CN102448991A - 分离的激动剂型抗edar单克隆抗体的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及本质上纯化的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的制备。本发明进一步涉及分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，以及它们在治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良和牙齿发育不全中的用途。本发明也涉及一种药物组合物，该药物组合物包含所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，本发明还涉及一种治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良和牙齿发育不全的方法。最后，本发明涉及一种药物试剂盒，该试剂盒包含所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。

Description

分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的制备
技术领域
本发明涉及本质上纯化的激动剂型抗EDAR单克隆抗体，或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段的制备。本发明进一步涉及分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体，或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段，以及它们在治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良和牙齿发育不全中的用途。本发明也涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体，或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段，本发明还涉及一种治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良和牙齿发育不全的方法。最后，本发明涉及一种药物试剂盒，所述药物试剂盒包括所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体，或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段。
背景技术
外胚层发育不良(ectodermal dysplasias，EDs)是先天性的，弥漫性的(diffuse)和非进行性的。EDs包括一大类异质的遗传病症，这些病症在源自胚胎外胚层的2种或更多种组织的发育过程中均存在原发性缺陷(primary defects)。迄今为止，已经记载了超过192种的不同病症。最常见的EDs是X-连锁少汗型外胚层发育不良(Christ-Siemens-Touraine综合征)和有汗型外胚层发育不良(Clouston综合征)。X-连锁少汗型外胚层发育不良也被公认为XLHED，下文中也将其称为XLHED。
主要涉及的组织为皮肤、毛发、指甲、外分泌腺和牙齿。可以观察到毛囊数目的减少以及结构性毛干的异常(abnormality)。
结构性毛干的异常可能由毛球形成中的畸变(aberration)造成，所述畸变包括纵行沟槽(longitudinal grooving)、毛干扭转(torsion)和表皮层皱褶(cuticle ruffling)。毛球可能为扭曲的(distorted)、分叉的(bifid)和很小的。
特别是在患有少汗型ED的患者中，外分泌汗腺可能缺失或为稀疏且退化(rudimentary)的。
可能发生唾液腺和泪腺的发育不完全(hypoplasia)。在一些患者中，上呼吸道及支气管、食道和十二指肠中粘液腺可能缺失。
可能出现牙齿的异常形态发生或没有牙齿。
异常的甲板(nail plate)形成可产生发脆(brittle)、变薄、起皱(ridged)或严重变形(deformed)的指甲。
在较早的婴儿期(2岁以前)中的死亡率接近30％。发病率和死亡率与外分泌腺和粘液腺的缺失或功能障碍有关。过了幼童时期，预期寿命的范围为从正常到略有缩短。
已鉴定出一种为人和小鼠的外胚层衍生而来的若干器官的正常发育所需要的激活蛋白，即外异蛋白同种型A1(Eda-A1，下文称为EDA1)。该分子由外异蛋白基因(EDA)编码，属于肿瘤坏死因子家族。该外异蛋白基因编码2种蛋白同种型：EDA1和EDA2，二者分别结合并激活两种不同的受体：EDA1受体(EDAR)和X-连锁EDA1受体(XEDAR)。下文中将EDA1受体称为EDAR。
XLHED的特征在于作为EDAR的配体的EDA1的缺失或功能缺乏。
人们已经进行了研究以表征XLHED的起源并找到合适的治疗方法。其中的大部分研究已经在与人类XLHED患者共享多种症状的Tabby小鼠中完成。类似于人XLHED患者，Tabby小鼠的表型由位于X染色体上的EDA基因的突变造成。
已经研究了多种治疗XLHED的方法。
其中一种方法是利用含有与IgG1的Fc域的C端融合的Eda-A1的受体-结合域的重组蛋白。出版物“Permanent correction of an inheritedectodermal dysplasia with recombinant EDA”(O.Gaide等，NatureMedicine，vol.9，number 5，pp 614-618，2003年5月)中记载了将重组EDA1给予发育中的胚胎和新生的Tabby小鼠，以用来矫正其表型并为XLHED的可能的治疗提供基础。
在美国专利2005/152,872(Gaide等人)中也记载了这一方法。特别地，该文件公开了包含含有以下的氨基酸序列的重组融合蛋白：(a)作为组分(A)或组分(A)的功能性变体的免疫球蛋白的Fc区段或Fc区段的一部分；(b)作为组分(B)或组分(B)的功能性变体的TNF配体的胞外部分或TNF配体胞外部分的一部分序列；和任选的(c)组分(A)与组分(B)之间的过渡区，包含接头。
US 6,355,782(Zonana等人)和US 7,115,555(Zonana等人)中公开了另一种方法。在这些文件中记载了用于通过改变细胞或组织中的EDA1活性，增强或减弱起源于外胚层的细胞或组织(例如毛发、牙齿、皮肤，和/或汗腺)的发育的编码人EDA1的核酸序列以及方法和组合物。可单独使用本文公开的EDA1、dl和DL基因，cDNA和蛋白序列(及其变体、多态性和突变体)，以及反义分子和特异结合试剂，或与药物载体联用来提高或降低EDA1的活性。
考虑到抗体是最广泛使用的治疗蛋白类型，再考虑到对于抗体的制造而言，显然已经很好地建立了安全性、长半衰期、良好的生物利用度、易于生产和可控的成本，US 2003/0023991(Zonana等人)设想了这样一种方法。特别地，该文件记载了与外胚层发育不良有关的蛋白配体(EDA1-II)和受体(dl和DL)的DNA和氨基酸序列。也公开了变体的DNA和氨基酸序列以及所述配体和受体的治疗性应用。同时记载了可使用针对EDAR(dl/DL)的抗体进行给药的不同的潜在应用。该应用特别记载了针对dl/DL(EDAR受体)的拮抗剂的用途。根据这一应用，这些拮抗剂可用于减少毛发生长，例如用于治疗多毛症；抑制牙齿发育，例如异位牙；选择性地消除汗腺，例如上唇或腋下的汗腺；以及抑制乳腺上皮细胞增殖，例如治疗乳腺癌；或用于其他皮肤创伤中。最后，设想了单克隆或多克隆抗体的生产和使用。然而，该文件并没有记载激动剂型或拮抗剂型的抗EDAR抗体的具体序列。没有提供起作用的实例以证明单克隆抗体或多克隆抗体是具有生物学活性的、有效的和有功能的。
也许可以说单克隆抗体的选择对本领域技术人员而言是一种常规的工作。然而，人们无法认同分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的制备和获取是常规技术且不具备创造性。例如，通过用FS-7人成纤维细胞膜免疫接种小鼠得到针对人Fas的CH11单克隆抗体，所述人Fas是TNF受体家族的另一个成员，(Yonehara等，1989，J.Exp.Med 169.1747-1756)。CH11是一种IgM。当使用识别完全相同的表位的IgG1(mAbZB4)或使用CH11的二价Fab’2时，没有激动剂活性(Fadeel等，1997，Int Immunol 9，201-209)。激动剂型抗人Fas单克隆抗体的第二个实例是APO-1。通过用人SKW 6.4细胞系的质膜免疫接种小鼠得到抗人Fas单克隆抗体APO-1(Trauth等，1989，Science 245，301-305)。该抗体是一种IgG3。尽管该抗体的Fas结合部分保持不变，一旦进行同种型转换，该抗体便丧失其激动剂活性(Dhein等，1992，J.Immunol 149，3166-3173)。可尝试性地通过IgG3的自身聚合倾向解释该结果。这两个例子表明针对TNF受体家族成员的激动剂型单克隆抗体的获取对本领域技术人员来说决不是小事。
在本发明的情况下，申请人必须面对如下的数个问题：
-商业化的抗EDAR多克隆抗体(在山羊中产生，来自R&D Systems)不能诱导转导了EDAR:Fas的Jurkat细胞的死亡。人们可以认为所述多克隆抗体制剂是由具有各种活性(激动剂、拮抗剂等)的抗体混合物制成。因此令申请人失望的是，观察到即使使用了大量的抗体，基于细胞进行的分析仍不显示任何激动剂活性。这些结果对激动剂型抗EDAR单克隆抗体的开发而言并不鼓舞人心。
-依赖于EDA1的生物学分析的开发因为多个原因而困难重重。第一，仅有少数细胞系内源性地表达EDAR(一个实例是人角质化细胞系HaCat)。筛选了若干人类、小鼠和大鼠的角质化细胞系中EDAR表达的情况。所述筛选通过用Fc-EDA1和抗EDAR单克隆抗体对细胞染色，利用流式细胞术检测。没有细胞系表达可检出水平的EDAR。第二，发现依赖于NF B的读出系统差强人意(I B的磷酸化和降解)，因为它既不定量，也不可完全重现。为了克服这些局限性，最终尝试了向转染了EDAR的成纤维细胞中导入由NF B启动子控制的报告基因(例如荧光素酶)。然而，还发现该系统不能得到恰当发挥作用的生物学活性分析(低信噪比和低灵敏度)。因此，使用本领域技术人员已知的技术不能令人满意。
-天然存在的可溶性EDA1蛋白可能为三聚物的多聚体(Swee等，J.Biol.Chem.284：27267-76，2009)，并且Fc-EDA1为六聚体配体。由于Fas已得到了详尽的记载，申请人得到了表明多个EDAR受体的同时接合(engagement)和成簇(clustering)是生物学活性所必需的证据(Swee等，J.Biol.Chem.284：27267-76，2009)。相反，抗EDAR抗体仅为二价。因此，这种分子形式不太可能与Fc-EDA1具有同样的生物学活性。
-没有可用的合适的动物模型。没有合适的小鼠品系(EDAR缺乏的小鼠)的鉴别，将会严重妨碍本发明抗体的开发。假定缺少申请人所推荐的动物模型和具体的准备过程，将不能得到具有激动剂性质的抗EDAR单克隆抗体(即因为它们在EDAR上将具有不同的结合位点)。
然而，需要针对XLHED的更有效的治疗方法并提高患有这类疾病的患者的生活质量。特别是目前没有可用于患有外胚层发育不良(如XLHED或牙齿发育不全)的儿童、青少年或成人的祛病(curative)疗法。
本发明的目的在于提供用于制备本质上纯化的和分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的新工艺，所述抗体为有生物学活性的、有效的和有功能的。本发明也能够迅速地辨别最佳的激动剂型抗EDAR单克隆抗体。本发明也展示了激动剂型抗EDAR单克隆抗体作为候选药物用于治疗XLHED或相关疾病的用途。
可从上文明显得到的这些目的和其他目的已经由本发明实现。
发明内容
在第一个实施方式中，本发明涉及用于生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体，或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段的方法，所述方法包括以下步骤：
a)生产小鼠和/或人和/或脊椎动物种的EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白；
b)用所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白免疫接种EDAR缺乏的小鼠；
c)检测免疫接种了所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的血清中的抗EDAR抗体；
d)生产骨髓瘤细胞和来自免疫接种了EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的淋巴结细胞间的杂交瘤；
e)通过下述i.的方法鉴定识别人和/或小鼠EDAR和/或来自脊椎动物种的EDAR的激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段在如下ii.和iii.方面的能力：
i.利用经设计用于检测所述激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与人和/或小鼠EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白之间的结合的结合分析；和
ii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的细胞或组织中诱导体外生物学应答的能力；
iii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的生物体中诱导体内生物学应答的能力；
f)基于步骤e)ii和步骤e)iii，选择生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体的杂交瘤系；
g)对上述选择的杂交瘤系进行克隆和亚克隆；
h)对得到的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段进行纯化。
在第二个实施方式中，本发明提供了由该工艺获得的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段，其中，对Fab片段而言，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段以至少10-8M的亲和力(KD)结合至人和/或小鼠的EDAR。此外，如实施例7所记载的：当将所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段给药于新生Tabby小鼠时，其能以小于20mg/kg的EC50与小鼠EDAR交叉反应诱导尾部毛发形成和/或汗腺形成。
本发明也公开了编码所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段的分离的核酸分子，还公开了包含至少一个拷贝的所述核酸分子的表达载体。
本发明也公开了包含本发明的表达载体的宿主细胞；分泌所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的杂交瘤；以及含有所述分离的核酸分子和/或所述表达载体的基因组的转基因非人动物。
此外，本发明涉及包含本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的又一目的涉及所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或所述药物组合物在制备用于调节外胚层起源的细胞或组织(例如毛发、牙齿、皮肤、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞(larynx and trachea mucus-producingcells)、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺)的发育的药物中的用途。
本发明的另一目的包含所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或所述药物组合物在制造用于皮肤重建或改进毛发形态的药物中的用途。
本发明也提供增强组织中一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺发育的方法，该方法包括将本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或本发明所述的药物组合物给予有需要的受试者。
最后，本发明涉及包含至少有效量的本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或本发明所述药物组合物的药物试剂盒及其使用说明书。
通过阅读接下来的具体描述，并参考下列说明性附图和所附权利要求书，本发明的其他目的和优势对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
图1.通过蛋白G亲合色谱纯化的抗EDAR mAb的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。从无血清培养基(mAbEDARs，1-4、6-10、12-14)或含血清培养基(mabEDAR5，11和15)中的培养物上清中，通过蛋白G亲合色谱纯化抗EDAR mAb。利用对在还原条件下进行的SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色来分析纯化的材料(10μg/道)。分子量标准在最左边泳道跑电泳，它们的相应大小用kDa表示。
结果显示该纯化的抗EDAR mAb具有典型的mAb的特征(它在蛋白G上纯化，并由预期的大小约为50kDa和25kDa的重链和轻链组成)。
图2.抗EDAR mAb的非变性凝胶电泳。除了电泳时间为1h外，按照制造商的说明，通过非变性凝胶电泳(BIOMIDI，RefKGMP)和酰胺黑染色分析蛋白G纯化的4μg的抗EDAR抗体。结果显示不同的mAbEDARs具有不同的等电点。
图3.抗EDAR单克隆抗体mAbEDAR1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15的重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列的测定。序列起始于所述重链的成熟N端。以粗体和下划线标示CDR。
图4.抗EDAR单克隆抗体mAbEDAR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15的轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列的测定。序列起始于所述轻链的成熟N端。以粗体和下划线标示CDR。
图5.抗EDAR单克隆抗体mAbEDAR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15的重链和轻链的氨基酸序列的比对。序列起始于成熟N端。CDRs用大方框突出显示。标示出了由V、D和J基因编码，或由随机添加的核苷酸(N)编码的蛋白质区段的假定接合区(junction)。也显示了与恒定区(C)的接合区。mAbEDARs 1、2、3、4、5和6的重链和轻链经SDS-PAGE分离，胰蛋白酶消化并由液相色谱质谱联用(LC-ms-ms)进行了分析。标示出了由LC-ms-ms鉴定的肽。mAbEDAR1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14和15是IgG1，mAbEDAR5是IgG2b，mAbEDAR6是IgG2a。
从此图中可以看出，虽然mAbEDAR2和mAbEDAR4的轻链相同，mAbEDAR10和mAbEDAR11的重链相同，但mabEDAR1-15都是不同的。mAbEDAR1、mAbEDAR3和mAbEDAR8具有类似的重链，该重链极可能来源于相同的VH基因，并具有类似的轻链，该轻链极可能来源于相同的VL基因。
图6.抗EDAR mAb与小鼠EDAR和人EDAR的特异性结合。将梯度浓度的mAbEDAR1-4或对照mAb(Aprily 5)加入到用100μl的1μg/ml的人EDAR-Fc、小鼠EDAR-Fc、人Fas-Fc或Flag-人APRIL包被的96孔ELISA板的孔中。通过加入偶联至HRP的抗小鼠IgG并随后加入底物来显示结合的抗体。于490nm下测定吸光度。
该图显示了与人EDAR(图A)和小鼠EDAR(图B)都结合的四种抗EDAR mAb。此外，由它们不能与人Fas-Fc(图C)结合而确定了它们的结合特异性。不相干的同种型匹配的单克隆抗体(Aprily-5)能够识别APRIL，却不能识别任何一个EDAR-Fc分子(图D)。对用于实验的EDAR-Fc和Fas-Fc的样品(5g)进行非还原的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色(图E)。
图7.抗EDAR mAb在Western印迹法中的用途。(A)纯化的人EDAR-Fc、小鼠EDAR-Fc、人Fas-Fc(见图6E)和Flag-人April在还原或非还原的条件下进行12％的SDS-PAGE，转移至硝化纤维素膜并用所示的mAbEDAR1-4或Aprily5探测。
结果显示抗EDAR mAb mAbEDAR1、2、3和4能够识别固定在硝化纤维素膜上的人EDAR和小鼠EDAR两者，但是只能在非还原的条件下识别，这表明完整的二硫键是EDAR识别所需要的。与小鼠EDAR得到的信号较弱可由凝胶上的小鼠EDAR-Fc上样量较少来解释。通过显示出没有一个mAbEDARs与Fas-Fc和Flag-人APRIL结合(而抗APRILmAb识别Flag-人APRIL)确立其结合特异性。(B)牛血清白蛋白(BSA，2μg)、纯化的人EDAR-Fc(20ng)和纯化的hFas-Fc(20ng)，在还原或非还原的条件下进行12％的SDS-PAGE，转移至硝化纤维素膜上并用mAbEDAR1-15探测。在BSA泳道中mAbEDAR5识别的条带可能是由于相邻泳道EDAR-Fc的交叉污染。
这些图显示出在非还原条件下，所有mAbEDARs特异性地识别人EDAR-Fc而不识别Fas-Fc。这些图进一步显示出mAbEDAR5、6和12也能识别还原的EDAR。
图8.抗EDAR mAb不与Fc-EDA1竞争结合EDAR(A、B、C)。如所示的，用hEDAR-Fc包被ELISA板的孔，用牛奶封闭，并用用作竞争剂的梯度浓度的mAbEDAR1、2、3、4、Aprily5或Fc-EDA1孵育。其后，如所示的，加入恒定量的生物素化的mAbEDAR1、2、3或4(A)，或带Flag标签的EDA1(B)。用偶联有辣根过氧化物酶的链霉亲和素显示生物素化的mAbEDARs的结合，用生物素化的抗Flag抗体(M2)和偶联有辣根过氧化物酶的链霉亲和素显示Fc-EDA1的结合。直接使用偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体显示mAbEDAR1、2、3和4的结合(C)。加入底物后，在490nm下监测吸光度。
此图显示抗EDAR mAb和Fc-EDA1之间不竞争结合EDAR，这意味着抗EDAR mAb和Fc-EDA1与EDAR上的不同位点结合。该图也显示出mAbEDAR1、2、3和4相互竞争结合EDAR，而mAbEDAR1具有最强的结合效力。
图9通过ELISA完成的重组人EDAR上的抗EDAR单克隆抗体的表位定位(epitope mapping)。(A)人EDAR的线性示意图显示了半胱氨酸残基的位置(水平细线)，推定的N-连接的糖基化位点的位置(水平粗线，N)，组成三个富含半胱氨酸的域(CRD1、CRD2、CRD3)的六个结构模块的位置(圆角矩形)，跨膜域的位置(矩形，TMD)，信号肽的位置(前导区)，茎结构的位置和胞内域的位置(ID)。标明了感兴趣的接合区处的氨基酸数目。箭头表明预测的信号肽的切割位点。除胞内域外，该图是按比例绘制的。(B)用山羊抗人IgG抗体包被ELISA板的孔，封闭，并进一步与经转染的细胞的细胞上清中的人EDAR-Fc、小鼠EDAR-Fc或所示的人EDAR-Fc截短蛋白孵育。留出一个无细胞上清的孔(对照，Ctrl)。使用偶联有辣根过氧化物酶的驴抗人IgG抗体控制各EDAR-Fc蛋白的有效捕获。用偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体监测mAbEDARs的结合。
该图显示出mAbEDAR1、2、3、4、7、8、10和11识别CRD1和CRD2中的表位(但是不能识别单独的CRD1或CRD2)，mAbEDAR5、6、12和13识别全部包含在CRD1中的表位，mAbEDAR9、14和15识别EDAR的全长胞外域，而不能识别含有两个相邻的CRDs的任意组合的融合蛋白。除mAbEDAR15仅能识别人EDAR而不能识别小鼠EDAR外，所有mAbEDARs都能识别人EDAR和小鼠EDAR两者。
图10通过Western印迹完成的重组人EDAR上的抗EDAR单克隆抗体的表位定位。存在于经转染的细胞的上清中的所示的EDAR-Fc截短蛋白在非还原的条件下进行12％的SDS-PAGE并转移至硝化纤维素膜。经不相干的乳蛋白饱和后，用1μg/ml的mAbEDAR1、2、3、4、5或6和随后的偶联有辣根过氧化物酶抗小鼠IgG抗体或偶联有辣根过氧化物酶抗人IgG抗体使膜显示。分子量标准(以kDa表示)的位置标示在左边。
此图显示EDAR-Fc截短突变体以大致相当的含量存在于所述膜上。mAbEDAR1、2、3和4识别与CRD1和CRD2重叠的表位，而mAbEDAR5和6识别全部包含在CRD1中的表位。
图11通过FACS完成的抗EDAR单克隆抗体的表位定位。将编码融合至TRAIL-R3的C端部分的人EDAR所示部分的质粒(包括其糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-附加序列)与编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的示踪质粒一同转染至293T细胞中。转染两天后，用mAbEDAR1、2、3或4及随后的偶联有PE的抗小鼠IgG抗体对细胞染色。还用识别TRAIL-R3的大鼠单克隆抗体mAb572及随后的偶联有PE的抗大鼠IgG抗体对细胞染色。使用双色FACS对细胞进行分析。在FL1上检测EGFP，并与GPI锚定的EDAR片段的表达关联。在FL2中检测抗体的结合。利用经转染的细胞(即FL1荧光强度为50-1000的细胞)的平均FL2荧光强度对抗体的结合进行定量。
该图显示mAbEDAR1、2、3和4识别与CRD1和CRD2重叠的人EDAR上的表位。该图也显示所述抗体可识别在细胞表面表达的天然EDAR-GPI蛋白。
图12抗EDAR单克隆抗体对表达EDAR-Fas的Jurkat细胞的杀伤(A、B)。测试纯化的抗EDAR单克隆抗体mAbEDAR1-mAbEDAR14和纯化的Fc-EDA1的连续稀释物诱导表达mEDAR-Fas的、Fas-缺乏的Jurkat细胞(A)凋亡的能力或诱导表达hEDAR-Fas的、Fas-缺乏的细胞(B)凋亡的能力。过夜培养后，通过PMS/MTS染色测定细胞存活力。取决于抗体及细胞系，Fc-EDA的EC50(诱导细胞存活力半最大下降(halfmaximal decrease)的激动剂浓度)为约1ng/ml，而mAbEDAR1、3、8、10和12的EC50在5-500ng/ml之间。在该测试中，mAbEDAR2、4、5、6、7、9、11、13和14没有或几乎没有活性。
