CN110088134A - 针对人ctla-4的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合至与现有技术抗CTLA4抗体不同的表位的新抗h CTLA‑4抗体、产生这些抗体的方法和这些抗体的治疗和诊断用途。这些抗体对于CTLA4抗原显示类似亲和力并且它们也能够阻断CTLA4与CD80和/或CD86的结合。

Description

针对人CTLA-4的抗体
本申请要求2016年8月2日提交的荷兰专利申请号2017270的优先权，该专利申请通过引用整体并入本文，包括全部表格、附图和权利要求书。
技术领域
本发明涉及通过刺激免疫响应，具体地通过刺激抗原特异性T-淋巴细胞来减轻病状的治疗。更具体地，本发明涉及抗人CTLA-4抗体以及这些抗体治疗疾病诸如癌症和感染疾病的用途。
背景技术
本发明的背景的以下讨论仅被提供来帮助读者理解本发明并且不承认描述或构成本发明的现有技术。
T淋巴细胞在对抗原的适应性免疫响应中起中心作用。原初T细胞需要两种信号进行完全活化(Bretscher 1999,Proc Natl Acad Sci USA 96:185-90)。第一种信号是抗原特异性并且通过T-细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)上的MHC/肽复合物相互作用来提供。第二种信号是通过T细胞上的受体与其在APC上的配体之间的相互作用所提供的共刺激信号。TCR/MHC和共刺激相互作用二者的接合经由许多细胞内路径(包括钙调磷酸酶和RAS促分裂原活化蛋白激酶)并且随后活化许多效应化合物的转录因子(包括细胞因子诸如IL-2)来引起T-细胞活化。
尽管多种正和负共刺激路径参与T细胞调控，最重要的是在T细胞上的CD28与APC上的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)之间。CD28促进T-细胞分化并且增强了由B进行的抗体产生和T细胞的活化。在APC诸如树突状细胞和B细胞上表达的CD80和CD86具有重叠但不同的功能。CD86组成型表达并且在与TCR/MHC接合一致的APC上快速上调。CD80表达在静止细胞上非常低，但是通常在延长的T细胞刺激之后诱导。这些差异表明，当CD86可能在T细胞活化的初始化中是重要的时，CD80可能在保持免疫响应方面起到更大的作用。
在T细胞活化之后，负调控受体细胞因子T淋巴细胞抗原4(CTLA-4或CTLA-4，也称为CD152)在T细胞上上调(Alegre等人,2001,Nat Rev Immunol 1:220-8)。CTLA-4在结构上与CD28同源，但更紧密地结合至CD80和CD86配体。CTLA-4以两种主要方式抑制免疫响应，它与CD28竞争CD80和CD86配体并且因此阻断共刺激，并且它还以负性方式发送信息以抑制T细胞活化(Krummel和Allison,1995,J Exp Med 182:459-465；Walunas等人,1994,Immunity 1:405-413)。已进一步显示，CD86在免疫突触处比CTLA-4更多接合CD28，而CD80比CD28更多地连接CTLA-4(Collins等人,2002,Immunity 17:201-210；Jansson等人,2005,J Immunol 175:1575-1585)。
已报告CTLA-4阻断增加了体外和体内T细胞响应，加强了抗肿瘤免疫，并且增强了诱导的自身免疫疾病。还报告，CTLA-4对T细胞免疫响应的初始特征具有替代性或另外的影响。这与一些自身免疫患者具有对CTLA-4的自身抗体的观察一致。可能的是，CTLA-4阻断自身抗体在这些患者中起致病作用。另外，针对人CTLA-4的人抗体已描述为许多疾病病状中的免疫刺激调节剂，诸如治疗或预防病毒和细菌感染病用于治疗癌症。伊匹单抗是人抗人CTLA-4抗体，其阻断CTLA-4与APC上的CD80和CD86的结合，从而阻断由这些分子的相互作用引发的免疫响应的负性下调。具有延长时间的肿瘤衰退发展的证据已见于患有黑素瘤并接受伊匹单抗(10D1)或另一种抗-CTLA-4抗体曲美木单抗(tremelimumab,CP-675,206)的患者中并且在患有黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌和肾细胞癌的患者中使用伊匹单抗观察到持久的响应。有趣的是，抗肿瘤响应的特征可在于短期进展以及随后延迟消退，并且抗-CTLA-4抗体的重要的、可能独特的临床特征为临床响应以及甚至稳定的疾病的持续时间通常相当延长。患有晚期黑素瘤的患者的临床前和早期临床研究显示伊匹单抗作为单一疗法和与诸如化学疗法、抗体、疫苗或细胞因子的治疗的组合促进抗肿瘤活性(Weber,J.,TheOncologist,12(7):864-872,2007；Scott,A.M.等人,Nature Reviews(Cancer)12:278-287,2012；Hodi,F.S.等人,New Eng.J.Med.363(8):711-723,2010；Schadendorf,D.等人,J.Clin.Oncol.33(17):1889-1894,2015；Larkin,J.V.等人,New Eng.J.Med.2015；Ribas,A.等人,J.Clin.Oncol.31(5):616-622,2013))。
伊匹单抗进行CTLA-4靶向的第二种提出的机制是消耗CTLA-4+调控T细胞(Treg)，该消耗已显示为晚于在小鼠中进行CTLA-4靶向的功效的关键性驱动因素(Peggs等人,JExp Med,2009,DOI:10.1084/jem.20082492；Simpson等人,J Exp med,2013,DOI:10.1084/j em.20130579；Selby等人Cancer Immunol,2013DOI:10.1158/2326-6066.CIR-13-0013)。
尽管伊匹单抗已经上市用于一些癌症治疗并且正在测试其他抗癌适应症，并且尽管曲美木单抗已在临床测试阶段中推进，但是仍需要替代性抗-CTLA-4抗体，尤其是其中它们具有可以与已知抗-CTLA-4抗体的活性不同的活性。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含以下一种或多种以及任选地每一种：
重链可变区CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列，
重链可变区CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列，
重链可变区CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列，
轻链可变区CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列，
轻链可变区CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列，以及
轻链可变区CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列。
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含以下一种或多种以及任选地每一种：
a.包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；
b.包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2；
c.包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3；
d.包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；
e.包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2；
f.包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3。
优选地，所述抗体具有根据SEQ ID NO:7的重链。进一步优选地，所述抗体具有根据SEQ ID NO:8的轻链。更优选地，重链选自SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一种。更优选地，轻链选自SEQ ID NO:22、24、26、30中的任一种。
本发明进一步涉及一种结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下各项组成的组轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白或轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白两者：
a.抗体或其抗原结合片段，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的可变重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的可变轻链；
b.抗体或其抗原结合片段，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20的可变重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:22、24、26或30的可变轻链；
c.抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者包含至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变重链和/或与SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者包含至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变轻链；
d.抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者包含至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变重链和/或与SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者包含至少90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变轻链，其中任何序列变化出现于该抗体或抗原结合片段的框架区中；
e.抗体或其抗原结合片段，其包含含有关于SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变重链和/或关于SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变轻链；以及
f.抗体或其抗原结合片段，其包含含有关于SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变重链和/或关于SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变轻链，其中任何所述取代在抗体或抗原结合片段的框架区中发生。
优选地，所述抗体或抗原结合片段具有以下特征中的至少一种：
a)结合至人CTLA-4，如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)所测量的，其KD值为至少约1x 10-9M；
b)阻断hCTLA-4与hCD80的结合，其IC50为约100nM或更低；
c)阻断hCTLA-4与hCD86的结合，其IC50为约100nM或更低；
d)结合至与伊匹单抗或曲美木单抗不同的CTLA-4表位。
本发明还包括结合至人CTLA-4的表位的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不结合至SEQ ID NO:44的小鼠-人嵌合CTLA-4分子。
本发明的另一个方面是一种结合至人CTLA-4的与包含可变重链SEQ ID NO:7和可变轻链SEQ ID NO:8的抗体相同的表位的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段不结合至SEQ ID NO:44的小鼠-人嵌合CTLA-4分子，且具有以下特征中的一种、两种、三种或全部四种：
g.结合至人CTLA-4，如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)所测量的，其KD值为至少约1x 10-9M；
h.阻断hCTLA-4与hCD80的结合，其IC50为约100nM或更低；
i.阻断hCTLA-4与hCD86的结合，其IC50为约100nM或更低；
j.结合至与伊匹单抗或曲美木单抗不同的CTLA-4表位。
本发明的另一个方面为一种结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段结合至人CTLA4的包含至少8个连续残基SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO:53)的表位。
根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中该表位由SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO:53)组成。
一种结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其中人CTLA-4在序列SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO:53)内的一个或多个突变防止抗体与人CTLA4的结合。
一种与抗体hCTLA4.27A竞争结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。
优选地，本发明的抗体或抗原结合片段为包含两条重链和两条轻链的人源化抗体。
在另一个方面中，本发明涉及一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:1-8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或30中任一种的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明涉及一种分离的核酸，所述分离的核酸编码以下各项：本发明的抗体或抗原结合片段中的任一种或如以上所限定的多肽中的任一种。本发明还涵盖一种表达载体，其包含此分离的核酸。
本发明还包括一种宿主细胞，其包含本发明的抗体、结合片段、多肽、多核苷酸或表达载体。所述宿主细胞优选地是毕赤酵母属细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段与一种或多种环状二核苷酸或其他STING路径激动剂结合使用。STING(干扰素基因的刺激物，也称为TMEM173、MITA、ERIS和MPYS)是定位至ER的跨膜蛋白，该跨膜蛋白响应于环状二核苷酸(CDN)的直接结合而经历构象改变，从而导致涉及TBK1活化、IRF-3磷酸化和IFN-β和其他细胞因子的产生的下游信号传导级联。肿瘤驻留抗原呈递细胞中的STING路径参与诱导针对肿瘤衍生化抗原的自发CD8+T细胞响应。此路径的活化和随后IFN-β的产生也据报告有助于辐射的抗肿瘤作用。STING激动剂及其用途描述于例如US20060040887、US20080286296、US20120041057、US20140205653、WO2014179335、WO 2014179760、US20150056224、WO2016096174、WO 2017011444、WO 2017027645和WO 2017027646中。其中该化合物作为包含药学上可接受的载体的药物组合物施用。Sting激动剂可以通过一种或多种非经肠或经肠路径来施用。在一些实施方案中，该施用时皮下、肌内、经皮、粘膜、阴道、子宫颈、肿瘤周、肿瘤内或直接施用至肿瘤引流淋巴结中。在某些实施方案中，STING激动剂和本发明的抗体或抗原结合片段作以单独施用形式例如在不同时间和/或通过不同施用路径来施用。
本发明的另一个实施方案由组合物形成，该组合物包含本发明的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂。优选地，所述组合物还包含选自由以下各项组成的组的剂：
k.抗-PD1抗体或其抗原结合片段；
l.抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；
m.抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；
n.抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；
o.抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；
p.抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；
q.抗-CD27抗体或其抗原结合片段；
r.抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；
s.抗-CD70抗体或其抗原结合片段；
t.抗-CD137抗体或其抗原结合片段；
u.抗-OX40抗体或其抗原结合片段；
v.抗-CD28抗体或其抗原结合片段；
w.抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；
x.抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；
y.抗-GITR抗体或其抗原结合片段；
z.抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；
aa.抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；bb.抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；
cc.抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；
dd.抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；
ee.抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；
ff.抗-4-1BB抗体或其抗原结合片段；
gg.抗-NK2GA抗体或其抗原结合片段；
hh.抗-NK2GC抗体或其抗原结合片段；
ii.抗-NK2GE抗体或其抗原结合片段；
jj.抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；
kk.STING激动剂，以及；
ll.抗-IL10抗体或其抗原结合片段。
还优选地，在所述组合物中，抗-PD1抗体或其抗原结合片段选自由以下各项组成的组：派姆单抗或其抗原结合片段和纳武单抗或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明的组合物还包含选自由以下各项组成的组的化合物：ADU-S100、美法仑、长春新碱、氟达拉滨、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、依托泊苷、多柔比星、环磷酰胺、顺铂、免疫调节剂诸如皮质类固醇(例如地塞米松或强的松)、沙利度胺类似物(例如沙利度胺、来那度胺或泊马度胺)、激酶抑制剂(例如依鲁替尼)、idealisib、靶向CD20的抗体(例如利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumab)或奥托珠单抗(obinotuzumab))、靶向CD52的抗体(例如阿仑单抗)、靶向CD38的单抗(例如达雷木单抗)、靶向IL-6或IL-6受体的单抗(例如萨瑞鲁单抗(sarilumab)或托珠单抗)、靶向CS-1的抗体(例如埃罗妥珠单抗)、靶向BCMA的抗体(例如GSK2857916)、靶向BAFF或BLyss的抗体(例如它布鲁单抗)、双膦酸盐(例如帕米膦酸盐或唑来膦酸)、硼替佐米或其组合。
本发明还涉及一种产生抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括：
mm.在有利于编码本发明的抗体或抗原结合片段中的任一种的重链和/或轻链的多核苷酸的表达的条件下培养包含该多核苷酸的宿主细胞；以及
nn.任选地，从该宿主细胞和/或培养基回收该抗体或抗原结合片段。
在某些实施方案中，宿主细胞包含含有此多核苷酸的表达载体，其中该表达载体包含可操作连接至该多核苷酸的控制序列，这些控制序列驱动抗体或抗原结合片段表达。在优选的实施方案中，多核苷酸包含介导宿主细胞分泌抗体或抗原结合片段的分泌信号序列。
本发明的另一个方面为一种治疗受试者优选地人受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段或介导该抗体或抗原结合片段在受试者中表达的表达载体，任选地与另一种治疗剂或治疗程序结合。
本发明的另一个部分是一种治疗人受试者中的感染或感染性疾病的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的根据本发明的抗体或抗原结合片段，任选地与另一种治疗剂或治疗程序结合。
本发明还包括一种疫苗，该疫苗包含根据本发明的抗体或抗原结合片段和抗原。
在另一个方面，本发明包括一种用于检测样品中CTLA-4肽或其片段的存在的方法，该方法包括使该样品与本发明的抗体或片段接触以及检测抗体或片段与肽之间的复合物的存在；其中检测到该复合物指示CTLA-4肽的存在。
本发明还涉及一种增加免疫细胞的活性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据本发明的抗体或抗原结合片段或者介导抗体或抗原结合片段在受试者内表达的表达载体。优选地，所述方法用于：
oo.治疗癌症；
pp.治疗感染或感染性疾病；或者
qq.用作疫苗佐剂。
在另一个方面，本发明涉及一种根据本发明的抗体或抗原结合片段或者一种介导该抗体或抗原结合片段在受试者内表达的表达载体，其用于制备药物以：
rr.增加免疫细胞活化；
ss.治疗癌症；或者
tt.治疗感染或感染性疾病。
在以下方面，本发明包括本发明的抗体或抗原结合片段用于制造用以治疗癌症的药物的用途，所述药物用于：增加免疫细胞活化；治疗癌症；或治疗感染或感染性疾病。
本发明还包括本发明的一种抗体或其抗原结合片段，其中该片段为Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFV)。
在以下方面，本发明的抗体或其抗原结合片段包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、优选IgG1或IgG4的重链恒定区以及选自轻链恒定区κ或λ的轻链恒定区。在该抗体或其抗原结合片段包含人IgG4重链恒定区的实施方案中，所述IgG4序列优选具有位置228处的Ser→Pro突变，如SEQ ID NO:50中所示。
本发明还涉及一种刺激受试者中的免疫响应的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效刺激免疫响应的量的本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，在此方法中，抗体分子与一种或多种共刺激分子，例如选自由以下各项组成的组的一种或多种分子的激动剂组合施用：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体。或者，抗体分子与免疫检查点分子的一种或多种抑制剂，例如选自由以下各项组成的组的一种或多种抑制剂组合施用：PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR。
在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗癌症的方法，其中该癌症选自由以下各项组成的组：肺癌、黑素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、血液癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病或癌症的转移病灶。
还关于一种治疗癌症的方法，本发明还涉及一种方法，其中该抗体分子与一种或多种第二治疗剂或程序组合施用，例如其中该第二治疗剂或程序选自由以下各项组成的组：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤细胞药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、辐射程序、共刺激分子的活化剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法。
附图说明
图1：在基于Jurkat的报告测定中hCTLA4.27A抗体的功能性。
图2：hCTLA4.27抗体的不同hCD80阻断概况。
图3：在PBMC SEB中hCTLA4.27抗体诱导IL2产生。
图4A：hCTLA4.27和对照抗体：ADCC测定中的效应物功能。
图4B：hCTLA4.27和对照抗体：CDC测定中的效应物功能。
图5：hCTLA4.27A嵌合hIgG4与人/小鼠CTLA-4交换突变体的独特结合概况。
图6示出hCTLA4.27A结合至rhCTLA-4/Fc的表位映射结果。通过不同蛋白质水解方法检测到的交联肽为SEQ ID NO:54-57。示出hCTLA-4残基46-76(SEQ ID NO:58)用于参考。
具体实施方式
贯穿本发明的详细描述和实例，将使用以下缩写：
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号系统定义
CHO 中国仓鼠卵巢
EC50 引起总结合的50％的浓度
ELISA 酶联免疫吸附测定
FR 抗体框架区：排除CDR区域的免疫球蛋白可变区。
HRP 辣根过氧化物酶
IFN 干扰素
IC50 引起50％抑制总信号的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat倡导的免疫球蛋白比对和编号系统((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)
mAb或Mab或MAb 单克隆抗体
SEB 葡萄球菌肠毒素B
TT 破伤风类毒素
V区 IgG链的在不同抗体之间的序列可变的区段。它在轻链中延伸至Kabat残基109并且在重链中延伸至残基113。
VH 免疫球蛋白重链可变区
VL 免疫球蛋白轻链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
以下是本说明书中提及的序列列表(表1)：
“治疗(Treat/treating)”意指向患有一种或多种疾病症状或怀疑患有疾病(剂对其具有治疗活性)的受试者或患者内部或外部施用治疗剂诸如含有本发明的抗体或抗原结合片段的组合物。典型地，该剂以有效减轻所治疗受试者或群体中的一种或多种疾病症状的量施用，无论是通过诱导此类症状的消退或是抑制此类症状的进展至任何临床上可测量的程度。治疗剂有效减轻任何特定疾病症状的量可以根据各种因素诸如患者的疾病状态、年龄和体重以及药物在受试者中引发所需响应的能力来改变。疾病状态是否已减轻可以通过由医生或其他熟练健康护理提供者通常所使用的任何临床测量来评估，以评估该症状的严重性或进展状态。
本发明包括抗-CTLA-4抗体及其使用方法。如本文所用，术语“抗体”是指表现出期望的生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广泛的含义使用并且特别涵盖但不限于单克隆抗体(包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体以及驼峰化单结构域抗体。
本发明包括抗-CTLA-4抗原结合片段及其使用方法。如本文所用，除非另外指示，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合至由全长抗体所结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区域的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段；二抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；以及由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。
本发明包括抗-CTLA-4Fab片段及其使用方法。“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1与可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab片段”可以是抗体的木瓜蛋白酶裂解产物。
本发明包括包含Fc区的抗-CTLA-4片段及其抗原结合片段以及其使用方法。“Fc”区含有包含抗体CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水性相互作用来保持在一起。
本发明包括抗-CTLA-4Fab’片段及其使用方法。“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的含有VH结构域和C H1结构域并且也含有CH1与CH2结构域之间的区域的一部分或片段，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子。
