CN102449136A - 微生物浓集方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于捕集或浓集微生物以用于检测或测定的方法，所述方法包括：(a)提供浓集装置，所述浓集装置包括含有至少一种浓集剂的烧结的多孔聚合物基质，所述至少一种浓集剂包含无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品；以及(c)使所述浓集装置与所述样品接触使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分结合至所述浓集装置或被所述浓集装置捕集。

Description

微生物浓集方法和装置
优先权声明
本专利申请要求2009年4月3日提交的美国临时专利申请号61/166,266的优先权，籍此将其内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于捕集或浓集微生物使得它们保持活力以便检测或测定的方法。在其他方面，本发明还涉及用于实施这种方法的浓集装置(以及包括该装置的诊断试剂盒)以及用于装置制备的方法。
背景技术
由微生物污染导致的食源性疾病和医院内获得性感染为世界各地许多地方所关注。因此，测定多种诊断样品、食品样品、环境样品或其它样品中细菌或其它微生物的存在以确定所存在的微生物的身份和/或量常常是合乎需要的或是必要的。
例如，可测定细菌DNA或细菌RNA，以甚至在存在其它细菌种类的情况下评估特定细菌种类的存在与否。然而，检测特定细菌的存在的能力至少部分取决于所分析的样品中细菌的浓度。可对细菌样品进行铺板或培养，以增加样品中细菌的数量，来确保足够的检测水平，但培养步骤通常需要大量的时间且因此会显著耽搁评估结果。
使样品中的细菌浓集可缩短培养时间或甚至消除对于培养步骤的需要。因此，已经开发了通过使用特定细菌菌株的特异性抗体(例如，为抗体包被的磁性颗粒或非磁性颗粒的形式)来分离(并由此浓集)该菌株的方法。然而，这些方法往往昂贵，而且对于至少一些诊断应用来说速度仍比期望的稍慢。
也已经使用了非菌株特异性的浓集方法(例如，以获得对样品中所存在的微生物的较为一般性的评估)。在浓集了微生物混合群体之后，如果需要，通过使用菌株特异性探针来测定特定菌株的存在。
已经通过基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法实现了微生物的非特异性浓集或捕集。涂覆壳聚糖的支持物已经用作非特异性捕集装置，并且用作微生物营养素的物质(例如，碳水化合物、维生素、铁螯合的化合物以及铁载体)也已经被描述为可用作配体以进行微生物的非特异性捕集。
多种无机材料(例如，羟基磷灰石和金属氢氧化物)已经用于非特异性结合和浓集细菌。物理浓集方法(例如，过滤、色谱法、离心和重力沉降)已经被用于非特异性捕集，其使用和/或不使用无机结合剂。这些非特异性浓集方法具有不同的速度(至少一些食品检测程序仍需要至少过夜孵育作为主培养富集步骤)、成本(至少一些需要昂贵的设备、材料和/或受训技术人员)、样品要求(例如，样品特性和/或体积限制)、空间要求、易于使用性(至少一些需要复杂的多步骤方法)、就地使用的合适性和/或有效性。
发明内容
因此，我们认为迫切需要用于快速检测病原微生物的方法。所述方法将优选不仅快速而且成本低、简单(不涉及复杂的设备或程序)和/或在多种条件下(例如，不同类型样品基质和/或病原微生物、不同微生物负荷以及不同样品体积)有效。
简而言之，在一个方面，本发明提供了一种用于非特异性浓集样品中存在的微生物菌株(例如，细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)和细菌内生孢子的菌株)的方法，使得微生物保留活力以便检测或测定一种或多种菌株。所述方法包括(a)提供下述浓集装置，其包括含有至少一种浓集剂的烧结多孔聚合物基质，所述浓集剂包含无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品(优选地，为流体形式)；以及(c)使浓集装置与样品接触(优选地，使样品穿过浓集装置)使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分结合至浓集装置或被浓集装置捕集。
优选地，所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌株的存在(例如，通过基于培养的检测方法、显微镜/成像检测方法、基因检测方法、基于发光的检测方法或免疫检测方法)。所述方法还可任选包括将浓集装置与样品分离和/或培养性地富集至少一种结合的微生物菌株(例如，通过在通用或微生物特异性的培养基中培养分离的浓集装置，这取决于需要通用的微生物富集还是选择性的微生物富集)、和/或在样品接触之后将捕集的微生物(或者其一个或多个组分)与浓集装置隔离或分离(例如，通过使洗脱剂或裂解剂穿过浓集装置)。
本发明的方法不靶向特定的微生物菌株。相反，已经发现，烧结多孔聚合物基质中包含相对低成本的无机材料的浓集装置可在捕集多种微生物中出乎意料地有效(并且相对不具有无机材料的相应装置而言，在通过洗脱隔离或分离捕集的微生物中出乎意料地有效)。这类装置可以以非菌株特异性方式浓集存在于样品(例如，食品样品)中的微生物菌株，使得可更容易且快速地测定一种或多种微生物菌株(优选地，一种或多种细菌菌株)。
本发明的方法相对简单且成本低(不需要复杂的设备或昂贵的菌株特异性材料)，并且可相对快速(相对于未接触浓集装置的相应对照样品，优选的实施例在少于约30分钟内捕集存在于相对均匀的流体样品中的微生物的至少约70％(更优选地，至少约80％；最优选地，至少约90％))。另外，所述方法可对于多种微生物(包括诸如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之类的病原体)和多种样品(不同的样品基质，并且与至少一些现有技术的方法不同，甚至具有低微生物含量和/或大体积的样品)有效。因此，本发明的方法的至少一些实施例可满足上述对于在多种条件下快速检测病原微生物的低成本、简单方法的迫切需要。
本发明的方法可尤其有利于浓集食品样品中的微生物(例如，含颗粒的食品样品，尤其是包含相对较粗颗粒的那些)，因为所述方法中所用的浓集装置与至少一些过滤装置(例如，绝对的微米过滤器)相比可显示具有至少稍高的抗阻塞性。这可有利于更完整的样品处理(这对于消除食品检测中的假阴性测定至关重要)和相对较大体积样品的处理(例如，在现场条件下)。
在另一方面，本发明还提供下述浓集装置，其包括含有至少一种浓集剂的烧结多孔聚合物基质，所述浓集剂包含无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比。本发明还提供可用于实施本发明的浓集方法的诊断试剂盒，所述试剂盒包括(a)本发明的至少一种所述浓集装置；和(b)用于实施上文所述浓集方法的至少一种检测容器或检测试剂。
在另一个方面，本发明提供用于制备浓集装置的方法，其包括(a)提供混合物，所述混合物包含(1)至少一种颗粒状的可烧结聚合物(优选地，为粉末形式)和(2)至少一种颗粒浓集剂，所述颗粒浓集剂包含无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比；以及(b)将混合物加热至足以烧结聚合物的温度，以便形成包含颗粒浓集剂的烧结多孔聚合物基质。
具体实施方式
在以下详细说明中，描述了各组数值范围(例如，特定部分中的碳原子数的数值范围、特定组分的量的数值范围等等)，并且在每组数值范围内，范围的任何下限可与范围的任何上限配对。
定义
本专利申请中使用的：
“浓集剂”是指用于浓集微生物的组合物；
“检测”是指鉴定微生物的至少一种组分，由此确定微生物的存在。
“基因检测”是指对衍生自靶微生物的遗传物质组分如DNA或RNA的鉴定。
“免疫检测”是指对衍生自靶微生物的抗原物质如蛋白质或蛋白多糖的鉴定。
“微生物”是指具有适于分析或检测的遗传物质的任何细胞或粒子(包括(例如)细菌、酵母菌、病毒和细菌内生孢子)；
“微生物菌株”是指可通过检测方法区分的特定类型的微生物(例如，不同属的微生物，属内不同种的微生物或种内不同分离物的微生物)；
“样品”是指所采集的(例如，待分析的)物质或材料；
