	36
Ьуз Зег 1	Азр	Рго Агд 5	Суз	Ьеи	ТЬг	Агд
<210>	37
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	37
Зег Азр 1	ι Рго	Агд Суз 5	Ьеи	ТЬг	Агд	Туг
<210>	38
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	38
Азр Ргс 1	> Агд	Суз Ьеи 5	ТЬг	Агд	Туг	Туг
<210>	39
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зарЬепз

ТЬг Агд Туг Туг Зег Зег 10 15

Агд Туг Туг Зег Зег РЬе 10 15

Туг Туг Зег Зег РЬе Уа1 10 15

Туг Зег Зег РЬе Уа1 Азп 10 15

Зег Зег РЬе Уа1 Азп МеЬ 10 15 <400> 39

- 35 027229

Агд Суз 1

Ьеи

ТЬг Агд 5

Туг

Туг

Зег

Зег

РЬе 10

Уа1

Азп

МеЬ

С1и

Агд 15

<210>

40

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зар±епз

<400>

40

Суз Ьеи

ТЬг

Агд Туг

Туг

Зег

Зег

РЬе

Уа1

Азп

МеЬ

С1и

Агд

Азр

1

5

10

15

<210>

41

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зар±епз

<400>

41

Ьеи ТЬг

Агд

Туг Туг

Зег

Зег

РЬе

Уа1

Азп

МеЬ

С1и

Агд

Азр

Ьеи

1

5

10

15

<210>

42

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зар±епз

<400>

42

ТЬг Агд

Туг

Туг Зег

Зег

РЬе

Уа1

Азп

МеЬ

С1и

Агд

Азр

Ьеи

А1а

1

5

10

15

<210>

43

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зар±епз

<400>

43

Агд Туг

Туг

Зег Зег

РЬе

Уа1

Азп

МеЬ

С1и

Агд

Азр

Ьеи

А1а

Зег

1

5

10

15

<210>

44

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зар±епз

<400>

44

Агд А1а

С1и

Уа1 С1и

Азр

Азп

11е

МеЬ

Уа1

ТЬг

РЬе

Агд

Азп

С1п

1

5

10

15

<210> 45 <211> 15 <212> РЕТ <213> Ното зарТепз

- 36 027229 <400> 45

А1а С1и 1

Уа1

С1и Азр 5

Азп

11е

МеЬ

Уа1

ТНг 10

РНе

Агд

Азп

С1п

А1а 15

<210>

4 6

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

46

С1и ναι

С1и

Азр Азп

11е

МеЬ

Уа1

ТНг

РНе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

1

5

10

15

<210>

47

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

47

ναΐ С1и

Азр

Азп 11е

МеЬ

Уа1

ТНг

РНе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

1

5

10

15

<210>

48

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

48

С1и Азр

Азп

11е МеЬ

Уа1

ТНг

РНе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

1

5

10

15

<210>

49

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

49

Азп 11е

МеЬ

Уа1 ТНг

РНе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Зег

1

5

10

15

<210>

50

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

50

11е МеЬ

Уа1

ТНг РНе

Агд

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Зег

РНе

1

5

10

15

<210> 51

- 37 027229 <211> 15 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 51

МеЬ Уа1 1

ТЬг

РЬе Агд 5

Азп

С1п

А1а

Зег

Агд 10

Рго

Туг

Зег

РЬе

Туг 15

<210>

52

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

52

Уа1 ТЬг

РЬе

Агд Азп

С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Зег

РЬе

Туг

Зег

1

5

10

15

<210>

53

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

53

ТЬг РЬе

Агд

Азп С1п

А1а

Зег

Агд

Рго

Туг

Зег

РЬе

Туг

Зег

Зег

1

5

10

15

<210>

54

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

54

Агд С1п

Ьуз

РЬе Зег

Зег

Ьеи

Туг

11е

Зег

С1п

РЬе