本发明包括抗-CTLA-4F(ab’)2片段及其使用方法。“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，该两条重链含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab')2片段因此由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段组成。“F(ab')2片段”可以是抗体的胃蛋白酶裂解产物。
本发明包括抗-CTLA-4Fv片段及其使用方法。“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
本发明包括抗-CTLA-4scFv片段及其使用方法。术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY oF MONOCLONALANTIBODIES,第113卷,Rosenburg和Moore编Springer-Verlag,New York,第269-315页。还参见国际专利申请公布号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203。
本发明包括抗-CTLA-4结构域抗体及其使用方法。“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能的免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同抗原。
本发明包括抗-CTLA-4二价抗体及其使用方法。“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性(参见下文)。
本发明包括抗-CTLA-4驼峰化单结构域抗体及其使用方法。在某些实施方案中，本文中的抗体还驼峰化单结构域抗体。参见例如Muyldermans等人(2001)TrendsBiochem.Sci.26:230；Reichmann等人(1999)J.Immunol.Methods 231:25；WO 94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。
在一个实施方案中，本发明提供包含具有修饰的两个VH结构域的单结构域，使得形成单结构域抗体。
本发明包括抗-CTLA-4双体抗体及其使用方法。如本文所用，术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含相同多肽链(VH-VL或VL-VH)中连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并形成抗原结合位点。双体抗体更充分描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Holliger等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。关于工程化抗体变体的综述，通常参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。
通常，以一些方式修饰的本发明的抗体或抗原结合片段保留至少10％其结合活性(当与亲本抗体相比较)，此时该活性以摩尔基础表示。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更大的作为亲本抗体的CTLA-4结合亲和力。还预期本发明的抗体或抗原结合片段可以包含基本上不改变其生物活性的保守性或不保守性氨基酸取代(也称为抗体的“保守性变体”或“功能保守性变体”)。
本发明包括分离的抗-CTLA-4片段及其抗原结合片段以及其使用方法。“分离的”抗体或其抗原结合片段至少部分不含来自其中产生其他生物分子的细胞或细胞培养物的其他生物分子。此等生物分子包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、或其他物质诸如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体或抗原结合片段还可以至少部分不含来自宿主细胞或其生长培养基的表达系统组分，诸如生物分子。通常，术语“分离”不旨在是指此类生物分子的完全不存在、或是指水、缓冲液或盐的不存在、或是指包含抗体或片段的药物制剂的组分。
本发明包括抗-CTLA-4嵌合抗体(例如，人恒定结构域/小鼠可变结构域)及其使用方法。如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同的种类(美国专利号4,816,567；以及Morrison等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。典型地，可变结构域获得自来自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定结构域获得自人抗体，使得所得嵌合抗体将比亲本(例如，小鼠)抗体更不可能引发人受试者中的不良免疫响应。
本发明包括抗-CTLA-4人源化抗体及其抗原结合片段(例如，已人源化的大鼠或小鼠抗体)及其使用方法。本发明包括如实例中所示的hCTLA4.27A抗体的任何人源化形式。如本文所用，“27抗体”和“hCTLA4.27”可互换使用，是指包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ IDNO:8的VL序列，更优选地SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中任一项的VH序列和SEQ ID NO:22、24、26或30中任一项的VL序列的多肽。如本文所用，术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如，小鼠或大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体将包含至少一个并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的超变环对应于非人免疫球蛋白的那些超变环，并且全部或基本上全部的框架(FR)区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体可以可任选地保护人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一个部分。
一般而言，基本抗体结构单元包含四聚物。每种四聚物包含两对相同的多肽链，每一对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包含主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基端部分可限定主要负责效应物功能的恒定区。典型地，人轻链被分类为κ和λ轻链。另外，人重链典型地被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包含约10或更多个氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.编，第2版Raven Press,N.Y.(1989)。
每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能性或双特异性抗体中之外，两个结合位点通常是相同的。
]典型地，重链和轻链的可变结构域包含位于相对保守的框架区(FR)中的三个超变区，也称为互补决定区(CDR)。CDR通常通过框架区比对，使得能够结合至特异性表位。通常，自N-端至C-端，轻链和重链可变结构域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸到每个结构域的分配通常根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或者Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文所用，术语“超变区”是指抗体或其抗原结合片段的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链可变结构域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3)。参见Kabat等人.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(由序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(由结构定义抗体的CDR区)。如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除了本文定义为CDR残基的超变区之外的那些可变结构域。
“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”意指基因组、mRNA、cDNA、或合成来源或其一些组合的DNA或RNA，其与多核苷酸的天然可见分离的多核苷酸的全部或一部分缔合，或者连接至天然未连接的多核苷酸。出于本公开的目的，应理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”并不涵盖完整染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子可除指定序列之外还包含多至十种或甚至多至二十种其他蛋白质或其部分或片段的编码序列，或者可以包含控制所述核酸序列的编码区域的表达的可操作连接的调控序列，和/或可包含载体序列。
短语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞已知使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
核酸或多核苷酸当与另一个核酸序列成功能关系时“可操作连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常但并非一直如此，“可操作连接”意指所连接的DNA序列是连续的并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且在读取介导中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配子或接头。
如本文所用，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用并且所有此类指示包括子代。因此，单词“转化株”和“转化的细胞”包括初代受试者细胞和来源于该细胞而不考虑传代的次数的培养物。还应理解，由于有意或无意的突变，并非全部子代将具有精确相同的DNA含量。包括对于与初始转化细胞中筛选的子代相同的功能或生物活性的突变体子代。在希望不同指示时，将由上下文来明确。
如本文所用，“种系序列”是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用未重排的免疫球蛋白序列的任何适合来源。人种系序列可以例如获得自美国国家健康研究所的关节炎和肌肉骨骼与皮肤疾病国家研究所(National Institute of Arthritis andMusculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes ofHealth)的网站上的JOINSOLVER种系数据库。可以获得小鼠种系序列，例如，如Giudicelli等人.(2005)Nucleic Acids Res.33:D256-D261中所述的。
本发明的抗体可包含如本申请所限定且以SEQ ID NO:7和8示出的重链和轻链并且更优选地为如SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中所示出的重链和如SEQ ID NO:22、24、26和30中所示出的轻链的任何组合。
这意味着可以做出以下组合：
具有重链SEQ ID NO:10和轻链SEQ ID NO:22的抗体；
具有重链SEQ ID NO:12和轻链SEQ ID NO:22的抗体；
具有重链SEQ ID NO:14和轻链SEQ ID NO:22的抗体；
具有重链SEQ ID NO:16和轻链SEQ ID NO:22的抗体；
具有重链SEQ ID NO:18和轻链SEQ ID NO:22的抗体；
具有重链SEQ ID NO:20和轻链SEQ ID NO:22的抗体；
具有重链SEQ ID NO:10和轻链SEQ ID NO:24的抗体；
具有重链SEQ ID NO:12和轻链SEQ ID NO:24的抗体；
具有重链SEQ ID NO:14和轻链SEQ ID NO:24的抗体；
具有重链SEQ ID NO:16和轻链SEQ ID NO:24的抗体；
具有重链SEQ ID NO:18和轻链SEQ ID NO:24的抗体；
具有重链SEQ ID NO:20和轻链SEQ ID NO:24的抗体；
具有重链SEQ ID NO:10和轻链SEQ ID NO:26的抗体；
具有重链SEQ ID NO:12和轻链SEQ ID NO:26的抗体；
具有重链SEQ ID NO:14和轻链SEQ ID NO:26的抗体；
具有重链SEQ ID NO:16和轻链SEQ ID NO:26的抗体；
具有重链SEQ ID NO:18和轻链SEQ ID NO:26的抗体；
具有重链SEQ ID NO:20和轻链SEQ ID NO:26的抗体；
具有重链SEQ ID NO:10和轻链SEQ ID NO:30的抗体；
具有重链SEQ ID NO:12和轻链SEQ ID NO:30的抗体；
具有重链SEQ ID NO:14和轻链SEQ ID NO:30的抗体；
具有重链SEQ ID NO:16和轻链SEQ ID NO:30的抗体；
具有重链SEQ ID NO:18和轻链SEQ ID NO:30的抗体；
具有重链SEQ ID NO:20和轻链SEQ ID NO:30的抗体。
示例性抗-CTLA-4抗体的物理和功能特性
本发明提供具有指定结构和功能特性的抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段以及该抗体或其抗原结合片段治疗或预防疾病(例如，癌症或感染性疾病)的使用方法。所有这些来源于如实例中所述的已发现的小鼠抗体，该抗体具有重链SEQ ID NO:32和轻链SEQ IDNO:34(编码这些的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:31和33)。
表征此抗体和来源于此抗体的人源化抗体，因为它们以小于20nM、优选小于1nM的EC50结合至人CTLA-4(hCTLA-4)，并且它们能够阻断hCTLA-4与hCD80或hCD86的结合，其中对于hCD80阻断IC50为小于100nM、优选小于10nM并且优选对于hCD86阻断IC50为小于10nM、更优选小于2.5nM。应注意，本发明的抗体的hCD80阻断曲线处于10D1(伊匹单抗)与CP-675,206(曲美木单抗)的hCD80阻断曲线之间(参见图2)。该抗体不同于伊匹单抗和曲美木单抗，因为它结合至CTLA-4分子上的不同表位。这些差异之一在于本发明的抗体或抗原结合片段并不结合至以SEQ ID NO:44提供序列的嵌合小鼠-人CTLA4分子(还参见图5)，而10D1和CP-675,206结合。
存在可用于精细映射靶抗原上的抗体表位的若干种方法，包括：H/D-Ex质谱、X-射线结晶学、肽阵列和定点突变。例如，与蛋白水解和质谱放结合的HDX(氢氘交换)可以用于确定特异性抗原Y上的抗体的表位。HDX-MS依赖于当独自在D2O中并在其抗体存在下以不同时间间隔孵育时氘掺入的准确测量和抗原氘掺入程度的比较。氘与蛋白质在暴露区域中的酰胺主链上的氢交换，而抗原结合至抗体的区域将在通过蛋白质水解片段的LC-MS/MS进行分析之后显示更少的交换或未显示交换。
本发明还包括结合至人CTLA-4的表位但不结合至SEQ ID NO:44的小鼠-人嵌合CTLA-4分子的抗-CTLA-4抗体。
在其他实施方案中，本发明提供结合人CTLA-4(例如，人源化抗体)并具有与氨基酸序列SEQ ID NO:7-30有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性、优选与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26或30有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段；其中该变体展现出希望的结合和特性，具有结合至CTLA-4的能力和阻断CTLA-4与CD80和/或CD86的结合的能力。在其他实施方案中，本发明提供结合人CTLA-4(例如，人源化抗体)并具有与氨基酸序列SEQ ID NO:7-30有至少95％序列同一性、优选与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26或30有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，本发明提供结合人CTLA-4(例如，人源化抗体)并具有与氨基酸序列SEQ ID NO:7-30有至少97％序列同一性、优选与SEQID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26或30有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，本发明提供结合人CTLA-4(例如，人源化抗体)并具有与氨基酸序列SEQ ID NO:7-30有至少99％序列同一性、优选与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26或30有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段。
“保守性修饰的变体”或“保守性取代”是指蛋白质中的氨基酸被具有类似特征(例如，电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸取代，使得可以频繁做出改变而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见例如Watson等人(1987)MolecularBiology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(第4版))。另外，结构或功能上类似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性保守性取代在表2中列出。
表2.示例性保守性氨基酸取代
初始残基 保守性取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys；His
Asn(N) Gln；His
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；His
Met(M) Leu；Ile；Tyr
Phe(F) Tyr；Met；Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
本发明的抗体的功能保守性变体也由本发明所涵盖。如本文所用，“功能保守性变体”是指已改变一个或多个氨基酸残基而未改变希望的特性诸如抗原亲和力和/或特异性的抗体或片段。此类变体包括但不限于用具有类似特性的氨基酸置换一个氨基酸，诸如表2的保守性氨基酸取代。还提供包含本发明的抗-CTLA-4抗体的VL结构域(例如，SEQ ID NO：22、24、26、30)的分离多肽以及包含本发明的抗-CTLA-4抗体的具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代的VH结构域(例如，SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20)的分离多肽。
在另一个实施方案中，提供一种抗体或其抗原结合片段，其结合人CTLA-4并具有与本文所述的VL结构域或VH结构域中的一种或多种有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或75％序列同一性的VL结构域和VH结构域，并且展示与CTLA-4的特异性结合。在另一个实施方案中，本发明的结合抗体或其抗原结合片段包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸取代的VL和VH结构域(具有和不具有信号序列)并展示出与CTLA-4特异性结合。
多核苷酸和多肽
本发明还包括编码本发明的抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段的任何多肽或免疫球蛋白链的多核苷酸。例如，本发明包括编码SEQ ID NO:1-30中任一项所述的氨基酸的多核苷酸。
在一个实施方案中，提供编码本文所列出的分离抗体或抗原结合片段的多肽链的分离多核苷酸，例如DNA。在一个实施方案中，分离的多核苷酸编码包含至少一个根据本发明的成熟免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域和/或至少一个根据本发明的成熟免疫球蛋白重链可变(VH)结构域的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，分离的多核苷酸在单一多核苷酸分子上编码轻链和重链，并且在其他实施方案中，在单独多核苷酸分子上编码轻链和重链。在另一个实施方案中，多核苷酸还编码信号序列。
在一个实施方案中，本发明包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码包含HCDR-1(SEQ ID NO:1)、HCDR-2(SEQ ID NO:2)和HCDR-3(SEQ ID NO:3)的抗体重链可变(VH)结构域或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码包含LCDR-1(SEQ ID NO:4)、LCDR-2(SEQ ID NO:5)和LCDR-3(SEQ ID NO:6)的抗体轻链可变(VL)结构域或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码SEQ IDNO:7的免疫球蛋白重链可变(VH)结构域。
在一个实施方案中，本发明包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码SEQ IDNO:8的免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域。
在一个实施方案中，本发明包括一种根据SEQ ID NO:9、11、13、15、17或19中任一种编码人源化重链的分离的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明包括一种根据SEQ ID NO:21、23、25或29中任一种编码人源化轻链的分离的多核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，包括一种分离的多核苷酸，其包括根据SEQ IDNO:9、11、13、15、17或19中任一种编码人源化重链的分离的多核苷酸和根据SEQ ID NO:21、23、25或29中任一种并编码人源化轻链的分离的多核苷酸。包括这些的所有可能的组合。因此，本发明包括一种包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:21的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:21的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:9和SEQID NO:23的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:23的多核苷酸、一种包含SEQID NO:13和SEQ ID NO:23的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:23的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:23的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:23的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:25的多核苷酸、一种包含SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:25的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:25的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:25的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:25的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:29的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:29的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:29的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:29的多核苷酸、一种包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:29的多核苷酸、和/或一种包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:29的多核苷酸。
本发明还提供包含本发明的分离多核苷酸的载体，例如表达载体，诸如质粒，其中该多核苷酸可操作连接至当用载体转染细胞时由宿主细胞识别的控制序列。还提供包含本发明的载体的宿主细胞和用于产生本文所述的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，这些方法包括在培养基中培养具有编码该抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链的表达载体或核酸的宿主细胞并且从该宿主细胞或培养基分离该抗原或其抗原结合片段。
本发明还包括包含当通过BLAST算法比较时与本文所提供的抗体的氨基酸序列至少约75％相同、80％相同、更优选至少约90％相同并且最优选地至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列的多肽，例如免疫球蛋白多肽，其中选择该算法的参数以给出在相应参考序列的整个长度上在相应序列之间的最大匹配(例如预期阈值：10；字号：3；查询范围的最大匹配：0；BLOSUM62矩阵；空位成本：延长11、延长1；条件组成评分矩阵调整)。
序列同一性是指当最佳比对两个序列时两种多肽的氨基酸在等效位置处相同的程度。
以下参考文献涉及通常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS：Altschul等人(2005)FEBS J.272(20):5101-5109；Altschul,S.F.等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.等人,(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.等人,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.等人,(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.等人,(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等人,"A model of evolutionary change inproteins."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷，增补版3.M.O.Dayhoff(编辑),第345-352页,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人,"Matrices for detecting distant relationships."in Atlas ofProtein Sequence and Structure,(1978)第5卷,增补版3."M.O.Dayhoff(编辑),第353-358页,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.等人,(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.等人,(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877；Dembo,A.等人,(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；以及Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multipledistinct local alignments."in Theoretical and Computational Methods in GenomeResearch(S.Suhai编辑),(1997)第1-14页,Plenum,New York。