这些结果显示在体外细胞培养中，抗EDAR抗体中的一些而不是全部可通过EDAR-Fas融合蛋白促进传导，但是它们不如Fc-EDA1有效。
图13抗EDAR多克隆抗体不能诱导杀伤表达EDAR-Fas的Jurkat细胞。在存在或不存在抗山羊IgG(A)和纯化的Fc-EDA(B)的条件下，测试山羊抗小鼠EDAR多克隆抗体的连续稀释物诱导表达EDAR-Fas的、Fas-缺乏的Jurkat细胞凋亡的能力。过夜培养后，通过PES/MTS染色测定细胞存活力。APO200的EC50(诱导细胞存活力半最大下降的激动剂浓度)在3-9ng/ml之间，而所述抗EDAR多克隆抗体不能诱导细胞死亡。
这些结果显示所述抗小鼠EDAR多克隆抗体在体外没有激动剂活性。抗人EDAR多克隆抗体得到了类似的结果。总之，这些结果支持了对激动剂型抗EDAR单克隆抗体的开发并不是显而易见的的论点。
图14注射入新生小鼠后能矫正Tabby表型的抗EDAR mAb的鉴定。将来自40个阳性杂交瘤的上清样品通过腹膜内注射给予一天龄的Tabby小鼠。6周以后，测定爪垫上的功能性汗腺以及尾部毛发的存在。示出了利用7种杂交瘤上清样品得到的结果的实例。
这些结果显示超过一半的所述杂交瘤上清能够诱导爪垫上功能性汗腺的发育和尾部毛发的生长，这表明大部分的抗EDAR mAb具有模拟天然存在的蛋白EDA1的活性的激动剂性质。
图15抗EDAR mAb在新生Tabby小鼠中的治疗剂量。在刚出生的的24h内，经腹膜向新生Tabby小鼠注射梯度剂量的蛋白质G亲和色谱纯化的抗EDAR mAb。4至6周以后(mAbEDAR1、2、3和4)或3周以后(mAbEDAR4-14和Aprily5)，给尾部的毛发密度打分(A)。此外，对小鼠进行淀粉-碘汗水测试，给功能性汗腺的存在打分(B)。
这些结果显示，在新生Tabby小鼠中，大部分mAbEDARs产生半最大效应的剂量在0.1-0.5μg的范围内，类似于用Fc-EDA1得到的结果。虽然体外效力比Fc-EDA1低10至1000倍以上，但当用于体内时，抗EDAR mAb与Fc-EDA1同样有效。
图16抗EDAR mAb在野生型小鼠中的半衰期。对野生型小鼠静脉内注射200μl的1mg/ml的mAbEDAR1或mAbEDAR3。分别在20分钟、1天、2天、8天、16天和32天后收集血清样品。通过在用1μg/ml的人EDAR-Fc包被的孔中孵育血清的连续稀释物，随后加入偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG和OPD底物，测定抗EDAR mAb的浓度。为了分析，将在各个时间点显示OD＝1的血清稀释度(认为其代表IC50)绘制为时间的函数。除20分钟的时间点之外，在上述一系列点上拟合指数曲线。由此确定了mAbEDAR1和mAbEDAR3的半衰期为10-11天。
在这类实验设置中，10-11天的半衰期是典型值。这些结果进一步证明了这些mAb具有这类分子的典型属性。这也阐明了所述mAb具有可能比Fc-EDA1(体内半衰期短，10小时)更好的药理特性。
图17-23在怀孕的小鼠体内注射抗EDAR mAb后Tabby表型的矫正。在妊娠的第13和20天(E13/E20)或妊娠的第9和17天(E9/E17)，用400μg抗EDAR mAb mAbEDAR3处理怀孕的Tabby小鼠。在鼠仔6个月大时进行分析。为进行比较，对年龄匹配的野生型和EDA-缺乏的Tabby小鼠进行类似的分析。
上述动物的正视图，尾部表型和淀粉碘汗水测试(图17)，腹部外观(图18)，显示耳后毛发存在的头部俯视图(图19)，显示汗腺腺样结构的存在的爪垫的H&E切片(图20)，显示粘液分泌腺的用阿尔新蓝染色的气管切片(图21)，显示毛囊的存在的尾部皮肤纵向和横向切片(图22)，以及具有上、下臼齿的颌的图片(图23)。
这些图阐明了抗EDAR mAb的体内生物学活性。特别地，这些结果确定了这些mAb的治疗活性至少与Fc-EDA1相当。此前没有报道过在Fc-EDA1治疗的Tabby小鼠体内存在功能性产粘液细胞(图21)(此结果扩展了抗EDAR单克隆抗体显示出的治疗活性范围，但这并不出人意料)。
图24在新生的野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观。在第0、4、7、11、14天以5mg/kg的剂量向新生的野生型小鼠腹腔内注射mAbEDAR3。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。在所示出的时间点给小鼠拍照。
图25在新生的野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的毛发形态。如图24所示，在第18天从小鼠背部和腹部取毛发，置于显微镜下拍照。右边的图示出了所显示的锯齿状和锥状部分的毛发。野生型锯齿状毛发中的扭结(kink)不再存在于经mAbEDAR3处理的小鼠中(这些毛发被称作类锯齿状)。
图26对新生的野生型小鼠的抗EDAR mAb给药不影响其体重的增加。在第0、4、7、11、14天以1mg/kg的剂量向新生的野生型小鼠经腹膜内给予mAbEDAR3。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。将体重绘制为时间的函数，并代表了每组6只小鼠的平均体重(直至11天)，每组3只小鼠的平均体重(1只雄性和2只雌性)(直至32天)和每组2只小鼠的平均体重(1只雄性和1只雌性，从第40天开始)。
图27在新生的野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和毛发形态。在第0、4、7、11、14天以5mg/kg的剂量向新生的野生型小鼠经腹膜内给予mAbEDAR1。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。第18天对小鼠拍照。第18天收集毛发用于形态分析。
图28在新生的EDA-缺乏的小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和毛发形态。在第0、4、7、11、14天以5mg/kg的剂量向新生的EDA-缺乏的小鼠经腹膜内给予mAbEDAR1。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。第21天对小鼠拍照。第21天收集毛发用于形态分析。EDA-缺乏的小鼠具有一种称做“中间型(intermediate)”的单一的毛发类型。
图29在成年野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和颜色。对3周龄野生型小鼠进行背部脱毛，脱毛后立即接受单次腹膜内注射的剂量为5mg/kg的mAbEDAR1。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。在所示的时间点给小鼠拍照。
图30在成年野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的毛发形态。如图29所示，在脱毛后第21天，从小鼠背部的脱毛区或非脱毛区取毛发，置于显微镜下拍照。
图31在成年EDA-缺乏的小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和毛发形态。对9周龄的野生型小鼠进行背部脱毛，脱毛后立即接受单次腹膜内注射的剂量为5mg/kg的mAbEDAR1。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。在所示的时间点给小鼠拍照，脱毛第17天后用显微镜检查分析毛发形态。
图32抗EDAR抗体及其Fab片段的凝胶渗透色谱洗脱谱。纯化的抗EDAR抗体mAbEDAR1、10和13不经处理或在37℃用固定化的无花果蛋白酶消化72h。在消化的抗体中，通过蛋白A色谱除去Fc片段和未经消化的抗体。浓缩含有所述Fab片段的流体，并上样于在PBS中洗脱的Superdex-200凝胶渗透色谱柱上。在280nm处记录吸光度。以类似的方式对未经消化的抗体进行大小分馏。用mAbEDAR2、4、5、6、7、8、9、12和14得到了类似的结果(数据没有显示)。
这表明可通过无花果蛋白酶消化和凝胶过滤色谱法的结合得到抗EDAR抗体的单体Fab片段。
图33抗EDAR Fab片段对hEDAR-Fc的结合和解离动力学。人EDAR-Fc被捕获在Biacore T100中的抗人IgG Fc-衍生的CM5芯片上。施用所示浓度的抗EDAR抗体的Fab溶液90秒，随后用缓冲液漂洗。对mAbEDAR2、4、5、6、7、8、9、12和14的Fab片段进行类似的实验(数据没有显示)。
这些数据表明抗EDAR抗体的结合常数和解离常数各自不同。
图34抗EDAR抗体的重链可变区和轻链可变区的序列比较。用MacVector程序的ClustalW比对选项对抗EDAR mAb的重链可变部分和轻链可变部分的氨基酸序列进行比对。显示了不同的抗EDAR抗体之间在氨基酸水平上的一致性的百分比。
图35抗EDAR抗体的特征和性质。
该图总结了mAbEDARs的一些特征：最可能使用的基因、VDJ和VJ接合区处的氨基酸序列、用于免疫接种的抗原、同种型、鉴定出的表位和鉴定出的EDAR种(人和/或小鼠)。
图36抗EDAR抗体的特征和性质
此图总结了mAbEDARs的物理学和生物学性质：Fab片段的缔合和解离常数、Fab片段的亲合力、诱导新生的EDA-缺乏的Tabby小鼠尾部毛发形成和汗腺形成的体内活性、对EDAR:Fas、Fas-缺乏的报告Jurkat细胞的体外活性。这些数据显示mAbEDAR1-14为体内激动剂(没有测试不识别小鼠EDAR的mAbEDAR15)。这也显示出具有最小亲合常数的抗体，尤其是具有最小解离常数的抗体与在体外活性分析中具有最强活性的抗体之间的相关性。所有具有体外活性的抗体体内活性也很好。
序列表
本申请包括已通过EFS-Web提交的序列表，在此将其整体援引加入。2010年3月29日建立的所述ASCII复本，被命名为17321PCT.txt，大小为160,961字节。
分别用标准的核苷酸碱基字母缩写和氨基酸的三字母代码显示所附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。只显示了各个核酸序列的一条链，但其互补链应被理解为包括在对所显示的链的任意引用内。
SEQ ID NO：1-84显示了14种激动剂型抗EDAR单克隆抗体(即mAbEDAR 1、mAbEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDAR10、mAbEDAR11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15)的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。此外，mAbEDAR4的轻链和mAbEDAR2的轻链相同(参见表1)。
SEQ ID NO：85-168显示了14种上述的激动剂型抗EDAR单克隆抗体(即mAbEDAR1、mAbEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDAR 10、mAbEDAR 11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15)的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列(参见表2)。
SEQ ID NO：169-182显示了mAbEDAR1、mAbEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDAR10、mAbEDAR11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15的重链可变区的氨基酸序列(图3)。
SEQ ID NO：183-196显示了mAbEDAR1、mAbEDAR2(和mAbEDAR4相同)、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDAR10、mAbEDAR11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15的轻链可变区的氨基酸序列(图4)。
SEQ ID NO：197-210显示了mAbEDAR1、mabEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDAR10、mAbEDAR11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15的重链可变区的核苷酸序列(图3)。
SEQ ID NO：211-224显示了mAbEDAR1、mAbEDAR2(和mAbEDAR4相同)、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDAR10、mAbEDAR11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15的轻链可变区的核苷酸序列(图4)。
SEQ ID NO：225、227、229、231、233：显示了不同的EDAR构建体的核苷酸序列(从哺乳动物表达载体PCR3(Invitrogen)的T7位点到Sp6位点)。SEQ ID NO 225：小鼠EDAR(1-183)-Fc。SEQ ID NO 227：人EDAR(1-183)-Fc。SEQ ID NO 229：全长的人EDAR(1-448)。SEQID NO 229：人EDAR(1-72)-Fc。SEQ ID NO 231：人EDAR(1-114)-Fc。
SEQ ID NO：226、228、230、232、234：显示了由SEQ ID NO：225、227、229、231、233编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：235-242：显示了全长的人和小鼠EDAR以及人和小鼠EDAR片段的氨基酸序列。SEQ ID NO 235：全长的人EDAR(1-448)。SEQ ID NO 236：全长的小鼠EDAR(1-448)。SEQ ID NO 237：人EDAR(29-72)。SEQ ID NO 238：人EDAR(71-114)。SEQ ID NO 239：人EDAR(29-114)。SEQ ID NO 240：小鼠EDAR(29-72)。SEQ ID NO 241：小鼠EDAR(71-114)。SEQ ID NO 242：小鼠EDAR(29-114)。
具体实施方式
本文所使用的下列定义是为了便于理解本发明。
“一种(A)”或“一种(an)”是指“至少一种”或“一种或多种”。
术语“包含(comprise)”通常用于表示含有(include)的意思，即允许一个或多个特征或组分的存在。
本文所使用的术语“蛋白质”、“多肽”、“多肽的”、“肽”和“肽的”或“肽链”在本文可互换地使用，表示通过在α-氨基和相邻残基的羧基之间的肽键相互连接的一连串氨基酸残基。
“氨基酸残基”是指本领域技术人员已知的任意氨基酸残基。其包含天然存在的氨基酸(包括例如，用三字母代码表示，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)，以及稀有的和/或合成的氨基酸及其衍生物(包括例如Aad、Abu、Acp、Ahe、Aib、Apm、Dbu、Des、Dpm、Hyl、McLys、McVal、Nva等)。
所述氨基酸残基或其衍生物可为任意异构体，特别是任意手性的异构体，例如L-型或D-型异构体。
所谓氨基酸衍生物，在本文中我们是指在本领域中已知的任意氨基酸衍生物。例如，氨基酸衍生物包括来源于具有额外的侧链(例如烷基侧链)和/或杂原子取代的天然氨基酸残基。
术语“纯化的”不需要绝对的纯度；而是旨在作为一个相对的概念。因此，例如，纯化的激动剂型抗EDAR单克隆抗体制剂是指其中的蛋白比存在于细胞内的天然环境中的蛋白更纯的制剂。优选地，激动剂型抗EDAR单克隆抗体制剂经过纯化后，蛋白质的含量至少为制剂中总蛋白含量的50％。
本文所使用的表述“本质上纯的”是指至少50％纯的物质，优选至少90％纯的物质，更优选至少95％纯的物质，甚至更优选至少98％纯的物质和最优选99％纯的物质，或具有更高纯度的物质。
本文所使用的“分离的抗体”是指本质上不含具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合EDAR的分离的抗体是本质上不含特异性结合除EDAR以外的抗原的抗体)。然而，特异地结合人EDAR的表位、同种型或变体的分离的抗体可能与其他相关抗原(例如来自其他种(例如，EDAR同源种)的抗原)交叉反应。此外，分离的抗体可能本质上不含有其他细胞物质和/或化学试剂。在本发明的一个实施方式中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体结合成明确的组合物。
本文所使用的“疾病”是指由不同原因(例如感染、遗传缺陷、或环境应力)导致的生物体部位、器官、或系统的病理状况，并以可视为同一组的体征或症状为特征。
术语“受试者”是指人类患者或其他脊椎动物尤其是哺乳动物患者，包括希望利用本发明所述的方法检查或治疗的任意个体。然而，应当理解的是，“患者”并不自动地意味着存在症状或疾病。本文所使用的术语“患者”优选地是指需要治疗XLHED的人。
为了治疗起见，“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任意动物，包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、比赛用动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、猴等。优选地，所述哺乳动物为人。
为了治疗起见，“脊椎动物”是指被归类为脊椎动物的任意动物，包括鸟、两栖动物和鱼。优选地，所述脊椎动物为人。
“治疗”是指治疗性治疗和防范性(prophylactic)或预防性(preventive)措施。需要治疗的对象包括已经患有所述病症的对象以及将要预防所述病症的对象。因此，本文中的待治疗的哺乳动物可能已经被诊断为患有所述病症或易患所述病症或对所述病症敏感。因此本文中的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括祛病治疗(curativetreatment)、预防治疗以及缓解治疗(palliative treatment)，更具体的为缓解治疗和祛病治疗。为了本发明的目的，所述“治疗(treatment)”是为了得到有益结果的方法，所述有益结果包括但不限于下列的一种或多种：减缓或完全消除XLHED疾病的症状以及降低患者的死亡率。
短语“药学上可接受的”是指当给予患者特别是人时，生理上可容忍的并且通常不产生过敏反应或类似的不良反应(例如胃部不适、眩晕等)的分子实体和组合物。
表述“有效量”是足以达到有益效果或期望结果的量，所述有益效果或期望结果包括但不限于：临床结果、预防或减弱由所述疾病产生的症状、减少治疗所述疾病所需的其他药物的剂量。可通过活性物质的一次或多次给药来给予有效量。为了本发明的目的，所述活性物质为当与EDAR相互作用时诱导生物学活性的分子组合物(EDAR调节物)。
在本发明中，术语“受体”是指细胞表面上的(或细胞内部)结构，该结构选择性地接收并结合影响所述细胞活性的特定分子。
术语“抗原”是指能被选择性结合剂(如抗体)结合的分子或分子的一部分，所述“抗原”还能用于在动物体内引起能与该抗原的表位结合的抗体的产生。抗原可具有一个或多个表位。
本文所使用的术语“抗体”是指免疫系统针对抗原所产生的保护生物体的蛋白质。然而，本文所使用的术语不仅包括完整的单克隆抗体，而且包括其片段、单链、其突变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任意其他改变的构型。完整的“抗体”至少包含通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区由三个域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个域(CL)组成。所述VH和VL区可进一步细分成高度可变的所谓的互补决定区(CDR)，其中散布着更为保守的称为骨架区(FR)的区域。各VH和VL由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
所述重链和轻链的可变区包含可与抗原相互作用的结合域。所述抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括各种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和经典的补体系统的第一组分(Clq)。
术语“激动剂”是指能够与受体结合并激活受体，产生药理学应答(例如收缩、松弛、分泌、酶活化等)的药物/配体/抗体。
本文所使用的术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一的结合特异性及亲合性。术语“表位”是指能特异性的结合至抗体的蛋白决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原的特异性抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
本文所使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地，“抗体部分”)是指完整抗体的保留了特异性结合抗原(例如EDAR)的能力的一个或多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段实现。结合的实例包括(i)Fab片段：由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab)′2片段：包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)由VH域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)；和(vii)纳米抗体，包含单一可变区和两个恒定区的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个域(VL和VH)由不同的基因编码，但可通过合成的接头使用重组方法将它们连接，使它们能够形成单一的蛋白链，该链中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sc USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也包含在所述术语抗体的“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员已知的常规技术可得到这些抗体片段，并且采用与完整抗体相同的方式对所述片段的效用进行筛选。
“片段”是指与各自的完整的或全长的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的序列(天然的)共享至少40％的氨基酸的序列。只要它们显示出与其来源的天然序列相同的性质，这些序列就能被使用。优选这些序列与各自的完整的或全长的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的序列共享超过70％，优选超过80％，特别是超过90％的氨基酸长度。
在本发明的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的情况下，有用的片段包括但不限于：CDR区，尤其是重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变域；包含两个CDRs的抗体链的一部分或仅是包含两个CDRs的抗体的可变区等。合适的本发明的激动剂型抗EDAR单克隆抗体片段是免疫学上的功能性免疫球蛋白。本文所使用的术语“免疫学上的功能性免疫球蛋白片段”是指至少包含免疫球蛋白重链和轻链的CDRs的多肽片段。本发明的免疫学上的功能性免疫球蛋白片段能特异性结合EDAR。最优选地，所述片段特异性结合和/或调节EDAR的生物学活性。
在第一个实施方式中，本发明涉及用于生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体，或分离的单克隆抗体片段，或抗原结合部分或其片段的方法，所述方法包括以下步骤：
a)生产小鼠和/或人和/或脊椎动物种的EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白；
b)用所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白免疫接种EDAR缺乏的小鼠；
c)检测免疫接种了所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的血清中的抗EDAR抗体；
d)生产骨髓瘤细胞和来自免疫接种了EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的淋巴结细胞间的杂交瘤；
e)通过下述i.的方法鉴定识别人和/或小鼠EDAR和/或来自脊椎动物种的EDAR的激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段在如下ii.和iii.方面的能力：
i.利用经设计用于检测所述激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与人和/或小鼠EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白之间的结合的结合分析；和
ii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的细胞或组织中诱导体外生物学应答的能力；
iii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的生物体中诱导体内生物学应答的能力；
f)基于步骤e)ii和步骤e)iii，选择生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体的杂交瘤系；
g)对上述选择的杂交瘤系进行克隆和亚克隆；
h)对得到的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段进行纯化。
优选地，步骤a)所述的EDAR抗原为人EDAR，或小鼠EDAR，或来源于另外的哺乳动物种的EDAR，或来源于另外的脊椎动物种的EDAR。
优选地，步骤a)所述的EDAR抗原为天然地表达全长的EDAR的细胞系或转染了全长的EDAR的细胞系，或所述EDAR抗原为可溶性EDAR片段，或所述EDAR抗原为EDAR的胞外域和另一种蛋白的融合蛋白，或所述EDAR抗原为病毒样颗粒的一部分。
更优选地，所述EDAR抗原在与步骤b)的小鼠同系的细胞系中表达，或所述EDAR抗原与IgG的Fc部分融合。
甚至更优选地，所述EDAR抗原为与人IgG1Fc部分融合的人或小鼠EDAR。
作为步骤b)、c)和d)的替代，抗EDAR抗体，或其片段(如单链Fv)可通过选择由噬菌体展示在步骤a)的抗原上的抗体序列得到。
优选地，步骤e)的结合分析通过应用可视化方法进行，所述可视化方法包括ELISA、斑点杂交、Western印迹、RIA、免疫沉淀法、流式细胞术、荧光显微术、电子显微术、共聚焦显微术、测热法、等离子体共振、Ouchterlony测试、补体介导的血红细胞溶解、抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)等。
更优选地，步骤e)i所述的结合分析通过直接ELISA或捕获ELISA进行。