11е

11е

МеЬ

1

5

10

15

<210>

55

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

55

С1п Ьуз

РЬе

Зег Зег

Ьеи

Туг

11е

Зег

С1п

РЬе

11е

11е

МеЬ

Туг

1

5

10

15

<210>

56

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

56

Ьуз РЬе

Зег

Зег Ьеи

Туг

11е

Зег

С1п

РЬе

11е

11е

МеЬ

Туг

Зег

1

5

10

15

- 38 027229 <210> 57 <211> 15 <212> РКТ <213> Ното зарТепз <400> 57

РНе Зег Зег Ьеи Туг

11е

Зег

С1п

РНе

11е 10

11е

МеН

Туг

Зег

Ьеи 15

1

5

<210>

58

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

58

Зег Зег

Ьеи

Туг 11е

Зег

С1п

РНе

11е

11е

МеН

Туг

Зег

Ьеи

Азр

1

5

10

15

<210>

59

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

59

Ьеи Туг

11е

Зег С1п

РНе

11е

11е

МеН

Туг

Зег

Ьеи

Азр

С1у

Ьуз

1

5

10

15

<210>

60

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

60

Туг 11е

Зег

С1п РНе

11е

11е

МеН

Туг

Зег

Ьеи

Азр

С1у

Ьуз

Ьуз

1

5

10

15

<210>

61

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарТепз

<400>

61

11е Зег

С1п

РНе 11е

11е

МеН

Туг

Зег

Ьеи

Азр

С1у

Ьуз

Ьуз

Тгр

1

5

10

15

<210> 62 <211> 15 <212> РКТ <213> Ното зарТепз <400> 62

- 39 027229

Зег С1п РАе 1

11е 11е 5

МеЕ

Туг

Зег

Ьеи

Азр С1у Ьуз 10

Ьуз

Тгр

С1п 15

<210>

63

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

63

С1п РАе

11е

11е МеЕ

Туг

Зег

Ьеи

Азр

С1у

Ьуз

Ьуз

Тгр

С1п

ТАг

1

5

10

15

<210>

64

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

64

Н1з Азп

11е

РАе Азп

Рго

Рго

11е

11е

А1а

Агд

Туг

11е

Агд

Ьеи

1

5

10

15

<210>

65

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

65

Азп 11е

РАе

Азп Рго

Рго

11е

11е

А1а

Агд

Туг

11е

Агд

Ьеи

Н1з

1

5

10

15

<210>

66

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

66

11е РАе

Азп

Рго Рго

11е

11е

А1а

Агд

Туг

11е

Агд

Ьеи

Н1з

Рго

1

5

10

15

<210>

67

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

67

РАе Азп

Рго

Рго 11е

11е

А1а

Агд

Туг

11е

Агд

Ьеи

Н1з

Рго

ТАг

1

5

10

15

<210>	68
<211>	15
<212>	РЕТ

- 40 027229 <213> Ното зарЬепз <400> 68

Азп Рго Рго 1

11е 11е 5

А1а Агд Туг

11е

Агд 10

Ьеи

Н1з

Рго

ТЬг

Н1з 15

<210>

69

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

69

Рго 11е

11е

А1а Агд

Туг

11е

Агд

Ьеи

Н1з

Рго

ТЬг

Н1з

Туг

Зег

1

5

10

15

<210>

70

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

70

11е 11е

А1а

Агд Туг

11е

Агд

Ьеи

Н1з

Рго

ТЬг

Н1з

Туг

Зег

11е

1

5

10

15

<210>

71

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

71

11е А1а

Агд

Туг 11е

Агд

Ьеи

Н1з

Рго

ТЬг

Н1з

Туг

Зег

11е

Агд

1

5

10

15

<210>

72

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

72

А1а Агд

Туг

11е Агд

Ьеи

Н1з

Рго

ТЬг

Н1з

Туг

Зег

11е

Агд

Зег

1

5

10

15

<210>

73

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

73

Агд Туг

11е

Агд Ьеи

Н1з

Рго

ТЬг

Н1з

Туг

Зег

11е

Агд

Зег

ТЬг

1

5

10

15

- 41 027229

<210>	74
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	74
Рго Ргс	• Ьеи	Ьеи ТЬг Агд Туг Ьеи
1		5