结合亲和力
作为实例，本文所公开的抗体和抗原结合片段可以结合包含以下氨基酸序列的人CTLA-4(NCBI登录号NM_005214.4)：(SEQ ID NO:36)：
其中如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)所测定的，KD值为至少约1x 10-9M(即，KD值为1x 10-9M或更低)。
免疫细胞活化
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段增加了免疫细胞的活性。免疫细胞的活性的增加可以使用本领域已知的任何方法来检测。在一个实施方案中，免疫细胞的活性的增加可以通过测量免疫细胞的增殖来检测。例如，T细胞的活性的增加可以通过测量T细胞的增殖或信号转导事件(诸如将信号传输至转录调节因子的免疫受体或下游激酶的酪氨酸磷酸化)来检测。在其他实施方案中，免疫细胞的活性的增加可以通过测量特异性靶细胞上的CTL或NK细胞毒性功能或与抗肿瘤免疫的刺激相关联的IFNγ细胞因子响应来检测。在其他实施方案中，免疫细胞的活性的增加可以通过测量来源于受试者的样品中的离体T细胞活化来检测。在一个实施方案中，T细胞活性的增加通过以下各项来确定：(i)测量选自由以下各项组成的组的一种或多种促炎性细胞因子的SEB(葡萄球菌肠毒素B)诱导的产生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13，或者选自由以下各项组成的组的膜活化标记的上调：CD25和CD69，或者使用通过流式细胞术或3H-结合器(incorportationor)进行胚细胞形成的检测来获得增殖诱导，(ii)测量T细胞受体(TCR)信号传导诱导选自由以下各项组成的组的细胞因子的产生的混合型淋巴细胞响应或直接抗-CD3mAb刺激：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13，或者选自由以下各项组成的组的膜活化标记的上调：CD25和CD69，或者使用通过流式细胞术或3H-结合进行胚细胞形成的检测来获得增殖诱导。在某些实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段将刺激CD3+T细胞，当这些细胞被呈递至表达CD80和CD86的Raji细胞以产生选自由以下各项组成的组的促炎性细胞因子：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13，或者选自由以下各项组成的组的膜活化标记的上调：CD25和CD69，或者使用通过流式细胞术或3H-结合进行胚细胞形成的检测来获得增殖诱导时。在某些实施方案中，本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段将刺激活化T细胞产生IL-2和/或IFNγ至少1.5倍。如由实验部分清楚的是，本发明的抗体的T细胞活化特征约等同于已知现有技术抗-hCTLA4抗体伊匹单抗和曲美木单抗的T细胞刺激特征。
抗-hCTLA-4抗体的效应物功能
在一些实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或抗原结合片段可消耗CTLA-4+调控T细胞。抗体发挥此效应物功能的能力可以使用本领域已知的方法来确定。在一个实施方案中，抗体诱导抗体依赖性细胞介导性细胞毒性的能力使用作为效应细胞的天然杀伤细胞和稳定表达人CTLA-4的细胞来确定。如实验部分中所示，具有人IgG1Fc部分的hCTLA-4抗体能够在CTLA-4+细胞上诱导ADCC。
在另一个实施方案中，抗体诱导补体依赖性细胞细胞毒性的能力使用人补体和稳定表达人CTLA-4的细胞系来确定。如实验部分中所示，具有人IgG1Fc部分的hCTLA-4抗体能够在CTLA-4+细胞上诱导CDC。
在另一个实施方案中，抗体诱导细胞介导的裂解的能力可以使用在hIgG1CTLA-4抗体诸如伊匹单抗的背景下诱导CTLA-4+Treg的FcγRIIIA-依赖性裂解的非典型CD14+CD16++单核细胞来确定(Romano等人；PNAS；2015；6140-6145；doi:10.1073/pnas.1417320112)
抗-hCTLA-4抗体阻断与hCD80和hCD86的结合的能力
在一些实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或抗原结合片段能够阻断人CTLA-4与人CD80和/或人CD86的结合。阻断人CTLA-4与人CD80和/或人CD86的结合的能力可以使用本领域已知的任何方法来确定。在一个实施方案中，抗体阻断人CTLA-4与人CD80和/或人CD86的结合的能力使用ELISA测定来确定。
如实验部分所示，阻断CTLA-4与人CD80和/或人CD86的结合的功效类似于已知的抗-CTLA-4抗体伊匹单抗和曲美木单抗的活性。应突出显示本发明的抗-CTLA-4抗体关于hCD80的阻断显示伊匹单抗与曲美木单抗的效应之间的中间功效(参见图2)。
制备抗体及其抗原结合片段的方法
因此，本发明包括用于制成本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段的方法，这些方法包括在有利于表达该抗体或片段的条件下培养表达该抗体或片段的杂交瘤细胞并且任选地将该抗体或片段从该杂交瘤和/或生长培养基(例如细胞培养基)中分离。
来源于除大鼠和小鼠之外的动物的单克隆抗体提供独特的优点。与信号转导和疾病相关的许多蛋白质靶标在小鼠、大鼠与人之间为高度保守的，并且可以因此被小鼠或大鼠宿主识别为自身抗原，使得它们具有较小免疫原性。当使用兔作为宿主动物时，可以避免此问题。参见例如Rossi等人,Am.J.Clin.Pathol.,124,295-302,2005。
用于使用杂交瘤技术产生并筛选特异性抗体的方法为常规的并且本领域已熟知的。在一个非限制性实例中，小鼠可以用感兴趣的抗原或表达此抗原的细胞免疫接种。一旦检测到免疫响应，例如检测小鼠血清中对抗原有特异性的抗体，就收获小鼠脾脏并且分离脾细胞。培养B细胞，如Steenbakkers等人.,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134所述。
然后例如通过根据公布的程序进行微型电融合来使来自反应性上清液的B-细胞克隆永生化(Steenbakkers等人,1992,J.Immunol.Meth.152:69-77；Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-34)。选择杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。
然后通过本领域对于分泌能够结合抗原的抗体的细胞已知的方法测定杂交瘤克隆。腹水通常含有高水平的抗体，可以通过用阳性杂交瘤克隆腹膜内接种小鼠来生成。
可以用于抗体生成方法中的佐剂包括但不限于蛋白质佐剂；细菌佐剂，例如完整细菌(BCG、短小棒状杆菌、明尼苏达沙门氏菌)和细菌组分，包括细胞壁骨架、海藻糖二霉菌酸酯、单磷酰脂质A、结核杆菌甲醇可提取残余物(MER)、完全或不完全弗氏佐剂；病毒佐剂；化学佐剂，例如氢氧化铝、碘醋酸酯和胆甾醇半琥珠酸酯；或者裸DNA佐剂。可以用于本发明的方法中的其他佐剂包括霍乱毒素、副痘病毒(paropox)蛋白、MF-59(ChironCorporation；还参见Bieg等人.(1999)“GAD65And Insulin B Chain Peptide(9-23)AreNot Primary Autoantigens In The Type 1Diabetes Syndrome Of The BB Rat,”Autoimmunity,31(1):15-24，该文献通过引用并入本文)、(Corixa Corporation；还参见Lodmell等人(2000)“DNA Vaccination Of Mice Against Rabies Virus:EffectsOf The Route Of Vaccination And The Adjuvant Monophosphoryl Lipid A(MPL),”Vaccine,18:1059-1066；Johnson等人.(1999)“3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid ADerivatives:Synthesis And Immunostimulant Activities,”Journal of MedicinalChemistry,42:4640-4649；Baldridge等人(1999)“Monophosphoryl Lipid A(MPL)Formulations For The Next Generation Of Vaccines,”Methods,19:103-107，所有这些文献通过引用并入本文)、RC-529佐剂(Corixa Corporation；来自Corixa氏氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸盐(AGP)化学文库的先导化合物，还参见www.corixa.com)、以及DETOXTM佐剂(Corixa Corporation；DETOXTM佐剂包括佐剂(单磷酰脂质A)和分枝杆菌细胞壁骨架；还参见Eton等人(1998)“Active Immunotherapy With Ultraviolet B-IrradiatedAutologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX In Patients With MetastaticMelanoma,”Clin.Cancer Res.4(3):619-627；以及Gupta等人(1995)“Adjuvants ForHuman Vaccines—Current Status,Problems And Future Prospects,”Vaccine,13(14):1263-1276，两份文献均通过引用并入本文)。
许多出版物讨论了使用噬菌体展示技术产生和筛选结合至所选分析物的多肽文库。参见例如Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等人,Science 249,404-6,1990；Scott和Smith,Science 249,386-88,1990；以及Ladner等人,美国专利号5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念为在编码待筛选的多肽的DNA与该多肽之间建立物理缔合。此物理缔合通过噬菌体颗粒提供，该噬菌体颗粒将一种多肽展示为包封编码该多肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。在多肽与其遗传物质之间建立物理缔合允许同时大量筛选极大数目的具有不同多肽的噬菌体。展示与靶标具有亲和力的多肽的噬菌体结合至靶标并且这些噬菌体通过对靶标的亲和力筛选来富集。由这些噬菌体展示的多肽的同一性可以由其相应基因组确定。使用这种方法，鉴定为对希望的靶标具有结合亲和力的多肽然后可以通过常规方式大量合成。参见例如美国专利号6,057,098，该专利整体并入本文，包括全部表格、附图和权利要求书。
通过这些方法生成的抗体然后可以通过首次筛选与感兴趣的纯化多肽的亲和力和特异性并且在需要时将这些结果与这些抗体与期望从结合中排除的多肽的亲和力和特异性相比较来选择。筛选程序可以涉及将纯化多肽固定在微量滴定板的单个孔中。然后将含有潜在抗体或抗体组的溶液放置到在相应微量滴定孔中并且孵育约30min至2h。然后洗涤微量滴定孔并且将标记的二抗(例如，如果产生的抗体是小鼠抗体，则缀合至碱性磷酸酶的抗小鼠抗体)添加到这些孔中并且孵育约30min并且然后洗涤。将底物添加到孔中并且将出现颜色反应，其中存在固定多肽的抗体。
然后可以在所选的测定设计中进一步分析如此鉴定的抗体的亲和力和特异性。在用于靶蛋白的免疫测定的开发中，纯化的靶蛋白充当标准物，使用该标准物判断使用已选择的抗体的免疫测定的敏感性和特异性。因为各种抗体的结合亲和力可能不同；某些抗体对(例如，在夹心测定中)可能在空间上等彼此干扰，抗体的测定性能可能是比抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。
抗体也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机引入或者通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞中。或者，除人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区和多变区也可以引入到小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以通过经由同源重组引入人免疫球蛋白基因座来单独或同时赋予无功能性。具体而言，JH区的纯合子缺失防止了内源性抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞并且将其显微注射到囊胚中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。使用利用所选抗原，例如本发明的多肽的全部或一部分的常规方法免疫接种转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所具有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重新排列，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用此技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于产生人抗体的此技术的综述，参见Lonberg等人.(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol.13:65-93，该文献通过引用整体并入本文)。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的此技术和用于产生此类抗体的方案的详细讨论，参见例如国际公布号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、以及5,939,598，这些专利通过引用整体并入本文。另外，诸如Abgenix/Amgen(Freemont,Calif.)和Medarex/BMS(Princeton,N.J.)、Kymab(Cambridge,UK)和Merus(Utrecht,Netherlands)等公司可能致力于使用类似于上文所述技术的技术提供针对所选抗原的人抗体。
本文所公开的抗-CTLA-4抗体也可以重组产生(例如，在大肠杆菌/T7表达系统、哺乳动物细胞表达系统或低等真核表达系统中)。在此实施方案中，编码本发明的抗体免疫球蛋白分子(例如，VH或VL)的核酸可以插入到基于pET的质粒中并且在大肠杆菌/T7系统中表达。例如，本发明包括用于在宿主细胞(例如，细菌宿主细胞，诸如大肠杆菌，诸如BL21或BL21DE3)中表达抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，这些方法包括在也包含编码免疫球蛋白链并可操作连接至T7启动子的多核苷酸的细胞中表达T7 RNA聚合酶。例如，在本发明的一个实施方案中，细菌宿主细胞诸如大肠杆菌包含编码可操作连接至lac启动子的T7 RNA聚合酶基因的多核苷酸，并且该聚合酶和该链的表达通过将宿主细胞与IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷吡喃糖苷)一起孵育来诱导。
单克隆抗体制备物可以使用本领域已知的各种各样的技术来产生，这些技术包括施用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知并且例如Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等人,于：MONOCLONALANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS,pp.563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(两份文献通过引用整体并入本文)中所教导的那些技术。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是其所产生的方法的抗体。一种用于重组产生抗体的方法的一个实例在美国专利号4,816,567中公开。
因此，本发明包括用于制成本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，这些方法包括引入编码该抗体或片段的一种或多种免疫球蛋白链(例如，免疫球蛋白重链和/或轻链)的多核苷酸；在有利于此类表达的条件下培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母属或巴斯德毕赤酵母)，并且任选地从宿主细胞和/或宿主细胞所生长的培养基中分离抗体或片段或链。
抗-CTLA-4抗体也可以通过美国专利号6,331,415中所列出的任何方法来合成。
作为宿主用于表达本文所公开的抗体或片段或免疫球蛋白链的真核细胞和原核细胞(包括哺乳动物细胞)是本领域已熟知并且包括可得自美国模式培养物保藏所(ATCC)的许多永生化细胞系。这些细胞尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。特别优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，诸如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、库德毕赤酵母(Pichiakoclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、林氏毕赤酵母(Pichia lindneri))、有孢毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichiaguercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属某种(Pichia sp.)、酿酒酵母、酵母属某种、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母菌属某种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母、白色念珠菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属某种(Fusarium sp.)、稗草镰刀菌(Fusarium gramineum)、镶片镰刀菌(Fusariumvenenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。毕赤酵母属某种、任何酵母属某种、多形汉逊酵母、任何克鲁维酵母菌属某种、白色念珠菌、任何曲霉属某种、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、任何镰刀菌属某种、解脂耶氏酵母、以及粗糙脉孢菌。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过培养这些宿主细胞足以允许抗体或片段或链在宿主细胞中表达或分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间段来产生抗体。
可以利用各种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体。此类宿主表达系统表示媒介物，通过这些媒介物可以产生抗体的编码序列并且随后纯化，而且这些系统表示细胞，当用适当核苷酸编码序列转化或转染时，这些细胞可以原位表达本发明的抗体。这些包括但不限于，用含有免疫球蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，诸如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有免疫球蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属、毕赤酵母属)；用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有免疫球蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者具有含有来源于哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；疫苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利号No.5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的大鼠视网膜细胞)。
在细菌系统中，可以根据对于正在表达的抗体预期的用途有利地选择许多表达载体。例如，当将产生大量此蛋白质以用于生成抗体的药物组合物，指导高水平的容易纯化的融合蛋白产物的表达的载体可能是希望的。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人.(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones,”EMBO J.2:1791-1794)，其中该抗体编码序列可以单独连接到与lac Z编码区同框的载体中，以使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等人.(1985)“Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene OfEscherichia coli,”Nucleic Acids Res.13:3101-3110；Van Heeke等人.(1989)“Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli,”J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等等。也可以使用pGEX载体来表达外来多肽作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此类融合蛋白为可溶的并且可以通过吸附并结合至基质谷胱甘肽-琼脂珠粒，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱来容易从裂解的细胞中纯化。pGEX载体被设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，以使得克隆的靶基因产物可以从GST部分中释放。
在昆虫系统中，使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外来基因。该病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可以单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中并且处于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将感兴趣的抗体编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三重前导序列。然后可以通过体外或体内重组将此嵌合基因插入到腺病毒基因组中。病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)中的插入将形成具有活性并能够在受感染宿主中表达免疫球蛋白分子的重组病毒。(参见例如Logan等人.(1984)“Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs LateAfter Infection,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)81:3655-3659)。对于插入的抗体编码序列的有效翻译，可能还需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。另外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同框，以确保整个插入物翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种天然和合成的来源。表达的效率可以通过包含适当转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见Bitter等人.(1987)“Expression AndSecretion Vectors For Yeast,”Methods in Enzymol.153:516-544)。
另外，还可以选择以所希望的特定方式调节插入序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞品系。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)可能对于蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性的和具体的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保该表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。为了这个目的，可以使用具有用于对初始转录物进行适当加工、糖基化、以及对基因产物进行磷酸化的细胞机构的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
为了长期高产量产生重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可以将稳定表达本发明的抗体的细胞系工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以使用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标记转化宿主细胞。在引入外来DNA之后，可以允许工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后将其转换到选择培养基中。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性并且允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中并且生长形成集落，该集落进而可以克隆并扩增成细胞系。该方法可以有利地用于将表达本发明的抗体的细胞系工程化。此类工程化细胞系可以特别适用于筛选和评价与本发明的抗体直接或间接相互作用的化合物。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等人(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To CulturedMouse Cells,”Cell 11:223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等人(1962)“Genetics Of Human Cess Line.IV.DNA-Mediated Heritable TransformationOf A Biochemical Trait,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48:2026-2034)以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人(1980)“Isolation Of Transforming DNA:Cloning The HamsterAprt Gene,”Cell 22:817-823)基因，可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择基础：dhfr，赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人.(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-ActingGene,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:3567-3570；O'Hare等人.(1981)“Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By ARecombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:1527-1531)；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等人.(1981)“Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli GeneCoding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:2072-2076)；neo，赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Tachibana等人.(1991)“Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma CellsTransfected By pSV2-Neo Gene,”Cytotechnology 6(3):219-226；Tolstoshev(1993)“Gene Therapy,Concepts,Current Trials And Future Directions,”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of GeneTherapy,”Science 260:926-932；以及Morgan等人.(1993)“Human gene therapy,”Ann.Rev.Biochem.62:191-217)。可以使用的重组DNA技术领域通常已知的方法描述于Ausubel等人(编),1993,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,NY；Kriegler,1990,GENE TRANSFER AND EXPRESSION,A LABORATORY MANUAL,StocktonPress,NY；以及在第12章和第13章,Dracopoli等人(编),1994,CURRENT PROTOCOLS INHUMAN GENETICS,John Wiley&Sons,NY.；Colbere-Garapin等人.(1981)“A New DominantHybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells,”J.Mol.Biol.150:1-14；以及hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人.(1984)“Expression Of Prokaryotic GenesFor Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse LCells,”Gene 30:147-156)。