优选地，步骤e)ii所述的体外生物学分析是对离体的Tabby小鼠胚胎的胚胎皮肤中的基板形成的测定(Mustonen等，Ectodysplasin A1promotes placodal fate during early morphogenesis of ectodermalappendages，Development 131：4907-4919，2004)，对EDAR阳性细胞中的NF-κB活化的测定，或对用嵌合的人EDAR-Fas受体和/或小鼠EDAR-Fas受体转导的Fas-缺乏的Jurkat细胞的细胞凋亡的测定。
更优选地，步骤e)ii所述的体外生物学分析是对用嵌合的人EDAR-Fas受体和/或小鼠EDAR-Fas受体转导的Fas-缺乏的Jurkat细胞的细胞凋亡的测定。
优选地，步骤e)iii所述的体内生物学分析是对新生的EDA-缺乏的Tabby小鼠给药后尾部毛发形成的测定和/或功能性汗腺形成的测定。
特别地，步骤h)所述的纯化是通过蛋白A或蛋白G亲合色谱或通过蛋白L、基于抗小鼠IgG抗体的亲合色谱、离子交换、乙醇或硫酸铵沉淀等进行。
用于制备免疫原和免疫接种动物的方法是本领域公知的方法(Kohler和Milstein 1975Nature 256：495-497；Brown等1981J Immunol127：539-46；Brown等，1980J Biol Chem 255：4980-83；Yeh等，1976Proc Natl Acad Sci USA 76：2927-31；Yeh等，1982Int J Cancer 29：269-75；Kozbor等，1983Immunol Today 4：72；Cole等，1985Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96；U.S.Pat.No.4,816,567；Clackson等，1991Nature 352：624-628；Marks等，1991J Mol Biol 222：581-597)。
用于得到激动剂型抗EDAR抗体的优选实施方式之一如下：
a)生产人EDAR-Fc和小鼠EDAR-Fc融合蛋白。
b)用人EDAR-Fc融合蛋白免疫接种OVE1B EDAR-缺乏的小鼠，并用小鼠EDAR-Fc融合蛋白免疫接种OVE1B EDAR-缺乏的小鼠。
c)检测免疫接种的EDAR-缺乏的小鼠血清中的抗EDAR抗体。
d)生产骨髓瘤细胞和来自EDAR-Fc-免疫接种的EDAR-缺乏的小鼠的淋巴结细胞的杂交瘤。
e)通过ELISA鉴定能特异性识别人和小鼠EDAR-Fc，而非不相干的Fc融合蛋白的感兴趣的杂交瘤。
f)通过给予新生的Tabby小鼠未纯化的上清以鉴定生产激动剂型抗EDAR抗体的步骤e)的杂交瘤，并选择诱导尾部毛发形成和/或汗腺形成的杂交瘤。
g)亚克隆并扩增步骤f)选择的杂交瘤，将它们转移至无血清培养基中，并利用蛋白G亲合色谱从无血清的上清中纯化抗体。通过它们在280nm下的吸光度测定纯化的抗体的剂量。
h)在用嵌合的人EDAR-Fas受体转导的Fas-缺乏的Jurkat细胞上和在用嵌合的人EDAR-Fas受体转导的Fas-缺乏的Jurkat细胞上滴定步骤g)中纯化的抗EDAR抗体。测定它们诱导细胞凋亡的EC50。
i)在新生的Tabby小鼠中滴定步骤g)中纯化的抗EDAR抗体，并测定它们诱导尾部毛发形成和/或汗腺形成能力的EC50。
j)选择在步骤h)和i)的测试中具有最小的EC50的抗EDAR抗体。
通过该工艺获得的抗体序列为mAbEDAR1-15的抗体序列(SEQ ID#169-196)，优选地为mAbEDAR1、3、5、6、7、8、9、10、12、13和14的序列(SEQ ID#169、171-177、179-181、183、185、186-191和193-195)，甚至更优选地为mAbEDAR1、3、10和12的序列(SEQ ID#169、171、177、179、183、185、191和193)。
在实施例1中阐明了优选的用于生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的方法。
令人惊讶地，申请人观察到按照本发明所述的工艺得到了一些意料之外的结果。
特别地，为了开发EDA1-依赖的生物学活性分析开发出了不同的细胞系(EDAR-Fas-转导的Jurkat细胞系和Fas-阴性的Jurkat细胞系)，所述分析对EDA1的多聚化形式是灵敏且特异的。因为Fas-阳性细胞会造成细胞系对EDAR激动剂具有不恰当的灵敏度，可能需要应用Fas-阴性的受体细胞系。已经发现能够在该分析中正常工作的细胞系表达低水平的转导的EDAR-Fas融合蛋白。如果细胞系的选择是基于转基因的表达完成的，可以料想人们将选择表达高水平的转基因的细胞。人们可以预见这将造成不能成功地鉴定出合适的细胞系。这些意料之外的结果现在可通过高水平的转基因甚至在缺少配体时都引起细胞凋亡来进行合理化的解释。因此这些细胞在选择前被迅速地剔除。尽管如此，那些表达高水平EDAR-Fas融合蛋白的细胞是不灵敏的，这极有可能是因为它们具有信号通路中的突变的下游元件。
另一要点在于表达EDAR-Fas的细胞允许迅速地将激动剂型抗EDAR抗体分选为两类：在这些细胞中显示体外活性的抗体和在这些细胞中不显示体外活性的抗体。那些能激活表达EDAR-Fas的细胞的抗体通常也是那些具有最小亲合常数和最小解离常数的抗体。可以预期这些抗体也是那些在牙齿发育中具有最好活性的抗体。适当的牙齿发育所需的EDA信号，实际上被认为比其他外胚层附属部分(appendage)的发育所需的EDA信号更强或更优质(Mues等，Eur.J.Hum.Gen.18：19-25，2010)。
第三个令人关注的要点是开发单克隆抗体的经典方法在于用人蛋白抗原免疫接种野生型小鼠。在这种情况下，得到的是特异性针对小鼠和人蛋白之间不同的决定簇的抗体。为了生产能与小鼠和人EDAR两者交叉反应的激动剂型抗EDAR单克隆抗体，申请人使用EDAR-缺乏的小鼠OVEB1(由于EDAR信号缺乏的小鼠downless和sleek仍然表达EDAR多肽的胞外区，它们并不合适)。该方法被认为能够使申请人生产的抗EDAR抗体的多样性最大化。所述OVEB1小鼠品系不能商购得到。这种情况使得该方法对大多数想开发激动剂型抗EDAR抗体的人来说都存在问题。起初，申请人尝试通过用重组EDA1蛋白(人和小鼠之间100％相同的部分)免疫接种野生型小鼠来开发抗EDA1抗体。但没有获得有用的抗体。相反，当用EDA1免疫接种Tabby小鼠(EDA-缺乏的小鼠)时，得到了抗EDA1单克隆抗体。
申请人进一步请大家注意，在体外筛选之后，通过将所述激动剂型抗EDAR单克隆抗体注射入新生的Tabby小鼠进行体内筛选。该体内分析当然决不是本领域没有经验的科学家能够容易地进行的标准测试。
本发明的另一个目的是提供通过上文记载的工艺获得的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，对Fab片段而言，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段以至少10-8M的亲合常数(KD)结合至人和/或小鼠EDAR。本发明所述的特异性结合呈现出高亲合力。此外，实施例7中记载了：当给予新生的Tabby小鼠与小鼠EDAR交叉反应的所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段时，诱导了尾部毛发的形成和/或汗腺的形成，并具有小于20mg/kg的EC50。
本文所使用的“特异性结合”是指抗体结合至预定的抗原。典型地，对Fab片段而言，所述抗体结合的亲合常数(KD)为10-8M以下，并且与预定抗原结合的KD比与除预定抗原或密切相关的抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)结合的KD至少要低10倍。短语“识别抗原的抗体”和“抗原的特异性抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
本文所使用的术语“Kassoc”或“Ka”是指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率，而术语“KdiS”或“Kd”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。术语IgG抗体的“高亲合力”是指对Fab片段而言的亲合常数(KD)为至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M、或至少约10-12M或更高，例如高达10-13M或10-14M或更高。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲合力”结合可以不同。
优选地，特异性结合人和小鼠EDAR的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段包含：含有以下互补决定区氨基酸序列的重链可变区：SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15；或SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27；或SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQID NO：33；或SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39；或SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51；或SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57；或SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63；或SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69；或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81；以及含有以下互补决定区氨基酸序列的轻链可变区：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：10SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24；或SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30；或SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36；或SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48；或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54；或SEQID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60；或SEQ ID NO：64、SEQID NO：65、SEQ ID NO：66；或SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQID NO：72；或SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84；和/或其组合，其中所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段为人和小鼠EDAR的激动剂。
得到的特异性结合人EDAR(mAbEDAR1-15)和小鼠EDAR(mAbEDAR1-14)的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的CDR氨基酸序列如表1所示。
表1
Figure BDA0000114652830000291
更优选地，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段包含：含有CDR1、CDR2、CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)所述重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NOs：1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73或79及其保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NOs：2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74或80及其保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NOs：3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75或81及其保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述轻链可变区的CDR1序列包含选自于由下列氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID NOs：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76或82及其保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述轻链可变区的CDR2序列包含选自于由下列氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID NOs：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77或83及其保守修饰的氨基酸序列；
(f)所述轻链可变区的CDR3序列包含选自于由下列氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID NOs：6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78或84及其保守修饰的氨基酸序列。
本文所使用的术语“保守的序列修饰”是指不显著影响或改变包含所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代，添加和删除。可通过本领域已知的标准技术(如定点突变和PCR-介导的突变)将修饰引入本发明的抗体。保守的氨基酸取代是用具有类似侧链的氨基酸残基替换原有的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域已有定义。本文中将保守的氨基酸取代定义为下列五组之一中的交换：
I.小的脂肪族的、非极性的或略有极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性的、带正电的残基：His、Arg、Lys；
III.极性的、带负电的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
IV.大的、芳香族的残基：Phe、Tyr、Trp；
V.大的、脂肪族的、非极性的残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys(参见，例如Creighton，Proteins(1984))。
根据特定的实施方式，氨基酸取代可为：(1)降低对蛋白水解作用的敏感度；(2)降低对氧化作用的敏感度；(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲合力；(4)改变结合亲合力；和/或(5)赋予或改变这些多肽的其他物理化学性质或功能性质的氨基酸取代。
本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体不限于整个分子，可为所述抗体的片段或其改变的产物，只要其仍然能与EDAR(或其片段或其变体)结合并保留了作为EDAR激动剂的能力。
多价抗体(优选二价抗体)和单价抗体包含在抗体片段的实例中，所述抗体片段包括Fab、F(ab)′2、Fv、具有一个Fab和完整的Fc的Fab/c、以及单链Fv(scFv)(其中重链或轻链的Fv用合适的接头连接)。具体地，通过用酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或无花果蛋白酶)处理所述抗体合成抗体片段，或构建编码这些抗体片段的基因，将所述基因导入表达载体，然后通过合适的宿主细胞表达所述基因(参见，例如，Rousseaux，J等，Methods in Enzymology(1989)121，663-669，和Bird，R E等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通过将抗体的重链V-区和轻链V-区连接得到scFv。在所述scFv中，通过接头，或优选肽接头连接所述重链V-区和轻链V-区(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中的重链V-区和轻链V-区可来源于本申请文件中记载的任意抗体。作为连接所述V-区的肽接头，例如，可使用包含12-19个氨基酸残基的任意单链肽。
最优选地，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段由下述组成：
(a)含有SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73或79的重链可变区的CDR1；
(b)含有SEQ ID NO：2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74或80的重链可变区的CDR2；
(c)含有SEQ ID NO：3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75或81的重链可变区的CDR3；
(d)含有SEQ ID NO：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76或82的轻链可变区的CDR1；
(e)含有SEQ ID NO：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77或83的轻链可变区的CDR2；和
(f)含有SEQ ID NO：6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78或84的轻链可变区的CDR3。
根据本发明的实施方式，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段可存在抗体重链，所述重链选自：IgG、IgM、IgA、IgE、单链抗体和其它免疫球蛋白衍生的构建体或非抗体结合蛋白。
本文使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如IgM、IgA、IgE或IgG)。
通常，非抗体结合蛋白包含adnectins(基于纤连蛋白的试剂)、Affibody(基于蛋白A的试剂)、DARPins(基于锚蛋白的试剂)、avimers(富含半胱氨酸的细胞表面受体蛋白)、anticalins(脂质运载蛋白衍生的试剂)和基于核苷酸的试剂等(参见例如，Nutall和Walsh 2008Curr OpPharmacol 8：609)。
当所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段可含有IgG抗体重链时，后者可选自：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、不再被FcR识别的突变IgG1、不再经历重链交换(swapping)的突变IgG4序列、改变了糖基化的突变的IgG、PEG化的IgG等。应当明白的是，本领域技术人员已知的所有可能的“同种型转换”可认为包含在本发明的范围中。
本文使用的“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别转化为其它Ig类别之一的现象。
在基于抗体的架构(scaffold)列表中，可有利地使用七鳃鳗衍生的单域抗体VNAR。
本发明进一步提供包含选自于由下述氨基酸序列组成的组的氨基酸序列的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段：
(a)在SEQ ID NO 169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181或182中显示的重链可变区的氨基酸序列以及在SEQ ID NO 183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195或196中显示的轻链可变区的氨基酸序列；
(b)通过1个或多个保守的氨基酸取代而不同于(a)中具体列举的那些氨基酸序列的氨基酸序列；
(c)与在(a)或(b)中具体列举的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；
(d)作为人EDAR和小鼠EDAR激动剂的、在(a)或(b)或(c)中具体列举的氨基酸序列的生物学活性片段；和
(e)作为人EDAR和小鼠EDAR激动剂的、在(a)或(b)或(c)或(d)中具体列举的氨基酸序列的生物学活性变体或修饰物。
术语“序列一致性/相似性”具有本领域的常规含义。在两个或多个多肽序列的情况下，术语“一致的”或百分比“一致性”是指当比较并比对最大相似度时，两个或多个序列相同或具有的相同氨基酸残基的特定百分比(即对于特定的区域具有至少70％的一致性，优选至少75％、80％、85％、90％的一致性，甚至更优选至少95％或98％或甚至99％的一致性)。可以百分比一致性的方式测定序列一致性；该百分比越高，所述序列越一致。可以百分比相似性的方式测定序列相似性(考虑保守的氨基酸取代)；该百分比越高，所述序列越相似。当利用标准方法比对时，核苷酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物拥有相对较高的序列一致性/相似性。相比于亲缘关系较远的物种(例如人和秀丽隐杆线虫的序列)，当直系同源的蛋白或cDNAs来自于亲缘关系较近的物种(例如人和小鼠的序列)时，这种同源性更加显著。
用于比较的序列的比对方法是本领域熟知的。Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73：23744，1988；Higgins和Sharp，CABIOS5：151-3，1989；Corpet等，Nuc.Acids Res.16：10881-90，1988；Huang等，Computer Appls.in the Biosciences 8，155-65，1992；和Pearson等，Meth.Mol.Bio.24：307-31，1994中记载了多种程序和比对算法。Altschul等，J.Mol Biol.215：403-10，1990中描述了对序列比对方法和同源性计算的详细见解。在序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx的使用方面，NCBI的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altshul等，J.Mol.Biol.215：403-10，1990)可从多种资源中获取，包括国家生物信息中心(NCBI，国家医药图书馆，38A楼，8N805室，贝赛斯达，Md.20894)和因特网上。可在NCBI网站上找到额外的信息。对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较而言，利用设定至默认参数(空位存在罚11分，每个残基空位罚1分)的默认BLOSUM62矩阵来使用Blast2序列的功能。对于短肽(小于约30个氨基酸)的比对而言，利用设定至默认参数(开放空位罚9分，延伸空位罚1分)的PAM30矩阵来使用Blast 2序列的功能，从而完成该比对。当通过该方法进行评价时，与参比序列具有甚至更高相似性的蛋白将显示出提高的百分比一致性，如至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列一致性。当比较短于完整序列的序列一致性时，对于10-20个氨基酸的短窗(shortwindow)而言，同源物将典型地具有至少75％的序列一致性，根据它们与参比序列的一致性，可拥有至少85％、90％、95％或98％的序列一致性。测定对于该短窗的序列一致性的方法如NCBI网站中所述。典型地，所公开的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的同源物的特征在于：利用NCBIBlast 2.0或利用上述的手动比对与所公开的氨基酸序列进行全长比对时，所述同源物具有至少70％，优选至少95％并更优选至少98％的序列一致性。当通过该方法进行评价时，与激动剂型抗EDAR单克隆抗体序列具有甚至更高相似性的蛋白将显示出提高的百分比一致性，如至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％的序列一致性。当比较短于完整序列的序列一致性时，对于10-20个氨基酸的短窗而言，同源物将典型地具有至少75％的序列一致性，根据它们与参比序列的一致性，可拥有至少85％、90％、95％或甚至98％的序列一致性。本领域技术人员将明白，这些序列一致性范围的提供仅是用于指导，有可能得到落在所提供的范围之外的非常重要的同源物。
本发明还包括所述激动剂型抗EDAR单克隆抗体的变体。术语激动剂型抗EDAR单克隆抗体序列的“变体”或衍生物或等价物是指具有在某种程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽，所述多肽是通过保守的氨基酸取代而不同于天然序列的氨基酸序列，其中，一个或多个氨基酸被另一个具有相同特征和构象作用的氨基酸取代。氨基酸序列变体具有在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的特定位置的取代、删除和/或插入。典型地，这些变体具有与天然序列至少90％、优选至少95％并且非常尤其优选至少98％的序列一致性。在这一点上，尤其优选的变体是替换的变体，与各公开的序列相比，所述替换的变体典型地包含少于10个，优选少于5个并且非常尤其优选小于3个的替换。
除了在骨架或CDR区内进行的修饰之外或作为在骨架或CDR区内进行的修饰的替代选择，典型地，本发明的激动剂型抗EDAR单克隆抗体可被设计为包含Fc区内的修饰，从而改变所述抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可被化学修饰(例如可将一个或多个化学部分连接至抗体)或被修饰以改变它的糖基化，仍然是为了改变所述抗体的一种或多种功能性质。
例如，糖基化可被改变以增加抗体对抗原的亲和力。这种糖类修饰可通过，例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸取代从而去除一个或多个可变区骨架的糖基化位点，由此去除该位点的糖基化。这种糖基化可增强抗体对抗原的亲和力。Co等在U.S.Patent Nos 5,714,350和6,350,861中更详细地描述了该方法。