Агд 11е Нтз Рго С1п Зег Тгр 10 15

<210>	75
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	75
Рго Ьеи	. Ьеи	ТЬг Агд Туг Ьеи Агд
1		5

11е Нтз Рго С1п Зег Тгр Уа1 10 15

<210>	76
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	76
Ьеи Ьеи	. ТЬг	Агд Туг Ьеи Агд 11е
1		5

Нтз Рго С1п Зег Тгр Уа1 Нтз 10 15

<210>	77
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	77
Ьеи ТЬг	Агд	Туг Ьеи Агд 11е Нтз
1		5

Рго С1п Зег Тгр Уа1 Нтз С1п 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> РЕТ <213> Ното зартепз <400> 78

ТЬг Агд Туг Ьеи Агд 11е Нтз Рго С1п Зег Тгр Уа1 Нтз С1п 11е 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> РЕТ <213> Ното зартепз <400> 79

Туг Ьеи Агд 11е Нтз Рго С1п Зег Тгр Уа1 Нтз С1п 11е А1а Ьеи

- 42 027229

1

5

10

15

<210>

80

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

80

Ьеи Агд

• 11е

Н1з Рго

С1п

Зег

Тгр

Уа1

Н1з

С1п

11е

А1а

Ьеи

Агд

1

5

10

15

<210>

81

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

81

Агд 11е

Н1з

Рго С1п

Зег

Тгр

Уа1

Н1з

С1п

11е

А1а

Ьеи

Агд

МеЬ

1

5

10

15

<210>

82

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

82

11е Н1з

Рго

С1п Зег

Тгр

Уа1

Н1з

С1п

11е

А1а

Ьеи

Агд

МеЬ

С1и

1

5

10

15

<210>

83

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

83

Н1з Рго

С1п

Зег Тгр

Уа1

Н1з

С1п

11е

А1а

Ьеи

Агд

МеЬ

С1и

Уа1

1

5

10

15

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (11)

1. Пептид, представляющий собой фрагмент фактора УШ, который подавляет или предупреждает образование антител-ингибиторов к фактору УШ ίη νίνο и который состоит из последовательности ΕΌММУТРНХОЛЗН.

2. Композиция для подавления или предупреждения образования антител-ингибиторов к фактору УШ ίη νίνο, содержащая пептид по п.1.

3. Применение пептида по п.1 для подавления или предупреждения образования антителингибиторов к фактору УШ ίη νίνο.

4. Применение композиции по п.2 для подавления или предупреждения образования антителингибиторов к фактору УШ ίη νίνο.

5. Применение пептида по п.1 для приготовления лекарственного средства для подавления или предупреждения образования антител-ингибиторов к фактору УШ ίη νίνο.

6. Применение композиции по п.2 для приготовления лекарственного средства для подавления или

- 43 027229 предупреждения образования антител-ингибиторов к фактору VШ ш νίνο.

7. Способ подавления или предупреждения образования антител-ингибиторов к фактору VШ у индивидуума, включающий стадию введения пептида по п.1 или композиции по п.2 указанному индивидууму.

8. Способ лечения гемофилии у индивидуума, включающий стадию введения пептида по п.1 или композиции по п.2 указанному индивидууму.

9. Способ по п.7 или 8, где указанный индивидуум страдает гемофилией А и подвергается или может быть подвергнут заместительной терапии путем введения фактора VIII.

10. Способ по п.7 или 8, где указанный индивидуум страдает приобретенной гемофилией или подвержен риску развития у него приобретенной гемофилии.

11. Способ по любому из пп.7-10, где у индивидуума экспрессируется НРА-ОК2.