本发明的抗体的表达水平可以通过载体扩增来增加(关于综述，参见Bebbington和Hentschel,“The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For TheExpression Of Cloned Genes In Mammaian Cells,”in DNA CLONING,第3卷.(AcademicPress,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数目。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关，所以该抗体的产生也将增加(Crouse等人(1983)“Expression And AmplificationOf Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,”Mol.Cell.Biol.3:257-266)。
宿主细胞可以用本发明的两种表达载体(编码重链来源的多肽的第一载体和编码轻链来源的多肽的第二载体)共同转染。两种载体可以含有相同的可选择标记，使得重链和轻链多肽等同表达。或者，可以使用编码重链和轻链多肽二者的单一载体。在此类情况下，轻链应置于重链之前，以避免过量有毒的游离重链(Proudfoot(1986)“Expression AndAmplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,”Nature322:562-565；Kohler(1980)
“Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。例如，本发明的抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链(或来自它们的其他部分)从生产细胞系中的表达可以使用多种已知的技术来增强。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是一种用于在某些条件下增强表达的常见方式。GS系统整体或部分讨论于欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号89303964.4中。因此，在本发明的一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞(例如CHO)缺乏谷氨酰胺合成酶基因并且在培养基中在谷氨酰胺不存在下生长，然而其中编码免疫球蛋白链的多核苷酸包含补充基因在宿主细胞中的缺乏的谷氨酰胺合成酶基因。
本发明包括用于纯化本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段的方法，这些方法包括将包含该抗体或片段的样品引入到纯化介质中(例如，阳离子交换介质、阴离子交换介质、亲水性交换介质、亲和力纯化介质(例如蛋白质-A、蛋白质-G、蛋白质-A/G、蛋白质-L))并从不结合该介质的所述样品的流通级分收集纯化的抗体或片段；或者丢弃该流通级分并洗脱来自介质的结合抗体或片段并收集洗脱液。在本发明的一个实施方案中，介质处于施加样品的柱中。在本发明的一个实施方案中，在抗体或片段在宿主细胞中重组表达之后进行纯化方法，例如其中该宿主细胞首先裂解并且任选地在对介质纯化之前从不溶性材料纯化裂解物。
一般而言，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有糖基化模式，该糖基化模式为细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白所特有的。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生该抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，本文所提供的核酸分子所编码的或包含本文所提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，独立于这些抗体可具有的糖基化模式。类似地，在特定实施方案中，具有糖基化模式并仅包含非岩藻糖基化N-聚糖的抗体可为有利的，因为这些抗体已显示典型地在体外和体外展现出比其岩藻糖基化相对物更强效的功效(参见例如Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775)。具有非岩藻糖基化N-聚糖的这些抗体不可能是免疫原性的，因为它们的碳水化合物结构是群体的存在于人血清IgG中的正常组分。
本发明包括对CTLA-4和另一种抗原例如在免疫刺激中起作用的抗原诸如PD-1、PD-L1、TSLP、IL-10、4-IBB、SIRP-α、ICOS、NKG2C、NKG2A、KR2DL和KIR3DL抗原、OX40、CD40、ITL-1toITL-8、GITR、CD137、CS1、CD27、APRIL或LAG-3、或者在靶向或识别癌细胞中起作用的抗原诸如EGFR(ERBB1)、HER2(ERBB2)、ERBB3、CD19、CD20、CD30、CD33、CD52、CEA、α-胎蛋白、CC49、VEGF、VEGFR、HGFR(MET)、CA-125、腱生蛋白、整合素、FAB、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2或RANKL具有结合特异性的双特异性和双功能性抗体和抗原结合片段以及其使用方法。在本发明的一个实施方案中，抗-CTLA-4链包含以SEQ ID NO:7-30提供的VH/VL序列中的任一种(或者所述序列中任一种的抗原结合片段，诸如以SEQ ID NO:1-6提供)。双特异性或双功能性抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过各种方法产生，这些方法包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见例如Songsivilai等人,(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321,Kostelny等人,(1992)JImmunol.148:1547-1553。另外，双特异性抗体可以形成为“双体抗体”(Holliger等人,(1993)PNAS USA 90:6444-6448)或为“Janusin”(Traunecker等人,(1991)EMBO J.10:3655-3659和Traunecker等人,(1992)Int.J.Cancer增补版7:51-52)。另外，双特异性抗体可以形成为“Duobody”(Labrijn等人,PNAS 2013；110(13):5145-5150)。
本发明还包括本文所公开的抗-CTLA-4抗体的抗-CTLA-4抗原结合片段。抗体片段包括F(ab)2片段，其可以通过由例如胃蛋白酶酶促裂解IgG来产生。Fab片段可以通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2来产生。
免疫球蛋白可以根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列来分成不同类别。在一些实施方案中，不同恒定结构域可以附加到源自本文所提供的CDR的人源化VL和VH区域。至少存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。本发明包括任何抗体类别或亚类的抗体或抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如人恒定区，诸如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，诸如λ或κ人轻链区域或其变体。作为实例并且不限于，人重链恒定区可以是γ4并且人轻链恒定区可以是κ。在一个替代性实施方案中，该抗体的Fc区是具有Ser228Pro突变的γ4(Angal S.等人,1993,Mol Immunol.30:105-108，位置241是基于Kabat编号系统)。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含IgG1亚型的重链恒定区。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含IgG2亚型的重链恒定区。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含IgG4亚型的重链恒定区。
抗体工程化
还包括抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段为工程化抗体的实施方案，以包括对亲本hCTLA4.27A单克隆抗体的可变结构域内的框架残基的修饰，例如以改进该抗体或片段的特性。典型地，完成此类框架修饰以减小该抗体或片段的免疫原性。这通常通过用来自将使用该抗体的物种免疫库的类似残基，例如在人治疗剂的情况下的人残基置换亲本(例如啮齿动物)抗体或片段的可变结构域(即框架残基)中的非-CDR残基来完成。此抗体或片段被称为“人源化”抗体或片段。在一些情况下，希望增加工程化(例如人源化)抗体的亲和力或改变该抗体的特异性。一种方式是“反向突变”对应种系序列中的一个或多个框架残基。更具体地，已经历体细胞突变的抗体或片段可以含有不同于抗体所来源的种系序列的框架残基。此类残基可以通过比较抗体或片段框架序列与该抗体或片段所来源的种系序列来鉴定。另一种方式是返回至工程化(例如人源化)抗体的一个或多个位置处的初始亲本(例如啮齿动物)残基，例如恢复可能在置换框架残基的过程中丧失的结合亲和力。(参见例如美国专利号5,693,762、美国专利号5,585,089和美国专利号5,530,101。)
在某些实施方案中，将抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段工程化(例如人源化)以包含框架和/或CDR中的修饰，以改进其特性。此类工程化改变可以基于分子建模。可以构建亲本(非人)抗体序列的可变区的分子模型，以理解抗体的结构特性，并且将该模型用于鉴定抗体上可以与抗原相互作用的潜在区域。常规CDR基于免疫球蛋白序列的比对并且鉴定可变区域。Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公布号91-3242；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616。Chothia和同事小心评估了抗体结晶结构中的环的构象并且提出了超变环。Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或者Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883。在区域之间存在分类为“CDR”和“超变环”的变型。最新研究(Raghunathan等人,(2012)J.MolRecog.25,3,103-113)分析了若干种抗体-抗原结晶复合物并且观察到抗体中的抗原结合区域不一定严格符合“CDR”残基或“超变”环。非人抗体的可变区的分子模型可以用于引导可潜在结合至抗原的区域的选择。在实践中，基于模型的潜在抗原结合区域不同于常规“CDR”或“超变”环。商用科学软件诸如Discovery Studio(BIOVIA,Dassault Systemes)可以用于分子建模。人框架可以基于与框架和CDR中的非人序列的最佳匹配来选择。对于VH中的FR4(框架4)，将人种系的VJ区域与相应非人区域相比较。在VL中的FR4(框架4)的情况下，将人种系序列的J-κ和J-λ区域与相应非人区域相比较。一旦鉴定出适合的人框架，就将CDR移植到所选人框架中。在一些情况下，VL-VH界面中的某些残基可以保留在非人(亲本)序列中。分子模型也可以用于鉴定可潜在改变CDR构象并因此改变与抗原的结合的残基。在一些情况下，这些残基可以保留在非人(亲本)序列中。分子模型也可以用于鉴定可引起不需要的作用诸如糖基化、脱酰胺化和氧化的溶剂暴露的氨基酸。在设计阶段中可在早期引入可展开过滤器，以消除/最小化这些潜在问题。
另一种类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以去除T细胞表位，从而减小抗体的潜在免疫原性。此方式也称为“脱免疫”并且进一步详细描述于美国专利号7,125,689中。
在特定实施方案中，将希望将含有暴露的侧链的某些氨基酸改变成另一种氨基酸残基，以便提供最终抗体的更大化学稳定性，从而避免脱酰胺化或异构化。天冬酰胺的脱酰胺化可发生在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上并且导致形成将扭结引入到多肽链中并减小其稳定性(异天冬氨酸作用)的异天冬氨酸残基。异构化可发生于DG、DS、DA或DT序列处。在某些实施方案中，本公开的抗体不含脱酰胺化或天冬酰胺异构化位点。
例如，天冬酰胺(Asn)残基可以改变成Gln或Ala以减小在任何Asn-Gly序列处，特别在CDR内形成异天冬氨酸的可能性。类似问题可发生在Asp-Gly序列处。Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.LifeSci.60:1281。异天冬氨酸形成可以减弱或完全消除抗体与其靶抗原的结合。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731，在734处。在一个实施方案中，天冬酰胺改变成谷氨酰胺(Gln)。还可能希望改变与天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基相邻的氨基酸以减小脱酰胺化的可能性，当小氨基酸与天冬酰胺或谷氨酰胺相邻地出现时，该脱酰胺化以更大比率发生。参见Bischoff&Kolbe(1994)J.Chromatog.662:261。另外，CDR中的任何甲硫氨酸残基(通常为溶剂暴露的Met)可以改变成Lys、Leu、Ala、或Phe或其他氨基酸，以便减小甲硫氨酸硫氧化的可能性，该甲硫氨酸硫氧化可减小抗原结合亲和力并且还在最终抗体制备中产生分子异质性。同上。另外，为了防止或最小化潜在的易裂开Asn-Pro肽键，可能希望将CDR中可见的任何Asn-Pro组合改变成Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有此类取代的抗体以确保这些取代不减小抗体对CTLA-4的亲和力或特异性或者其他希望的生物活性至不可接受的水平。
表3.示例性稳定CDR变体
Fc区的抗体工程化
本文所公开的抗体(例如，人源化抗体)及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以被工程化以包含Fc区内的修饰，典型地改变该抗体的一种或多种特性，诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或效应物功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。另外，本文所公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以附接至该抗体)或被修饰以改变其糖基化，再改变该抗体或片段的一种或多种特性。这些实施方案各自在下文中进一步详细描述。Fc区中残基的编号为Kabat的EU索引编号。
本文所公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也包括具有修饰(或阻断)的Fc区的抗体和片段以提供改变的效应物功能。参见例如美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可以用于增强或抑制免疫系统的各种反应，其在诊断和治疗中具有可能的有利作用。Fc区的变化包括氨基酸改变(取代、缺失和插入)、糖基化或脱糖基化、以及添加多个Fc区。对Fc的改变也可以改变治疗性抗体中的抗体半衰期，使得给药频率更少并且因此增加便利性并减少材料使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731，在734-35处。
在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)是包含在对应于重链恒定区的铰链区中的位置228(S228P；EU索引)的位置处的丝氨酸至脯氨酸突变的IgG4同种型抗体或片段。据报告此突变消除了铰链区中的重链间二硫桥的异质性(Angal S.等人.,1993,Mol Immunol.30:105-108；位置241是基于Kabat编号系统)。
在本发明的一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰为使得铰链区中的半胱氨酸残基数目增加或减少。此方式在美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区中的半胱氨酸残基数目，例如以促进轻链和重链的组装或者增加或减小该抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)的Fc铰链区被突变以减小该抗体或片段的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使得该抗体或片段具有相对于天然Fc铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合受损的SpA结合。此方式在美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)被修饰以增加其生物半衰期。各种方式均为可能的。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F，如美国专利号6,277,375中所述。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获取的挽救受体结合表位，如美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
在其他实施方案中，Fc区通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变，以改变该抗体或抗原结合片段的效应物功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换，使得该抗体对于效应物配体具有改变的亲和力并且保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应物配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。此方法在美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换，使得该抗体具有改变C1q结合和/或减小或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法在美国专利号6,194,551中进一步详细描述。
在另一个实例中，改变在氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固体补体的能力。此方法在PCT公布WO94/29351中进一步描述。
在另一个实例中，通过修饰在以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以减小本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或减小抗体或片段对Fcγ受体的亲和力的能力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方式在PCT公布WO 00/42072中进一步描述。此外，已映射人IgG1上对于FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点并且描述了具有改进的结合的变体(参见Shields等人.(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
在本发明的一个实施方案中，通过修饰残基243和264来修饰Fc区以减小本发明的抗体(例如，抗体27A及其人源化形式)介导效应物功能和/或增加抗炎特性的能力。在一个实施方案中，通过将位置243和264处的残基改变成丙氨酸来修饰抗体或片段的Fc区。在一个实施方案中，通过修饰残基243、264、267和328来修饰Fc区以减小本发明的抗体或片段介导效应物功能和/或增加抗炎特性的能力。
效应物功能增强
在一些实施方案中，修饰抗-CTLA-4抗体的Fc区以增加抗体或抗原结合片段介导效应物功能和/或增加其与Fcγ受体(FcγR)的结合的能力。
如本文所用的术语“效应物功能”旨在是指抗体依赖性细胞介导细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性(CDC)介导的响应、Fc-介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞毒性吞噬作用(ADCP)和经由FcRn受体进行的抗体循环中的一种或多种。
据信在抗原结合蛋白的恒定区与各种Fc受体(FcR)(包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))之间的相互作用介导了抗原结合蛋白的效应物功能，诸如ADCC和CDC。Fc受体对于抗体交联也是重要的，这可能对于抗肿瘤免疫为重要的。
效应物功能可以多种方式测量，包括例如经由FcγRIII与天然杀伤细胞的结合或者经由FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合，以测量ADCC效应物功能。例如，可以在天然杀伤细胞测定中评估本发明的抗原结合蛋白的ADCC效应物功能。此类测定的实例可见于Shields等人,2001J.Biol.Chem.,第276卷，第6591-6604页；Chappel等人,1993J.Biol.Chem.,第268卷，第25124-25131页；Lazar等人,2006PNAS,103；4005-4010。
本发明的抗体的ADCC或CDC特性或其交联特性可以许多方式增强。
已显示含有对残基Asn297的特异性突变或改变的糖基化的人IgG1恒定区增强了与Fc受体的结合。在一些情况下，这些突变也已显示增强ADCC和CDC(Lazar等人PNAS 2006,103；4005-4010；Shields等人J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等人MolImmunol,2007,44；1815-1817)。
在本发明的一个实施方案中，此类突变处于选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置中或其他IgG同种型的等效位置中。适合突变的实例为S239D和I332E和A330L。在一个实施方案中，本文所述的本发明的抗原结合蛋白在位置239和332处突变，例如S239D和I332E，或者在其他实施方案中，其在选自239和332和330的三个或更多个位置处突变，例如S239D和I332E和A330L(EU索引编号)。
在本发明的一个替代性实施方案中，提供一种包含具有改变的糖基化曲线的重链恒定区的抗体，使得抗原结合蛋白具有增强的效应物功能。例如，其中该抗体具有增强的ADCC或增强的CDC，或者其中该抗体具有增强的ADCC和CDC效应物功能。产生具有改变的糖基化曲线的抗原结合蛋白的适合方法的实例描述于WO2003011878、WO2006014679和EP1229125中。
在另一个方面中，本发明提供“非岩藻糖基化”或“无岩藻糖基化”抗体。非岩藻糖基化抗体具有Fc的复合物型N-聚糖的三-甘露糖核心结构而无岩藻糖残基。缺乏来自Fc N-聚糖的核心岩藻糖残基的这些糖工程化抗体由于FcγRIIIa结合能力增强而可展现出比岩藻糖基化等效物更强的ADCC。
本发明还提供一种产生根据本发明的抗体的方法，该方法包括以下步骤：a)培养包含含有如本文所述的分离核酸的表达载体的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞不包含α-1,6-岩藻糖基转移酶；以及b)回收该抗原结合蛋白。重组宿主细胞可能通常不含有编码α-1,6-岩藻糖基转移酶(例如酵母宿主细胞，诸如毕赤酵母属某种)的基因或者可能已被修饰以灭活α-1,6-岩藻糖基转移酶。已被遗传修饰以灭活编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因的重组宿主细胞为可用的。参见例如可得自BioWa,Inc.(Princeton,N.J.)的POTELLIGENTTM技术系统，其中缺乏FUT8基因的功能性拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的单克隆抗体，该活性相对于在具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体有所增加。POTELLIGENTTM技术系统的方面描述于US7214775、US6946292、WO0061739和WO0231240中。本领域普通技术人员将认识其他适当的系统。
本领域技术人员将清楚的是，此类修饰不仅可以单独使用，而且可以彼此组合使用，以便进一步增强效应物功能。
具有修饰的糖基化的抗体的产生
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)包含特定糖基化模式。例如，可以制成无岩藻糖基化或无糖基化抗体或片段(即，抗体分别缺乏岩藻糖或糖基化)。抗体或片段的糖基化模式可以被改变以例如增加抗体或片段对CTLA-4抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可以通过例如改变抗体或片段序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以做出一种或多种氨基酸取代，使得一个或多个可变区框架糖基化位点被去除，从而消除该位点处的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体或片段对抗原的亲和力或亲合力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
本文所公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可还包括低等真核宿主细胞中、特定真菌宿主细胞诸如酵母和丝状真菌中产生的那些抗体，所述抗体已被遗传工程化以产生具有哺乳动物样或人样糖基化模式的糖蛋白(参见例如Choi等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027；Hamilton等人.,(2003)Science 301:1244-1246；Hamilton等人.,(2006)Science 313:1441-1443；Nett等人.,Yeast 28(3):237-52(2011)；Hamilton等人.,Curr Opin Biotechnol.Oct；18(5):387-92(2007))。这些遗传修饰的宿主细胞相对于当前使用的哺乳动物细胞系的特定优点为控制在细胞中产生的糖蛋白的糖基化曲线，使得可以产生糖蛋白组合物的能力，其中特定N-聚糖结构占优势(参见例如美国专利号7,029,872和美国专利号7,449,308)。这些遗传修饰的宿主细胞已用于产生主要具有特定N-聚糖结构的抗体(参见例如Li等人,(2006)Nat.Biotechnol.24:210-215)。