另外地或可选地，抗体可被制造为具有改变的糖基化类型，如具有减少量的岩藻糖化残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。已证实这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种糖类修饰可通过，例如，在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达该抗体来实现。具有改变的糖基化机器的细胞在本领域已有记载，并可被用作表达本发明的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的宿主细胞，从而生产出具有改变的糖基化的抗体。可选地，可利用岩藻糖苷酶切除所述抗体的岩藻糖残基。
本发明设想的对本文的抗体进行的另一种修饰是聚乙二醇化修饰。抗体可被聚乙二醇化修饰，例如，以增加该抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体乙二醇化，在一个或多个PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下，该抗体或其片段典型地与聚乙二醇(PEG)反应，如PEG的反应性酯或醛衍生物。优选地，通过与反应性的PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷化反应来实现所述聚乙二醇化。本文使用的术语“聚乙二醇”旨在包括任意形式的被用来衍生化其它蛋白质的PEG，如单(C1-C 10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在特定的实施方式中，待聚乙二醇化的抗体是糖基化的抗体。用于蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并可被用于本发明的抗体。参见例如Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0401384。
在特定的实施方式中，本发明的激动剂型抗EDAR单克隆抗体不包含天冬酰胺异构位点。可分别在N-G或D-G序列上发生脱酰胺作用或异天冬氨酸效应。所述脱酰胺作用或异天冬氨酸效应导致异天冬氨酸的形成，异天冬氨酸通过在侧链羧基末端而在非主链形成扭结结构，降低了抗体的稳定性。
在一个优选的实施方式中，选择不会快速降解的抗体。可通过本领域熟知的毛细管电泳(CE)和MALDI-MS测定抗EDAR单克隆抗体的片段化(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。在另一个优选的实施方式中，选择具有最小的聚集效应的抗体。聚集可导致引发不想要的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学性质。通常，具有25％以下，优选20％以下，甚至更优选15％以下，甚至更优选10％以下并且甚至更优选5％以下的聚集的抗体是可接受的。可通过本领域熟知的几种技术测定聚集，包括体积排阻柱(SEC)高效液相色谱(HPLC)和光散射，以鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体。
图5显示出关于14个激动剂型抗EDAR单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列，所述抗体即mAbEDAR1、mAbEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDAR10、mAbEDAR11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15。
一些额外的未预料到的结果对本发明的非显而易见的性质而言是有利的。
随着一些初步的结果，申请人观察到，在利用EDAR-Fas-转导的Jurkat细胞的体外分析中，发现本发明的激动剂型抗EDAR mAb的效果比Fc-EDA1差10倍甚至1000倍以上(参见US Patent 2005/152,872；Gaide等)。基于这种低的体外效力，在抗EDAR mAb的第一次体内评价时，并不预期观察到抗EDAR mAb会像Fc-EDA1一样有效。这些结果可通过所述抗体的半衰期比Fc-EDA1融合蛋白的半衰期长约10到20倍解释，或通过如下事实解释：申请者使用的体外系统中的激活通路或体内细胞中的激活通路是不同的。
除此之外，天然存在的可溶性EDA1很可能为三聚体的多聚体，并且Fc-EDA1为六聚体配体。已有详细的记载表明多个Fas受体的同时接合和成簇对生物学活性而言是必需的(Schneider等，J.Exp.Med.187：1205-13，1998；Holler等，Mol.Cell.Biol.23：1428-40，2003)并强烈怀疑多个EDAR受体的同时接合和成簇对生物学活性而言是必需的(Schneider等，J.Biol.Chem.276：18819-27，2001；Swee等，J.Biol.Chem.284：27267-76，2009)。相比之下，抗EDAR抗体仅仅是二价的。因此，这种分子格式不可能与Fc-EDA1具有一样的生物学活性。
另外，并未期望具有Fc-EDA1的结合特异性以外的结合特异性(在EDAR上的不同结合位点)的抗EDAR单克隆抗体会具有激动剂性质。由于没有控制抗体的抗原特异性的简单方法(除非冒着丧失构象决定簇的风险，使用涵盖了希望的抗原特异性区域的短的抗原片段)，申请人的结果是完全出乎意料的。
最终，来自若干同种型的抗体可显示出毒性活性(例如ADCC或抗体依赖的细胞毒性，CDC或补体依赖的细胞毒性以及FcR介导的骨髓细胞的活化)，这使得这些抗体的体内使用并不现实。
本发明的另一个目的是提供编码上述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段或抗原结合蛋白或其片段的分离的核酸分子。
本文使用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链的或双链的，但优选为双链DNA。
除上述单克隆抗体外，人工改变的基因重组抗体(如嵌合抗体或人源化抗体)可被用来例如降低针对人的抗原异质性。可用已知方法生产这些改变的抗体。
嵌合抗体可通过例如下述过程得到：将编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将产物插入表达载体中并将该载体导入宿主中以使宿主生产该抗体。利用该已知方法，可得到本发明中有用的嵌合激动剂型抗EDAR单克隆抗体。
人源化抗体也是指改造的人抗体，所述人源化抗体是通过将除人以外的哺乳动物(如小鼠)的抗体CDR移植至人抗体的CDR而制备的。其常用的基因重组技术也是已知的(参见欧洲专利申请公开EP 125023和WO 96/02576，或它们的US对应专利的任意一个，如US 6,068,040)。
术语“人源化抗体”旨在涉及将源自另外的哺乳动物种(如小鼠)的CDR序列移植到人骨架序列上的抗体。在所述人骨架序列中可进行额外的骨架区修饰。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可基于上文中制备的非人单克隆抗体的序列来制备。可利用标准的分子生物学技术从感兴趣的非人的杂交瘤中得到编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并将其设计为包含非鼠科动物(如人)的免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可利用本领域已知的技术，将鼠科动物可变区连接至人恒定区(参见例如U.S.PatentNo.4,816,567，Cabilly等)。为产生人源化的单克隆抗体，可利用本领域已知的方法，将鼠科动物CDR区插入人骨架中(参见例如U.S.Patent No.5,225,539，Winter和U.S.Patent Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，Queen等)。在优选的实施方式中，本发明的抗体为人单克隆抗体。
编码特异性结合人(mAbEDAR1-15)和鼠(mAbEDAR1-14)EDAR的所得的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的CDR核苷酸序列在表2中示出。
表2
Figure BDA0000114652830000401
另外，图3和图4显示出抗EDAR单克隆抗体mAbEDAR1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15的核苷酸序列的确定。
本发明的另一个目的涉及包含至少一个拷贝的上述核酸分子的表达载体。
本文使用的术语“载体”旨在涉及能运输另一个与它相连的核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，它是指环状双链DNA环，附加的DNA片段可被连接至其中。另一类载体为病毒载体，其中附加的DNA片段可被连接至病毒基因组中。某些载体能在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌性载体以及附加型(episomal)哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)一旦导入宿主细胞就可被整合入宿主细胞的基因组中，并因此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导其可操作地连接的基因的表达。本文中的这些载体是指“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。
通常，在重组DNA技术中应用的表达载体经常为质粒形式。在本申请文件中，由于质粒是最常用的载体形式，“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，如发挥等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒)。
本发明也涉及到包含上述表达载体的宿主细胞。本文使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在涉及已导入重组表达载体的细胞。应当理解，该术语不仅旨在涉及特定的受试细胞，也涉及该细胞的子代细胞。由于突变或者环境影响，在后代中可发生某些修饰，事实上，这些子代细胞可能不同于母细胞，但是仍包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括，例如CHO细胞和淋巴细胞。
尤其适合用于表达重组抗体和人源化抗体的表达载体和宿主细胞是本领域已知的。下述参考文献是适合重组免疫球蛋白表达的方法和载体的代表，这些方法和载体可在本发明中使用：Weidle等，Gene，51：21-29(1987)；Dorai等，J.Immunol.，13(12)：4232-4241(1987)；De Waele等，Eur.J.Biochem.，176：287-295(1988)；Colcher等，Cancer Res.，49：1738-1745(1989)；Wood等，J.Immunol.，145(9)：3011-3016(1990)；Bulens等，Eur.J.Biochem.，195：235-242(1991)；Beldsington等，Biol.Technology，10：169(1992)；King等，Biochem.J.，281：317-323(1992)；Page等，Biol.Technology，9：64(1991)；King等，Biochem.J.，290：723-729(1993)；Chaudhary等，Nature，339：394-397(1989)；Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1989)；Benhar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：12051-12055(1994)；Singer等，J.hnunol.，150：2844-2857(1993)；Couto等，Hybridoma，13(3)：215-219(1994)；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10029-10033(1989)；Caron等，Cancer Res.，52：6761-6767(1992)；Coloura等，J.Immunol.Meth.，152：89-109(1992)。此外，适合重组抗体表达的载体可商购得到。例如，所述载体可为裸露的核酸区段、载体相关(carrier-associated)的核酸区段、核蛋白质、质粒、病毒、类病毒或转座因子。
已知能表达功能性免疫球蛋白的宿主细胞包括，例如：哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；COS细胞；骨髓瘤细胞，如NSO和SP2/0细胞；昆虫细胞；细菌，如大肠杆菌；酵母细胞，如酿酒酵母；以及其他宿主细胞。这些宿主细胞中，考虑到CHO细胞有效表达和分泌免疫球蛋白的能力，他们被许多研究者使用。NSO细胞是在本发明中有用的优选的宿主细胞类型之一。
按照本领域技术人员已知的技术转化宿主细胞。“转化的”细胞是通过分子生物学技术将核酸分子导入其中的细胞。本文使用的术语转化包括可将核酸分子导入细胞中的所有技术，包括借助病毒载体的转染、借助质粒载体的转化和通过电穿孔法、脂质转染法、磷酸钙沉淀法和粒子枪加速法导入裸露DNA。
特别地，本发明也涉及分泌本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的杂交瘤。
由此制备的生产单克隆抗体的杂交瘤可在标准的培养液中传代培养或可在液氮中保藏很长一段时间。为从杂交瘤中得到单克隆抗体所使用的方法的一个实例包括根据标准方法培养杂交瘤，并在培养物上清中得到单克隆抗体。前一种方法适合抗体的大量生产。
可在本发明中使用的单克隆抗体可为通过下述过程制备的重组单克隆抗体：通过基因工程技术，从杂交瘤中克隆抗体基因，将该基因插入适当的载体中，将该载体导入宿主中，然后使该宿主生产所述的重组单克隆抗体(例如，参见Vandamme，A.M.等，Fur.J.Biochem，(1990)192，767-775，1990)。
除了上述宿主细胞，转基因动物或植物也可被用来生产重组抗体。
因此，本发明的进一步目的涉及具有包含本发明所述分离的核酸分子和/或表达载体的基因组的转基因非人动物。
另一方面，本发明涉及包含本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段及药学上可接受的载体的药物组合物。根据本发明，所述药物组合物包含至少治疗上有效分量(quantity)或总量(amount)的本发明所述的本质上纯化和分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。
本文所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段作为“化合物”可与生理上可接受的载体一起给药。生理上可接受的载体为可将化合物加入其中以使化合物溶解或可促进化合物给药的制剂。选择合适的生理上可接受的载体的一个重要因素为选择化合物在其中仍保持活性的载体，或载体与化合物结合生成活性化合物。通常地，药学上可接受的载体可为溶剂或分散介质。可用于本发明的药物组合物的合适的水性的和非水性的载体实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)、以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。可通过例如乳化剂(如卵磷脂)的使用、在分散剂的情况下通过维持所需的颗粒尺寸、以及通过表面活性剂(如吐温20)的使用来维持适当的流动性。
所述药物组合物也可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂、药学上可接受的抗氧化剂和分散剂。可通过在前的灭菌程序并通过含有多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)来共同确保防止微生物的出现。也可希望在组合物中含有等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过包含延缓吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)延长可注射的药物形式的吸收。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的药学上可接受的盐也可被预见。
“药学上可接受的盐”是指保留了母体化合物希望的生物学活性并且不会产生不希望的毒性作用的盐(参加例如，Berge，S.M.等，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物被配制为用于胃肠道外给药、静脉给药、口服给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药或局部给药。
本文使用的短语“胃肠道外给药”和“胃肠道外地给药”是指不同于肠内给药和局部给药的给药模式，通常是通过注射，并包括但不限于静脉注射和输注、肌内注射和输注、动脉注射和输注、鞘内注射和输注、囊内注射和输注、眼眶内注射和输注、心内注射和输注、皮内注射和输注、腹膜内注射和输注、经气管注射和输注、皮下注射和输注、表皮下注射和输注、关节内注射和输注、囊下注射和输注、蛛网膜下注射和输注、脊椎内注射和输注、硬膜外注射和输注以及间质内注射和输注。
本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的优选的给药途径为静脉给药、肌内给药和腹膜内给药。优选的递送模式为通过注射和输注。
可注射的形式可包括无菌水溶液剂或分散剂。另外，可制备无菌粉末的形式，以用于这些无菌的可注射溶液剂或分散剂的随时制备。就一切情况而论，为了便利的注射性能(syringability)，最终的可注射的形式必须是无菌的并且必须是有效流动。该药物组合物在制造和储存的条件下必须稳定；因此，优选应该使其免受微生物(如细菌和真菌)的污染作用。
胃肠道外给药可被制备成生理溶液中的联合组分的溶液剂或悬浮剂。可包含合适的表面活性剂，如，例如羟丙基纤维素。分散剂也可被制备在油中的甘油、液体聚乙二醇及其混合物中。
进一步的，可包含防腐剂以阻止微生物的有害生长。
在口服剂型的制备中，可使用任意适宜的药用介质。例如，可使用水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等以形成口服液体制剂，如悬浮剂、酏剂和溶液剂；同时可使用如淀粉、糖类、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂等的载体，以形成口服固体制剂，如粉末剂、胶囊剂和片剂。由于易于给药，使用固体药物载体的片剂和胶囊剂为优选的口服剂量单位。任选地，可通过标准的水性或非水性技术给片剂包衣。
可通过压缩(compression)或模塑(molding)制备片剂，任选地，可与一种或多种附加成分或佐剂一起制备。
可通过在合适的机器中将自由流动形式的联合组分(如粉末或颗粒)进行压缩而制备压缩片剂，任选地，可与粘结剂、润滑剂、非活性稀释剂、表面活化剂或分散剂混合制备。
可通过在合适的机器中，将用非活性液体稀释剂润湿的粉末化的化合物的混合物进行模塑制造模塑片剂。
调整有效剂量疗法以提供最佳的希望的应答(例如，治疗应答)。例如，可给予单次大丸剂(bolus)，可随时间的推移给予若干次经划分的剂量，或如治疗情况紧急性所指出的，可成比例地减少或增加剂量。配制利于给药和剂量一致性的剂量单位形式的胃肠外组合物是尤其有利的。本文使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位；每个单位包含预定分量的活性化合物，该预定分量是经计算而得，以与需要的药物载体一起产生希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格通过下述条件规定并直接依赖于下述条件：(a)所述活性化合物的特有的特征和待达到的特定治疗效果，和(b)本领域中将这样的活性化合物进行化合以用于个体敏感性治疗的固有限制。
与所选给药途径无关，通过本领域技术人员已知的常规方法，将可以以合适的水合形式使用的本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段和/或本发明的药物组合物，配制成药学上可接受的剂型。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平是可变的，从而得到对特定患者、组合物和给药模式而言有效地产生希望的治疗应答的活性成分的量，而不会对患者产生毒性。所选剂量水平依赖于多种药代动力学因素，包括：本发明所用的具体组合物或其盐或其氨基化合物的活性；给药途径；给药时间；治疗的持续时间；与所用的具体组合物联合使用的其他药物；化合物和/或物质；治疗的患者的年龄、性别、体重、身体条件、健康状况和之前的病史等因素。
医生或兽医可从低于达到希望的疗效所需的水平开始给予所述药物组合物中使用的本发明的化合物，并逐步增加剂量直到达到希望的效果。通常，本发明的组合物的合适的每日剂量为有效产生疗效的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述的因素。优选静脉给药、肌内给药、腹膜内给药或皮下给药，或靠近靶位点给药。如果需要的话，任选地，可以在一天中以适当的间隔，以单位剂量形式将治疗组合物的有效的每日剂量以2、3、4、5、6或更多的亚剂量分别给药。尽管对于本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段而言，单独给药是可能的，但优选将其作为药物制剂(组合物)给药。
用于本文所述的免疫相关状况和疾病的治疗的本发明的组合物的有效剂量随许多不同的因素而改变，包括给药方法、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、给予的其他药物以及所述处理是防范性的还是治疗性的。治疗剂量需要被滴定测量，以优化安全性和效力。
对于抗体的给药，以宿主的体重计，剂量范围从约0.0001mg/kg到100mg/kg，更通常为0.01mg/kg到5mg/kg。例如剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1mg/kg到10mg/kg体重的范围内。示例的治疗方法要求每两周给药一次或每月给药一次或每3-6个月给药一次。在某些方法中，同时给予具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在这种情况下，给予的各抗体的剂量都落入所指出的范围内。抗体通常是多次给药的。单次剂量间的间隔可为周、月或年。正如通过测定患者体内针对EDAR的抗体的血液水平所指示的，间隔也可以没有规律。在某些方法中，剂量被调整成可达到0.001-1000μg/ml的血浆抗体浓度。可选地，抗体可以作为持久释放制剂给药，在这种情况下，需要较低频率的给药。
剂量和频率随抗体在患者体内的半衰期而不同。通常，人抗体显示出最长的半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。给药的剂量和频率可根据所述治疗是防范性的还是治疗性的而不同。在防范性应用中，在长时间内以相对低的频率给予相对低的剂量。某些患者在余生中一直接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对短的间隔、相对高的剂量，直至疾病进展减缓或终止，并优选地直至患者显示出疾病症状的部分改善或完全改善。从那以后，可以防范疗法的方式对患者给药。
本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的剂量范围可根据给药途径和患者状态(年龄、性别、体重、疾病的程度等)而不同。理想地，以0.1mg/kg体重到100mg/kg体重的剂量单位，将本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段对有需要的患者给药。
意外发现了尤其是在X-连锁少汗型外胚层发育不良(XLHED)或牙齿发育不全的治疗中，本发明所述的药物组合物的给药(例如外敷、注射、递送、接触等)产生改进的疗效。
证实了本发明对在外胚层起源的细胞或组织的发育中忍受痛苦的患者的新型治疗策略的设计而言具有重要的含义。更具体的，本发明对患有XLHED或牙齿发育不全的患者的新型治疗策略的设计而言具有重要的含义。
本发明也涉及本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物在制备用于调节外胚层起源的细胞或组织的发育的药物中的用途，所述外胚层起源的细胞或组织包括如毛发、牙齿、皮肤、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺。
在本发明中，术语“调节”是指能与特定受体反应并能改变或控制所述受体的活性的分子。
本发明所述的药物可被用于疾病的治疗，如治疗外胚层发育不良或不是由EDA1中的突变引起的外胚层结构紊乱(disturbance)或反常(anomalies)，如毛发、牙齿或腺体反常，尤其用于治疗脱毛症、皮脂腺失常、或汗腺或皮脂腺缺乏、或用于伤口愈合。
优选地，本发明的药物可被用于治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良或牙齿发育不全。
在第一个实施方式中，所述药物可给予怀孕中的母体/母体动物。可按上述相同的途径直接完成对胎儿的药物注射(胃肠道外给药、静脉给药、口服给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药或局部给药)，或者可选地通过脐静脉来完成。
在本发明的第二个实施方式中，所述药物可给予早产新生受试者、新生受试者、幼年受试者、青年受试者或成年受试者。考虑到Gaide和Schneider的研究中报道的结果(Nature Medicine 2003)，设想出生后几天Fc-EDA1不再具有生物学活性。因此，令人惊奇的是，在成年Tabby小鼠和成年野生型小鼠中，本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物的给药仍具有治疗活性。
在数天到数周内测定免疫球蛋白的半衰期。毫不惊奇的是，在注射一周后仍能在血清中检测到本发明的抗EDAR单克隆抗体的存在。所述抗体的体内长半衰期开启了患者(如青少年的和成年的Tabby小鼠或人)更长时间地接触到这些治疗性试剂的可能性。因此，这种长期的治疗甚至在产后期之后都带来了意想不到的治疗益处。
除了将抗EDAR单克隆抗体作为候选药物用于XLHED等的治疗外，这些抗体也构成了无价的分析工具。这些抗体中的大多数显示出了与小鼠EDAR和人EDAR的交叉反应性。本发明的抗EDAR单克隆抗体也能检测大鼠、兔和狗的EDAR。这些抗体在流式细胞术和Western印迹应用中成功进行了测试。这些试剂在免疫组织化学中的使用作为诊断工具而言具有真正的重要性。
可选地，本发明另一方面也涉及在有需要的患者中治疗XLHED的方法。根据本发明，治疗XLHED的方法包括将治疗有效量的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段给予患者。
本发明另一方面在于使用本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物制造涉及皮肤重建的药物。
优选地，皮肤重建包括灼伤、溃烂或伤疤(如褥疮)、如肿瘤消融手术后的美容性重建。