“样品基质”是指除微生物以外的样品组分；
“烧结”(涉及大量的聚合物粒子)是指通过施加热引起聚合物粒子中的至少一些的粒间结合或粘合、而未引起完全的粒子熔融(例如，通过将大量的聚合物粒子加热至介于聚合物的玻璃化转变温度和熔点之间的温度以实现粒子软化)；
“可烧结的”(涉及聚合物)是指可被烧结的聚合物；
“被烧结的”(涉及基质)是指通过烧结形成的；
“靶微生物”是指需要检测的任何微生物；
“穿透孔”(涉及多孔基质)是指包括穿过基质的通道或沟槽(具有单独的入口和出口)的孔；
“曲折通道基质”是指具有至少一个曲折穿透孔的多孔基质。
浓集剂
适用于实施本发明的方法的浓集剂包括含有金属硅酸盐并且具有下述表面组成的那些，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于约0.5(优选地，小于或等于约0.4；更优选地，小于或等于约0.3；最优选地，小于或等于约0.2)的金属原子与硅原子比。优选地，表面组成还包括至少平均约10原子％的碳(更优选地，至少平均约12原子％的碳；最优选地，至少平均约14原子％的碳)，这经X射线光电子光谱(XPS)测定。XPS是一种可测定样品表面的最外侧约3至10纳米(nm)的元素组成并且对周期表中除氢和氦之外的所有元素均敏感的技术。XPS是一种定量技术，对于大多数原子而言检测极限在0.1至1原子％浓度范围。XPS的优选表面组成评价条件可包括相对于接受立体角为±10度的样品表面测得的90度的飞离角。
使用上述浓集剂进行的浓集或捕集通常不特异性针对任何特定株系、种或类型的微生物，因此提供了对样品中微生物全体群落的浓集。然后，可使用任何已知的检测方法用特异性探针从捕集的微生物群落中检测特定的微生物菌株。因此，所述浓集剂可用于检测临床样品、食品样品、环境样品或其它样品中的微生物污染物或病原体(特别是食源性病原体，例如细菌)。
当分散于或悬浮于水体系中时，无机材料如金属硅酸盐呈现出材料和水体系pH特征性的表面电荷。整个材料-水界面上的电势称为“ζ电势”，其可通过电泳迁移率(即，材料颗粒在设置于水体系中的带电电极之间移动的速率)进行计算。在实施本发明的方法时所用的浓集剂具有比例如常用金属硅酸盐(如普通滑石粉)更负的ζ电势。然而令人惊讶地是，浓集剂比滑石粉更有效地浓集表面通常趋于带负电的微生物(如细菌)。优选地，浓集剂在约为7的pH下具有负ζ电势(更优选地，在约为7的pH下约-9毫伏至约-25毫伏范围内的Smoluchowskiζ电势；甚至更优选地，在约为7的pH下约-10毫伏至约-20毫伏范围内的Smoluchowskiζ电势；最优选地，在约为7的pH下约-11毫伏至约-15毫伏范围内的Smoluchowskiζ电势)。
可用的金属硅酸盐包括金属(例如镁、钙、锌、铝、铁、钛等(优选地，镁、锌、铁和钛；更优选地，镁)以及它们的组合)的无定形硅酸盐。优选的是至少部分熔融颗粒形式的无定形金属硅酸盐(更优选地，无定形的球化金属硅酸盐；最优选地，无定形的球化硅酸镁)。金属硅酸盐为已知的并且可通过已知方法进行化学合成或者通过开采和加工天然存在的原始矿石获得。
无定形的至少部分熔融颗粒形式的金属硅酸盐可通过下述已知方法中的任何一种来制备，所述已知方法为在可控条件下熔融或软化相对小的进料粒子(例如，平均粒度至多为约25微米)以制备大致椭圆形或球形粒子(即，具有通常为大致圆形且不含尖角或尖锐边缘的放大二维图像的粒子，包括真正或基本上圆形和椭圆形的形状以及任何其它的圆形或弯曲形状)。这种方法包括原子化、火抛光、直接熔融等等。优选方法为火焰熔融，其中通过直接熔融或火抛光固体进料粒子形成至少部分熔融的、基本上玻璃状的粒子(例如，如同描述于美国专利号6,045,913(Castle)的方法，其说明书以引用方式并入本文中)。最优选地，这种方法可通过将无规则形状进料粒子的相当大一部分(例如，约15至约99体积％；优选地，约50至约99体积％；更优选地，约75至约99体积％；最优选地，约90至约99体积％)转换成大致椭圆形或球形的粒子而用于制备无定形的球化金属硅酸盐。
一些无定形金属硅酸盐为市售的。例如，无定形的球化硅酸镁可商购获得以用于化妆品制剂(例如，以3MTM Cosmetic MicrospheresCM-111，得自3M公司(St.Paul，MN))。
除了无定形金属硅酸盐之外，浓集剂还可包括其它材料，该其它材料包括金属(例如，铁或钛)的氧化物、结晶金属硅酸盐、其它结晶材料等等，前提条件是浓集剂具有上文所述的表面组成。然而，浓集剂优选基本上不含结晶二氧化硅。
在实施本发明的方法中，浓集剂可以基本上任何颗粒形式(优选地，相对干燥或不含挥发物的形式)使用，所述颗粒形式适于与颗粒聚合物共混以形成用于所述方法中的浓集装置。例如，浓集剂可以粉末形式使用或者可施用至诸如微珠等等的颗粒载体。
优选的是，浓集剂以粉末形式使用。可用的粉末包括含有微粒(优选地，粒度范围为约1微米(更优选地，约2微米)至约100微米(更优选地，约50微米；甚至更优选地，约25微米；最优选地，约15微米；其中任何下限可与上述范围中的任何上限配对))的那些。
浓集装置
适用于实施本发明的方法的浓集装置包括具有烧结的多孔聚合物基质的那些，所述烧结的多孔聚合物基质包含上述浓集剂中的至少一种。可(例如)通过下述方式来制备这种浓集装置，即将至少一种颗粒状的可烧结聚合物(优选地，为粉末形式)与至少一种颗粒浓集剂混合或共混并随后将所得混合物加热至足以烧结该聚合物的温度。此方法以及其它已知或将来开发的烧结方法可用于在冷却之后提供包含颗粒浓集剂的烧结的多孔聚合物基质。
例如，烧结可引起聚合物粒子在其接触点发生软化，并且接下来的冷却可随后引起粒子的熔合。可产生包含颗粒浓集剂的硬化或自支承的多孔聚合物主体(例如，其中浓集剂嵌入到聚合物主体内或聚合物主体的表面上)。这可提供具有相对复杂孔结构(优选地，包括曲折通道基质的浓集装置)和相对良好机械强度的浓集装置。
适用于制备浓集装置的聚合物包括可烧结聚合物及其组合。优选的可烧结聚合物包括热塑性聚合物及其组合。更优选地，热塑性聚合物可被选择为具有相对较高的粘度和相对较低的熔融流速。这可有利于烧结过程期间的粒子形状保持。
可用的可烧结聚合物包括聚烯烃(包括烯烃均聚物和共聚物以及烯烃和其它乙烯基单体的共聚物)、聚砜、聚醚砜、聚苯硫醚等等以及它们的组合。可用聚合物的代表性实例包括乙烯醋酸乙烯酯(EVA)聚合物、乙烯丙烯酸甲酯(EMA)聚合物、聚乙烯(包括(例如)低密度聚乙烯(LDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)和超高分子量聚乙烯(UHMWPE))、聚丙烯、二元乙丙橡胶、三元乙丙橡胶、聚苯乙烯、聚(1-丁烯)、聚(2-丁烯)、聚(1-戊烯)、聚(2-戊烯)、聚(3-甲基-1-戊烯)、聚(4-甲基-1-戊烯)、1，2-聚-1，3-丁二烯、1，4-聚-1，3-丁二烯、聚异戊二烯、聚氯丁二烯、聚(醋酸乙烯酯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(四氟乙烯)等等以及它们的组合。
优选的聚合物包括烯烃均聚物和共聚物(特别是聚乙烯、聚丙烯、乙烯醋酸乙烯酯聚合物以及它们的组合)。更优选的聚合物包括烯烃均聚物及其组合(甚至更优选地，聚乙烯及其组合；最优选地，超高分子量聚乙烯(UHMWPE)及其组合)。可用的超高分子量聚乙烯包括分子量为至少约750,000(优选地，至少约1,000,000；更优选地，至少约2,000,000；最优选地，至少约3,000,000)的那些。
可使用宽范围的聚合物粒度，这取决于烧结的多孔聚合物基质中所需的孔(例如，洞、凹陷、或优选地，沟槽)尺寸。较细小粒子可在烧结基质中提供较细小的孔尺寸。一般来讲，聚合物粒子可为微粒(例如，粒度或直径范围为约1微米至约800微米；优选地，约5微米至约300微米；更优选地，约5微米至约200微米；最优选地，约10微米至约100或200微米)，以便提供微米或更低量级的孔尺寸。可使用不同的均值(平均)和/或中值粒度(例如，可使用约30微米至约70微米的平均粒度)。如果需要，则可通过使用较高和较低熔融流速的聚合物的共混物来改变或控制烧结基质中的孔隙度。