在特定实施方案中，本文所公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)还包括在低等真核宿主细胞中产生的那些抗体并且包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化杂合物和复合N-聚糖，包括等分和多触角种类，包括但不限于N-聚糖，诸如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在特定实施方案中，本文所提供的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可包括具有选自由以下组成的组的至少一个杂合N-聚糖的抗体或片段：GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；以及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在特定方面中，杂合N-聚糖为组合物中的主要N-聚糖种类。
在特定实施方案中，本文所提供的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)包括具有至少一个选自由以下各项组成的组的复合N-聚糖的抗体和片段：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；以及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定方面中，复合N-聚糖为组合物中的主要N-聚糖种类。在其他方面中，复合N-聚糖为在组合物中包含约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％复合N-聚糖的特定N-聚糖种类。在一个实施方案中，本文所提供的抗体及其抗原结合片段包含复合N-聚糖，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％复合N-聚糖包含结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其中此类结构为无岩藻糖基化的。此类结构可以例如在工程化巴斯德毕赤酵母宿主细胞中产生。
在特定实施方案中，N-聚糖是岩藻糖基化的。一般而言，岩藻糖在N-聚糖的还原端处与GlcNAc处于α1,3-键合，在N-聚糖的还原端处与GlcNAc处于α1,6-键合，在N-聚糖的非还原端处与Gal处于α1,2-键合，在N-聚糖的非还原端处与GlcNac处于α1,3-键合，或者在N-聚糖的非还原端处与GlcNAc处于α1,4-键合。
因此，在以上糖蛋白组合物的特定方面中，糖型为处于α1,3-键合或α1,6-键合岩藻糖形式，以产生选自由以下各项组成的组的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、以及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；处于α1,3-键合或α1,4-键合岩藻糖形式以产生选自由以下各项组成的组的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、以及NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或者处于α1,2-键合岩藻糖形式以产生选自由以下各项组成的组的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、以及NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其他方面中，抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段包含高甘露糖N-聚糖，包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2N-聚糖结构组成的N-聚糖。
在上文的其他方面，复合N-聚糖还包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化等分和多触角种类。
如本文所用，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用并且是指N-连接的寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰基葡萄糖胺键连接至多肽的天冬酰胺残基的寡糖。N-连接的糖蛋白含有连接至蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺氮的N-乙酰基葡萄糖胺。糖蛋白上可见的主要糖为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰基-神经氨酸(NANA))。糖基的加工在ER的管腔中共同翻译地发生并且在翻译后在高尔基氏体中继续以用于N-连接的糖蛋白。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2的常见五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；并且“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰基葡糖胺)。通常，N-聚糖结构提供有左侧非还原端和右侧还原端。N-聚糖的还原端为附接至包含蛋白质上的糖基化位点的Asn残基的末端。N-聚糖关于支链数目(触角)不同，该聚糖包含添加至Man3GlcNAc2(“Man3”)核心结构的周围糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)，该核心结构也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”。N-聚糖根据其支链成分(例如，高甘露糖、复合物或杂合物)分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合物”型N-聚糖通常具有至少一个连接至1,3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖也可以具有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)残基，所述残基任选地用唾液酸或衍生物(例如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸并且“Ac”是指乙酰基)修饰。复合N-聚糖也可以具有链内取代，包含“等分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复合N-聚糖也可以在“三甘露糖核心”上具有多个触角，通常称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂的末端上具有至少一个GlcNAc并且在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上具有零个或更多个甘露糖。各种N-聚糖也称为“糖型”。
关于复合N-聚糖，术语“G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”、“A1”、以及“A2”意指以下各项。“G-2”是指可表征为Man3GlcNAc2的N-聚糖；术语“G-1”是指可表征为GlcNAcMan3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G0”是指可表征为GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G1”是指可表征为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G2”是指可表征为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“A1”是指可表征为NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；并且术语“A2”是指可表征为NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。除非另外指示，否则术语“G-2、”“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”、“A1”和“A2”是指缺乏连接至N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基的岩藻糖的N-聚糖种类。当术语包括“F，”“F”指示N-聚糖种类在N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基上含有岩藻糖残基。例如，G0F、G1F、G2F、A1F和A2F全部指示N-聚糖还包含连接至N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基的岩藻糖残基。低等真核生物诸如酵母和丝状真菌通常不产生形成岩藻糖的N-聚糖。
关于多触角N-聚糖，术语“多触角N-聚糖”是指还包含构成N-聚糖的1,6臂或1,3臂的非还原端的甘露糖残基上的GlcNAc残基或构成N-聚糖的1,6臂和1,3臂的非还原端的每个甘露糖残基上的GlcNAc残基的N-聚糖。因此，多触角N-聚糖可以由式GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2表征。术语“1-4”是指1、2、3或4个残基。
关于等分N-聚糖，术语“等分N-聚糖”是指其中GlcNAc残基连接至N-聚糖的还原端处的甘露糖残基的N-聚糖。等分N-聚糖可由式GlcNAc3Man3GlcNAc2表征，其中每个甘露糖残基在其非还原端连接至GlcNAc残基。相比之下，当多触角N-聚糖被表征为GlcNAc3Man3GlcNAc2时，该式指示两个GlcNAc残基连接至N-聚糖的两个臂之一的非还原端处的甘露糖残基并且一个GlcNAc残基连接至N-聚糖的另一个臂的非还原端处的甘露糖残基。
抗体物理特性
本文所公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)还可含有轻链或重链免疫球蛋白可变区中的一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可由于抗原结合发生改变而导致抗体或片段的免疫原性增加或抗体的pK发生变化(Marshall等人.(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol 172:5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人.(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。
每种抗体或抗原结合片段(例如，27A或其人源化形式)将具有独特的等电点(pI)，该等电点通常落入在6与9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI典型落入在7-9.5的pH范围内并且IgG4抗体的pI典型地落入在6-8的pH范围内。
每种抗体或抗原结合片段(例如，27A或其人源化形式)将具有特征性熔融温度，其中较高熔融温度指示体内较大总体稳定性(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)CurrPharm Biotechnol 3:361-71)。一般而言，TM1(初始展开的温度)可大于60℃、大于65℃或大于70℃。抗体或片段的熔点可使用差式扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68:47-52)或圆二色谱(Murray等人.(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)来测量。
在另一个实施方案中，选择不快速降解的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)。抗体或片段的降解可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS测量(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem 67:3626-32)。
在另一个实施方案中，选择具有最小聚集作用的抗体(例如，抗体27A及其人源化形式)及其抗原结合片段，该最小聚集作用可导致引发不需要的免疫响应和/或改变的或不宜的的药动力学特性。通常，抗体和片段在25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、或5％或更少聚集的情况下为可接受的。聚集可通过若干技术(包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射)测量。
抗体缀合物
本文所公开的抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以缀合至化学部分。化学部分可以尤其是聚合物、放射性核素或细胞毒素因子。在特定实施方案中，化学部分为增加抗体或片段在受试者身体内的半衰期的聚合物。适合聚合物包括但不限于亲水性聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、右旋糖酐和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人,(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等人,(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)公开了与附接至放射性金属螯合剂(二乙烯基三胺五乙酸(DTPA))的PEG缀合的抗体。
本文所公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以与标记诸如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th、以及40K、157Gd、55Mn、52Tr以及56Fe缀合。
本文所公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以是聚乙二醇化的，例如以增加其生物(例如血清)半衰期。为了将抗体或片段聚乙二醇化，典型地在其中一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下，将抗体或片段与反应形式的聚乙二醇(PEG)诸如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。在特定实施方案中，经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)进行酰基化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于使其他蛋白质衍生化的任何形式的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或酰氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体或片段为无糖基化的抗体或片段。用于将蛋白质聚乙二醇化的方法为本领域已知的并且可以施用至本发明的抗体。参见例如EP 0 154 316和EP 0 401 384。
本文所公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以与荧光或化学发光标记缀合，所述荧光或化学发光标记包括荧光团诸如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、异硫氰酸盐、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹酰、伞形酮、荧光素、发光标记、等发光标记、芳香吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、水母素标记、2,3-二氢酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记以及稳定的自由基。
本发明的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以缀合至细胞毒素因子，诸如白喉毒素、铜绿假单胞菌外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲菌素(sarcin)、油桐蛋白和化合物(例如，脂肪酸)、石竹素蛋白、美国商陆(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、观赏苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素以及伊诺霉素。
可以采用本领域已知用于将本发明的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)缀合至各个部分的任何方法，包括Hunter等人,(1962)Nature 144:945；David等人,(1974)Biochemistry 13:1014；Pain等人,(1981)J.Immunol.Meth.40:219；以及Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407所述的那些方法。用于缀合抗体和片段的方法为常规的并且为本领域非常熟知的。
抗体或其他多肽可以固定到各种固体载体上以用于测定。可用于固定特异性结合成员的固相包括开发和/或用作固相结合测定中的固相的那些固相。适合固相的实例包括膜过滤器、纤维素基纸、珠粒(包括聚合物、乳胶和顺磁性颗粒)、玻璃、硅片、微粒、纳米颗粒、TentaGel、AgroGel、PEGA凝胶、SPOCC凝胶以及多孔板。测定条带可通过在固体载体上的阵列中涂覆抗体或多种抗体来制备。此条带然后可浸入到测试样品中并且然后通过洗涤和检测步骤快速处理以生成可测量信号，诸如有色点。抗体或其他多肽可以通过直接缀合至测定装置表面或通过间接结合来结合至测定装置的特定区域。在后一种情况的实例中，抗体或其他多肽可以固定在颗粒或其他固体载体上，并且该固体载体固定至装置表面。
生物测定需要用于检测的方法，并且用于定量结果的最常见方法之一为将可检测标记缀合至对生物系统中正在研究的组分之一有亲和力的蛋白质或核酸。可检测标记可包括本身可检测的分子(例如，荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)以及可通过产生可检测反应产物(例如，酶，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过本身可检测的特异性结合分子(例如，生物素、异羟基洋地黄毒苷、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)来间接检测的分子。
固相和可检测标记缀合物的制备通常包括使用化学交联剂。交联试剂含有至少两个反应性基团，并且通常分成同官能性交联剂(含有相同反应基团)和异官能性交联剂(含有不同反应基团)。通过胺、巯基偶联或非特异性反应的同官能性交联剂可得自许多商业来源。马来酰亚胺、烷基和酰基卤化物、α-卤代酰基和吡啶二硫化物为硫醇反应性基团。马来酰亚胺、烷基和酰基卤化物和α-卤代酰基与巯基反应以形成硫醇醚键，而吡啶基二硫化物与巯基反应以产生混合型二硫化物。吡啶基二硫化物产物为可裂解的。亚氨酸酯也非常适用于蛋白质-蛋白质交联。多种异双官能交联剂可商购获得，其各自将成功缀合的不同属性组合。
抗-CTLA-4抗体的治疗性用途
还提供用于使用本文所公开的分离抗体或其抗原结合片段(例如抗体27A及其人源化形式)治疗有需要的受试者(包括人受试者)的方法。在本发明的一个实施方案中，此受试者罹患感染或感染性疾病。在本发明的另一个实施方案中，此受试者罹患癌症。在一个实施方案中，该癌症为例如骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、Wilm氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈部癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外皮肿瘤、成神经管母细胞瘤、星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、脉络膜丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本发明的一个实施方案中，该癌症为例如上文所述的种类的转移癌。
在一个实施方案中，本发明提供用于使用本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)治疗受试者的方法，其中该受试者罹患病毒感染。在一个实施方案中，病毒感染为被选自由以下各项组成的组的病毒感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦巴尔病毒)、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或虫媒病毒脑炎病毒。
在一个实施方案中，本发明提供用于使用本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中该受试者罹患细菌感染。在一个实施方案中，细菌感染为被选自由以下各项组成的组的细菌感染：砂眼衣原体、立克次体细菌(诸如埃立克体属、东方体属和立克次氏体)、分枝杆菌(诸如麻风分枝杆菌或弥漫型麻疯分枝杆菌)、葡萄球菌属(诸如金黄色葡萄球菌)、链球菌、肺炎双球菌、脑脊髓膜炎菌和淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、杆菌、霍乱弧菌、破伤风梭菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、流感嗜血杆菌、放线菌、细螺旋体、密螺旋体、志贺氏杆菌、鹦鹉热衣原体和包柔氏螺旋体。
在一个实施方案中，本发明提供用于使用本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中该受试者罹患真菌感染。在一个实施方案中，真菌感染为被选自由以下各项组成的组的真菌感染：假丝酵母属(白色念珠菌、克鲁斯假丝酵母、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新型隐球菌、曲霉属(烟曲霉菌、黑曲霉等)、毛霉菌目(毛霉菌属、犁头霉属、根霉菌属)、申克氏胞丝菌、皮炎芽生菌、巴西芽生菌、粗球孢子菌和荚膜组织胞浆菌。
在一个实施方案中，本发明提供用于使用本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中该受试者罹患寄生虫感染。在一个实施方案中，寄生虫感染为被选自由以下各项组成的组的寄生虫感染：痢疾阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏耐格里变形虫、棘阿米巴属、氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、卡氏肺孢子虫、间日疟原虫、微小巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫和巴西日圆线虫。
“受试者”可为哺乳动物，诸如人、狗、猫、马、牛、小鼠、大鼠、猴(食蟹猴(Macacafascicularis/cynomolgus monkey))或兔。在本发明的优选实施方案中，该受试者是人受试者。
在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物与其他抗体分子、STING激动剂、化学疗法、其他抗癌疗法(例如，靶向抗癌疗法、基因疗法、病毒疗法、RNA疗法骨髓移植、纳米疗法(nanotherapy)或溶瘤药)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法(例如，细胞因子或基于细胞的免疫疗法)、手术程序(例如，乳房肿瘤切除术或乳房切除术)或辐射程序、或前述任一种的组合中的一种或多种一起施用。额外疗法可呈辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，额外疗法为酶抑制剂(例如，小分子酶抑制剂)或转移抑制剂。可以组合施用的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、蒽环类、长春花生物碱、插入剂、能够干扰信号转导通路的剂、促进细胞凋亡的剂、蛋白体抑制剂和辐射(例如局部或全身照射(例如γ照射))。在其他实施方案中，额外疗法为手术或辐射或其组合。在其他实施方案中，额外疗法为靶向PI3K/AKT/mTOR通路、HSP90抑制剂或微管蛋白抑制剂中的一种或多种的疗法。可替代地或与上述组合的组合，本文所述的方法和组合物可以与以下一种或多种组合施用：免疫调节剂(例如，共刺激分子的活化剂或抑制分子的抑制剂，例如免疫检查点分子)；疫苗，例如治疗性癌症疫苗；或者其他形式的细胞免疫疗法。
在特定实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)可以单独或者与其他另外的治疗剂和/或治疗程序组合用于治疗或预防需要此治疗或预防的受试者中的任何疾病，诸如癌症，例如，如本文所讨论的。包含药学上可接受的载体、包含此类抗体与其他治疗剂的组合的组合物，例如药物组合物也是本发明的一部分。
在特定实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以单独使用或与肿瘤疫苗组合使用。
在特定实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以单独使用或与化学治疗剂组合使用。
在特定实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以单独使用或与辐射疗法组合使用。
在特定实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以单独使用或与靶向疗法组合使用。靶向疗法的实例包括：激素疗法、信号转导抑制剂(例如，EGFR抑制剂，诸如西妥昔单抗(Erbitux)和埃罗替尼(Tarceva))；HER2抑制剂(例如，曲妥单抗(Herceptin)和帕妥珠单抗(Perjeta))；BCR-ABL抑制剂(诸如伊马替尼(Gleevec)和达沙替尼(Sprycel))；ALK抑制剂(诸如克里唑蒂尼(Xalkori)和色瑞替尼(Zykadia))；BRAF抑制剂(诸如维莫非尼(Zelboraf)和达拉菲尼(Tafinlar))、基因表达调节剂、细胞凋亡诱导剂(例如，硼替佐米(Velcade)和卡非佐米(Kyprolis))、血管生成抑制剂(例如，贝伐单抗(Avastin)和雷莫芦单抗(Cyramza)、附接至毒素的单克隆抗体(例如，本妥昔单抗(brentuximab vedotin,Adcetris)和ado曲妥珠单抗(ado-trastuzumabemtansine,Kadcyla))。
在特定实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以与抗癌治疗剂或或免疫调节药诸如免疫调节受体抑制剂，例如特异性结合受体的抗体或其抗原结合片段组合使用。