本发明的另一目的是本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物在制备用于改变毛发形态的药物中的用途。
如果预测本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物的注射将与Fc-EDA1具有相似的作用是合理的，并未预期这些抗体会如此引人注目地改变毛发颜色(Gaide和Schneider，Nature Medicine 2003讲到“Thecoat of treated animals was often darker in color，probably because of anincreased number ofhair-associated melanocytes”“处理后的动物的皮毛的颜色经常更深，这可能是因为毛发相关的黑素细胞量的增加”)。
也未预期抗EDAR抗体会改变毛发的形态(结构)。更相信的是毛囊数或它们的周期将被改变。
此外，证实了在成年Tabby小鼠和成年野生型小鼠中的本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物的给药改变了毛发结构和颜色。
本发明也提供了增强组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺发育的方法，该方法包括将本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物给予有需要的受试者。
优选地，该方法包括将一定量的本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物给予所述有需要的受试者，所述量足以促进所述有需要的受试者的组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺的发育。
特别地，所述受试者患有外胚层疾病，并且优选所述外胚层疾病为XLHED、牙齿发育不全或脱毛症。
此外，本发明涉及药物试剂盒，所述试剂盒包含至少有效量的本发明的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物以及使用说明书，尤其是针对XLHED的治疗的说明书。
本发明所述的药物试剂盒可包含容器，所述容器至少含有所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。
通常地，所述试剂盒包含容器和在该容器上或与该容器相关联的标签或包装说明书(package insert)。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。该容器可由多种材料形成，如玻璃或塑料。该容器容纳了对治疗所述状况有效的组合物，并可具有无菌的入口(例如该容器可为静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的瓶塞的小瓶)。所述标签和包装说明书指示了该组合物是用于治疗所选病症，如XLHED。
可选地，或附加地，该试剂盒还可包含含有药学上可接受的缓冲液(如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。该试剂盒可进一步含有在商业角度和使用者角度上期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
与小鼠EDAR和人EDAR交叉反应的激动剂型抗EDAR抗体也可与大多数哺乳动物种的EDAR交叉反应，并且也可与其他脊椎动物种的EDAR交叉反应。如果所述激动剂型抗体不与给定的哺乳动物或脊椎动物种的EDAR交叉反应，可根据本申请中所述的方法，通过用EDAR抗原(其中的EDAR序列对应于感兴趣的种的EDAR序列)免疫接种EDAR-缺乏的小鼠来产生该激动剂型抗体。
最后，本发明的另一个目的是本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物在制造用于任意哺乳动物或脊椎动物种的兽医应用的药物中的用途。该药物可被用于子宫内(对于哺乳动物)或卵内(对于鸟类、爬行动物、卵生鱼类等)、或用于幼年动物、或用于成年动物。该治疗可用于调节外胚层起源的细胞或组织(如毛发、羽毛、鳞片、角、爪、喙、牙齿、皮肤、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺)的发育，该治疗尤其可被用于暂时或永久地改变毛发、鳞片或羽毛的颜色和/或形态。
给出特定的可变域区的序列，普通技术人员利用本领域熟知的方法可容易地筛选出互补的可变域区的序列。参见，例如，Klimka等，BritishJournal of Cancer(2000)93：252-260；Beboer等，J.Mol.Biol.(2000)296：833-849；Radar等，PNAS(1998)95：8910-8915；Portolano等，J.Immuno.(1993)150：880-887和Clarkson等，Nature(1991)352：624-628，本文中将其全部内容援引加入。例如，可针对轻链可变域的序列文库筛选包含本文所述的重链CDR1、2或3的氨基酸序列的重链可变域的序列，从而得到结合人和/或小鼠EDAR的抗体。可选地，可针对重链可变域的序列文库筛选包含本文所述的轻链CDR1、2或3的轻链可变域的序列，从而得到结合人和/或小鼠EDAR的抗体。不希望受理论的束缚，该方法学可用于将任意已知的抗体人源化。例如，可针对人可变域的序列、随后再针对已鉴定的人可变域的序列(该序列是针对第二套人可变域的序列筛选得到的)筛选非人可变域的序列。
因此，在某些实施方式中，所述抗体、抗体片段或抗原结合部分或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的互补决定区(CDR)氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3；或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；或SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；或SEQ ID NO：19、SEQID NO：20和SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；或SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；或SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；或SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：49、SEQID NO：50和SEQ ID NO：51；或SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57；或SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；或SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69；或SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：79、SEQID NO：80和SEQ ID NO：81。
在某些实施方式中，所述抗体、抗体片段或抗原结合部分或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自于由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182；(b)通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守的氨基酸取代而不同于在(a)中具体列举的那些序列的氨基酸序列；以及(c)与在(a)或(b)中具体列举的序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体、抗体片段或抗原结合部分或其片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含以下的互补决定区(CDR)氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；或SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；或SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：46、SEQID NO：47和SEQ ID NO：48；或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；或SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60；或SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66；或SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72；或SEQ ID NO：76、SEQID NO：77和SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。
在某些实施方式中，所述抗体、抗体片段或抗原结合部分或其片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含选自于由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195和196；(b)通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守的氨基酸取代而不同于在(a)中具体列举的那些序列的氨基酸序列；以及(c)与在(a)或(b)中具体列举的序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列一致性的氨基酸序列。
通常地，与可变域区序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列一致性的氨基酸序列在可取代位置处将不同于所述可变域区的序列。“可取代位置”是可被不同氨基酸取代而不显著降低抗体的结合活性的可变域区序列中的特定位置。可取代位置也可被称为“容忍变化的位置”。通过比对重链或轻链可变域的序列，并确定哪个氨基酸在哪个位置发生取代而显示可变域序列的可取代位置。通过如下事实鉴定本文所公开的可变域序列的可取代位置：可取代位置处的氨基酸一致性在相关抗体(例如，本文示例的抗体)的各可变域序列之间是不同的。一旦鉴定出来，各可变域序列的可取代位置的氨基酸可被取代为不同的氨基酸而不会显著降低该抗体的结合亲和力。通常，为获得抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段，优选可取代位置在CDRs之外。然而，也可利用CDRs中的1个、2个、3个、4个或5个或更多位置。优选地，当利用CDRs中的可取代位置时，可利用不多于1个、2个、3个、4个或5个这种位置作为可取代位置。美国专利申请公开号2006/0099204记载了用于鉴定可取代位置的方法，本文将其内容援引加入。
在某些实施方式中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的互补决定区(CDR)氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；或SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；或SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；或SEQ ID NO：43、SEQID NO：44和SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51；或SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57；或SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；或SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69；或SEQ ID NO：73、SEQID NO：74和SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81；并且所述轻链可变区包含以下的互补决定区(CDR)氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；或SEQID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；或SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；或SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：46、SEQID NO：47和SEQ ID NO：48；或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；或SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60；或SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66；或SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72；或SEQ ID NO：76、SEQID NO：77和SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。
正如本文所公开的，本发明人等已鉴定出了人EDAR和小鼠EDAR的新的抗原性部分，本文所述的抗体可结合至该部分。因此，本文所述的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与对应于SEQ ID NO.235的29-114位氨基酸(鉴定为SEQ ID NO：239，SNCGENEYYNQTTGLCQECPPCGPGEEPYLS CGYGTKDEDYGCVPCPAEKFSKGGYQICRRHKDCEGFFRATVLTPGDMENDAECG)和SEQ IDNO.236的29-114位氨基酸(鉴定为SEQ ID NO：242，SNCGENEYHNQTTGLCQQCPPCRPGEEPYMSCGYGTKDDDYGCVPCPAEKFSKGGYQICRRHKDCEGFFRATVLTPGDMENDAECG)的人EDAR和/或小鼠EDAR序列片段结合，但不显著地与也是本发明公开的主题的对应于SEQ ID NO：235的29-72位氨基酸(鉴定为SEQ ID NO.237，SNCGENEYYNQTTGLCQECPPCGPGEEPYLSCGYGTKDEDYGCV)和/或SEQ ID NO：236的29-72位氨基酸(鉴定为SEQ ID NO.240，SNCGENEYHNQTTGLCQQCPPCRPGEEPYMSCGYGTKDDDYGCV)的EDAR序列片段结合。本文使用的术语“不显著地结合”是指与SEQ IDNO：239和/或SEQ ID NO：242结合的所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段的亲和常数大于10-7M、10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、10-1M或1M。因此，在某些进一步的实施方式中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段不显著地与对应于SEQ ID NO：235的71-114位氨基酸(鉴定为SEQ ID NO.238，VPCPAEKFSKGGYQICRRHKDCEGFFRATVLTPGDMENDAECG)和/或SEQ ID NO：236的71-114位氨基酸(鉴定为SEQ ID NO.241，VPCPAEKFSKGGYQICRRHKDCEGFFRATVLTPGDMENDAECG)的EDAR序列片段结合。
在某些实施方式中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与对应于SEQ ID NO：2441和/或SEQ ID NO：243的人EDAR和/或小鼠EDAR序列片段结合，但在没有SEQ ID NO.238时，并不显著地与SEQ ID NO：239的EDAR序列片段结合，和/或在没有SEQ ID NO.241时，不与SEQ ID NO：242的EDAR序列片段结合。
在某些实施方式中，如下的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与相同的抗原决定簇结合：(a)包含含有如下的互补决定区氨基酸序列的重链可变区的抗体：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；或SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；或SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；或SEQ ID NO：43、SEQID NO：44和SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51；或SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57；或SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；或SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69；或SEQ ID NO：73、SEQID NO：74和SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81；和/或(b)包含含有如下的互补决定区氨基酸序列的轻链可变区的抗体：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；或SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；或SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：46、SEQID NO：47和SEQ ID NO：48；或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；或SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60；或SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66；或SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72；或SEQ ID NO：76、SEQID NO：77和SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84，其中所述分离的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与(a)或(b)中的抗体竞争结合该抗原决定簇。
根据本发明，所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为人EDAR和/或小鼠EDAR的激动剂。优选地，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段以至少10-8M的亲和常数(KD)结合至人EDAR和/或小鼠EDAR。
根据本发明的实施方式，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为人源化的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为单价的。根据本发明的另一个实施方式，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为多价的。
在某些实施方式中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为单链的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
根据一个实施方式，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为Fab、F(ab)’2、Fv、Fab/c、Fv、单链Fv(sc Fv)或Fd片段。
根据另一个实施方式，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为嵌合的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
根据本发明的另一个实施方式，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为融合蛋白。
在某些实施方式中，本发明所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的重链选自于由IgG、IgM、IgA、IgE、单链抗体、免疫球蛋白衍生的构建体和非抗体结合蛋白的重链组成的组。优选地，所述IgG选自于由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、不再被FcR识别的突变IgG1和不再经历重链交换的突变IgG4组成的组。
根据另一个实施方式，所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的非抗体结合蛋白选自于由adnectins、Affibody、DARPins、avimers、anticalins和基于核苷酸的试剂组成的组。
本文使用的术语“抗原决定簇”是指与特定的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段接触的抗原的部分(即表位)。当蛋白或蛋白的片段被用于免疫接种宿主动物，所述蛋白的多个区域可诱导产生特异性结合至该蛋白上的给定区域或三维结构的抗体；这些区域或结构被称为抗原决定簇。抗原决定簇可与完整的抗原(即，用来激发免疫应答的免疫原)竞争结合至抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
本文使用的短语“竞争结合该抗原决定簇”是指在竞争结合分析中，对于与相同的抗原决定簇的结合，抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段将另一种抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段的亲和常数至少提高5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.1倍、1.25倍、1.5倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多倍的能力。本领域普通技术人员很清楚用于测定结合常数的方法。用于测定结合常数的一个方法为如实施例1中所述的可商购的Biacore分析设备。在某些实施方式中，在存在竞争的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段时，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段的结合亲和力高于10-7M、10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、10-1M或1M。
嵌合抗体是典型地通过基因工程构建的轻链和重链基因来自于不同物种的抗体可变区和恒定区基因的抗体。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区结合至人恒定区，如γ1、γ2、γ3和γ4。
本文使用的术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白的蛋白域的多肽。例如，融合蛋白可包含抗原结合部分或抗体片段以及非抗体蛋白。
在本发明的一个实施方式中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与配体和/或标签缀合。
在一个实施例中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段的重链与配体和/或标签缀合。
在另一个实施例中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段的轻链与配体和/或标签缀合。抗体与配体/标签的缀合
多种多样的配体或标签可与本文所述的抗体偶联(即，连接)。不希望受理论的束缚，本发明的抗体可缀合至其他肽或者其他分子，用于定制例如生物利用度、抗体的血清半衰期或储存期限、免疫原性、人体耐受性，或用于影响所述抗体在药学上可接受的载体中的溶解度。尽管本文针对抗体与配体和标签的缀合进行了论述，需要理解的是，抗体片段和抗原结合部分及其片段也能与配体和标签缀合。在某些实施方式中，配体包括天然存在的分子，在某些实施方式中，配体包括重组的分子或合成的分子。示例的配体包括但不仅限于：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如，PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、聚磷腈、聚乙烯亚胺、阳离子基团、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、拟肽聚胺、树状物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化的聚氨基酸、运铁蛋白、二碳磷酸盐化合物(bisphosphonate)、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、适配体、去唾液酸胎球蛋白、透明质酸(hyaluronan)、前胶原、免疫球蛋白(例如抗体)、胰岛素、运铁蛋白、白蛋白、糖-白蛋白缀合物、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(例如，TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、稠环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人造核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂分子(例如，类固醇、胆汁酸、胆固醇、胆酸、金刚烷醋酸、1-芘基丁酸、双氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、牻牛儿氧己基基团、十六烷基甘油、龙脑、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧三苯甲基或吩噁嗪、肽类(例如，α-螺旋肽、两亲肽、RGD肽、细胞透过肽、溶内体肽/融合肽)、烷基化剂、磷酸盐、氨基、巯基、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性示踪的标记、酶、半抗原(例如，生物素)、运输/吸收促进因子(例如，甲氧萘丙酸、阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类(imidazole cluster)、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP、AP、抗体、激素和激素受体、凝集素、碳水化合物、多价碳水化合物、维生素(例如，维生素A；维生素E；维生素K；维生素B，例如叶酸、B12、核黄素、生物素和吡哆醛)、维生素辅因子、脂多糖、p38MAP激酶的激活剂、NF-κB的激活剂、分类群(taxon)、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、噻氨酯哒唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、拉春库林A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine、肌基质蛋白(myoservin)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β、γ-干扰素、天然或重组的低密度脂蛋白(LDL)、天然或重组的高密度脂蛋白(HDL)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)和细胞透过剂(例如，α-螺旋细胞透过剂)。