可将聚合物粒子和颗粒浓集剂(以及任何可选的添加剂，例如润湿剂或表面活性剂)进行混合和机械性共混(例如，使用商业混合设备)以形成混合物(优选地，均匀混合物)。一般来讲，基于混合物中的所有粒子的总重量，混合物中存在的颗粒浓集剂的浓度可为至多约90重量％(优选地，约5至约85重量％；更优选地，约10至约80重量％；最优选地，约15至约75重量％)。如果需要，可在混合物中包含少量(例如，至多约5重量％)的常规添加剂(例如，润湿剂、表面活性剂等等)。
可将所得混合物设置在模具或其它合适的容器或基底中。可用的模具可由碳素钢、不锈钢、黄铜、铝等制成，并且可具有单个腔体或多个腔体。腔体可具有基本上任何所需形状，前提条件是在完成处理之后可将其烧结的内容物从模具中移出。优选的是，可通过使用商业粉末处理和/或振动设备来辅助模具填充。
可通过将热引至模具(例如，通过电阻加热、电感应加热或蒸汽加热)来实施热处理。可将模具加热至足以烧结聚合物的温度(例如，通过加热至略低于聚合物的熔点的温度)。烧结方法为已知的并且可根据所用聚合物的特性和/或形式进行选择。任选的是，可在加热过程期间将压力施加至混合物。在热处理之后，可允许模具自然地或通过使用基本上任何方便的冷却方法或装置冷却至环境温度(例如，约23℃的温度)。
可通过使用美国专利No.7,112,272、No.7,112,280和No.7,169,304(Hughes等人)中所述的聚合物粒子和处理方法来制备优选的浓集装置，所述粒子和方法的描述以引用方式并入本文中。可将两种不同类型的超高分子量聚乙烯(UHMWPE)粒子共混在一起，其中一种为“爆米花形”(具有表面卷旋)并且另一种为基本球形的。优选的“爆米花形”和球形UHMWPE分别以PMX CF-1(具有0.25-0.30克/立方厘米的堆密度和约30至40微米的平均直径(范围为约10微米至约100微米))和PMX CF-2(具有0.40-0.48克/立方厘米的堆密度和约55至65微米的平均直径(范围为约10微米至约180微米))得自Ticona(总部位于Frankfurt，Germany的Celanese的分部)。还可使用得自其它制造商的具有类似形态、堆密度和粒度并且具有约750,000至约3,000,000范围内的分子量的UHMWPE。两种类型的UHMWPE粒子可被选择为具有相同或不同的分子量(优选地，两者均具有位于所述范围内的相同分子量；更优选地，两者均具有约3,000,000的分子量)。
可将两种不同类型的UHMWPE粒子以不同的相对量(例如，等量)进行混合并且随后与浓集剂以上述比率进行进一步地混合。任一种UHMWPE可以相比另一种较小的量使用、或者可甚至从混合物中省去，这取决于浓集装置的所需特性。
可将选定的粒子共混在一起以形成优选均匀的混合物。例如，可使用带状共混器等等。可将所得的混合物设置在模具腔体中，此时优选利用基本上任何标准的机械振动器同时进行振动。在填充和振动周期结束时，可将模具加热至足以烧结聚合物的温度(一般来讲，范围为约225℉至约375℉或更高的温度，这取决于聚合物的分子量)。
冷却之后，可获得自支承的烧结的多孔聚合物基质。基质可显示具有复杂的内部结构(包括具有不同直径的互连的多向穿透孔)并且可因而包括优选的曲折通道基质(用作本发明的浓集方法中的浓集装置)。如果需要，浓集装置还可包括一种或多种其它部件，例如(如)一种或多种预滤器(例如，以在样品穿过多孔基质之前从样品移除相对较大的食品粒子)、用于在整个装置上施加压差的歧管(例如，以有助于使样品穿过多孔基质)、和/或外部壳体(例如，容纳和/或保护多孔基质的一次性料筒)。
样品
本发明的方法可用于多种不同类型的样品，包括但不限于医学样品、环境样品、食品样品、饲料样品、临床样品和实验室样品以及它们的组合。医学或兽医样品可包括(例如)来自生物来源(例如，人或动物)的待测定以便进行临床诊断的细胞、组织或流体。环境样品可为(例如)来自医学或兽医设施、工业设施、土壤、水源、食品制备区(食品接触和非接触区)、实验室或已潜在遭受生物恐怖的区域。优选的是食品加工、处理以及制备区样品，这是因为这些在细菌病原体导致的食品供应污染方面常常受到特别的关注。
以液体形式或者以固体在液体中的分散体或悬浮液形式获得的样品可直接使用，或可进行浓集(例如，通过离心法)或稀释(例如，通过添加缓冲(控制pH的)溶液)。固体或半固体形式的样品可直接使用或可根据需要通过(例如)用流体介质(例如，缓冲溶液)洗涤或冲洗或者悬浮或分散于流体介质中的方法来提取。可从表面(例如，通过擦拭或冲洗)获取样品。优选地，样品为流体(例如，液体、气体或者固体或液体在液体或气体中的分散体或悬浮液)。
可用于实施本发明的方法的样品的实例包括食品(例如，新鲜农产品或即食型午餐或“deli”肉)、饮料(例如，果汁或碳酸盐饮料)、饮用水和生物流体(例如，全血或其组分，例如血浆、富含血小板的血液级分、血小板浓缩物或浓缩红血细胞；细胞制剂(例如，分散的组织、骨髓抽吸物或椎体骨髓)；细胞悬浮液；尿液、唾液、以及其它体液；骨髓；肺流体；脑流体；伤口渗出物；伤口活检样品；眼液；脊髓液等)、以及可使用已知程序(例如使用裂解缓冲液)形成的裂解制剂(例如细胞裂解物)等。优选的样品包括食品、饮料、饮用水、生物流体以及它们的组合(更优选为食品、饮料、饮用水以及它们的组合)。
样品体积可根据具体应用而不同。例如，当本发明的方法用于诊断或研究应用时，样品的体积可通常为微升范围(例如，10微升或更大)。当所述方法用于食品病原体检测分析或用于饮用水安全性检测时，样品的体积可通常为毫升至升的范围(例如，100毫升至3升)。在工业应用中，例如生物工艺或制药配方中，所述体积可为成千上万升。
本发明的方法可从浓集状态的样品分离微生物，并且还可使得能从可对待使用的检测程序造成限制的样品基质组分分离微生物。在所有这些情况中，本发明的方法可伴随或替代其它的微生物浓集方法而使用。因此，任选地，如果需要另外的浓集，可在实施本发明的方法之前或之后从样品培养培养物。这种培养富集可为总体的或初级的(以便富集大部分或基本上所有微生物的浓集物)或者可为特异性或选择性的(以便仅富集一种或多种选定微生物的浓集物)。
接触
可通过多种已知的或将来开发的提供两种材料间接触的方法中的任何一种来实施本发明的方法。例如，可将浓集装置添加至样品，或者可将样品添加至浓集装置。可将浓集装置浸于样品中、可将样品倾注到浓集装置上、可将样品倾注到含有浓集装置的管或孔内，或优选地，可使样品在浓集装置其上或其内(优选地，其内)穿过(或反之亦然)。优选地，以下述方式进行接触，即，使样品穿过烧结的多孔聚合物基质的至少一个孔(优选地，穿过至少一个穿透孔)。
可在多种容器或储存器中的任何一者(任选地，带盖、闭合、或密封的容器；优选地，设计用于容纳基本上无样品渗漏的装置的柱、注射筒、或另一个储存器)内组合(使用任何添加顺序)浓集装置和样品。用于实施本发明的方法的合适容器将由具体样品决定，并且可在尺寸和性质上大不相同。例如，所述容器可为小容器(例如10微升容器(例如，试管或注射器))或较大容器(例如100毫升至3升容器(例如，锥形瓶或环状圆柱形容器)。
直接接触样品的容器、浓集装置、以及任何其它装置或添加剂可在使用前进行灭菌(例如，通过受控热、环氧乙烷气体或辐射来进行)，以便减少或防止任何可导致检测误差的样品污染。浓集装置中足以捕集或浓集特定样品的微生物以便成功检测的浓集剂的量是可变动的(取决于例如，浓集剂和装置的性质和形式以及样品的体积)，并且可由本领域的技术人员容易地确定。
可进行接触达所需的时间段(例如，对于等于或小于约100毫升体积的样品，最多约60分钟的接触可以是有用的；优选地，约15秒至约10分钟或更长时间；更优选地，约15秒至约5分钟；最优选地，约15秒至约2分钟)。任选但可优选的是，可通过混合(例如，通过搅动、摇动或通过在整个装置上施加压差以有利于样品穿过其多孔基质)和/或通过孵育(例如，在环境温度下)来增强接触，以便增加浓集装置的微生物接触。
优选的是，可通过使样品穿过浓集装置(例如，通过泵送)至少一次(优选地，仅一次)来实现接触。可使用用于在整个装置(例如，注射器或柱塞)上建立压差的泵(例如，蠕动泵)或其它设备中的基本上任何一种。以高达约100毫升/分钟或更高的样品流速穿过所述装置可为有效的。优选地，可使用约10-20毫升/分钟的流速。