因此，本发明包括包含本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)与以下PD-1/PD-L1阻断抗体中的一种或多种的组合的组合物：派姆单抗、纳武单抗、皮地珠单抗(pidilizumab)、REGN2810、MEDI-0680、PDR-001、SHR-1210、BGB-A317、PF-06801591、TSR-042、atezoluzimab、度伐单抗、BMS-936559；以及用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段和派姆单抗、纳武单抗、皮地珠单抗、REGN2810中的一种或多种。任选地，还向受试者施用另一种治疗剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)与编码派姆单抗的重链和轻链的分离抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)与编码纳武单抗的重链和轻链的分离抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)与以下一种或多种结合：抗-PD1抗体(例如，派姆单抗、纳武单抗、皮地珠单抗(CT-011))、抗-PDL1抗体、抗-TIGIT抗体、抗-CD27抗体、抗-CS1抗体(例如，埃罗妥珠单抗)、抗-KIR2DL1/2/3抗体(例如，利利单抗(lirilumab))、抗-CD137抗体(例如，优瑞鲁单抗(urelumab))、抗-GITR抗体(例如，TRX518)、抗-PD-L1抗体(例如，BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗-PD-L2抗体、抗-ILT1抗体、抗-ILT2抗体、抗-ILT3抗体、抗-ILT4抗体、抗-ILT5抗体、抗-ILT6抗体、抗-ILT7抗体、抗-ILT8抗体、抗-CD40抗体、抗-OX40抗体、抗-ICOS、抗-SIRPα、抗-KIR2DL1抗体、抗-KIR2DL2/3抗体、抗-KIR2DL4抗体、抗-KIR2DL5A抗体、抗-KIR2DL5B抗体、抗-KIR3DL1抗体、抗-KIR3DL2抗体、抗-KIR3DL3抗体、抗-NKG2A抗体、抗-NKG2C抗体、抗-NKG2E抗体、抗-4-1BB抗体(例如，PF-05082566)、抗-TSLP抗体、抗-IL-10抗体、抗-APRIL(例如BION1301)、抗-CD38(达雷木单抗)、抗-IL-10或聚乙二醇化IL-10、或此类靶标的任何小有机分子抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-PD1抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-PDL1抗体(例如，BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-CD27抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-CS1抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR2DL1/2/3抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-CD137(例如，优瑞鲁单抗)抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-GITR(例如，TRX518)抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-PD-L2抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL1抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL2抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL3抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL4抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL5抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL6抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL7抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ITL8抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-CD40抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-OX40抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR2DL1抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR2DL2/3抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR2DL4抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR2DL5A抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR2DL5B抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR3DL1抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR3DL2抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-KIR3DL3抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-NKG2A抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-NKG2C抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-ICOS抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-SIRPα抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-4-1BB抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-IL-10抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗-TSLP抗体结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与IL-10或聚乙二醇化IL-10结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTKLA-4抗体或其抗原结合片段与优选作为药物组合物的一部分的Tim-3通路拮抗剂结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与优选作为药物组合物的一部分的Vista通路拮抗剂结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与优选作为药物组合物的一部分的BTLA通路拮抗剂结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与优选作为药物组合物的一部分的LAG-3通路拮抗剂结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与优选作为药物组合物的一部分的TIGIT通路拮抗剂结合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与优选作为药物组合物的一部分的STING激动剂结合。环状-二-核苷酸(CDN)环状-二-AMP(由单核细胞增多性李斯特氏菌和其他细菌产生)及其类似物环状-二-GMP和环状-GMP-AMP被宿主细胞识别为病原体相关分子模式(PAMP)，其结合至称为干扰素基因刺激物(STING)的病原体识别受体(PRR)。STING为宿主哺乳动物细胞的细胞质中的衔接蛋白，该蛋白质活化TANK结合激酶(TBK1)—IRF3和NF-κB信号传导轴，引起对IFN-β和强烈活化先天性免疫的其他基因产物的诱导。现在认识到，STING为宿主胞质监测通路的组分(Vance等人,2009)，其感测细胞内病原体的感染并且在响应中诱导IFN-β的产生，从而引起由抗原特异性CD4+和CD8+T细胞以及病原体特异性抗体组成的适应保护性病原体特异性免疫响应的发展。环状嘌呤二核苷酸的实例详细描述于例如：美国专利7,709458和7,592,326；专利申请WO2007/054279、WO2014/093936和WO2014/189805；以及Yan等人,Bioorg.Med.Chem Lett.18:5631(2008)。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段增加了免疫细胞的活性。免疫细胞的活性的增加可以使用本领域已知的任何方法来检测。在一个实施方案中，免疫细胞的活性的增加可以通过测量免疫细胞的增殖来检测。例如，T细胞的活性的增加可以通过测量T细胞的增殖或信号转导事件(诸如将信号传输至转录调节因子的免疫受体或下游激酶的酪氨酸磷酸化)来检测。在其他实施方案中，免疫细胞的活性的增加可以通过测量特异性靶细胞上的CTL或NK细胞毒性功能或IFNγ细胞因子响应来检测，这些功能或响应与抗肿瘤免疫的刺激相关联。在其他实施方案中，免疫细胞的活性的增加可以通过测量来源于受试者的样品中的离体T细胞活化来检测。在一个实施方案中，T细胞活性的增加通过以下各项来确定：(i)测量选自由以下各项组成的组的一种或多种促炎性细胞因子的SEB(葡萄球菌肠毒素B)诱导的产生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13；或者(ii)测量T细胞受体(TCR)信号传导诱导选自由以下各项组成的组的细胞因子的产生的混合型淋巴细胞反应或直接抗-CD3mAb刺激：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13。在某些实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段将刺激IL-2和/或IFNγ的抗原特异性T细胞产生和/或CD25和/或CD69的上调至少1.5倍。在某些实施方案中，当这些被呈递至表达CD80和CD86的Raji细胞以产生选自由以下各项组成的组的促炎性细胞因子时：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段将刺激CD3+T细胞。
有利于引起溶细胞T细胞响应的额外的剂可以与本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段组合使用。这些抗体包括但不限于B7共刺激分子、白介素-2、干扰素-γ、GM-CSF、PD-1拮抗剂、OX-40/OX-40配体、CD40/CD40配体、沙格司亭、左旋咪唑、牛痘病毒、卡介苗(BCG)、脂质体、明矾、弗氏完全或不完全佐剂、解毒木糖醇、矿物油、表面活性物质诸如脂质卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、以及油或烃类乳液。
用于诱导T细胞免疫响应并对比抗体响应优先刺激溶细胞T细胞响应的组合物为优选的，尽管也可以使用刺激两种类型的响应的组合物。在该剂为多肽的情况下，可以施用多肽本身或编码该多肽的多核苷酸。载体可以是细胞，诸如抗原呈递细胞(APC)或树突状细胞。抗原呈递细胞包括诸如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞的细胞类型。其他专业抗原呈递细胞包括单核细胞、边缘区枯否细胞、小胶质细胞、朗格汉斯细胞、指状突树突状细胞、滤泡树突状细胞和T细胞。也可以使用兼性抗原呈递细胞。兼性抗原呈递细胞的实例包括星形胶质细胞、卵泡细胞、内皮细胞和成纤维细胞。
组合物可包含被转化以表达多肽或递送随后在疫苗接种个体的细胞中表达的多核苷酸的细菌细胞。可以添加佐剂诸如氢氧化铝或磷酸铝以增加疫苗引发、增强或延长免疫响应的能力。
组合物可包含被转化以表达多肽或递送随后在疫苗接种个体的细胞中表达的多核苷酸的细菌细胞。许多细菌物种已被开发用作疫苗并且可以用作本发明中的疫苗平台，包括但不限于弗氏志贺菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌或分枝杆菌属。此列表并不意味着为限制性的。本发明涵盖减轻、共生和/或杀灭但有代谢活性的细菌菌株作为疫苗平台的用途。在优选的实施方案中，细菌为单核细胞增多性李斯特氏菌。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与灭活的肿瘤细胞疫苗。“灭活的肿瘤细胞疫苗”意指已被处理以预防细胞分裂的肿瘤细胞(患者“自体”或“同种异体”)。出于本发明的目的，此类细胞保留其免疫原性及其代谢活性。此类肿瘤细胞被遗传修饰以表达在患者内作为癌症疗法的一部分表达的转基因。因此，本发明的组合物或疫苗包括经历治疗的患者自体或同种异体的瘤(例如肿瘤)细胞并且最优选为与影响患者的类型相同的一般类型的肿瘤细胞。例如，将典型地向罹患黑素瘤的患者施用来源于黑素瘤的遗传修饰的细胞。用于灭活肿瘤细胞以用于本发明中(诸如使用辐射)的方法为本领域已熟知的。
在一些实施方案中，本发明的灭活肿瘤细胞被修饰以表达并分泌一种或多种热休克蛋白。例如，gp96-Ig融合蛋白可以被表达并分泌以刺激免疫响应(Yamazaki等人,TheJournal of Immunology,1999,163:5178-5182；Strbo等人,Immunol Res.2013Dec；57(1-3):311-25)。在一些实施方案中，灭活的肿瘤细胞被修饰以表达并分泌gp96-Ig融合蛋白。
本发明的灭活肿瘤细胞与一种或多种共刺激分子或剂一起施用至患者。优选的共刺激剂包括刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子。用于评估此类共刺激剂的方法为文献中已熟知的。DC的诱导和成熟典型通过在刺激之后某些膜分子诸如CD80和CD86的表达和/或促炎性细胞因子诸如IL-12和I型干扰素的分泌增加来评估。
在优选的实施方案中，灭活的肿瘤细胞本身被修饰以表达并分泌一种或多种细胞因子，该细胞因子刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟。本发明以关于GM-CSF的使用的示例性术语描述。因此，通过实例，肿瘤细胞可以表达编码GM-CSF的转基因，如美国专利号5,637,483、5,904,920、6,277,368和6,350,445以及美国专利公布号20100150946中所述的。用于治疗胰腺癌的表达GM-CSF的遗传修饰的癌细胞或“表达细胞因子的细胞疫苗”的形式描述于美国专利号6,033,674和5,985,290中。
可由此类灭活的肿瘤细胞和/或旁邻细胞表达的代替GM-CSF或与其一起的其他适合细胞因子包括但不限于CD40配体、FLT-3配体、IL-12、CCL3、CCL20和CCL21中的一种或多种。此列表并不意味着为限制性的。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与旨在刺激对一个或多个预定抗原的免疫响应一种或多种疫苗结合施用。抗原可以直接施用至个体或者在个体内从例如可为自体或同种异体的肿瘤细胞疫苗(例如GVAX)、树突状细胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、基于病毒的疫苗、细菌或酵母疫苗(例如，单核细胞增多性李斯特氏菌或酿酒酵母)等表达。参见例如Guo等人,Adv.Cancer Res.2013；119:421–475；Obeid等人,Semin Oncol.2015年8月；42(4):549–561。可用于本发明中的靶抗原的实例列出在以下表中。靶抗原也可以是包含该表中所列出的抗原的免疫活性部分的片段或融合多肽。此列表并不意味着为限制性的。
表4.与本发明的如本文所述的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段组合使用的抗原的列表
适合的抗原为本领域已知的其他生物体包括但不限于沙眼衣原体、酿脓链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌肺炎、金黄色酿脓葡萄球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、淋病奈瑟氏菌、霍乱弧菌、沙门氏菌属某种(包括伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)、肠道沙门菌(包括幽门螺杆菌弗氏志贺菌和其他D组志贺氏杆菌属某种)、鼻疽伯克霍德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌、肺炎克雷伯菌、梭菌属某种(包括艰难梭菌)、副溶血弧菌和创伤弧菌。此列表并不意味着为限制性的。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与诸如以下各项的抑制剂中的一种或多种(例如，小有机分子或抗体或其抗原结合片段)结合：MTOR(雷帕霉素哺乳动物靶标)抑制剂、细胞毒素剂、铂剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、微管稳定剂、紫杉烷、CD20抑制剂、CD52抑制剂、CD30抑制剂、RANK(核因子κ-B的受体活化剂)抑制剂、RANKL(核因子κ-B配体的受体活化剂)抑制剂、ERK抑制剂、MAP激酶抑制剂、AKT抑制剂、MEK抑制剂、PI3K抑制剂、HER1抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、Bcl2抑制剂、CD22抑制剂、CD79b抑制剂、ErbB2抑制剂或法呢基蛋白转移酶抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与以下一种或多种结合：13-顺式-视黄酸、3-[5-(甲基磺酰哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、4-羟基它莫西芬、5-脱氧尿苷、5'-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、7-羟基十字孢碱、A-443654、醋酸阿比特龙、白蛋白结合型紫杉醇、ABT-578、阿考比芬、ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺、氨磷汀、氨鲁米特、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、血管抑素、AP-23573、ARQ-197、阿佐普芬、AS-252424、AS-605240、天冬酰胺酶、AT-9263、阿曲生坦、阿西替尼、AZD1152、卡介苗(BCG)疫苗、巴他布林(batabulin)、BC-210、besodutox、贝伐单抗、比卡鲁胺、Bio111、BIO140、博来霉素、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米、乙基酰胺、白消安、钙三醇、喜树碱、卡奈替尼、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、CC8490、西地尼布、CG-1521、CG-781、衣原体、苯丁酸氮芥、氯毒素、西仑吉肽、西咪替丁、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、COL-3、CP-724714、环磷酰胺、环丙孕酮、醋酸环丙孕酮、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、达卡巴嗪、达西司特、更生霉素、达洛妥珠单抗(dalotuzumab)、达鲁舍替、达沙替尼(dasatanib)、道诺霉素、德卡坦尼(decatanib)、鱼藤素、地尼白介素(denileukin)、脱氧助间型霉素、缩酚酸肽、二芳基丙腈、二乙基已烯雌酚、融合毒素(diftitox)、多西他赛、多韦替尼、阿霉素、屈洛昔芬、伊朵堤卡林(edotecarin)、钇-90标记的依多曲肽、依多曲肽、EKB-569、EMD121974、内皮抑素、恩杂鲁胺、泽兰素(enzastaurin)、表柔比星、爱波喜龙(epithilone)B、ERA-923、爱必妥、埃罗替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、芬克拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、非那雄胺、黄酮吡醇、氟尿苷、氟达拉滨、氟氢化可的松、氟甲睾酮、氟他胺、FOLFOX方案、氟维司群、高丽酮(galeterone)、吉非替尼、吉西他滨、吉马替康、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、棉子酚、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、羟孕酮己酸酯、羟基脲、IC87114、伊达比星、依达氧芬(idoxyfene)、异环磷酰胺、IM862、伊马替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干扰素、白介素-12、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊立替康、JNJ-16241199、酮康唑、KRX-0402、拉帕替尼、拉索昔芬、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体包埋紫杉醇、洛莫司汀、洛那法尼、甲硫恩酮、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、马马司他、二氯甲基二乙胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽酮、陶扎色替、MLN8054、癌立消、来那替尼、neuradiab、尼罗替尼、nilutimide、洛拉曲塞、NVP-BEZ235、奥利默森(oblimersen)、奥曲肽、奥法木单抗、奥戈伏单抗(oregovomab)、orteronel、奥沙利铂、紫杉醇、帕博西尼、帕米磷酸盐、帕尼单抗、帕唑帕尼、PD0325901、PD184352、PEG-干扰素、培美曲塞、喷司他丁、哌立福辛、丙氨酸氮芥、PI-103、pictilisib、PIK-75、哌喷昔芬(pipendoxifene)、PKI-166、普卡霉素、卟吩姆钠、强的松、甲苄肼、孕酮、PX-866、R-763、雷洛昔芬、雷替曲塞、丙二胺四乙酰亚胺(razoxin)、地磷莫司、利妥昔单抗、罗米地辛、RTA744、鲁比替康、scriptaid、Sdx102、塞利西利(seliciclib)、司美替尼、司马沙尼、SF1126、西罗莫司、SN36093、索拉非尼、安体舒通、角鲨胺、SR13668、链脲菌素、SU6668、辛二酞基苯胺异羟肟酸、舒尼替尼、合成雌激素、他仑帕奈、talimogene laherparepvec、他莫西芬、替莫唑胺、西罗莫司脂化物(temsirolimus)、替尼泊苷、替米利芬、睾酮、粉防己碱、TGX-221、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、替昔木单抗(ticilimumab)、替吡法尼、替沃扎尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、拓扑替康、枸橼酸托瑞米芬、曲贝替定、曲妥珠单抗、维甲酸、曲古抑菌素A、一水合磷酸曲西瑞宾、双羟萘酸曲普瑞林、TSE-424、乌拉莫司汀(uracil mustard)、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、瓦他拉尼、VEGF trap、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、维他新(vitaxin)、维特斯潘(vitespan)、伏立诺他、VX-745、渥曼青霉素、Xr311、扎木单抗、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与一种或多种止吐药结合，该止吐药包括但不限于：卡索匹坦(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(MGI-Helsinn)和其他NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(由MGIPharma作为Aloxi销售)、阿瑞匹坦(由Merck and Co.作为Emend销售；Rahway,NJ)、苯海拉明(由Pfizer作为销售；New York,NY)、羟嗪(由Pfizer作为销售；NewYork,NY)、甲氧氯普胺(由AH Robins Co作为销售；Richmond,Va)、氯羟去甲安定(由Wyeth作为销售；Madison,NJ)、阿普唑仑(由Pfizer作为销售；NewYork,NY)、氟哌啶醇(由Ortho-McNeil作为销售；Raritan,NJ)、氟哌利多屈大麻酚(由Solvay Pharmaceuticals有限公司作为销售；Marietta,GA)、地塞米松(由Merck公司作为销售；Rahway,NJ)、甲基强的松龙(由Pfizer作为销售；New York,NY)、普鲁氯嗪(由Glaxosmithkline作为销售；Research Triangle Park,NC)、格拉司琼(由Hoffmann-La Roche有限公司作为销售；Nutley,NJ)、昂丹司琼(由Glaxosmithkline作为销售；Research Triangle Park,NC)、多拉司琼(由Sanofi-Aventis公司作为销售；New York,NY)、托烷司琼(由Novartis作为销售；East Hanover,NJ)。
癌症治疗的其他副作用包括红血细胞和白雪细胞缺乏症。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与治疗或预防此缺乏症的剂结合，该剂诸如非格司亭、PEG-非格司亭、红细胞生成素、重组人红细胞生成素或阿法达贝泊汀。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与抗癌辐射疗法结合施用。例如，在本发明的一个实施方案中，辐射疗法为外照射疗法(EBT)：一种用于将高能X-射线束递送至肿瘤位置的方法。该束在患者体外生成(例如通过线性加速器)并且靶向肿瘤部位。这些X-射线破坏癌细胞并且仔细治疗计划允许不伤害周围正常细胞。在患者体内未放置放射性源。在本发明的一个实施方案中，放射疗法为质子束疗法：用质子代替X-射线轰击患病组织的适形治疗类型。在本发明的一个实施方案中，放射疗法为适形外粒子束辐射疗法：使用先进技术为个体身体结构定制辐射疗法的程序。在本发明的一个实施方案中，辐射疗法为短程疗法：将放射性材料短时间放置于身体内，通常用于向区域施用额外剂量或大量辐射。
在本发明的一个实施方案中，可以与本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)结合应用的手术程序为外科肿瘤切除术。
术语“与...结合”是指在本发明的方法中施用的组分(例如，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)连同派姆单抗)可以配制成用于同时递送的单一组合物或单独配制成两种或更多种组合物(例如，药盒)。每种组分可以在与施用另一种组分时不同的时间向受试者施用；例如，每次施用可以在给定时间段内在若干间隔时不同时(例如，单独或依次)施用。此外，单独组分可以通过相同或不同路径施用至受试者。
实验和诊断使用
本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)可以用作亲和纯化剂。在此过程，使用本领域已熟知的方法将抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段固定在固相诸如交联葡聚糖、玻璃或琼脂树脂或滤纸上。将固定的抗体或片段与含有待纯化的CTLA-4蛋白(或其片段)的样品接触，并且之后用适合溶剂洗涤支撑物，这将去除样品中除结合至固定抗体或片段的CTLA-4蛋白之外的基本上全部的材料。最终，用洗脱结合的CTLA-4(例如蛋白A)的溶剂洗涤支撑物。此类固定的抗体和片段形成本发明的一部分。
还提供用于生成适用于例如执行蛋白质印迹和本文所讨论的其他测定的二抗的抗原。
抗-CTLA-4抗体(例如，人源化抗体)及其抗原结合片段也可适用于CTLA-4蛋白的诊断测定中，例如检测其在特定细胞、组织或血清，例如肿瘤细胞，诸如黑素瘤细胞中的表达。此类诊断方法可适用于各种疾病诊断。
本发明包括结合本文所公开的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)的使用的ELISA测定(酶联免疫吸附测定)。
例如，此方法包括以下步骤：
(a)用抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段涂覆基底(例如，微量滴定板孔例如塑料板的表面)；
(b)将待测试CTLA-4的存在的样品应用至基底；
(c)洗涤该板，使得样品中未结合的材料被去除；
(d)还施加对CTLA-4抗原有特异性的可检测标记的抗体(例如，酶联抗体)；
(e)洗涤该基底，使得未结合的标记的抗体被去除；
(f)如果标记的抗体为酶联的，则施加由酶转化为荧光信号的化学物；以及
(g)检测标记的抗体的存在。
检测到与基底缔合的标记指示CTLA-4蛋白的存在。
在另一个实施方案中，将标记的抗体或其抗原结合片段用过氧化物酶标记，该过氧化物酶与ABTS(例如，2,2'-联氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸))或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺反应以产生可检测的颜色变化。或者，将标记的抗体或片段用可检测的放射性同位素(例如，3H)标记，该同位素可以在闪烁体存在下通过闪烁计数器检测。
本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)可以用于蛋白质印迹或免疫蛋白质印迹程序中。此程序形成本发明的一部分并且包括例如：
(1)任选地使用本领域已知的方法(例如，半干印迹或坦克印迹)将来自待测试CTLA-4的存在的样品的蛋白质(例如通过对样品中的蛋白质进行PAGE或SDS-PAGE电泳分离)转移至膜或其他固体基底；将待测试结合CTLA-4或其片段的存在的该膜或其他固体基底与本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触。