可由于许多原因而使用配体，这些原因包括但不限于：靶向、PK调节和添加标记/添加标签。靶向配体可对选定的靶标(例如，细胞、细胞类型、组织、器官、身体部位、或区室(如细胞区室、组织区室或器官区室)提供增强的亲和力。PK调节配体可调节抗体在体内的药代动力学。
在某些实施方式中，本发明的抗体与标记/标签缀合，如荧光标记或生物素标记。不希望受理论的束缚，这些标记使得可以容易地追踪所述抗体(如有必要的话)或能够帮助纯化所述抗体。
也可以以如下方式设计配体：当完成抗体纯化后可移除该配体。例如，所述配体可通过接头连接于抗体上，在适当的条件下可容易地切除。这些条件可包括酸性或碱性pH、加热、超声、酶切等。
本文使用的术语“标记”是指能产生指示靶标存在的可检测信号的组分。合适的标记包括荧光分子、放射性同位素、核苷酸生色团、酶、底物、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光部分等。这样而言，标记是可通过本文所述的方法和装置所需的光谱(spectroscopic)手段、光化学手段、生物化学手段、免疫化学手段、电子手段、光学手段或化学手段检测的任意组分。例如，所述抗体可以用可检测的标签标记，然后可利用特异性针对该标记的抗体进行检测。
示例的荧光标记包括但不限于：羟基香豆素琥珀酰亚胺酯、氨基香豆素琥珀酰亚胺酯、甲氧基香豆素琥珀酰亚胺酯、级联蓝(Cascade Blue)、酰肼、太平洋蓝(Pacific Blue)、马来酰亚胺、太平洋橙(Pacific Orange)、荧光黄、NBD、NBD-X、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物(Cy-chrome、R670、Tri-Color、量子红)、PE-Cy7缀合物、Red 613、PE-德克萨斯红、PerCP、多甲藻素叶绿素蛋白、TruRed(PerCP-Cy5.5缀合物)、FluorX、异硫氰酸荧光素(FITC)、BODIPY-FL、TRITC、X-罗丹明(XRITC)、丽丝胺罗丹明B、德克萨斯红、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7缀合物、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、AlexaFluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、AlexaFluor 750、Alexa Fluor 790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5或Cy7。
所述配体可直接或者通过接头与所述抗体的重链和/或轻链的N端、C端或氨基酸侧链缀合。当氨基酸在合成期间被引入抗体的重链和/或轻链时，配体可存在于所述氨基酸上。在某些实施方式中，所述配体可在“前体”氨基酸被引入抗体的重链和/或轻链后，通过与所述“前体”氨基酸偶联而被引入。例如，具有亲电基团(如五氟苯基酯基团或五氟苯基醛基团)的配体可缀合至所述抗体的重链和/或轻链的N端。
在另一个实施例中，可引入具有适合于参与点击化学反应(ClickChemistry reaction)的化学基团(例如叠氮基或炔基)的单体。在随后的操作中，即，在引入所述前体单体抗体重链和/或轻链后，可通过将所述炔烃和叠氮化物偶联在一起，将具有相配的化学基团(如炔基或叠氮基)的配体连接至所述前体单体上。
在某些实施方式中，所述抗体和配体间的共价连接通过接头介导。根据应用，该接头可为可切除的接头或不可切除的接头。本文使用的“可切除的接头”是指在多种条件下能切除的接头。适合切除的条件包括但不限于：pH、UV照射、酶促活性、温度、水解作用、消除反应和取代反应、氧化还原反应以及所述连接的热力学性质。在某些实施方式中，可切除的接头可被用于在将抗体运输至希望的靶标后释放所述抗体。所述缀合或偶联的相互作用的预期性质或所期望的生物学效应将决定接头基团的选择。
本文使用的术语“非肽接头”是指连接肽的两部分的有机部分，并且该部分不是肽。典型地，接头包含：直接结合或如氧或硫的原子；如NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH的单元；或原子的链，如取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、可切除的连接基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中止或终止；其中R1为氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。可通过在该分子的各部分上提供相配的进行偶联反应的化学官能团，将所述化合物的两部分连接到一起。
在某些实施方式中，接头可为化合物的两部分或两个不同分子的非共价偶联。这种非共价偶联可通过例如离子相互作用、氢键、范德华力相互作用和一个分子对另一个分子的亲和力实现。当使用非共价偶联时，化合物的各部分缀合的部分与该化合物的第二部分缀合的另一部分是相配的。这种相配的偶联的一个实例为生物素/抗生物素蛋白偶联。其他的实例包括寡核苷酸与其互补链、受体/配体结合、适配体/配体结合和抗体/抗原结合的亲和力。
在本领域有许多用于将肽与肽和其他分子缀合的已知策略。例如，Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，第2版，Acdemic Press(2008)和Niemeyr，C.M.，Bioconjugate Protocols：Strategies andMethods(Methodsin Molecular Biology)，Human Press(2004)提供了许多用于将肽与其他分子缀合的方法和技术。将上述两者中的全部内容援引加入本文。对于将非天然氨基酸位点特异性地引入肽中以用于缀合的综述参见A.J.deGraaf等，Biocojugate Chemistry(2009)20(7)：1281-1295，将其全部内容援引加入本文。国际专利申请公开号WO92/13095记载了用于将肽PEG化的方法，将其全部内容援引加入本文。
一个缀合策略为生物素-夹层法(Davis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103：8155-8160(2006))，在该方法中，肽被生物素化并利用四价的链霉亲和素蛋白作为接头结合至生物素化的配体。为实现这一方法，所述肽可偶联至用于生物素化的受体肽的15个氨基酸序列(被称为AP；Chen等，Nat.Methods 2：99-104(2005))。可通过在所述肽的N端或C端引入附加序列制得该融合蛋白。所述受体肽序列允许通过大肠杆菌生物素连接酶进行位点特异性的生物素化(BirA；Chen等，Nat.Methods 2：99-104(2005))。类似地，配体肽也可被生物素化，以与本文所述的肽缀合。许多商业化的试剂盒可用于蛋白的生物素化。也可用本领域熟知的用于将生物素与非肽分子(例如，小的有机分子)缀合的方法，将非肽基配体试剂与生物素缀合。为防止生物素/抗生物素蛋白基团与肽或配体之间的空间位阻，可在它们之间包含间隔物。
本文所述的接头和连接方法也可用于连接抗体的重链和轻链、两个或多个Fv域和其片段。
为简单起见，在合适的结构环境对本领域技术人员而言是清楚的情况下，全文所限定并涉及的化学部分可以为单价化学部分(例如烷基、芳基等)或多价化学部分。
术语“烷基”是指饱和的非芳香族的烃链，该烃链可为直链或支链的，该烃链包含所示数目的碳原子(包括但不限于甲基、乙基、丙基、烯丙基或炔丙基)，任选地，可将N、O、S、SS、SO2、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)N或NC(O)插入该烃链。例如，C1-C6表示该基团中可具有1到6(包括端值)个碳原子。
术语“烯基”是指包含至少一个双键的烷基。示例的烯基基团包括但不限于：例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。
术语“芳基”是指单环的、双环的或三环的芳香族环系，其中各环的0、1、2、3或4个原子可被取代基取代。示例的芳基基团包括但不限于苯基、萘基、蒽基、薁基、芴基、茚满基、茚基、萘基、苯基、四氢萘基等。
术语“杂芳基”是指芳香族的5-8个原子的单环系、8-12个原子的双环系或11-14个原子的三环系，如果为单环系，则具有1-3个杂原子；如果为双环系，则具有1-6个杂原子；或如果为三环系，则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果为单环、双环或三环系，则分别具有碳原子以及1-3个、1-6个或1-9个N、O或S的杂原子)，其中，各环的0、1、2、3或4个原子可被取代基取代。示例的杂芳基基团包括但不限于：吡啶基、呋喃基(furyl)或呋喃基(furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、哒嗪基、吡嗪基、喹啉基、吲哚基、噻唑基和萘啶基等。
术语“环基”、“环的”、“环烷基”是指饱和的和部分不饱和的环烃基，所述环烃基具有3-12个碳原子，例如，3-8个碳原子，以及例如3-6个碳原子，任选地，其中的环烷基可进一步被取代。示例的环烷基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基等。
术语“杂环基”、“杂环”、“杂环的”是指非芳香族的5-8个原子的单环系、8-12个原子的双环系或11-14个原子的三环系，如果为单环系，则具有1-3个杂原子；如果为双环系，则具有1-6个杂原子；或如果为三环系，则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果为单环、双环或三环系，则分别具有碳原子以及1-3个、1-6个或1-9个N、O或S的杂原子)，其中，各环的0、1、2或3个原子可被取代基取代。示例的杂环基基团包括但不限于：哌嗪基、吡咯烷基、二氧杂环己基、吗啉基、四氢呋喃基等。
术语“任选地被取代”是指特定的基团或部分，如烷基、芳基基团、杂芳基基团等被一个或多个(典型地，1-4个取代基)独立地选自于下面的用于“取代基”的定义所列举的取代基的组中的或另有规定的取代基取代或未被取代。
术语“取代基”是指在烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、酰基、氨基基团的任意原子上“取代的”基团。合适的取代基包括但不限于：卤素、羟基、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氨基、烷基氨甲酰基、芳基氨甲酰基、氨烷基、烷氧羰基、羧基、羟烷基、烷硫基、CF3、N-吗啉代、苯基硫基、烷基磺酰胺基、芳基磺酰胺基、烷基亚磺酰胺基、芳基亚磺酰胺基、芳烷基亚磺酰胺基、烷基羰基、酰氧基、氰基或脲基。在某些实施方式中，取代基自身可任选地被取代。在某些情况下，两个取代基与它们所连接的碳可形成环。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘的任意基团。
术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基或杂芳基羰基，其中任一个都可被取代基进一步取代。示例的酰基基团包括但不限于：(C1-C6)烷酰基(例如，甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、叔丁基乙酰基等)、(C3-C6)环烷基羰基(例如，环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基、环己基羰基等)、杂环羰基(例如，吡咯烷基羰基、吡咯烷-2-酮-5-羰基、哌啶基羰基、哌嗪基羰基、四氢呋喃基羰基等)、芳酰基(例如苯甲酰基)和杂芳酰基(例如，苯硫基-2-羰基、苯硫基-3-羰基、呋喃基-2-羰基、呋喃基-3-羰基、1H-吡咯甲酰基-2-羰基、1H-吡咯甲酰基-3-羰基、苯并[b]苯硫基-2-羰基等)。此外，所述酰基基团的烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基部分可为各自的定义中所记载的任意一种基团。
术语“烷氧基”是指-O-烷基基团。
术语“氨基烷基”是指氨基取代的烷基。
术语“巯基”是指-SH基团。
术语“硫代烷氧基”是指-S-烷基基团。
术语“卤代烷基”是指连接了1个、2个、3个或更多个卤素原子的烷基基团。示例的卤代烷基基团包括但不限于氯代甲基、溴代乙基、三氟甲基等。
根据本发明的另一目的，通过本发明的方法得到所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
本发明的另一目的是提供分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述公开的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。
本发明的另一目的是提供含有至少一个拷贝的本发明的核酸分子的表达载体。
本发明也包括包含所述表达载体的宿主细胞和具有包含上述的本发明的分离的核酸分子和/或表达载体的基因组的转基因非人动物。
本发明进一步提供分泌本发明的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的杂交瘤。
本发明的另一目的是包含分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段及药学上可接受的载体的药物组合物。优选地，将所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段以0.1mg/kg体重到100mg/kg体重的剂量单位给予有需要的患者。
本发明的药物组合物适合用于治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良(XLHED)或牙齿发育不全。
在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物被配制为用于胃肠道外给药、静脉给药、口服给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药或局部给药。
本发明也包括本发明所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物在制备用于调节外胚层起源的细胞或组织(如毛发、牙齿、皮肤、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺)的发育的药物中的用途。
优选地，所述药物被用于治疗外胚层发育不良、或不是由EDA1中的突变引起的外胚层结构紊乱或反常，如毛发、牙齿或腺体反常，尤其用于治疗脱毛症、皮脂腺失常、或汗腺或皮脂腺缺乏、或用于伤口愈合。
更优选地，所述药物被用于X-连锁少汗型外胚层发育不良或牙齿发育不全。
在一个实施方式中，所述药物被给予怀孕中的母体/母体动物。
特别地，所述药物被给予有需要的受试者。根据某些情况，有需要的受试者为胎儿受试者、早产新生受试者、新生受试者、幼年受试者、青年受试者或成年受试者。
本发明的另一目的是本发明所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物在制备涉及皮肤重建的药物中的用途。根据本发明，所述皮肤重建可包括灼伤、溃烂或伤疤(如褥疮)、如肿瘤消融手术后的美容性重建。
本发明的另一目的是本发明所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物在制备用于改变毛发形态的药物中的用途。
本发明也提供增强组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺发育的方法，该方法包括将本发明所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物给予有需要的受试者。优选地，该方法包括将一定量的本发明所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物给予所述有需要的受试者，所述量足以促进所述有需要的受试者的组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺的发育。优选地，所述有需要的受试者患有外胚层疾病。特别地，所述外胚层疾病为XLHED或脱毛症或牙齿发育不全。
此外，本发明还涉及药物试剂盒，所述试剂盒包含至少有效量的本发明所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或药物组合物以及使用说明书。
本领域技术人员将明白，除明确记载的之外，本文所述的发明容许进行变化和改变。需要明白的是，本发明包含所有这些变化和改变，而不脱离其精神或基本特征。本发明也单独地或总体地包含在本申请文件中提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，本发明还包含所述步骤或特征的任意组合及所有组合，或包含任意两个或更多个所述步骤或特征。因此，在所有情况下，本公开都应被视为是示例性的及非限制性的，本发明的范围由所附的权利要求书指明，并且在等同的意义和范围中的所有变化被视为包含在本发明的范围中。
该申请文件全文引用了多篇参考文献，将各篇参考文献的内容整体援引加入本文。
参考下面的实施例将更全面的理解之前的描述。然而，这些实施例是实行本发明的方法的示例，并不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1抗EDAR单克隆抗体，开发、鉴定和表征
可溶性EDAR的制备
EDAR-Fc表达载体的开发。根据标准的分子生物学技术，将所述EDAR-Fc基因构建体克隆入PCR3哺乳动物表达载体(Invitrogen)。用于表达EDAR-Fc的载体的开发在此之前已有记载(Holler，N.，Tardivel，A.，Kovacsovics-Bankowski，M.，Hertig，S.，Gaide，O.，Martinon，F.，Tinel，A.，Deperthes，D.，Calderara，S.，Schulthess，T.，Engel，J.，Schneider，P.，和Tschopp，J.2003Mol Cell Biol 23，1428-1440；Bossen，C，Ingold，K.，Tardivel，A.，Bodmer，J.L.，Gaide，O.，Hertig，S.，Ambrose，C，Tschopp，J.，和Schneider，P.2006J Biol Chem 281，13964-13971；Schneider，P.2000Meth.Enzymol.322，322-345；Holler，N.，Kataoka，T.，Bodmer，J.L.，Romero，P.，Romero，J.，Deperthes，D.，Engel，J.，Tschopp，J.，和Schneider，P.2000JImmunol Methods237，159-173)。
稳定表达EDAR-Fc的293细胞的开发。在稳定表达EDAR-Fc的293细胞中生产EDAR-Fc。为生成这些细胞，将人胚肾293细胞(ATCC CRL1573)在补充了2％FCS和抗生素的以1∶1的比例混合的DMEM和F12营养混合培养基(Life Technologies)(293培养基)中每周稀释两次。在转染前两天，将5×105汇合的(confluent)293细胞重悬于4ml的293培养基中。将这些细胞接种于25cm2的细胞培养瓶(Nunc)中。将通过乙醇沉淀法灭菌的10μg的表达质粒回溶于250μl的250mM无菌CaCl2中。一旦细胞贴壁，用PBS漂洗一次，然后加入补充了10％FCS和抗生素的4ml的DMEM。在轻柔涡旋的同时，向质粒溶液中加入250μl的2×HeBS。在1到3min后，将该溶液加入细胞中并过夜放置。然后用PBS漂洗一次该细胞，并加入4ml的293培养基，放置1-3天。随后重悬该细胞，并在4ml的选择培养基(补充了400μl的100mg/ml的G418水溶液的50ml的293培养基，Life Technologies)中稀释1-8倍。4-7天后，将该细胞在4ml的选择培养基中稀释1-8倍。当4-7天后细胞汇合时，重悬该细胞，并将10μl的细胞悬液接种至为9cm直径的细胞培养板里的8ml的选择培养基中。10-15天后，当克隆为裸眼肉眼可见时，收集细胞并转移至含有200μl的选择培养基的平底96孔板(Costar，Cambridge，MA)的孔中。在7-10天后，以及之后的每3-4天，将克隆在选择培养基中稀释1-10倍。在14天后，当起始孔中的培养基变黄时，在非还原条件下通过Western印迹评价重组的EDAR-Fc的存在。对于非还原的EDAR-Fc融合蛋白的检测，使用0.5μg/ml的蛋白A-过氧化物酶溶液(Sigma，St-Louis，MO)，并利用ECL试剂(GE Healthcare)显示出来。所选克隆通过从96孔板到25cm2、75cm2、175cm2的细胞培养瓶和最终的2L滚瓶(Falcon，Lincoln Park，NY)的连续转移而得以扩增。在滚瓶中培养14天后，通过离心(3000×g)和过滤(利用0.45μm滤器(Nalgene，Rochester，IL)从细胞中使培养物上清澄清。用0.02％的NaN3补充该上清，并储存于4℃或-20℃直至进行纯化。
EDAR-Fc重组融合蛋白的纯化。利用HiTrap蛋白A柱(GEHealthcare)进行EDAR-Fc嵌合蛋白的一步纯化程序。简要地，将所述柱在PBS中平衡，以4ml/min的流速加载1L的上清，用10ml的PBS漂洗并用4ml的pH 2.5的0.1M的柠檬酸盐-NaOH洗脱。将洗脱物用1ml的pH 8.5的1M Tris-HCl中和，在Centricon-30装置中浓缩至小于0.5ml并用2ml的PBS漂洗两次以置换缓冲液。利用BCA试剂(Pierce，Rockford，IL)并以牛血清白蛋白作为标准测定蛋白浓度。纯化产率为每升包含0.5-5mg的EDAR-Fc。最终，纯化的EDAR-Fc蛋白利用Millex-GV低蛋白结合滤器(Millipore，Bedford，MA)的0.2μm过滤灭菌，并且将各等分试样储存于-20℃。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测其纯度。
EDAR缺乏的小鼠的免疫接种
将PBS(500μl)中的可溶性EDAR-Fc(150μg)与500μl的STIMUNE(Cedidiagnostics，Lelystad，The Netherlands)混合，短暂地超声3次并在4℃保存至使用。用150μl的抗原制剂对雌性OVEB1小鼠(Headon等，Nature Genetics 22：370-4，1999)进行背部皮下注射，用100μl的抗原制剂对雌性OVEB1小鼠进行尾部肌内注射。10-14天之后，用100μl的抗原在各条后腿进行肌内注射，用150μl的抗原在背部进行皮下注射。第一次免疫接种28-32天后，对小鼠取血，并通过ELISA检测血清的连续稀释物中抗EDAR抗体的存在(参见下面的方案)。在第一次抗原注射后的40-45天，在通过ELISA发现的阳性小鼠的背部和后腿注射PBS中的150μg抗原。3天后，将来自淋巴结的细胞与骨髓瘤细胞融合。
EDAR免疫接种的小鼠的血清中的抗EDAR抗体的检测
通过ELISA确认EDAR免疫接种的小鼠的血清中的抗EDAR抗体的存在。简要地，用PBS中的100μl的1μg/ml的EDAR-Fc，在37℃下2h或室温下过夜包被ELISA板(96孔Maxisorp Immunoplate，Nunc)。各孔用300μl的封闭缓冲液(PBS中的5％FCS)封闭并在37℃下孵育1h。然后将各孔用漂洗缓冲液(PBS+0.05％吐温20)漂洗3次，并将稀释在孵育缓冲液(PBS中的5％FCS)中的100μl血清加到各孔中。在37℃下孵育1h后，将各孔用漂洗缓冲液漂洗3次。通过加入100μl的在孵育缓冲液中稀释1000倍的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)，在37℃下30min显示出结合的抗体，随后用漂洗缓冲液重复漂洗3次并加入100μl的邻苯二胺(OPD)试剂(Sigma)。显色后，用50μl的2N HCl终止该反应，并在490nm测定吸光度。
杂交瘤细胞的生成
在无菌的玻璃匀浆器里，在10ml的RPMI 1640中，利用硼硅酸化的研杵捣6-8次将淋巴结细胞匀浆。将悬液转移至50ml的Falcon管并将细胞于室温下在300g离心(spin down)10min。将细胞重悬于10ml的RPMI 1640培养基中并对淋巴结细胞计数。将10-20×107的淋巴结细胞和10-20×106的骨髓瘤细胞(P3-X63Ag8或NS 1)以10∶1的比例混合以用于融合，通过在300×g下离心10min使细胞成团。将预热的PEG 1500(0.5ml)沿管壁逐滴加至该细胞团，将该管在37℃下保温3min，同时轻柔摇动。用10min的时间沿管壁加入5ml(0.5ml/min)的RPMI 1640培养基(在37℃预热)，随后在37℃下孵育1min。用5-6min的时间沿管壁再次加入5ml的RPMI 1640培养基。通过在300×g于室温下离心10min使细胞成团，在6ml的RPMI 1640完全培养基中重悬，并在CO2培养箱中于37℃下孵育1h。将该细胞融合悬液轻柔地铺到(100μl/孔)包含于平底696孔板中的小鼠巨噬细胞(饲养层)上。融合24h后，将含HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶)的选择培养基(RPMI 1640)加入该细胞。通过ELSIA测试所述96孔板的上清的抗体分泌情况。通过将汇合的、由ELISA鉴定的阳性克隆转移至含有巨噬细胞饲养层和1×HAT培养基的24孔板中而扩增。阳性克隆通过有限稀释法经历两轮亚克隆，并通过ELISA筛选抗体分泌情况。最终的亚克隆慢慢地适应了不含巨噬细胞和HAT补充物的培养基。
基于ELISA的抗EDAR抗体的鉴定