优选的接触方法包括使样品如此穿过浓集装置(例如，通过泵送)并随后利用浓集装置(例如，在上述容器中的一者内)孵育(例如，约3小时至约24小时；优选地，约4小时至约20小时)含微生物的样品(优选地，流体)。如果需要，可在接触期间在浓集装置和样品的组合中包含一种或多种添加剂(例如，裂解试剂、生物发光测定试剂、核酸捕集试剂(例如，磁珠)、微生物生长培养基、缓冲液(例如，用于润湿固体样品)、微生物染色试剂、清洗缓冲液(例如，清洗掉未结合的材料)、洗脱试剂(例如，血清白蛋白)、表面活性剂(例如，TritonTM X-100非离子表面活性剂，得自Union CarbideChemicals and Plastics(Houston，TX))、机械摩擦/洗脱剂(例如，玻璃珠)等)。
本发明的方法还可任选包括分离结合微生物的浓集装置与样品。可通过本领域中熟知的多种方法来进行分离(例如，通过泵送、滗析或虹吸流体样品，以便将结合微生物的浓集装置留在用于实施所述方法的容器或储存器中)。另外可以在样品接触之后从浓集装置隔离或分离(例如，通过使洗脱剂或裂解剂在浓集装置之上或之内穿过)捕集的微生物(或者其一种或多种组分)。
本发明的方法可人工实施(例如，以批次方式)或可为自动的(例如，以便能够进行连续或半连续处理)。
检测
可通过使用本发明的方法来浓集并且任选但优选地检测多种微生物，包括(例如)细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)、细菌内生孢子(例如，芽孢杆菌属(包括炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和梭状芽孢杆菌(包括肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)和产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)))等等以及它们的组合(优选地，细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子、真菌以及它们的组合；更优选地，细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合；甚至更优选地，细菌、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合；最优选地，革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、无包膜病毒(例如，诺罗病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、鼻病毒以及它们的组合)、细菌内生孢子以及它们的组合)。所述方法可用于检测病原体，这对于食品安全或对于医学、环境或反恐原因来说是重要的。所述方法尤其可用于检测病原性细菌(例如，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)以及多种酵母菌、霉菌和支原体(以及这些中的任何的组合)。
待检测的靶微生物属包括(但不限于)李斯特菌属(Listeria)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、螺杆菌属(Helicobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、志贺氏菌属(Shigella)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、博德特氏菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)等以及它们的组合。样品可含有多种微生物菌株，并且任何一种菌株可独立于任何其它菌株而被检测到。可作为检测靶的具体微生物菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(无害李斯特菌为替代物)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、葡萄球菌肠毒素亚种(Staphylococcal enterotoxin ssp)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等、以及它们的组合(优选地，金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、酿酒酵母菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、人类感染性无包膜肠道病毒(大肠杆菌噬菌体为替代物)以及它们的组合)。
已被浓集装置捕集或结合(例如，通过吸附或通过筛分)的微生物可通过基本上任何目前已知或将来开发的所需方法来检测。这类方法包括(例如)基于培养的方法(当时间允许时可为优选的)、显微镜法(例如，使用可用于观察标记有荧光染料的微生物的透射光显微镜或落射荧光显微镜)以及其它成像方法、免疫检测方法和遗传检测方法。微生物捕集后的检测过程可任选包括洗涤以移除样品基质组分、切片或者说是打碎浓集装置中烧结的多孔聚合物基质、染色等等。
免疫检测是对衍生自靶生物体的抗原物质的检测，该抗原物质通常是充当细菌或病毒颗粒的表面上的标志的生物分子(例如，蛋白质或蛋白多糖)。抗原物质的检测通常可通过抗体、选自诸如噬菌体展示之类的过程的多肽或来自筛选过程的适体来进行。
免疫检测方法是熟知的，并且包括(例如)免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可以多种方式(例如，通过用荧光染料、用量子点或用可产生化学发光的酶或有色底物来标记第一抗体或第二抗体，和使用读板机或侧流装置)来检测抗体结合。
还可通过基因检测(例如，通过核酸杂交或引物指导的扩增)来进行检测，基因检测常常是优选的方法。可将捕集或结合的微生物裂解，以使它们的遗传物质可供检测。裂解方法是熟知的，包括例如下述处理：声裂法、渗压震扰、高温处理(例如，约50℃至约100℃)以及与酶一起孵育，该酶例如为溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶(zymolose)、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒内溶素。
许多常用的基因检测分析可检测特定微生物的核酸，包括DNA和/或RNA。基因检测方法中使用的条件的严格性与所检测的核酸序列的变异水平相关。高严格的盐浓度和温度条件可使检测限于靶标的精确核酸序列。因此，使用高度严格的基因检测可区分靶核酸序列存在小变异的微生物菌株。基因检测可以基于核酸杂交，其中，单链核酸探针与微生物的变性核酸杂交，使得产生包含探针链的双链核酸。本领域技术人员应熟悉用于在凝胶电泳、毛细管电泳或其它分离方法之后检测杂交物的探针标记，例如放射性标记、荧光标记以及化学发光标记。
特别有用的基因检测方法是基于引物指导的核酸扩增。引物指导的核酸扩增方法包括(例如)热循环方法(例如，聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)以及连接酶链反应(LCR))以及等温法和链置换扩增(SDA)(以及它们的组合，优选地，为PCR或RT-PCR)。用于检测扩增产物的方法包括(但不限于)例如凝胶电泳分离和溴化乙锭染色以及检测产物中掺入的荧光标记或放射性标记。还可使用在检测扩增产物之前不需要分离步骤的方法(例如，实时PCR或均相检测)。
生物发光检测方法是熟知的，并且包括(例如)三磷酸腺苷(ATP)检测方法，包括美国专利No.7,422,868(Fan等人)中所描述的那些，将其说明内容以引用方式并入本文。也可使用其它基于发光的检测方法。
由于本发明方法是非菌株特异性的，它提供了容许在同一样品中靶向多种微生物菌株以便检测的通用捕集系统。例如，在测定食品样品的污染时，将同一样品中的单核细胞增多性李斯特菌、大肠杆菌以及沙门氏菌一并检测是合乎需要的。在单个捕集步骤之后接着可进行例如PCR或RT-PCR测定，其使用特异性引物来扩增来自这些微生物菌株中每个菌株的不同核酸序列。因此，可避免需要对每个菌株分开进行样品处理和制备程序。
诊断试剂盒