此膜可以采用已转移有(例如，在凝胶中电泳分离之后)测试CTLA-4在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中的存在的蛋白质的硝基纤维素或乙烯基(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF))膜的形式。在将该膜与抗-CTLA-4抗体或片段结合之前，任选地例如用非脂肪干乳或类似物阻断该膜，以便结合该膜上的非特异性蛋白质结合位点。
(2)将该膜洗涤一次或多次以去除未结合的抗-CTLA-4抗体或片段和其他未结合的物质；以及
(3)检测结合的抗-CTLA-4抗体或片段。
检测到结合的抗体或片段指示CTLA-4蛋白存在于该膜或基底上并存在于样品中。结合的抗体或片段的检测可以通过将抗体或片段与可检测标记的二抗(抗免疫球蛋白抗体)结合并且然后检测该二抗的存在来进行。
本文所公开的抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以用于免疫组织化学中。此方法形成本发明的一部分并且包括例如：
(1)将待测试CTLA-4蛋白的存在的细胞(例如，肿瘤细胞，诸如黑素瘤细胞)与本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触；以及
(2)检测细胞上或细胞内的抗体或片段。
如果抗体或片段本身为可检测标记的，则可以直接检测它。或者，抗体或片段可以通过检测的可检测标记的二抗结合。
本文所公开的某些抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)也可以用于体内肿瘤成像。此方法可包括将放射性标记的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段注射到待检测与CTLA-4表达相关的肿瘤(例如，在肿瘤浸润性淋巴细胞上表达CTLA-4)的存在的患者身体内，随后对患者的身体进行核成像以例如在包含高浓度的结合至肿瘤的抗体或片段的位点处检测标记的抗体或片段的存在。检测到位点指示肿瘤中CTLA-4+细胞的存在。
成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层扫描)或PET成像(正电子放射断层造影术)。标记包括例如碘-123(123I)和锝-99m(99mTc)，例如与SPECT成像结合，或者11C、13N、15O或18F，例如与PET成像或铟-111结合(参见例如Gordon等人,(2005)InternationalRev.Neurobiol.67:385-440)。
药物组合物和施用
为了制备本发明的抗-CTLA-4抗体及其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)的药物或无菌组合物，将该抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合为例冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式中来制备(参见例如Hardman等人(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(编辑)(1993)PharmaceuticalDosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
单独或与另一种治疗剂组合施用的本发明的抗体的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定，例如该程序用于测定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数(LD50/ED50)。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于配制一系列用于在人中使用的剂量。此类化合物的剂量优选地处于循环浓度的范围内，包括几乎不具有或不具有毒性的ED50。该剂量可在此范围内根据所采用的剂型和施用路径来改变。
在另一个实施方案中，另一种治疗剂根据Physicians'Desk Reference 2003(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))与本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)结合施用至受试者。
施用模式可以改变。施用模式包括口服、直肠、跨粘膜、肠内、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。
在特定实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以通过侵入性路径诸如通过注射来施用。在本发明的另一个实施方案中，抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段或其药物组合物静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、肿瘤内施用或通过吸入、气雾剂递送施用。通过非侵入性路径施用(例如，口服；例如，以丸剂、胶囊或片剂形式)也处于本发明的范围内。
本发明提供一种容器(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱、中空针或注射器圆筒)，该容器包含本发明的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)或其药物组合物中的任一种。本发明还提供一种注射装置，该注射装置包含本发明的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)或药物组合物中的任一种。注射装置为将经由胃肠外路径，例如肌肉内、皮下或静脉内将物质引入到患者身体中的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预先填充有药物组合物，诸如自动注射器)，其例如包括用于保持待注射的流体(例如，抗体或其片段或医药组合物)的圆筒或圆管、用于刺穿皮肤和/或血管以用于注射流体的针；以及用于将流体推出圆筒并通过针孔的活塞。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的注射装置是静脉内(IV)注射装置。此装置在附接至用于保持流体(例如盐水；或包含NaCl、乳酸钠、KCl、CaCl2并任选地包含葡萄糖的乳酸钠林格注射液)的袋或储器的插管或套管针/针中包括抗体或其片段或药物组合物，该流体通过该插管或套管针/针引入到患者体内。在本发明的一个实施方案中，一旦套管针和插管插入到受试者静脉中并将套管针从插入的插管中去除，就可将抗体或其片段或药物组合物引入到装置中。IV装置可以例如插入到外周静脉(例如，在手或臂中)；上腔静脉或下腔静脉或心脏右心房内(例如，中枢)；或者插入到锁骨下静脉、颈内静脉或股静脉中，并且例如向心脏推进，直到其到达上腔静脉或右心房(例如，中心静脉导管)。在本发明的一个实施方案中，注射装置为自动注射器；喷射注射器或外部输液泵。喷射注射器使用液体高压窄喷嘴，该液体渗透上皮将抗体或其片段或药物组合物引入到患者身体内。外部输液泵为将抗体或其片段或药物组合物以受控量递送到患者身体中的医疗装置。外部输液泵可以电力或机械供能。不同泵以不同方式运行，例如注射泵在注射器储器中保持流体，并且可移动活塞控制流体递送，弹性泵在可伸展气球储器中保持流体，并且来自气球的弹性壁的压力驱动流体递送。在蠕动泵中，一组滚筒在柔性管长度上向下拧紧，推动流体向前。在多通道泵中，流体可从多个储器中以多个速率递送。
本文所公开的药物组合物可以使用无针皮下注射装置施用；诸如美国专利号6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。包含药物组合物的此类无针装置也为本发明的一部分。本文所公开的药物组合物也可以通过输液来施用。用于施用药物组合物的熟知植入物和模块的实例包括以下各项中所公开的那些：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微量输液泵；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输液速率递送药物的药物输液泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量可植入输液装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔室隔室的渗透性药物递送系统。许多其他此类植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所熟知的并且包含本发明的药物组合物的那些处于本发明的范围内。
或者，可以局部方式而非全身性方式，例如经由将抗体或片段直接注射到肿瘤中来施用本发明的抗-CTLA-4抗体或抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)。另外，可以靶向药物递送系统，例如以用靶向例如肿瘤(例如由免疫病理学表征)的组织特异性抗体涂覆的脂质体来施用该抗体或片段。脂质体将靶向受累组织并且被该受累组织选择性摄取。此类方法和脂质体为本发明的一部分。
施用方案取决于若干种因素，包括治疗性抗体或抗原结合片段的血清或组织转换率、症状的水平、治疗性抗体的免疫原性以及靶细胞在生物基质中的易接近。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体或片段以实现靶向疾病状态中的改进，同时使不希望的副作用最小化。因此，所递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体和正在治疗的病状的严重性。选择适当剂量的治疗性抗体或片段的指导为可用的(参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
适当剂量的确定由临床医生，例如使用现有技术已知或怀疑影响治疗的参数或因素来进行。通常，剂量以稍微小于最佳剂量的量开始并且之后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用实现希望的或最佳的作用。重要的诊断测量包括例如炎性症状的那些或所产生的炎性细胞因子的水平。一般而言，希望将使用的生物制剂来源于与靶向治疗的动物相同的物种，从而使对试剂的任何免疫响应最小化。在人受试者的情况下，例如，人源化和完全人抗体可以是期望的。
本文所公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以通过连续输液或通过所施用的剂量来提供，例如每日一次、每周1-7次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每季一次、每半年一次、每年一次等。剂量可以例如静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、直肠、肌肉内、大脑内、脊柱内或通过吸入来提供。总每周剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多(参见例如，Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:151-144)。还可以提供剂量以实现抗-CTLA-4抗体在受试者血清中的预定靶向浓度，诸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更大。在其他实施方案中，本发明的抗-CTLA-4抗体例如皮下或静脉内，基于每周一次、每两周一次、“每4周一次”、每月一次、每两月一次或每季一次，以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者来施用。
如本文所用，术语“有效量”是指本发明的抗-CTLA-4或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)当单独施用或与另一种治疗剂组合施用至细胞、组织或受试者时有效引起疾病例如癌症的一种或多种症状或癌症进展的可测量改进的量。有效剂量还是指抗体或片段足以引起症状的至少部分减轻，例如肿瘤收缩或消除、肿瘤生长缺乏、存活时间增加的量。当应用于单独施用的个体活性成分时，有效剂量是指该单独的成分。当应用于组合时，有效剂量是指活性成分无论是连续或同时组合施用时引起治疗性作用的组合量。治疗剂的有效量将引起诊断测量值或参数改进至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，以及最优选至少50％。有效量也可引起在使用主观测量评估疾病严重性的情况下主观测量的改进。
药盒
还提供包含一种或多种组分的药盒，这些组分包括但不限于如本文所讨论的抗-CTLA-4抗体或抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)与一种或多种额外组分的结合，这些额外组分包括但不限于如本文所讨论的药学上可接受的载体和/或治疗剂。抗体或片段和/或治疗剂可配制为纯组合物或与药学上可接受的载体组合配制为药物组合物。
在一个实施方案中，该药盒包括一个容器(例如无菌玻璃或塑料小瓶)中的本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A或其人源化形式)及其药物组合物和/或另一个容器(例如，无菌玻璃或塑料小瓶)中的治疗剂。
在另一个实施方案中，药盒包括本发明的组合，包括本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，人源化27A)连同药学上可接受的载体，任选地与配制在一起的一种或多种治疗剂的组合，任选地在药物组合物中，在单一常见容器中。
如果药盒包括用于胃肠外施用至受试者的药物组合物，则该药盒可包括用于执行此施用的装置。例如，药盒可包括如上文所讨论的一个或多个皮下针或其他注射装置。
该药盒可包括包装说明书，该说明书包括关于药盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息帮助患者和医生有效且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，关于本发明的组合的以下信息可以在说明书中提供：药代动力学、药效动力学、临床研究、功效参数、适应症和使用、禁忌症、警告、措施、不良反应、过剂量、适当的剂量和施用、供应方式、适当的储存条件、参考文献、制造商/经销商信息和专利信息。
检测药盒和治疗药盒
为了方便起见，本发明的抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段(例如，抗体27A及其人源化形式)可以提供于药盒中，即预定量的试剂的包装组合和用于执行诊断或检测测定的说明书。在抗体或片段被酶标记的情况下，药盒将包含底物和酶所需要的辅酶因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包含其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如，阻断缓冲液或裂解缓冲)等。各种试剂的相对量可以广泛地改变以提供基本上优化测定的敏感性的试剂溶液中的浓度。具体而言，这些试剂可以作为干燥粉末，通常为冻干粉末提供，包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
还提供诊断或检测试剂以及包含用于各种检测测定中的一种或多种此类试剂的药盒，这些检测测定包括例如免疫测定诸如ELISA(夹心型或竞争性形式)。当使用药盒时，药盒的组分可以预先附接至固体支撑物或者可以应用于固体支撑物的表面。在本发明的一些实施方案中，在使用之前，信号生成方式可能与本发明的抗体或片段预先缔合或者可能需要与一种或多种组分，例如缓冲液、抗体-酶缀合物、酶底物等组合。药盒还可包括额外试剂，例如用于减少与固相表面的非特异性结合的阻断试剂、洗涤试剂、酶底物等。固相表面可以是呈管、珠粒、微量滴定板、微球体或适用于固定蛋白质、肽或多肽的其他材料的形式。在特定方面中，催化化学发光或发色产物的形成或化学发光或发色底物的减少的酶为信号生成方式的组成。此类酶为本领域所熟知的。药盒可包含本文所述的捕获剂和检测试剂中的任一种。任选地，药盒还可以包括用于执行本发明的方法的说明书。
还提供一种药盒，该药盒包含封装在容器诸如小瓶或瓶中的抗-CTLA-4抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段并且还包含附接至容器或封装在容器内的标记，该标记描述了容器的内含物并且提供关于使用容器的内含物治疗如本文所述的一种或多种疾病状态的指示和/或说明书。
在一个方面中，该药盒用于治疗癌症并且包含抗-CTLA-4抗体(例如人源化抗体)或其抗原结合片段和另一种治疗剂或疫苗。该药盒可以任选地还包括用于胃肠外，例如静脉内施用的注射器。在另一个方面中，药盒包含抗-CTLA-4抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段和附接至容器或封装在容器内的标记，该标记描述了抗体或片段与疫苗或另一种治疗剂的使用。在另一个方面中，药盒包括疫苗或另一种治疗剂和附接至该容器或封装在该容器内的标记，该标记描述了疫苗或另一种治疗剂与抗-CTLA-4抗体或片段的使用。在某些实施方案中，抗-CTLA-4抗体和疫苗或另一种治疗剂处于单独的小瓶中或者一起组合在同一药物组合物中。
如上文在组合疗法部分中所讨论的，同时施用两种治疗剂不需要这些剂同时或通过同一路径施用，只要在这些剂发挥其治疗作用期间的时间段中存在重叠。涵盖同时或依次施用，如在不同天或周施用。
还可制备本文所公开的治疗和检测药盒，其包含本文所公开的抗体、肽、抗原结合片段或多核苷酸中的至少一种和用于使用该组合物作为检测试剂或治疗剂的说明书。用于此类药盒中的容器典型地包括至少一个小瓶、测试管、烧瓶、瓶、注射器或其他适合容器，其中可以放置检测和/或治疗组合物中的一种或多种，并且优选地适当等分。在还提供第二治疗剂时，该药盒还可以含有第二不同容器，在该第二不同容器中可以放置此第二检测和/或治疗组合物。或者，可以将多种化合物制备于单一药物组合物中，并且可以将其封装在单一容器装置中，诸如小瓶、烧瓶、注射器、瓶或其他适合的单一容器中。本文所公开的药盒还典型地包括用于容纳严格限制商业销售的小瓶的装置，例如其中保留希望的小瓶的注射或吹塑容器。在药盒中包括放射性标记、发色、荧光或其他类型的可检测标记或检测装置时，标记剂可作为检测或治疗组合物本身提供于同一容器中，或者可替代地放置于第二不同容器装置中，其中可放置此第二组合物并适合地等分。或者，检测试剂和标记可以制备于单一容器装置中，并且在大部分情况下，药盒也将典型地包括用于容纳严格限制用于商业销售且/或便于包装和递送的小瓶的装置。
还提供用于执行本文所述的检测或监测方法的装置或设备。此装置可包括可输入样品的腔室或管、流体处理系统(其包括引导样品流过该装置的阀门或泵)、任选地从血液中分离血浆或血清的过滤器、用于添加捕获剂或检测试剂的混合腔室、以及任选地用于检测结合至捕获剂免疫复合物的可检测标记的检测装置。样品流动可以为被动的(例如，通过毛细管、流体静力学或一旦应用样品就不要求进一步操纵该装置的其他力)或主动的(例如，通过施加经由机械泵、电渗泵生成的力、离心力或增加的气压)、或者通过主动力和被动力的组合。
在另外的实施方案中，还提供处理器、计算机可读存储器和存储于计算机可读存储器上并适于在处理器上执行以执行本文所述的任何方法的程序。适合的技术系统、环境和/或配置的实例包括个人计算机、服务器计算机、手持式或平板式装置、多处理器系统、基于微型处理器的系统、机顶盒、可编程消费性电子产品、网络PC、小型计算机、大型计算机、包括任何以上系统或装置的分布式计算环境、或本领域已知的任何其他系统。
一般方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook、Fritsch和Maniatis(1982&1989第2版，2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning，第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,第217卷,Academic Press,San Diego,CA)。标准方法还出现于Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wiley andSons,Inc.New York,NY，该文献描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱分析、电泳、离心和结晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley andSons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见例如Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第2卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols inMolecular Biology,第3卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391页)。描述了多克隆抗体和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等人(2001)CurrentProtcols in Immunology,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Harlow和Lane，同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术为可用的(参见例如Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,New York)。
可以制备单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体(参见例如Sheperd和Dean(编)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann和Dubel(编)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,第139-243页；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165:6205；He等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利号6,329,511)。
人源化的替代方案为使用噬菌体上展示的人抗体文库或转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)PhageDisplay:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides andProteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
描述了单链抗体和双体抗体(参见例如Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218；Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276:7346-7350；Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290；Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231:177-189；以及美国专利号4,946,778)。提供双特异性抗体(参见例如Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15；Volkel等人(2001)Protein Engineering 14:815-823；Segal等人(2001)J.Immunol.Methods 248:1-6；Brennan等人(1985)Science 229:81-83；Raso等人(1997)J.Biol.Chem.272:27623；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Traunecker等人(1991)EMBO J.10:3655-3659；以及美国专利号5,932,448、5,532,210和6,129,914)。
还提供双特异性抗体(参见例如Azzoni等人(1998)J.Immunol.161:3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162:6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74:9115；Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275:38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276:12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165:2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875)。
抗原的纯化对于抗体的生成而言为不必要的。动物可以用携带感兴趣抗原的细胞免疫。然后可以从免疫动物分离脾细胞，并且可以将脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见例如Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity 13:233-242；Preston等人,supra；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗体可以缀合至例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)。抗体适用于治疗、诊断、药盒或其他目的，并且包括偶联至例如染料、放射性同位素、酶或金属(例如胶体金)的抗体(参见例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。
用于流式细胞术的方法(包括荧光活化细胞分选(FACS))为可用的(参见例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针、多肽和抗体)的荧光试剂(例如用作诊断试剂)为可用的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述了免疫系统组织学的标准方法(参见例如Muller-Harmelink(编)(1986)HumanThymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库为可用的(参见例如GenBank,Vector Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
实施例
以下实施例用于说明本发明。这些实施例不旨在限制本发明的范围。
实施例1：抗-hCTLA-4抗体的免疫和选择
为了分离针对人CTLA-4蛋白的抗体，用编码hCTLA-4的表达构建体免疫小鼠。为了生成此构建体，将编码hCTLA-4的全长开放阅读框的cDNA(NCBI参考序列：NM_005214.4，SEQID NO:35)亚克隆到pCI-新载体(Promega,Madison,WI)中。通过基因枪免疫使用Helios基因枪(BioRad,Hercules,CA)和DNA涂覆的金子弹(BioRad)按照制造商的说明书免疫小鼠。简言之，将1μm金颗粒用2:1:1比率的小鼠Flt3L和小鼠GM-CSF的pCI-neo-CTLA-4cDNA和商业表达载体(两者均来自Aldevron,Fargo,ND)涂覆。将总计1μg质粒DNA用于涂覆500μg金颗粒。具体地，用基因枪在耳朵中免疫7-8周龄的雌性BALB/C小鼠，在两只耳朵中接受4次施用循环。大约，在三次DNA免疫之后在小鼠血清中通过流式细胞术检测1:125-625抗-hCTLA-4滴度。对于此筛选，使用CHO-K1细胞，所述CHO-K1细胞用pCI-neo-CTLA-4构建体，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染。将转染的细胞培养过夜并随后使用细胞解离溶液(Sigma)获得单一细胞悬浮液。将7,5*105个细胞用稀释的小鼠血清的每个样品在4℃下孵育30分钟。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)/2％牛胎儿血清(FBS)洗涤细胞并在4℃下用FITC-标记的山羊抗小鼠IgG(BD Pharmingen)染色细胞30分钟。再次用PBS/2％FBS洗涤细胞，接着重新悬浮于PBS/2％FBS中并基于其FITC-标记检测抗体结合的细胞，通过流式细胞术评估(FACS Canto II；BD Biosciences)。将展示针对hCTLA-4的反应性的小鼠免疫最终四次并且在四天后处死。如先前所述地制备红细胞消耗的脾和淋巴结细胞群(Steenbakkers等人,1992,J.Immunol.Meth.152:69-77；Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134)并且在-140℃下冷冻。