通过ELISA测定杂交瘤培养物上清中的抗EDAR抗体的存在。简要地，用PBS中的1μg/ml的EDAR-Fc或用PBS中的所示对照抗原在4℃下过夜包被微量培养板。在室温下用PBS、0.05％吐温20和1％BSA封闭培养板1h。将在PBS和0.1％BSA中稀释的杂交瘤上清在室温下孵育4h。利用缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoresearch)检测结合的抗体。四甲基联苯胺(Sigma)用作底物。各步骤之间都用PBS和0.05％吐温20漂洗两次。
单克隆抗体的生产和纯化
在RPMI 1640完全培养基中扩增杂交瘤细胞，用无菌的PBS漂洗两次并以100,000细胞/ml的量重悬于Opti MEM I无血清培养基(GibcoBRL，Life Technology，Basel，瑞士)中。分别用100ml和800ml的细胞培养物接种T175瓶或滚瓶。细胞生长10-14天。过滤培养物上清并与叠氮化钠储存于4℃或-20℃。可选地，杂交瘤细胞慢慢地适应了OptiMEMI培养基并直接在该培养基中培养。将上清上样至HighTrap蛋白G柱(GE Healthcare)上，用PBS漂洗并用0.1M的pH 2.7的柠檬酸钠洗脱。用1M的pH 9的Tris中和洗脱的馏分。利用微量浓缩器(Millipore)将馏分浓缩并将缓冲液置换为PBS。
单克隆抗体的Fab片段的生产(图32)
在供应商推荐的条件下(Pierce，Rockford，I L.产品编号44881)于37℃将单克隆抗体(各为0.5-5mg)用固定化的无花果蛋白酶消化72h。在蛋白A亲和柱的流体中回收Fab片段，用微量浓缩器浓缩至250μl，并上样到Superdex-200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上，在PBS中以0.5ml/min的流速洗脱。收集了0.5ml的馏分。合并了含有所述Fab片段的峰馏分，该Fab用于测定亲和常数。
抗EDAR Fab片段的结合常数和解离常数的测定(图33)
在装有Biacore T100控制软件的Biacore T100设备上进行测定。将抗人IgG Fc抗体固定在CM5芯片上。然后将2μg/ml的hEDAR-Fc以2μl/min的速度上样至该芯片上，持续60s。对各种浓度(100nM、25nM、6.25nM、1.6nM、0.4nM和0nM)的Fab片段而言，以50μl/min的速度上样90s，然后用缓冲液漂洗900s。用3M的MgCl2以10μl/min的速度使芯片再生30s。用1∶1相互作用模型来拟合实验曲线，该模型用于测定缔合速度(ka)、解离速度(kd)以及平衡解离常数(KD＝kd/ka)(也被称为Fab的亲和力)。
表达EDAR-Fas的Jurkat细胞的生成
基本上按照在此之前所记载的方法生产逆转录病毒(Soneoka，Y.，Cannon，P.M.，Ramsdale，E.E.，Griffiths，J.C，Romano，G.，Kingsman，S.M.和Kingsman，A.J.1995Nucleic AcidsRes 23，628-633)。简要地，用pMSCVpuro-hEDAR-Fas或pMSCVpuro-mEDAR-Fas瞬时转染293T细胞，并用分别包含gag-pol和VSV-G序列的pHIT60和VSV-G质粒共转染。pMSCVpuro-EDAR-Fas编码人EDAR的胞外域(1-183位氨基酸)或鼠EDAR的胞外域(1-183位氨基酸)、氨基酸VD和人Fas的跨膜域及胞内域(169-335位氨基酸)。转染后，在补充了10％FCS的RPMI中孵育293T细胞24h。Fas-缺乏的Jurkat-JOM2细胞是Olivier Micheau(University of Dijon，France)友情赠送的。Jurkat-JOM2细胞(1ml中有106个细胞)与补充了8μg/ml的聚凝胺的含病毒的上清(3ml)混合，在37℃下放置15min，并在37℃下于450×g离心1h。用5μg/ml的嘌呤霉素选择细胞并进行克隆。大约测试了40个克隆对Fc-EDA1的敏感性，并选择了其中一个敏感的克隆(对于hEDAR-Fas的Jurkat-2199克隆23以及对于mEDAR的Jurkat-2260克隆7)用于进一步的实验工作。
抗EDAR抗体诱导的表达EDAR-Fas的Jurkat细胞的凋亡(图12和图13)
利用EDAR-Fas Jurkat细胞进行的细胞毒性分析是依据所述的用于FasL对Jurkat细胞的细胞毒性分析(Schneider，P.，Holler，N.，Bodmer，J.L.，Hahne，M.，Frei，K.，Fontana，A.和Tschopp，J.1998JExp Med187，1205-1213)而完成的。
激动剂型抗EDAR抗体的体内鉴定(图14)
根据惯常的指导以及瑞士联邦兽医办公室(Swiss Federal VeterinaryOffice)的指导，在Office Vétérinaire Cantonal du Canton de Vaud的授权下处理Tabby小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbour)。
利用浸泡在Aramis纹身墨水(Braintree Scientific，Braintree，MA)中的30Gauge的针，对这些动物的爪垫进行穿刺以标记这些动物。在出生后的24h内，用最大体积为20μl的杂交瘤上清，利用0.5ml的U-100胰岛素注射器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)来进行抗体的腹膜内注射。在注射后3-4周进行尾毛的检查和照相。6周后，以4个单位的等级对尾部上毛发的存在情况打分(0：没有毛发以及4：毛发密度类似于野生型小鼠尾部上的毛发密度)，并利用淀粉碘分析(Gaide，O.，和Schneider，P.2003Nat Med 9，614-618)测定爪垫上汗腺的存在。
实施例2单克隆抗体mAbEDAR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15与人和小鼠的EDAR两者的结合(图6和图9)
用人抗原免疫接种小鼠通常产生不与小鼠同源蛋白交叉反应的抗体。为得到识别人和小鼠EDAR两者的抗体(这是一个相当有利于候选药物的临床前研究的特征)，用人EDAR免疫接种EDAR缺乏的小鼠。然后评价从这些小鼠中生成的单克隆抗体是否确实识别来自这两种动物种的EDAR。用可溶性人和小鼠EDAR-Fc融合蛋白以及阴性对照蛋白(人Fas-Fc)包被微量培养板的孔，封闭，并用抗EDAR单克隆抗体(mAb)mAbEDAR1、2、3和4及阴性对照mAb(Aprily 5)(图6)的连续稀释物，或用单一剂量的mAbEDAR1-15(图9)探测。通过加入过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体及随后的邻苯二胺(OPD)显示出结合的抗体的存在，并在490nm下测定吸光度。发现mAbEDAR1-14识别人和小鼠的EDAR，而mAbEDAR15只识别人的EDAR而不识别小鼠的EDAR。15个抗EDAR抗体均不识别对照蛋白(Fas-Fc，或与EDAR的不相干部分融合的人Fc)，并且，对照mAb Aprily 5与小鼠和人的EDAR均不结合。总之，这些结果显示出14个抗EDAR mAb对人和小鼠EDAR具有特异性，1个仅识别人EDAR。
这些mAb识别人EDAR及其小鼠对应物(counterpart)的能力构成了用于进一步的临床开发的重要特征，这是因为它使得在动物中进行药学研究成为可能。
实施例3抗EDAR mAb在EDAR上识别的区域的定位(图9-图11)
EDAR是一种跨膜蛋白，其胞外部分由三个远膜的富含半胱氨酸的域(CRDs)和近膜的茎状域组成(图9A)。将编码完整的EDAR蛋白、编码域I和域II、编码域II和域III、编码域III和茎状域、编码单独的域I、域II和域III及编码单独的茎状域的构建体与人IgG1的Fc区组装，插入到哺乳动物表达载体中，并瞬时转染入293T细胞。在ELISA板中，利用抗人IgG抗体来捕获培养物上清，并用抗EDAR mAb mAbEDAR1-15以及与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG mAb显示培养物上清，以监测已被有效捕获的各EDAR-Fc的截短突变体。mAbEDAR1、2、3、4、7、8、10和11识别由域I和域II构成的片段。其他片段不被识别，尤其是由单独的域I或单独的域II构成的片段。mAbEDAR5、6、12和13特异性地识别单独的域I或连同域II的域I。mAbEDAR9、14和15只识别包含有完整的EDAR胞外域的Fc构建体。分别利用Western印迹法和基于FACS的分析，由mAbEDAR1-6和mAbEDAR1-4得出了相似的结论。
实施例4对于结合EDAR，APO200和抗EDAR mAb之间缺乏竞争(图8)
对Fc-EDA1和抗EDAR mAb在EDAR上是否有重叠的结合位点进行了评价。用EDAR-Fc包被微量培养板的孔，封闭，并用mAbEDAR1、2、3或4或Aprily 5或Fc-EDA1(竞争剂)的连续稀释物孵育。其后，在各孔中加入固定量的生物素化的mAbEDAR1、2、3或4或Flag-EDA1(显示剂)。用过氧化物酶标记的链霉亲和素(用于生物素化的mAbEDAR1、2、3和4)或生物素化的抗Flag M2抗体及随后的过氧化物酶标记的链霉亲和素(用于Flag-EDA1)显示出所结合的显示剂的存在。发现Fc-EDA1的加入阻止了Flag-EDA1与EDAR-Fc的结合，但并不阻止生物素化的抗EDAR mAb与EDAR-Fc的结合，这表明所述抗EDAR mAb与APO200具有不重叠的结合位点。相反地，抗EDAR抗体(特别是mAbEDAR1)的加入阻止了生物素化的抗EDAR抗体的结合，但并不阻止Flag-EDA1的结合。这些结果表明，即使抗EDAR mAb在EDAR上的结合位点不同于APO200在EDAR上的结合位点，它们也可具有激动剂活性。
实施例5无激动剂活性的抗EDAR多克隆抗体(图13)
为评定抗EDAR抗体是否通常具有激动剂性质，测试了山羊中产生的抗小鼠EDAR多克隆抗体是否能诱导转导了EDAR-Fas的Jurkat细胞的凋亡。将这些细胞与山羊抗EDAR抗体的连续稀释物孵育并不会导致任何显著的细胞死亡。甚至加入抗山羊IgG交联的抗体，也不能赋予这些抗EDAR多克隆抗体杀伤活性。相反的，APO200以1-10ng/ml的ED50值(ED50：半数有效剂量，诱导半数最大值的细胞死亡的激动剂剂量)诱导细胞凋亡。此外，这些山羊抗EDAR抗体被成功用于对转染了人和小鼠EDAR的细胞染色。这些结果表明这些抗体实际上结合至EDAR。同时，这些发现表明只有所述的抗EDAR抗体中的一个子集具有激动剂性质。
实施例6在小鼠中注射抗EDAR单克隆抗体后的半衰期(图16)
蛋白的药代动力学很大程度上控制着它的治疗活性。过去测定了Fc-EDA1在小鼠中具有7-9h的半衰期。具有更长的半衰期的EDAR激动剂很可能能表现出更好的治疗效果。因此确定了抗EDAR mAbmAbEDAR1和mAbEDAR3的体内半衰期。向野生型小鼠静脉注射mAbEDAR1或mAbEDAR3(1mg/ml，200μl)。在20min和1、2、8、16和32天后收集血清样品。随后通过ELISA测定抗EDAR mAb的浓度。简要地，在用1μg/ml的人EDAR-Fc包被的孔中孵育血清的连续稀释物，随后加入偶联了辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG和作为底物的邻苯二胺。对于每个时间点，通过对在490nm下吸光度为1的血清稀释物绘图来计算抗EDAR mAb的半衰期。然后得到在这一系列点上拟合的指数曲线。不包括20min时的时间点，因为该时间点对应于抗体的分布期。mAbEDAR1和mAbEDAR3的半衰期被测定为11天。相比于Fc-EDA1，抗EDAR mAb的延长的半衰期有利于这些分子的治疗活性。
实施例7新生Tabby小鼠中抗EDAR mAb的治疗剂量(图15)
为评价抗EDAR mAb回复Tabby小鼠表型的能力，用梯度剂量的蛋白G-亲和色谱处理过的抗EDAR mAb mAbEDAR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14(每组1-5只小鼠)腹膜内注射一天龄的Tabby小鼠。3-6周之后，在4的等级上对尾部上的毛发密度进行盲法打分。得分0、1、2、3和4分别对应于无毛发、在腹侧具有稀疏毛发、在腹侧具有茂密的毛发、在两侧均具有茂密的毛发以及类似于野生型小鼠的毛发密度。在某些情况下，通过淀粉-碘分析证明了爪垫中功能性汗腺的存在，并在2的等级上对其打分。得分0、1和2分别对应于无汗腺、很少量汗腺(典型地，1-4个之间)和若干汗腺(大于4个)。发现在新生Tabby小鼠中产生半数最大效应的剂量在0.25-1μg的范围内，类似于用Fc-EDA1得到的结果。由于所述抗EDAR mAb在体外比Fc-EDA1的效果差10倍到1000倍以上，表明免疫球蛋白G的药用特征非常适合传递EDAR的体内激动剂性质，使得这些发现具有重要的意义。
实施例8在怀孕的小鼠中注射抗EDAR mAb后Tabby表型的矫正(图17-图22)
评价了在怀孕的Tabby小鼠中的抗EDAR mAb的静脉给药是否能矫正后代的Tabby表型。在妊娠期的第13天和第20天(E13/E20)或第9天和第17天(E9/E17)，用400μg的抗EDAR mAb mAbEDAR3处理怀孕的小鼠。对于这些母鼠所生的小鼠，在六月龄时进行肉眼观察研究和组织学研究。在胎儿时期，用抗EDAR mAb处理过的小鼠中Tabby表型的许多特征得到了矫正。小鼠的整个身体外观得以改变。具体地，皮毛比未处理的Tabby小鼠加深并更加茂密，并且眼睛充分张开。在图17的图片上可观察到这些特征。引人注目地，经处理的小鼠的皮毛也比野生型小鼠的颜色深(图17和图18)。相似地，处理后的动物的腹侧皮毛比Tabby小鼠的颜色深并且更加茂密(图18)。通过在处理的Tabby小鼠中观察到了尾部上的毛发并通过淀粉碘测试检测到了爪垫上的功能性汗腺(图17)，进一步阐明了Tabby表型的特征的矫正。
在耳后没有毛发是赋予Tabby小鼠特色的另外一个肉眼可见的特征。在胎儿发育中暴露至抗EDAR mAb后，处理过的小鼠在耳后显示出类似于在野生型小鼠中观察到的程度的毛发生长(图19)。
组织学分析显示，Tabby小鼠的爪垫上的汗腺、气管和喉中的产粘液细胞及尾部上的毛囊的发育是通过在小鼠胎儿时期用抗EDAR mAb处理所诱导的(图20-图22)。引人注目的是，来自野生型小鼠和来自处理的Tabby小鼠的组织切片是难以区分的，这表明抗EDAR mAb能很大程度地矫正这些小鼠中的皮肤异常。
 实施例9在胎儿时期用抗EDAR mAb处理的Tabby小鼠中的牙齿发育(图23)
在6月龄时检查在胎儿时期用抗EDAR mAb处理的Tabby小鼠的牙齿发育。来自处理的Tabby小鼠和野生型小鼠的牙齿在数目、尺寸和形状(即牙尖数目)方面非常相似。就上、下颌的第一个臼齿而言尤其惊人，这些臼齿在Tabby小鼠中发育非常不充分。在处理的Tabby小鼠和野生型小鼠中，第一个臼齿具有相似的外观。
实施例10在新生的野生型或Tabby小鼠中注射抗EDAR mAb后改变的毛发形态(图24-图28)
为研究抗EDAR mAb对毛发生长的影响，在出生后0天、4天、7天、11天和14天对新生的野生型小鼠注射或不注射5mg/kg的抗EDARmAb mAbEDAR3或PBS。相比于对照小鼠的皮毛(光滑地排布在身体上)，在出生后第18天检查的处理的小鼠的皮毛具有皱褶的和油滑的(greasy)外观。这个特征对于动物的背侧和腹侧均是明显的(图24)。
锯齿状毛发的显微镜检查显示出，相比于未处理的小鼠，用抗EDARmAb处理导致锯齿状毛发和锥状毛发均变细。锥状毛发变细在腹部的毛发上尤其明显，该毛发轻微着色并呈现出两并排而非三并排的细胞。此外，锯齿状毛发的特征性扭结丧失或强烈的减弱。毛发着色增强，这在来自小鼠背部的锥状毛发中尤其明显(图25)。后者的观察解释了处理的小鼠中皮毛加深的外观(图24)。处理并不影响这些动物的生长曲线(图26)。当用mAbEDAR1处理新生小鼠时，在皮毛外观和毛发形态上观察到了相似的效应(图27)。
也有人质疑通过抗EDAR mAb处理改变的皮毛外观和毛发形态是否稳定，或是否最终会回复为初始的普遍情况。当小鼠长大时，毛发表型逐渐消失，可能反映出所述激动剂型抗EDAR mAb被清除以及改变的毛发被后来的毛发周期中长出的新毛发所取代的状况(图24，第175天)。
Tabby小鼠具有介于锥状和auchene之间的单一的毛发类型，我们称之为“中间型”类型的毛发。在第0天、4天、7天、11天和14天以5mg/kg的mAbEDAR1处理的新生Tabby小鼠也发育出松散的、不整齐的和更深的皮毛(图28)，其以改变的中间型毛发的存在作为特征，所述中间型毛发更细并由单排细胞组成，令人联想到野生型锯齿状毛发的结构(图28)。
同时，这些结果表明在毛发生长的第1阶段给予激动剂型抗EDARmAb对于野生型小鼠和EDA缺乏的小鼠均相似地影响毛发形态和着色。
实施例11在成年野生型小鼠和成年Tabby小鼠中注射抗EDAR mAb后改变的毛发形态(图29-图31)
在用抗EDAR抗体处理过的新生小鼠中观察到的毛发表型是毛囊发育改变的结果，并不会发生在已建立的成年毛囊中，这一观点是有可能的。因此，在成年野生型小鼠中研究了抗EDAR mAb的作用。将三周龄小鼠在背部脱毛，以5mg/kg的mAbEDAR1在脱毛后的第0天、4天、7天、11天和14天腹膜内给药进行处理。这种处理使得只能观察在应用抗体时处于生长过程中的毛发。显著地，当在脱毛后第21天评定时，与未处理的小鼠相比，处理的小鼠在脱毛区域重新长出的毛发看起来更细并且颜色明显更深(图29)。正如显微镜分析所评定时，这种改变与形态变化相关：具有深色的锥状毛发和更细的锯齿状毛发(图30)。总之，在处理的成年野生型小鼠中的毛发形态非常类似于在处理的新生野生型小鼠中观察到的毛发形态。进一步在成熟小鼠中研究了该作用的可逆性。当mAb处理后约5个月的处理的小鼠中皮毛颜色仍旧很深时(图29，第146天)，毛发被后来的毛发周期中的正常外观的毛发取代(图29，第189天)。这些结果表明抗EDAR mAb对皮毛外观和毛发形态的作用很大程度上是可逆的。
为评定抗EDAR mAb对成年的EDA缺乏的小鼠毛发生长和形态的作用，将9周龄的Tabby小鼠背部脱毛，以5mg/kg的量在脱毛后的第0天、4天、7天、11天和14天腹膜内注射给予mAbEDAR1。在脱毛后第17天在处理的小鼠的脱毛区重新长出的毛发比未处理小鼠的毛发明显颜色更深且更粗糙(图31)。毛发质地的不同事实上是通过毛发形态的显微镜分析而确认的(图31)。如在处理的新生Tabby小鼠中观察到的，在处理期长出的处理过的成年Tabby小鼠的中间型毛发具有单排而非两排或三排细胞，类似于在野生型小鼠中最高丰度的毛发类型，即锯齿状毛发的结构。
重要地，这些结果确立了EDAR在成年野生型小鼠和成年Tabby小鼠中表达并且是有功能的。这是未曾预料到的，因为目前为止搜集到的结果都表明Fc-EDA1的活性在出生后几天内就会消失。这些结果暗示了在成年XLHED患者中，抗EDAR mAb是有治疗益处的。
此外，抗EDAR mAb对新生和成年野生型和EDA缺乏的小鼠的毛发形态和颜色的作用是未预料到的(参见图24-图31)。这些作用构成了第一个观点：药用EDAR激动剂在成年野生型和EDA缺乏的小鼠中是有活性的。存在mAbEDARs时，毛发一致地变得较细，并且至少对于锥状毛发而言颜色较深。引人注目的是，在EDA缺乏的小鼠中的中间型类型的毛发类似于其中形成了多于一并排的细胞的锥状毛发，在用EDAR激动剂处理后，所述中间型类型的毛发变为具有单排细胞的类锯齿状毛发。这些形态学上的变化发生在毛发生长期间，当EDAR激动剂被清除且新的毛发周期起始时是可逆的。
该表型意味着EDAR激动剂作用于两种不同的细胞类型：形成毛发的角质化细胞或角质化细胞衍生细胞以及负责毛发着色的黑素细胞。
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Claims (85)

1.一种生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的方法，该方法包括如下步骤：
a)生产小鼠和/或人和/或脊椎动物种的EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白；
b)用所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白免疫接种EDAR缺乏的小鼠；
c)检测免疫接种了所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的血清中的抗EDAR抗体；
d)生产骨髓瘤细胞和来自免疫接种了EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的淋巴结细胞间的杂交瘤；
e)通过下述i.的方法鉴定识别人EDAR和/或小鼠EDAR和/或来自脊椎动物种的EDAR的激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段在如下ii.和iii.方面的能力：
i.利用经设计用于检测所述激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与人和/或小鼠EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白之间的结合的结合分析；和
ii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的细胞或组织中诱导体外生物学应答的能力；
iii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的生物体中诱导体内生物学应答的能力；
f)基于步骤e)ii和步骤e)iii，选择生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体的杂交瘤系；
g)对上述选择的杂交瘤系进行克隆和亚克隆；
h)对得到的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段进行纯化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EDAR抗原是可溶性人EDAR-Fc融合蛋白或可溶性小鼠EDAR-Fc融合蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)所述的结合分析通过应用可视化方法进行，所述可视化方法包括ELISA、斑点杂交、Western印迹、RIA、免疫沉淀法、流式细胞术、荧光显微术、电子显微术、共聚焦显微术、测热法、等离子体共振、Ouchterlony测试、补体介导的血红细胞溶解、抗体依赖性细胞的细胞毒性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤e)i所述的结合分析通过直接ELISA或捕获ELISA进行。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)ii所述的体外生物学分析是对用嵌合的人EDAR-Fas受体和/或小鼠EDAR-Fas受体转导的Fas-缺乏的Jurkat细胞的细胞凋亡的测定。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)iii所述的体内生物学分析是对新生EDA-缺乏的Tabby小鼠给药后尾部毛发形成的测定和/或功能性汗腺形成的测定。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤h)所述的纯化是通过蛋白A或蛋白G亲和色谱或通过蛋白L、基于抗小鼠IgG抗体的亲和色谱、离子交换、乙醇或硫酸铵沉淀进行。
8.通过权利要求1-7任一项所述的方法可得到的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段以至少10-8M的亲和常数(KD)与人EDAR和/或小鼠EDAR结合。
9.如权利要求8所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与人EDAR和小鼠EDAR特异性结合，并且包含：
含有以下互补决定区氨基酸序列的重链可变区：SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15；或SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27；或SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQID NO：33；或SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39；或SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51；或SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57；或SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63；或SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69；或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81；
以及含有以下互补决定区氨基酸序列的轻链可变区：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24；或SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30；或SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36；或SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48；或SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54；或SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：60；或SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：66；或SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72；或SEQID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：82、SEQID NO：83、SEQ ID NO：84；和/或其组合，
其中，所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段是人EDAR和小鼠EDAR的激动剂。