用于实施本发明的浓集方法的诊断试剂盒包括(a)至少一种上述浓集装置；和(b)用于实施本发明的浓集方法的至少一种检测容器或检测试剂(优选地，无菌检测容器或检测试剂)。优选地，诊断试剂盒还包括用于实施所述方法的说明书。
可用的检测容器或储存器包括上文所述的那些并且可用于(例如)接触、孵育、采集洗脱液或其它所需的方法步骤。可用的检测试剂包括微生物培养基或生长培养基、裂解剂、洗脱剂、缓冲液、发光检测分析组分(例如，发光计、裂解试剂、荧光素酶、酶底物、反应缓冲液等等)、基因检测分析组分等等以及它们的组合。优选的裂解剂是在缓冲液中提供的分解酶或化学品，并且优选的基因检测分析组分包括靶微生物的一种或多种特异性引物。所述试剂盒还可任选包括无菌镊子等等。
实例
下面的实例将进一步说明本发明的目的和优点，但这些实例中列举的具体材料及其量以及其它条件和细节不应被解释为是对本发明的不当限制。所有微生物培养物均购自美国模式培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)。
浓集剂
结晶硅酸镁浓集剂(下文中，滑石粉)购自Mallinckrodt Baker公司(Phillip sburg，NJ)。
无定形的球化硅酸镁浓集剂(下文中，AS-滑石粉)以3MTM CosmeticMicrospheres CM-111(成型为实体球；粒子密度为2.3克/立方厘米；表面积为3.3m2/克；粒度：90％小于约11微米、50％小于约5微米、10％小于约2微米；得自3M公司(St.Paul，MN))获得。
ζ电势测定
利用装配有TM200自动滴定模块、pH电极和在线电导池的Colloidal Dynamics Acoustosizer IITM多频电声光谱分析仪(ColloidalDynamics，Warwick，RI)进行测定，滑石粉和AS-滑石粉浓集剂的水分散体(分别为18兆欧姆的去离子水中的5.75重量％的滑石粉和5.8重量％的AS滑石粉，所述去离子水是通过使用得自Millipore公司(Bedford，MA)的Milli-QTM Elix 10TM Synthesis A10去离子系统获得的)的ζ电势随所添加的盐酸(pH)而变化。利用具有下述一般参数的极性校正和极性样品设定来进行测定：
在约7的pH下，AS-滑石粉显示具有约-12mV的Smoluchowskiζ电势，而滑石粉具有约-8mV的Smoluchowskiζ电势。
表面组成分析
通过X射线光电子光谱(XPS；也称为ESCA)来分析滑石粉和AS-滑石粉浓集剂样品的表面组成。将粉末样品挤压到铝箔的双面压敏粘合剂条带上。通过利用压缩氮气吹扫从每个样品表面移除过量的粉末。
利用具有工作在固定通能模式下的单色Al-KαX射线激发源(1487eV)和半球状电子能量分析器的Kratos AXIS UltraTM DLD光谱仪(Kratos Analytical，Manchester，England)来采集光谱数据。在相对于接受立体角为±10度的样品表面测得的90度的飞离角下检测发出的光电子。使用低能量电子流枪来使表面充电最小化。利用140瓦的阳极功率和2×10-8托的室压进行测定。
对个各个数据点分析每个浓集剂样品的测量为约300微米×约700微米的表面区域。分析每个样品的三个区域并求平均值以获得平均原子百分比记录值。使用标准Vision2TM软件(Kratos Analytical，Manchester，England)来进行数据处理。结果(在XPS的可检测水平下存在于浓集剂表面上的元素)示于下表A中：
表A.
Figure BDA0000111831070000211
浓集剂筛检：微生物浓集检测方法
将分离的微生物菌落接种于5mL BBLTM TrypticaseTM大豆肉汤(Becton Dickinson，Sparks，MD)中并在37℃下孵育18-20小时。将约109个菌落形成单位/mL的该过夜培养物在pH7.2的吸附缓冲液(含5mMKCl、1mM CaCl2、0.1mMmgCl2以及1mM K2HPO4)中稀释，获得103个微生物/mL的稀释液。将1.1mL体积的微生物稀释液添加至各经标记的含10mg浓集剂的无菌5mL聚丙烯管(BD FalconTM，BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)，给各管封盖，并在Thermolyne MaximixPlusTM涡旋混合器(Barnstead International，Iowa)上混合。在室温(25℃)下于Thermolyne Vari MixTM振荡器平台(Barnstead International，Iowa)上孵育各封盖的管15分钟。在孵育后，让各管在试验台上静放10分钟以使浓集剂沉降下来。以相同方式处理含有1.1mL微生物稀释液但无浓集剂的对照样品管。然后将所得的沉降的浓集剂和/或上清液(以及对照样品)用于分析。
根据制造商的说明书，将沉降的浓集剂重悬浮于1mL的无菌巴特非尔德氏(Butterfield’s)缓冲溶液(pH为7.2±0.2；磷酸二氢钾缓冲溶液；VWR目录号83008-093，VWR，West Chester，PA)中并且铺板至3MTMPetrifilmTM好氧性微生物计数板培养基(干燥，可再水合的；3M公司(St.Paul.，MN))。使用3MTM PetrifilmTM读板机(3M公司(St.Paul.，MN))对好氧性微生物计数进行量化。使用下式计算结果：
重悬浮的浓集剂中的CFU百分数/mL＝
(来自铺板的重悬浮的浓集剂的菌落数)/(来自铺板的未处理的对照样品的菌落数)×100
(其中，CFU＝菌落形成单位，其为活的或有活力的微生物的单位)。
然后使用下式以微生物被浓集剂捕集的百分数来报告结果：
捕集效率或捕集百分数＝重悬浮的浓集剂中的CFU百分数/mL浓集剂
出于比较目的，在至少一些情况下，取出1mL上清液，未经稀释进行铺板或在巴特非尔德氏缓冲液中1∶10稀释来铺板，铺板至3MTMPetrifilmTM好氧性微生物计数板培养基。使用3MTM PetrifilmTM读板机(3M公司(St.Paul.，MN))对好氧性微生物计数进行量化。使用下式计算结果：
上清液中的CFU百分数/mL＝
(来自铺板的上清液的菌落数)/(来自铺板的未处理的对照样品的菌落数)×100
(其中，CFU＝菌落形成单位，其为活的或有活力的微生物的单位)。
当微生物菌落和浓集剂的颜色相似时(给读板机提供的对比度很小)，结果是基于上清液，因而使用下式以微生物被浓集剂捕集的百分数来报告结果：
捕集效率或捕集百分数＝100-上清液中的CFU百分数/mL
浓集剂筛检1和2以及对比筛检1和2
利用上述微生物浓集检测方法，分别测定10mg无定形的球化硅酸镁(按上述方式制备；下文中，AS-滑石粉)和结晶(非球化)硅酸镁(下文中，滑石粉)对靶微生物革兰氏阴性菌肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的细菌浓集作用。结果示于下表1中(所有样品的标准差均小于10％)。
表1.
  筛检号   微生物   浓集剂   捕集百分数
  C-1   葡萄球菌   滑石粉   58
  1   葡萄球菌   AS-滑石粉   99
  C-2   沙门氏菌   滑石粉   69
  2   沙门氏菌   AS-滑石粉   92
浓集剂筛检3-5以及对比筛检3-5
利用上述微生物浓集检测方法，分别测定每单位体积不同重量的AS-滑石粉和滑石粉对靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的细菌浓集作用。结果示于下表2中(所有样品的标准差均小于10％)。
表2.
Figure BDA0000111831070000241
浓集剂筛检6-8以及对比筛检6-8
利用上述微生物浓集检测方法，分别测定10毫克AS-滑石粉和滑石粉对靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的不同细菌浓集作用。结果示于下表3中。
表3.
浓集剂筛检9-11以及对比筛检9-11
利用上述微生物浓集检测方法，分别测定10毫克AS-滑石粉和滑石粉对培养5、10和15分钟的靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的细菌浓集作用。结果示于下表4中(所有样品的标准差均小于10％)。
表4.
  筛检号   微生物   浓集剂   孵育时间(分钟)   捕集百分数
  C-9   沙门氏菌   滑石粉   5   74
  9   沙门氏菌   AS-滑石粉   5   97
  C-10   沙门氏菌   滑石粉   10   77
  10   沙门氏菌   AS-滑石粉   10   96
  C-11   沙门氏菌   滑石粉   15   75
  11   沙门氏菌   AS-滑石粉   15   92
浓集剂筛检12以及对比筛检12
利用上述微生物浓集检测方法，不同之处为使用巴特非尔德氏缓冲溶液代替吸附缓冲液，分别测定10毫克AS-滑石粉和滑石粉对靶微生物酿酒酵母菌(102CFU/mL；ATCC 201390)的酵母菌浓集作用。根据制造商的说明书，将所得的材料铺板于3MTM PetrifilmTM酵母菌和霉菌计数板培养基(干燥，可再水合；3M公司(St.Paul，MN))，并孵育5天。对分离的酵母菌落进行手工计数，并如上所述计算出捕集百分数。AS-滑石粉和滑石粉的捕集百分数分别为97％和82％(所有样品的标准差均小于10％)。
浓集剂筛检13-15
食品样品购自本地杂货店(Cub Foods，St.Paul)。将火鸡片和苹果汁(11g)在无菌玻璃盘中称重并且添加至无菌StomacherTM聚乙烯过滤袋(Seward公司(Norfolk，UK))。利用肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的18-20小时过夜培养物(原液)以102CFU/mL浓度用所述细菌培养物对食品样品进行接种。随后将99mL巴特非尔德氏缓冲溶液添加至各个接种样品。将所得的样品在StomacherTM400循环实验室共混仪(Seward公司(Norfolk，UK))中共混2分钟周期。将共混的样品收集在无菌的50mL离心管(BD FalconTM，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中并且以2000转/分钟(rpm)离心5分钟以移除大碎屑。将所得的上清液用作进一步检测的样品。在检测之前通过添加1N的氢氧化钠(VWR，West Chester，PA)将基于苹果汁的上清液的pH调节至7.2。将得自饮水喷头的饮用水(100mL)收集在无菌的250mL玻璃瓶(VWR，West Chester，PA)中并利用102CFU/mL的靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)进行接种，手动端对端(end-to-end)混合5次，并在室温(25℃)下孵育15分钟。将此水样品用于进一步检测。
利用上述微生物浓集检测方法，分别将如上制备的各1mL检测样品添加至含有10毫克AS-滑石粉的检测管并用于检测对靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的细菌浓集作用。结果示于下表5中(所有样品的标准差均小于10％)。
表5.
  筛检号   微生物   浓集剂   样品   捕集百分数
  13   沙门氏菌   AS-滑石粉   苹果汁   86
  14   沙门氏菌   AS-滑石粉   火鸡   78
  15   沙门氏菌   AS-滑石粉   水   98
浓集剂筛检16和17
测定AS-滑石粉对得自大体积样品(300毫克AS-滑石粉/30mL样品体积)的靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的浓集作用。将得自饮水喷头的饮用水(100mL)收集在无菌的250mL玻璃瓶(VWR，West Chester，PA)中并利用102CFU/mL的靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)进行接种。将所得的接种水手动端对端混合5次并在室温(25℃)下孵育15分钟。将孵育水的30mL样品添加至含有300毫克AS-滑石粉的无菌的50mL锥形聚丙烯离心管(BD FalconTM，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)并且利用上述微生物浓集检测方法进行检测。将所得的沉降AS-滑石粉重悬浮于30mL无菌的巴特非尔德氏缓冲溶液中并将1mL的所得悬浮液铺板至3MTM PetrifilmTM好氧性微生物计数板培养基。捕集百分数为98％(标准差小于10％)。
将得自本地杂货店(Cub Foods，St.Paul)的整个圣女果(grapetomato)(11g)置于无菌培养皿中并利用102CFU/mL的靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)进行接种，通过涡旋手动混合5次，并在室温(25℃)下孵育5分钟。将圣女果添加至含有99mL巴特非尔德氏缓冲溶液的无菌StomacherTM聚乙烯过滤袋(Seward公司，Norfolk，UK)中。通过涡旋将袋中的内容物混合1分钟。将30mL样品添加至含有300毫克AS-滑石粉的无菌的50mL锥形聚丙烯离心管(BDFalconTM，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)并利用上述微生物浓集检测方法来检测细菌浓集作用。通过以2000rpm离心(Eppendorf，Westbury，NY)5分钟来沉降AS-滑石粉粒子。将沉降粒子重悬浮于30mL无菌的巴特非尔德氏缓冲溶液中并将1mL的所得悬浮液铺板至3MTM PetrifilmTM好氧性微生物计数板培养基。捕集百分数为99％(标准差小于10％)。
浓集剂筛检18和19
测定10毫克AS-滑石粉对靶细菌内生孢子萎缩芽孢杆菌(ATCC9372)和枯草芽孢杆菌(ATCC 19659)的浓集作用。将上述微生物浓集检测方法以下述修改形式使用：过夜培养物分别具有2×102CFU/mL的萎缩芽孢杆菌和7×102CFU/mL的枯草芽孢杆菌；铺板未稀释的所得上清液；将具有结合的萎缩芽孢杆菌的沉降浓集剂重悬浮于1mL的无菌巴特非尔德氏缓冲溶液中并铺板；并且将具有结合的枯草芽孢杆菌的沉降浓集剂重悬浮于5mL的无菌巴特非尔德氏缓冲溶液中并铺板(各自为1mL)。基于得自铺板上清液的计数来计算捕集效率，结果示于下表6中(所有样品的标准差均小于10％)。
表6.
  筛检号   微生物   浓集剂   捕集百分数
  18   萎缩芽孢杆菌   AS-滑石粉   97
  19   枯草芽孢杆菌   AS-滑石粉   95
浓集剂筛检20和21
测定10毫克AS-滑石粉对靶无包膜细菌感染病毒大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC 15597-B1；其通常用作各种人类感染性无包膜肠道病毒的替代物)的浓集作用。使用双层琼脂方法(下文所述)来测定对大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC 15597-B1)(使用大肠杆菌细菌(ATCC 15597)作为宿主)的捕集。
在pH7.2的无菌1×吸附缓冲液(含有5mM KCl、1mM CaCl2、0.1mM MgCl2、以及1mM K2HPO4)中10倍系列稀释大肠杆菌噬菌体MS2原液，以获得分别具有103和102噬斑形成单位/毫升(PFU/mL)的2种稀释液。将1.0mL体积的所得噬菌体稀释液添加至含有10mg浓集剂的标记的无菌5mL聚丙烯管(BD FalconTM，Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)，并在Thermolyne Maximix PlusTM涡旋混合器(BarnsteadInternational，Iowa)上混合。在室温(25℃)下于Thermolyne Vari MixTM振荡器平台(Barnstead International，Iowa)上孵育封盖的管15分钟。孵育后，让管在试验台上静放10分钟以使浓集剂沉降下来。以相同方式处理含有1.0mL微生物稀释液但无浓集剂的对照样品管。然后将所得的沉降的浓集剂和/或上清液(以及对照样品)用于分析。
移取100微升上清液，使用下文所述的双层琼脂方法测定噬菌体。移取另外的800微升上清液并弃除。也对100微升沉降的浓集剂测定噬菌体。
双层琼脂方法：
将单菌落的大肠杆菌细菌(ATCC 15597)接种于25mL无菌的3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤(BactoTM胰蛋白酶大豆肉汤，Becton Dickinsonand Company，Sparks，MD；根据制造商的说明书制备)中，并在设为250转/分钟(rpm)的振荡培养箱(InnovaTM 44，New Brunswick ScientificCo.公司，Edison，NJ)中在37℃过夜孵育。将750微升的该过夜培养物用于接种75mL无菌的3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤。在设为250rpm的振动培养箱中于37℃孵育所得培养物，以获得指数期的大肠杆菌细胞，其中指数生长期是通过用SpectraMax M5分光光度计(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)于550nm处的吸光度(吸光度值0.3-0.6)而测定的。将细胞在冰上孵育直至用于测定。
将100微升的上述噬菌体检测样品与75微升冰孵育的大肠杆菌(宿主细胞)细胞一起混合，并在室温(25℃)下孵育5分钟。将所得样品与5mL无菌的熔化顶层琼脂(3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤、1.5重量％的NaCl、0.6重量％的琼脂，当天制备，保持在48℃的水浴中)混合。然后将该混合物倒至培养皿中的底层琼脂(3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤、1.5重量％的NaCl、1.2重量％的琼脂)之上。让混合物的熔化琼脂组分固化5分钟，倒置培养皿或培养板，在37℃下孵育。过夜孵育后，目测检查培养板，含有沉降浓集剂的那些培养板(以及对照培养板)显示存在噬菌体噬斑。基于来自铺板的上清液的计数来计算捕集效率，并且所述捕集效率对于102PFU/mL的稀释液测定为72％(标准差小于10％)。
浓集剂筛检22