10.如权利要求8或9所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，包含：含有CDR1、CDR2、CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)所述重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NOs：1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73或79及其保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NOs：2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74或80及其保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NOs：3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75或81及其保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述轻链可变区的CDR1序列包含选自于由下述氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NOs：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76或82及其保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述轻链可变区的CDR2序列包含选自于由下列氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NOs：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77或83及其保守修饰的氨基酸序列；
(f)所述轻链可变区的CDR3序列包含选自于由下列氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NOs：6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78或84及其保守修饰的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，由以下部分组成：
(a)包含SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73或79的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74或80的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75或81的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76或82的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77或83的轻链可变区CDR2；以及
(f)包含SEQ ID NO：6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78或84的轻链可变区CDR3。
12.如权利要求8-11任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体重链选自IgG、IgM、IgA、IgE、单链抗体和其它免疫球蛋白衍生的构建体或非抗体结合蛋白。
13.如权利要求12所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述非抗体结合蛋白包括adnectins、Affibody、DARPins、avimers、anticalins和基于核苷酸的试剂。
14.如权利要求12所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述IgG抗体重链选自：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；不再被FcR识别的突变IgG1；不再经历重链交换的突变IgG4序列；改变糖基化的突变的IgG；PEG化的IgG。
15.如权利要求8-14任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，包含选自于由下述氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
(a)在SEQ ID NO 169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182中显示的重链可变区的氨基酸序列以及在SEQ ID NO 183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195和196中显示的轻链可变区的氨基酸序列；
(b)通过1个或多个保守的氨基酸取代而不同于(a)中具体列举的那些氨基酸序列的氨基酸序列；
(c)与在(a)或(b)中具体列举的序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列；
(d)作为人EDAR和小鼠EDAR激动剂的、在(a)或(b)或(c)中具体列举的氨基酸序列的生物学活性片段；以及
(e)作为人EDAR和小鼠EDAR激动剂的、在(a)或(b)或(c)或(d)中具体列举的氨基酸序列的生物学活性变体或修饰物。
16.分离的核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。
17.表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如权利要求16所述的核酸分子。
18.宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求17所述的表达载体。
19.转基因非人动物，所述转基因非人动物具有包含如权利要求12所述的分离的核酸分子和/或如权利要求17所述的表达载体的基因组。
20.杂交瘤，所述杂交瘤分泌如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。
21.药物组合物，所述药物组合物包含：如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段；以及药学上可接受的载体。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其中，以0.1mg/kg体重到100mg/kg体重的剂量单位，将所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段给予有需要的患者。
23.如权利要求21或22所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良(XLHED)或牙齿发育不全。
24.如权利要求21-23任一项所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制用于胃肠道外给药、静脉给药、口服给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药或局部给药。
25.如权利要求7-14任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或者如权利要求21-24任一项所述的药物组合物在制备用于调节外胚层起源的细胞或组织的发育的药物中的用途，所述外胚层起源的细胞或组织如毛发、牙齿、皮肤、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺。
26.如权利要求25所述的用途，所述用途为：用于治疗外胚层发育不良、或不是由EDA1中的突变引起的外胚层结构紊乱或反常，如毛发反常、牙齿反常或腺体反常，尤其用于治疗脱毛症、皮脂腺失常、或汗腺或皮脂腺缺乏；或用于伤口愈合。
27.如权利要求25或26所述的用途，所述用途为用于治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良或牙齿发育不全。
28.如权利要求25-27任一项所述的用途，其特征在于，所述药物被给予怀孕中的母体/母体动物。
29.如权利要求25-27任一项所述的用途，其特征在于，所述药物被给予有需要的受试者。
30.如权利要求29所述的用途，其中，所述有需要的受试者为胚儿受试者、早产新生受试者、新生受试者、幼年受试者、青年受试者或成年受试者。
31.如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或者如权利要求21-24任一项所述的药物组合物在制备涉及皮肤重建的药物中的用途。
32.如权利要求31所述的用途，其中，所述皮肤重建包括灼伤、溃烂或伤疤如褥疮，如手术后的美容性重建，所述手术如肿瘤消融。
33.如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或者如权利要求21-24任一项所述的药物组合物在制备用于改变毛发形态的药物中的用途。
34.增强组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺发育的方法，该方法包括将如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求21-24任一项所述的药物组合物给予有需要的受试者。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述方法包括给予所述有需要的受试者足够量的如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求21-24任一项所述的药物组合物，所述量足以促进所述有需要的受试者的组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺的发育。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中，所述受试者患有外胚层疾病。
37.如权利要求34-36任一项所述的方法，其中，所述外胚层疾病为XLHED或脱毛症或牙齿发育不全。
38.药物试剂盒，所述药物试剂盒包含：至少有效量的如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求21-24任一项所述的药物组合物；以及使用说明书。
39.如权利要求8-15任一项所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求21-24任一项所述的药物组合物在制备用于哺乳动物或脊椎动物种的兽医应用中的药物中的用途。
40.与人EDAR和/或小鼠EDAR结合的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，所述抗体包含：
(a)含有以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的重链可变区：SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15；或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；或SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；或SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；或SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51；或SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57；或SEQ ID NO：61、SEQID NO：62和SEQ ID NO：63；或SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69；或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81；和/或
(b)含有以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变区：SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：10、SEQID NO：11和SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；或SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；或SEQ ID NO：40、SEQID NO：41和SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48；或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；或SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60；或SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66；或SEQ ID NO：70、SEQID NO：71和SEQ ID NO：72；或SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。
41.与人EDAR和/或小鼠EDAR结合的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含选自于由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182；
(b)通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守的氨基酸取代而不同于在(a)中具体列举的那些序列的氨基酸序列；以及
(c)与(a)或(b)中具体列举的序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。
42.与人EDAR和/或小鼠EDAR结合的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中，所述轻链可变区包含选自于由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195和196；
(b)通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守的氨基酸取代而不同于在(a)中具体列举的那些序列的氨基酸序列；以及
(c)与(a)或(b)中具体列举的序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。
43.分离的抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，所述分离的抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与鉴定为SEQ ID NO：240和/或SEQ ID NO：243的人EDAR和/或小鼠EDAR序列片段结合，但在缺失SEQ ID NO：239时不显著地与鉴定为SEQ ID NO：238的EDAR序列片段结合，和/或在缺失SEQ ID NO：240时不显著地与鉴定为SEQ ID NO：241的EDAR序列片段结合。
44.分离的抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，所述分离的抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与鉴定为SEQ ID NO：240和/或SEQ ID NO：243的人EDAR和/或小鼠EDAR序列片段结合，但在缺失SEQ ID NO：238时不显著地与鉴定为SEQ ID NO：239的EDAR序列片段结合，和/或在缺失SEQ ID NO：241时不显著地与鉴定为SEQ ID NO：242的EDAR序列片段结合。
45.与人EDAR和/或小鼠EDAR结合的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，如下的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与相同的抗原决定簇结合：
(a)包含含有如下的互补决定区氨基酸序列的重链可变区的抗体：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；或SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；或SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；或SEQ ID NO：37、SEQID NO：38和SEQ ID NO：39；或SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51；或SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57；或SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；或SEQ ID NO：67、SEQID NO：68和SEQ ID NO：69；或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81；和/或
(b)包含含有如下的互补决定区氨基酸序列的轻链可变区的抗体：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；或SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；或SEQ ID NO：40、SEQID NO：41和SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48；或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；或SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60；或SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66；或SEQ ID NO：70、SEQID NO：71和SEQ ID NO：72；或SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84；
其中所述分离的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与(a)或(b)中的抗体在该抗原决定簇处竞争结合。
46.如权利要求40-45任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段是人EDAR和/或小鼠EDAR的激动剂。
47.如权利要求40-46任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段以至少10-8M的亲和常数(KD)与人EDAR和/或小鼠EDAR结合。
48.如权利要求40-47任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为人源化的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
49.如权利要求40-48任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为单价的。
50.如权利要求40-49任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为多价的。
51.如权利要求40-50任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为单链的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
52.如权利要求40-51任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为Fab、F(ab)’2、Fv、Fab/c、Fv、单链Fv(sc Fv)或Fd片段。
53.如权利要求40-52任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为嵌合的抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段。
54.如权利要求40-53任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段为融合蛋白。
55.如权利要求40-54任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，重链选自于由IgG、IgM、IgA、IgE、单链抗体、免疫球蛋白衍生的构建体和非抗体结合蛋白的重链组成的组。
56.如权利要求55所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述非抗体结合蛋白选自于由adnectins、Affibody、DARPins、avimers、anticalins和基于核苷酸的试剂组成的组。
57.如权利要求55所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述IgG选自于由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、不再被FcR识别的突变IgG1和不再经历重链交换的突变IgG4组成的组。
58.如权利要求40-57任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段与配体和/或标签缀合。
59.如权利要求40-58任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段的重链与所述配体和/或标签缀合。
60.如权利要求40-58任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段的轻链与所述配体和/或标签缀合。
61.如权利要求58-60任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述配体和/或标签为聚乙二醇(PEG)或标记。
62.如权利要求40-61任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段，其中，所述抗体、抗体片段、或抗原结合部分或其片段通过如权利要求1-7任一项所述的方法得到。
63.分离的核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。
64.表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如权利要求63所述的核酸分子。
65.宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求64所述的表达载体。
66.转基因非人动物，所述转基因非人动物具有包含如权利要求63所述的分离的核酸分子和/或如权利要求64所述的表达载体的基因组。
67.杂交瘤，所述杂交瘤分泌如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段。
68.药物组合物，所述药物组合物包含：如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段；以及药学上可接受的载体。
69.如权利要求68所述的药物组合物，其中，以0.1mg/kg体重到100mg/kg体重的剂量单位，将所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段给予有需要的患者。
70.如权利要求68或69所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良(XLHED)或牙齿发育不全。
71.如权利要求68或69所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制用于胃肠道外给药、静脉给药、口服给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药或局部给药。
72.如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求68-71任一项所述的药物组合物在制备用于调节外胚层起源的细胞或组织的发育的药物中的用途，所述外胚层起源的细胞或组织如毛发、牙齿、皮肤、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺。
73.如权利要求72所述的用途，所述用途为：用于治疗外胚层发育不良、或不是由EDA1中的突变引起的外胚层结构紊乱或反常，如毛发反常、牙齿反常或腺体反常，尤其用于治疗脱毛症、皮脂腺失常、或汗腺或皮脂腺缺乏；或用于伤口愈合。
74.如权利要求72或73所述的用途，所述用途为用于治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良或牙齿发育不全。
75.如权利要求72-74任一项所述的用途，其特征在于，所述药物被给予怀孕中的母体/母体动物。
76.如权利要求72-75任一项所述的用途，其特征在于，所述药物被给予有需要的受试者。
77.如权利要求76所述的用途，其中，所述有需要的受试者为胎儿受试者、早产新生受试者、新生受试者、幼年受试者、青年受试者或成年受试者。
78.如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求68-71任一项所述的药物组合物在制备涉及皮肤重建的药物中的用途。
79.如权利要求78所述的用途，其中，所述皮肤重建包括灼伤、溃烂或伤疤如褥疮，如手术后的美容性重建，所述手术如肿瘤消融。
80.如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求68-71任一项所述的药物组合物在制备用于改变毛发形态的药物中的用途。
81.增强组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺发育的方法，该方法包括将如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求68-71任一项所述的药物组合物给予有需要的受试者。
82.如权利要求81所述的方法，其中，该方法包括给予所述有需要的受试者足够量的如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求68-71任一项所述的药物组合物，所述量足以促进所述有需要的受试者组织中的一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺的发育。
83.如权利要求81或82所述的方法，其中，所述受试者患有外胚层疾病。
84.如权利要求81-83任一项所述的方法，其中，所述所述外胚层疾病为XLHED或脱毛症或牙齿发育不全。
85.药物试剂盒，所述药物试剂盒包含：至少有效量的如权利要求40-62任一项所述的分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或如权利要求68-71任一项所述的药物组合物；以及使用说明书。
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