苹果汁购自本地杂货店(Cub Foods，St.Paul)。在无菌玻璃皿中称量苹果汁(11g)，将其添加至99mL无菌巴特非尔德氏缓冲液中。将所得的组合进行涡旋混合1分钟，并使用肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)和大肠杆菌(ATCC 51813)的18-20小时过夜培养物(细菌原液)，各以1CFU/mL浓度用这两种细菌培养物对所述组合进行接种。如上所述在1X吸附缓冲液中制备细菌原液的系列稀释液。
利用上述微生物浓集检测方法，将10mL体积的接种苹果汁样品添加至含有100毫克AS-滑石粉的无菌的50mL锥形聚丙烯离心管(BDFalconTM，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)并孵育15分钟以用于靶微生物沙门氏菌的细菌捕集/浓集(在存在大肠杆菌(竞争微生物)的情况下)。移取所得的上清液，并且将沉降的浓集剂转移至含有2mL无菌的3重量％胰蛋白酶大豆肉汤(BactoTM胰蛋白酶大豆肉汤，BectonDickinson and Company，Sparks，MD；根据制造商的说明书制备)的另一个无菌的50mL管。将管松散地封盖，混合其内容物，并在37℃下孵育。在过夜孵育后，使用来自SDI(Strategic Diagnostics公司，Newark，DE)的RapidChekTM沙门氏菌侧流免疫测定测试条检测所得肉汤混合物的沙门氏菌的存在。目测检查测试条显示其为沙门氏菌阳性。
还通过聚合酶链反应(PCR)对含有微生物的肉汤混合物进行核酸检测。使用来自Applied Biosystems(Foster City，CA)的TaqManTM ABI肠道沙门氏菌检测试剂盒，测定沙门氏菌在作为检测样品的1mL上述过夜孵育的含有浓集剂的肉汤中的存在。作为对照样品，也对1mL的肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的18-20小时过夜培养物(原液)进行测定。通过使用下列每个循环的循环条件(45个循环)在Stratagene Mx3005PTM QPCR(定量PCR)系统(StratageneCorporation，La Jolla，CA)中进行PCR检测：25℃30秒，95℃10分钟，95℃15秒以及60℃1分钟。对照样品获得的平均(n＝2)循环阈值(CT值)为17.71。从含有浓集剂的检测样品获得19.88的平均(n＝2)CT值，这指示出阳性PCR反应并证实了沙门氏菌的存在。
浓集装置的制备
两种不同的超高分子量聚乙烯(UHMWPE)粉末以PMX1(产品号GURTM2126，不规则形状的，粒度范围为50-100微米)和PMX2(产品号GURTM4150-3，球形的，中值粒度为约40微米)得自Ticona(总部位于Frankfurt，Germany的Celanese的分部)。以4∶1比率的PMX1∶PMX2来混合粉末。使用所得的组合物(下文中，UHMWPE混合物)来制备两种浓集装置。
对于浓集装置类型A，将40重量％的AS-滑石粉浓集剂的混合物(上文所述)与60重量％的UHMWPE混合物混合。对于浓集装置类型B(对照组)，使用未添加浓集剂的UHMWPE混合物。对于各种浓集装置，称出选定的组分并放入1升的圆柱形容器或广口瓶中。然后将广口瓶剧烈地摇动若干分钟或者作为另外一种选择在低速(约10-15转/分钟(rpm))旋转的滚筒辗粉机上放置至少两个小时，以产生均匀的共混物或絮状物。
然后使用絮状物的一部分(约6-10g)来填充50mm直径的圆柱形模具，所述圆柱形模具具有5mm的深度并且还在其底部和封盖处设置有0.05mm(2密耳)厚的聚四氟乙烯浸渍的玻璃纤维圆盘以避免絮状物发粘并且延迟透过模具面的热传递。将絮状物压缩到模具内，并且将模具的封盖按压到适当位置内以封闭模具。
将填充的模具在涡旋混合器(IKATMMS3数字涡旋器，得自VWRScientific(West Chester，PA))放置10-20秒以消除其内容物中的空隙或裂缝。然后将模具在设为175-185℃的通风对流烘箱(Thelco PrecisionModel 6555或ThermoElectron Precision Model 6566，得自Thermo FisherScientific公司(Waltham，MA))中放置一个小时以烧结絮状物。在冷却至室温(约23℃)之后，从模具中移出所得的烧结絮状物并且如果直径大于47mm，则利用冲模整修成47mm直径以用作浓集装置。
实例1
将分离的肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的细菌菌落接种于5mL BBLTM TrypticaseTM大豆肉汤(Becton Dickinson，Sparks，MD)中并在37℃下孵育18-20小时。将浓度为约1×109CFU/mL的该过夜培养物在巴特非尔德氏缓冲液(pH为7.2±0.2；磷酸二氢钾缓冲溶液；VWR目录号83008-093，VWR，West Chester，PA)中稀释以获得大约1×103CFU/mL的种菌。
使用大约1×103CFU/mL的种菌的1∶100稀释液对250mL体积的饮用水(得自饮水喷头)接种，产生浓度为约11CFU/mL的样品(在大约250mL的样品中含总计约2600CFU)。使用浓集装置的定制样品架(该架包括上部和下部流动分配板，具有加工出的塑料管，用于为47mm直径的浓集装置提供摩擦配合；O型环，用于避免上游和下游侧的渗漏；贯穿螺栓，提供封闭压力))、蠕动泵(HeidolphTM泵装置5201，得自VWR Scientific，West Chester，PA)和3.1mm内径的管材将样品以10mL/分钟的流速泵送穿过A型(As-滑石粉)浓集装置(基本上按上述方式制备)并持续25分钟。将数字压力传感器(SSI TechnologiesModel MGI-30-A-9V，Cole-Parmer，Vernon Hills，Illinois)设置在样品架的上游以监测压降。
在25分钟内每隔5分钟将流过样品级分(1mL)收集在标记的无菌5mL聚丙烯管(BD FalconTM，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中并根据制造商的说明书铺板于3MTM PetrifilmTM好氧性微生物计数板培养基(干燥，可再水合；3M公司(St.Paul，MN))。在样品穿过浓集装置之后，用含有500微生物数/毫升BSA(牛血清白蛋白，水中1mg/mL的原液，粉末购自Sigma Chemicals，St Louis.Mo的粉末)的过滤灭菌的20mL巴特非尔德氏缓冲液“冲洗”浓集装置以用于通过反向流动(5mL/分钟)来洗脱细菌。将所得的洗脱液收集在无菌的50mL聚丙烯管中并基本上按照上文所述进行铺板。
冲洗之后，使用无菌镊子将浓集装置从其架中移出并且在含有100mL无菌的3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤(BactoTM胰蛋白酶大豆肉汤，Becton Dickinson，Sparks，MD；根据制造商的说明书制备)的无菌StomacherTM聚乙烯过滤袋(PE-LD Model 400，Seward公司，Norfolk，UK)中孵育过夜。将该袋松散地系住并且与铺板的流过样品级分和铺板的洗脱液一起在37℃下孵育18-20小时。根据制造商的说明书在第二天来量化孵育板。
基于从铺板的流过样品级分获得的计数使用下述公式来计算捕集效率(其中CFU＝菌落形成单位，其为活性或活微生物的单位)：
级分中的CFU百分数＝(得自铺板级分的菌落数)/
(样品中的总菌落数)×100
捕集效率或捕集百分数＝100-级分中的CFU百分数
获得了大于99％的捕集效率。洗脱(通过反向流动)释放了捕集种菌的大约25％(660/2600CFU)。
使用来自SDI(Strategic Diagnostics公司，Newark，DE)的SDIRapidChek
Figure BDA0000111831070000331
沙门氏菌侧流免疫测定测试条来检测沙门氏菌在含有浓集装置的过夜培养肉汤中的存在，并且获得了阳性结果。将含有浓集装置的过夜培养肉汤在巴特非尔德氏缓冲液中进行稀释并铺板于3MTMPetrifilmTM好氧性微生物计数板(3M公司，St.Paul，MN)上，随后在37℃下孵育18-20小时并且在第二天进行量化。板计数表明，浓集装置中捕集的沙门氏菌数已增加至约2×109CFU/mL的浓度。
比较例1
大致重复实例1的程序，其中使用B型(对照)浓集装置(无浓集剂)代替A型(As-滑石粉)浓集装置，并且使用约13CFU/mL的接种饮用水样品(在大约250mL样品中总计约3300CFU)。获得了大于99％的捕集效率，并且洗脱(通过反向流动)释放了捕集种菌的大约2.4％(80/3300CFU)(比上述实例1中洗脱的百分数低一个数量级)。此洗脱结果表明本发明的浓集装置相比于对比装置可在捕集微生物的隔离或分离方面提供优点从而有利于进一步的分析。
实例2和3及比较例2
在3mL巴特非尔德缓冲液(pH为7.2±0.2；磷酸二氢钾缓冲溶液；VWR目录号83008-093，VWR，West Chester，PA)中使用得自己在30℃下孵育18小时的血液琼脂板(具有5重量％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂，Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)的无害李斯特菌的过夜划线培养物(ATCC 33090)来制备0.5McFarland标准(使用DensiCHEKTM密度计，bioMerieux公司，Durham，NC)。将含有1×108CFU/mL的所得细菌原液在巴特非尔德氏缓冲液中连续稀释以获得大约1×103CFU/mL的种菌。
袋装的卷心莴苣(实例2)和有机菠菜(实例3)购自本地杂货店(Cub Foods，St.Paul，MN)。在无菌StomacherTM聚乙烯过滤袋(Seward公司，Norfolk，UK)中分别称重25克莴苣和菠菜(下文中，农产品样品)。将大约1×103CFU/mL种菌的1∶1000稀释液在农产物样品上接种以在各个农产物样品中获得1CFU/mL的最终浓度。将各个接种的农产物样品通过摇动袋混合30秒，随后在室温(23℃)下孵育10分钟的时间段以允许细菌附着至农产物。
将225mL体积的巴特非尔德缓冲液(pH为7.2±0.2；磷酸二氢钾缓冲溶液；VWR目录号83008-093，VWR，West Chester，PA)添加至各个孵育的农产物样品，从而产生浓度为约1CFU/mL的样品(在大约250mL农产物样品中总计约250CFU)。将所得的农产物样品在StomacherTM400循环实验室共混仪(Seward公司，Norfolk，UK)中以200转/分钟(rpm)共混1分钟的周期。通过吸液从袋中移取共混的农产物样品并且收集在独立的无菌250mL玻璃瓶(VWR，West Chester，PA)中。
使用上述的(实例1中)浓集装置的定制样品架、蠕动泵(HeidolphTM泵装置5201，得自VWR Scientific，West Chester，PA)和3.1mm内径的管材将收集的农产物样品分别以10mL/分钟的流速泵送穿过A型(As-滑石粉)浓集装置(基本上按上文所述来制备所述两个装置)并持续25分钟。
使全部250mL莴苣样品穿过浓集装置。在25分钟内每隔5分钟将得自莴苣样品的流过级分(1mL)收集在标记的无菌5mL聚丙烯管(BDFalconTM，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中并且扩散铺板于(100微升)Modified Oxford培养基板(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)上。将板倒转并且在37℃下孵育18-20小时。
在15分钟内每隔5分钟将得自菠菜样品的流过级分(1mL)收集在标记的无菌5mL聚丙烯管(BD FalconTM，Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)中并且铺板于Modified Oxford培养基板(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)上，并以类似方式进行处理。在流动可能因浓集装置的阻塞而停止15分钟之后终止泵送。仅通过浓集装置处理250mL菠菜样品的一半。
以类似方式铺板得自1×103CFU/mL种菌的1∶10稀释液的100微升体积，作为种菌对照(未浓集)。
在农产物样品穿过浓集装置之后，使用无菌刮刀将浓集装置从其架中移出并且置于含有5mL无菌的3.7重量％的脑心浸剂肉汤(BBLTM脑心浸剂肉汤，Becton Dickinson，Sparks，MD；根据制造商的说明书制备)的无菌聚丙烯培养皿(60mm×15mm，Corning聚丙烯培养皿，得自VWR(West Chester，PA)，目录#25382-381)内并在37℃下孵育18-20小时。
为了比较(作为比较例2)，利用无菌的47mm直径、0.45微米孔径、混合纤维素酯膜过滤器(目录#HAWP04700，Millipore公司，Bedford，MA)通过真空过滤来处理接种无害李斯特菌的共混菠菜样品(基本上按照上述方式制备，在225ml巴特非尔德缓冲液中共混25克)。在流动可能因过滤器的阻塞而停止之前处理250mL样品中的约8mL体积。终止处理。
第二天通过手动计数来量化孵育的Modified Oxford培养基板。基于从铺板的流过样品级分获得的计数使用下述公式来计算捕集效率(其中CFU＝菌落形成单位，其为活性或活微生物的单位)：
级分中的CFU百分数＝(得自铺板级分的菌落数)/
(样品中的总菌落数)×100
捕集效率或捕集百分数＝100-级分中的CFU百分数
对于用于浓集莴苣样品的装置而言获得了大于99％的捕集效率。在菠菜样品的5分钟、10分钟和15分钟流过级分中未观察到细菌菌落。基于菌落计数，接种的莴苣和菠菜样品各包含总计500CFU。
根据制造商的说明书使用得自3M的3MTMTecraTM李斯特菌视觉免疫测定试剂盒(可得自3M Australia Pty公司，Frenchs Forest，Australia)来检测李斯特菌在含有浓集装置的各过夜培养肉汤中的存在。对于莴苣和菠菜样品均获得了阳性结果(经两次检测，各个样品在414纳米下的吸光度值均大于0.2，并且阴性对照的吸光度值小于0.2(实际吸光度值为0.055))。
将本文所引述的专利、专利文献、出版物中包含的参考说明内容以引用的方式全文并入本文，就如同将每个参考说明内容单独引入本文一样。对于本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的前提下，可对本发明作出各种无法预见的修改和更改。应该理解的是，无意使本发明不当地受限于本文所述的示例性实施例和实例，并且这些实例和实施例仅以举例的方式给出，本发明的范围仅旨在受限于如下文所述的权利要求书。

Claims (25)

1.一种方法，所述方法包括：(a)提供浓集装置，所述浓集装置包括含有至少一种浓集剂的烧结的多孔聚合物基质，所述至少一种浓集剂包含无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品；以及(c)使所述浓集装置与所述样品接触使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分结合至所述浓集装置或被所述浓集装置捕集。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌株的存在。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测是通过选自以下的方法实施的：基于培养的方法、显微镜法和其他成像方法、基因检测方法、免疫检测方法、基于发光的检测方法以及它们的组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括将所述浓集装置与所述样品分离和/或培养性地富集至少一种结合的微生物菌株和/或将至少一种结合的微生物菌株的至少一部分与所述浓集装置分离。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述烧结的多孔聚合物基质包含至少一种热塑性聚合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述热塑性聚合物选自烯烃均聚物、烯烃共聚物、烯烃和其它乙烯基单体的共聚物以及它们的组合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述热塑性聚合物选自烯烃均聚物以及它们的组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述烯烃均聚物为聚乙烯。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓集装置包括曲折通道基质。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面组成具有小于或等于0.4的金属原子与硅原子比。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面组成为至少平均10原子％的碳。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓集剂在为7的pH下具有负ζ电势。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属选自镁、钙、锌、铝、铁、钛以及它们的组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述金属为镁。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓集剂包含至少部分熔融颗粒形式的无定形金属硅酸盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述浓集剂为无定形的球化硅酸镁。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为流体的形式。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物菌株选自如下物质的菌株：细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述微生物菌株选自如下物质的菌株：细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触是通过使所述样品穿过所述浓集装置来实施的。
21.一种方法，所述方法包括：(a)提供浓集装置，所述浓集装置包括含有至少一种浓集剂的烧结的聚乙烯曲折通道基质，所述至少一种浓集剂包含无定形的球化硅酸镁并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比；(b)提供包含至少一种微生物菌株的流体样品，所述至少一种微生物菌株选自细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合；以及(c)以下述方式使所述流体样品穿过所述浓集装置，所述方式使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分结合至所述浓集装置或被所述浓集装置捕集。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌株的存在。
23.一种浓集装置，所述浓集装置包括含有至少一种浓集剂的烧结的多孔聚合物基质，所述至少一种浓集剂包含无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比。
24.一种用于实施根据权利要求1所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包括(a)至少一种根据权利要求23所述的浓集装置；和(b)至少一种检测容器或检测试剂。
25.一种用于制备浓集装置的方法，所述方法包括：(a)提供混合物，所述混合物包含(1)至少一种颗粒状的可烧结聚合物和(2)至少一种颗粒浓集剂，所述至少一种颗粒浓集剂包含无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成，所述表面组成经X射线光电子光谱(XPS)测定具有小于或等于0.5的金属原子与硅原子比；以及(b)将所述混合物加热至足以烧结所述聚合物的温度，以便形成包含所述颗粒浓集剂的烧结的多孔聚合物基质。
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