对于B-细胞选择和CELISA目的，通过用编码突变体hCTLA-4 cDNA(Y166G和Y183G，SEQ ID NO:37)的pCI-neo载体转染CHO-K1细胞(美国模式培养物保藏所)来生成CHO-K1.hCTLA-4稳定的细胞系。通过有限稀释来获得稳定的克隆。
为了选择产生抗-hCTLA-4抗体的B-细胞，设计并开发优选结合表达抗体的B细胞(所述抗体结合至hCTLA-4)的选择策略。从hCTLA-4免疫小鼠收获脾细胞和淋巴结并且将分离的细胞与在3,000RAD下照射的CHO-K1.hCTLA-4细胞一起孵育。在1小时后，通过多个洗涤步骤使用培养基去除未结合的细胞。随后使用解离缓冲液收获具有结合的淋巴细胞的CHO-K1.hCTLA-4细胞。培养结合的B-细胞，如Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134所述。简言之，将所选B-细胞与7.5％(v/v)T-细胞上清液和50,000照射的(2,500RAD)EL-4B5饲养细胞在96孔平底组织培养板的200μl最终体积培养基中混合。在第八天，通过如下文所述的CELISA针对hCTLA-4反应性筛选上清液。
将CHO-K1.hCTLA-4细胞接种在组织培养板的培养基(具有10％牛胎儿血清(Hyclone)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中并且在37℃、5％CO2和95％湿度下培养，直到它们汇合。随后，去除培养基并且将细胞与来自B细胞培养物的上清液在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用PBS/0.05％Tween(PBST)洗涤并且在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBST洗涤3次并且使用TMB稳定发色团(Invitrogen)观察抗-hCTLA-4免疫响应性。用0.5M H2SO4停止反应并且在450和610nm下读取吸光度。
另外，使用均相时间分辨荧光(HTRF)测定形式评价上清液的hCTLA-4/hCD80相互作用阻断。将上清液与生物素化重组hCD80在HTRF缓冲液(PBS/0.53M Kaliumfluoride/0.1％BSA)中共同孵育。添加与检测试剂Streptavidin K(供体)和抗人Fc D2(受体)组合的重组人CTLA-4/Fc。将完全混合物在室温(RT)下孵育3小时并且随后在615和665nM的波长下使用Victor2读取器(Perkin Elmer)测量荧光。hCTLA-4与hCD80的结合在设定为100％的设置中引起荧光信号。含有阻断抗体的上清液减少了荧光。
通过按照公布的程序进行微型电融合将显示阻断hCTLA-4/hCD80相互作用的hCTLA-4反应性上清液的B细胞克隆永生化(Steenbakkers等人,1992,J.Immunol.Meth.152:69-77；Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-34)。简言之，将B-细胞与106个Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞混合在电融合等克分子缓冲液(Eppendorf)中。在50μL融合腔室中通过30s、1MHz、15Vrm的交替电场，随后10μs、3kV/cm的平方高场脉冲并且再次接着30s、1MHz、15Vrm的交替电场来执行电融合。将腔室内容物转移至杂交瘤选择性培养基中并且在有限稀释条件下接种在96孔板中。在电融合之后第12天，如上文所述针对hCTLA-4结合活性筛选杂交瘤上清液。通过有限稀释亚克隆在上清液中分泌结合hCTLA-4的抗体的杂交瘤，以确保其完整性和稳定性。将稳定的杂交瘤在无血清培养基中培养7-10天；收获上清液并且根据制造商的说明书(GE Healthcare)使用MabSelect Sure ProteinA树脂纯化抗体。使用分光光度法定量抗体浓度。使用杂交瘤培养物的上清液对杂交瘤进行分型。简言之，使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Biorad)基于具有固定的山羊抗小鼠抗体带的浸渍片对常见小鼠同种型和轻链的每一种进行分型。回收的抗体全部被鉴定为小鼠IgG1。通过使用以下方法对小鼠IgG1杂交瘤材料的可变区进行测序来阐述抗体序列：提取杂交瘤细胞的总RNA，这允许cDNA合成。执行cDNA末端快速扩增(RACE)，这允许克隆TOPO(ThermoFisher)载体中的阳性片段。对TOPO克隆进行测序并且使用VBASE2(http://www.vbase2.org)注释序列。
在实验中，将结合和阻断与分别表达为人IgG1κ和IgG2κ的10D1(US20020086014)或CP-675,206(WO2007113648)相比较。通过使用293fectin转染试剂(Invitrogen)按照制造商的说明书转染到FreeStyle 293-F人胚胎肾细胞(HEK293T/17,ATCC-CRL-11268)来瞬时表达编码VH和VL构建体的质粒。在7天后收获上清液(30ml)并且使用MabSelect SureProtein A树脂根据制造商的说明书(GE Healthcare)纯化抗体。使用Zeba脱盐柱(ThermoScientific)将缓冲液更换为10mM组氨酸、100mM NaCl pH 5.5缓冲液。基于OD280(Nanodrop ND-1000)确定纯化的抗体的浓度。通过LAL-测试根据制造商的说明书(Lonza)测定内毒素水平。
表征hCTLA-4抗体与hCTLA-4、食蟹猴(Macaca fascicularis,cynomolgus)CTLA-4的结合和配体结合(hCD80/hCD86)的阻断。接着，使用基于Jurkat的报告测定(Promega)按照制造商的程序确定体外功能性。简言之，将表达hCD80/hCD86的Raji细胞与稳定表达膜CTLA-4和IL2-RE-荧光素酶报告物的Jurkat T细胞共同孵育。向此混合物中添加小鼠抗人CD3抗体(BD Pharmingen)和山羊抗小鼠IgG抗体(Thermo Fisher)，接着系列稀释hCTLA-4小鼠抗体(以200μg/ml及其稀释开始)。在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育六小时后，通过添加Bio-GloTM底物(Promega)并使用Envision读取器(Perkin Elmer)检测IL-2启动子活性。如图1所示，hCTLA4.27A与10D1相比更强效地增强IL-2启动子。
实施例2：人源化抗体设计和CDR移植
通过CDR-移植技术(参见例如美国专利号5,225,539以及Williams,D.G.等人,2010,Antibody Engineering,第1卷，第21章)对小鼠hCTLA4.27A抗体进行人源化。
首先，使用IgBLAST鉴定人种系序列(Ye J.等人,2013,Nucleic Acids Res.41:W34-40)。对于hCTLA4.27A VH人种系序列，鉴定出V-基因IGHV1-46*01(62.2％同一性)并且对于VL人种系序列，鉴定出IGKV1-NL1*01(68.4％同一性)。使用这两种种系序列直接移植小鼠CDR，产生以下两种cDNA构建体：SEQ ID NO:15(VH，编码SEQ ID NO:16)和SEQ ID NO:27(VL，编码SEQ ID NO:28)。接着，构建含有IMGT数据库中可用的全部人序列的数据库(Lefranc,M.-P.等人,1999,Nucleic Acid Res.27:209-212)，从而鉴定出82,958种单独的序列。使用TBLASTN(2.2.30+)查询这些序列，以鉴定出表明与hCTLA4.27A VH和VL序列的框架具有最高同一性的模板序列。鉴定出三个VH和三个VL序列，其证明70％或更高的类似性评分并且展示类似CDR长度，优选分别与hCTLA4.27A VH CDR1、CDR2、CDR3和VL CDR1、CDR2和CDR3中的那些相同。
对于重链，选择由GenBank(Benson,D.A.等人,2013,NucleicAcids Res.41(D1):D36-42)登录号L39130、DI109259和DD431634编码的框架作为用于hCTLA4.27A VH CDR的直线移植的模板，产生以下cDNA构建体：分别为SEQ ID NO:9、11和13。对于轻链，选择由GenBank登录号AB063955、DI112350和AB363305编码的框架作为用于hCTLA4.27A VL CDR的直线移植的模板，产生以下cDNA构建体：SEQ ID NO:21、23和25。框架和CDR定义为Kabat等人描述的那些。
为了研究人源化框架残基对Fv结构的作用，使用Discovery Studio 4.5内的‘抗体建模级联’(默认参数)制成小鼠hCTLA4.27A Fv的同源性模型。基于PDB ID 3V7A建立同源性模型。
经由电脑模拟移植CDR以研究接近于任何CDR并可影响环状构象的残基，称为游标残基。鉴定出可影响环构象并处于CDR表面的<内的残基并且在此位置处用小鼠氨基酸取代。使用Discovery Studio 4.5检查所得模板的翻译后修饰(PTM)基序的存在并且在可能时(即非-CDR、非游标残基)改变以防止PTM。对于重链，在hCTLA4.27A VH中预测的序列PTM基序和结构性考虑因素(即，主链的刚性)的去除产生两种额外构建体的设计：SEQ IDNO:17和19。对于轻链，PTM去除产生以下构建体：SEQ ID NO:29。
在每个鉴定的模板上移植CDR，表达为人IgG4(SEQ ID NO:50)、κ(SEQ ID NO:52)抗体，在pcDNA3.1(+)载体中克隆并且在无HEK293型细胞中瞬时转染。产生IgG4形式的人源化抗体，其具有稳定的Adair突变(Angal S.等人,1993,Mol Immunol.30:105-108)，其中丝氨酸228转化为脯氨酸。
还将hCTLA4.27IgG1表达为人IgG1(SEQ ID NO:48)、κ抗体(SEQ ID NO:52)，在pcDNA3.1(+)载体中克隆并且在无HEK293型细胞中瞬时转染。将编码人IgG1重链和轻链构建体的质粒以1:1比率(总计1280μg)混合并且通过使用293fectin转染试剂(Invitrogen)按照制造商的说明书转染到FreeStyle 293-F人胚胎肾细胞(HEK293T/17,ATCC-CRL-11268)来瞬时表达。在7天后收获上清液(1250ml)并且使用MabSelect Sure Protein A树脂根据制造商的说明书(GE Healthcare)纯化hCTLA4.27IgG1。使用Zeba脱盐柱(ThermoScientific)将缓冲液更换为10mM组氨酸、100mM NaCl pH 5.5缓冲液。基于OD280(Nanodrop ND-1000)确定纯化的hCTLA4.27IgG1的浓度。
另外，将小鼠hCTLA4.27A VH和VL(SEQ ID NO:32和34)表达为嵌合人IgG1(hCTLA4.27A.C1)和IgG4(hCTLA4.27A.C4)，κ抗体，在pcDNA3.1(+)载体中克隆并且在无HEK293型细胞中瞬时转染。
实施例3：人源化构建体的合成、表达和纯化
将编码重链和轻链构建体的质粒以1:1比率(总计30μg)混合并且通过使用293fectin转染试剂(Invitrogen)按照制造商的说明书转染到FreeStyle 293-F人胚胎肾细胞(HEK293T/17,ATCC-CRL-11268)来瞬时表达。在7天后收获上清液(30ml)并且使用MabSelect Sure Protein A树脂根据制造商的说明书(GE Healthcare)纯化抗体。使用Zeba脱盐柱(Thermo Scientific)将缓冲液更换为10mM组氨酸、100mM NaCl pH 5.5缓冲液。基于OD280(Nanodrop ND-1000)确定纯化的抗体的浓度。通过LAL-测试根据制造商的说明书(Lonza)确定内毒素水平。
实施例4：人源化CTLA-4抗体的结合
在CELISA形式中研究人源化抗体与hCTLA-4的结合。将CHO-K1.hCTLA-4细胞接种在组织培养板的培养基(具有10％牛胎儿血清(Hyclone)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中并且在37℃、5％CO2和95％湿度下培养，直到它们汇合。随后，去除培养基并且将细胞与纯化的hCTLA-4抗体(10μg/ml及其稀释)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用PBS/0.05％Tween(PBST)洗涤并且在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology)或山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBST洗涤3次并且使用TMB稳定发色团(Invitrogen)观察抗-hCTLA-4免疫响应性。用0.5M H2SO4停止反应并且在450和610nm下读取吸光度。使用Graphpad Prism 6计算EC50值，其为观察到50％总结合信号的浓度。在表5中，示出人源化hCTLA4.27抗体的EC50值。
表5：人源化hCTLA4.27抗体、亲本抗体和嵌合抗体与表达于CHO-K1.hCTLA-4细胞上的人CTLA-4的结合。EC50值表示为观察到50％总结合信号的浓度(由两个独立实验的值计算平均值和SD)。
使用已用亚克隆到pCI-neo载体(Promega)中的编码食蟹猴CTLA-4的全长开放阅读框(SEQ ID NO:39)的cDNA瞬时转染的CHO-K1细胞(美国模式培养物保藏所，Manassas,VA)证实hCTLA-4抗体与食蟹猴CTLA-4(SEQ ID NO:40)的结合。将CHO-K1.cynoCTLA-4细胞接种在组织培养板中并且在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育，直到细胞层汇合。随后，去除培养基并且将细胞与纯化的hCTLA-4抗体(10μg/ml及其稀释)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用PBST洗涤并且在37℃下与山羊抗人IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBST洗涤3次并且使用TMB稳定发色团(Invitrogen)观察抗-CTLA-4免疫响应性。用0.5M H2SO4停止反应并且在450和610nm下读取吸光度。
通过流式细胞术证实hCTLA4.27人源化抗体与人CD3+T细胞上表达的CTLA-4的结合。如下将人CD3+T细胞从人血沉棕黄层分离。首先，在室温下将血沉棕黄层用PBS稀释至180ml总体积。在混合细胞悬浮液之后，将等分试样装载在Sepmate管(StemcellTechnologies)中的Ficoll-Paque Plus梯度上并且在无制动器的情况下在20℃下在1200g下离心10分钟。接着，通过抽吸移出血浆并从血浆/Ficoll界面回收PBMC。将PBMC以PBS洗涤三次。随后，使用磁性珠粒(CD3+T-细胞生物素-Ab混合物；Miltenyi Biotec)进行CD3+T细胞分离。接着，将T细胞用αCD3/αCD28涂覆的珠粒(Thermo Fisher Scientific)刺激48小时。通过使用流式细胞术检测胚细胞形成来证实第一T细胞刺激。在用Cytofix/Cytoperm(Bd)将T细胞固定并透化之后评估hCTLA4.27人源化抗体的结合。将细胞用透化/洗涤缓冲液(BD)洗涤两次，与hCTLA4.27人源化抗体一起孵育，洗涤三次，并且最终与FITC-标记的山羊抗人-hIgG检测抗体(Southern Biotech)一起孵育。在此标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬浮于FACS缓冲液中并且通过流式细胞术在FACS Canto II(BD)上分析。使用Flowjo软件处理并分析数据。
通过流式细胞术证实hCTLA4.27人源化抗体与食蟹猴PBMC上表达的CTLA-4的结合。为此，将猕猴血液用PBS 1:1稀释并且将其添加到含有13ml Lymphoprep 95％/PBS 5％的50ml管中。将细胞在450g和20℃下在无制动器的情况下离心30分钟。接着，通过抽吸移出血浆并从血浆/Ficoll界面回收PBMC。将PBMC以PBS洗涤两次。在液氮中冷冻细胞并且在实验那天从冷冻器重新取回。由于CTLA-4在静息免疫细胞上的内源性表达较低，所以将解冻的PBMC用αCD3/αCD28/αCD2涂覆的珠粒(Milteny Biotec)刺激48小时。随后，通过使用流式细胞术检测胚细胞形成来证实PBMC的刺激。接着，通过流式细胞术分析细胞的hCTLA4.27抗体的细胞内结合。
实施例5：通过人源化hCTLA4.27抗体阻断hCD80与hCTLA-4的结合
以CELISA形式评估人源化hCTLA4.27抗体的完全小组的hCD80阻断。将CHO-K1.hCTLA-4细胞接种在组织培养板中并且在37℃、5％CO2和95％湿度下在培养基中孵育。一旦细胞汇合，就去除培养基并且将细胞与人源化hCTL4.27抗体变体(10μg/ml及其稀释)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用PBS/0.05％Tween-20(PBST)洗涤并且在37℃、5％CO2和95％湿度下与生物素化重组hCD80/Fc-蛋白一起孵育1小时。然后将细胞用PBST洗涤，接着在细胞上添加链霉亲和素-HRP缀合物，将该细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。随后，将细胞用PBST洗涤三次并且使用TMB稳定发色团(Invitrogen)观察hCD80/Fc-抗体的结合。用0.5MH2SO4停止反应并且在450和610nm下读取吸光度。由此数据计算用于阻断hCD80的IC50值并且在表6中示出。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
表6：人源化hCTLA4.27抗体、亲本抗体和嵌合抗体对hCD80结合的阻断。IC50值表示为观察到一半抑制时的浓度(由两个独立实验的值计算平均值和SD)。
实施例6：与10D1(伊匹单抗)和CP-675,206(曲美木单抗)相比的hCTLA4.27亲和力、与hCTLA-4的结合及其阻断hCD80/hCD86相互作用的能力
在Octet RED96上使用生物光干涉法对hCTLA4.27结合动力学和平衡结合常数作曲线图并且将其与本领域已知的若干种抗体相比较。首先，使用标准胺化学将抗-hCTLA-4mAb偶联至胺反应性第二代生物传感器(Fortebio)。然后在不同的hCTLA-4浓度下观察到hCTLA-4与生物传感器的结合和解离。通过将胺反应性生物传感器浸入在含有0.1M MES pH＝5.5的孔中10分钟来预先润湿这些传感器。然后使用0.1M NHS/0.4M EDC混合物活化这些生物传感5分钟。通过将生物传感器浸入2.5或12ug/mL抗体于0.1M MES中的溶液中7.5分钟来偶联抗体。使用1M乙醇胺溶液淬灭生物传感器表面5分钟。将生物传感器在Octet动力学缓冲液(ForteBio)中平衡5分钟。通过将生物传感器放置在含有不同rhCTLA-4/Fc浓度(2.5-40nM)的孔中并且监测干涉法15分钟来观察rhCTLA-4/Fc(R&D Systems)的结合。在将生物传感器转移至动力学缓冲液中并监测干涉信号45分钟之后测量解离。在板温度为30℃的情况下运行测定。使用包括所测试的全部浓度的1:1结合全局拟合模型拟合所观察到的结合和解离速率(kon和kdis)，并且计算平衡结合常数KD。如表7所示：hCTLA4.27具有与对照抗体类似的结合亲和力。
表7：格式化为人IgG1和人IgG4的hCTLA4.27相对于对照抗体10D1和CP-675,206的亲和力
接着，以CELISA形式将hCTLA4.27抗体与hCTLA-4的结合及其阻断hCD80/hCD86相互作用的能力与10D1和CP-675,206相比较。简言之，对CHO-K1.hCTLA-4细胞执行hCTLA-4结合的CELISA。分别使用山羊抗小鼠IgG HRP(对于小鼠hCTLA4.27A)(SouthernBiotech)和山羊抗人IgG-HRP(Southern Biotech)(对于hCTLA4.27A嵌合hIgG1和hIgG4和对照抗体)进行结合抗体的检测。为了评估hCD80和hCD86阻断，将CHO-K1.hCTLA-4细胞接种在组织培养板中并且在37℃、5％CO2和95％湿度下在培养基中孵育。一旦细胞汇合，就去除培养基并且将细胞与hCTL4.27抗体和对照抗体(10μg/ml及其稀释)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用PBS/0.05％Tween-20(PBST)洗涤并且在37℃、5％CO2和95％湿度下与生物素化重组hCD80/Fc-蛋白或hCD86/Fc蛋白一起孵育1小时。然后将细胞用PBST洗涤，接着在细胞上添加链霉亲和素-HRP缀合物，将该细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。随后，将细胞用PBST洗涤三次并且使用TMB稳定发色团(Invitrogen)观察hCD80/Fc-蛋白或hCD86/Fc-蛋白的结合。用0.5M H2SO4停止反应并且在450和610nm下读取吸光度。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
如图2所示，hCTLA4.27IgG1和hCTLA4.27IgG4抗体的hCD80阻断曲线位于伊匹单抗与曲美木单抗的hCD80曲线之间。因此尽管IC50值为可比较的，功效坪值不同。
表8：hCTLA4.27A、hCTLA4.27A嵌合hIgG1和hIgG4以及对照抗体与hCTLA-4的结合及其阻断hCD80/hCD86相互作用的能力。EC50值表示观察到50％总结合信号时的浓度。IC50值表示为观察到一半抑制时的浓度(由两个独立实验的值计算平均值和SD)。
实施例7：在人PBMC SEB测定中人源化hCTLA4.27抗体的功能性
为了证实在原代免疫细胞中人源化hCTLA4.27的功能性，将PBMC从人供体血液的血沉棕黄层分离。首先，在室温下将血沉棕黄层用PBS稀释并混合至180ml总体积。将等分试样装载在Sepmate管(Stemcell Technologies)中的Ficoll-Paque Plus梯度上并且在无制动器的情况下在20℃下在1200g下离心10分钟。接着，通过抽吸移出血浆并从血浆/Ficoll界面回收PBMC。将PBMC以PBS洗涤三次，之后用于测定中。将PBMC以每孔2*105个细胞接种。随后，将人源化hCTLA4.27和对照抗体以补充有10％牛胎儿血清的RPMI 1640培养基(Gibco)稀释并且在10平方根的稀释步骤下按以100ug/ml开始的浓度范围添加。以10μg/ml的浓度添加以补充有10％牛胎儿血清的RPMI 1640培养基稀释的葡萄球菌肠毒素B(Sigma)。将板在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育七十二小时，接着分离上清液。
在上清液中IL-2分泌作为免疫活化的量度被检测。通过离心将上清液从任何细胞材料中清除并且将其添加到已通过在4℃下孵育最少16小时的时间段来用PBS中的抗-hIL-2抗体(BD Pharmingen)涂覆的Nunc maxisorp ELISA板中。在添加上清液之前，将孔排空并且在室温(RT)下用PBS/1％BSA封闭一小时。将上清液在RT下在抗-hIL-2涂覆的板中孵育一小时，之后将板用PBST(PBS和0.05％Tween 20)洗涤三次。随后，添加在PBST/0.5％BSA中的0.5μg/ml抗-hIL2-生物素(BD Pharmingen)并且在RT下孵育一小时。在用PBST洗涤三次后，添加在PBST/0.5％BSA中的1:5000稀释的链霉亲和素-HRP(BD Pharmingen)。在用PBST洗涤六次之后，通过添加TMB稳定发色团(Invitrogen)来检测IL-2。用0.5M H2SO4停止反应并且在450和610nm下读取吸光度。在此测定中，将重组人IL-2(Sigma)用作参考以定量悬浮液中的IL-2蛋白质水平。图3显示hCTLA4.27抗体增强了免疫活化。
实施例8：在效应物功能测定中的hCTLA4.27
研究嵌合hCTLA4.27A抗体：hCTLA4.27A.C1和hCTLA4.27A.C4诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。对于ADCC测定，将人NK细胞用作效应细胞。将NK细胞从人血液中分离。用Rosette SEP NK富集混合物(StemcellTechnologies)富集血沉棕黄层的NK细胞。随后将血沉棕黄层与PBS/2％FBS 1:1混合并且铺层在Ficol Paque plus(GE Healthcare)上。在离心之后，收集中间相并且将细胞用PBS/2％FBS洗涤。通过流式细胞术表征分离的NK细胞证实了CD16和CD56表达。
将CHO-K1.hCTLA-4用作靶细胞并且连同NK细胞以10:1的效应物:靶标比率接种在平底细胞培养板中。添加hCTLA4.27抗体或对照抗体(10D1或同种型匹配的对照抗体(hIgG1,hIgG4))(100μg/ml及其稀释)。将板在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育过夜。在孵育过夜后，将细胞用PBST(PBS和0.01％Tween-20)洗涤并且在补充有10％牛胎儿血清(Hyclone)和1％Pen/Strep(Gibco)的RPMI(Gibco)中孵育，在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育30分钟。随后添加Celltiter 96Aqueous One溶液(Promega)，接着在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育3小时。通过使用iEMS读取器(Labsystems)分析OD492-690来评估细胞活力。如图4A所示，hCTLA4.27A.C1诱导两个不同供体中的NK-介导的细胞裂解，在格式化为hIgG4时它不能诱导细胞毒性。
为了评估补体依赖性细胞毒性，将一个浓度范围的hCTLA4.27抗体添加到CHO-K1.hCTLA-4靶细胞的汇合单层中。在15分钟孵育期之后，将50％人补体血清(Sigma)添加至细胞。在3,5小时孵育后，将细胞用PBST(PBS和0.01％Tween-20)洗涤，用补充的RPMI(Gibco)孵育并且在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育30分钟。随后添加Celltiter96Aqueous One溶液(Promega)，接着在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育3小时。通过在iEMS读取器(Labsystems)中分析OD492-690来评估细胞活力。如图4B所示，hCTLA4.27A.C1在CDC测定中诱导补体介导的细胞裂解，在格式化为hIgG4时它不诱导补体介导的细胞毒性。
实施例9：hCTLA4.27和对照抗体的交叉竞争
为了表征hCTLA4.27的结合位点与10D1(伊匹单抗)和CP-675,206(曲美木单抗)相比的差异，使用如先前所述的生物光干涉法对抗体之间的竞争性作曲线图。通过将胺反应性生物传感器浸入在含有0.1M MES pH＝5.5的孔中10分钟来预先润湿这些传感器。然后使用0.1M NHS/0.4M EDC混合物活化这些生物传感5分钟。通过将生物传感器浸入在12μg/mlmAb于0.1M MES中的溶液中7.5分钟来偶联格式化为人IgG1或人IgG4的hCTLA4.27。使用1M乙醇胺溶液淬灭生物传感器表面5分钟。将生物传感器在Octet动力学缓冲液(ForteBio)中平衡5分钟。通过将生物传感器放置在含有固定浓度的rhCTLA-4/Fc(12μg/ml)的孔中并且监测干涉法15分钟来观察rhCTLA-4/Fc的结合。接着，再持续2分钟，允许偶联至生物传感器的相同抗-hCTLA-4mAb结合，以确保全部可用的rhCTLA-4/Fc结合位点的结合。通过将生物传感器放置在含有固定浓度(6μg/ml)的另一种或相同抗-hCTLA-4mAb的孔中或仅含有动力学缓冲液的参考孔中5分钟来确定竞争性或非竞争性。如表9所示，在此直接竞争测定中，hCTLA4.27与rhCTLA-4的结合不阻断对照抗体与rhCTLA-4/Fc的结合。
表9：hCTLA4.27和对照抗体的交叉竞争。第二抗体以nm位移计的结合，零值或负值意指未观察到结合。
实施例10：与人/小鼠CTLA-4交换突变体的结合
hCTLA4.27之间的结合区域与10D1和CP-675,206相比的差异使用两种hCTLA-4突变体证实。设计一半人和一半小鼠的hCTLA-4突变体。基于Ig-样V-型(免疫球蛋白样)结构域CTLA-4的折叠，可以将蛋白质分成两个子结构域：一个含有β链1、2、5和6，包括连接环，并且一个含有β链3、4、7和8，包括连接环。人-小鼠变体(SEQ ID NO:42,Hum-Mou-CTLA-4)含有链1、2、5和6上的人残基和链3、4、7和8上的小鼠残基(SEQ ID NO:46)。小鼠-人变体(SEQ IDNO:44,Mou-Hum-CTLA-4)含有链1、2、5和6上的小鼠残基和链3、4、7和8上的人残基。
合成编码这些构建体(分别SEQ ID NO:41和43)的cDNA并且将其亚克隆到pCI-Neo载体(GeneArt)中。使用CELISA测试hCTLA4.27A嵌合hIgG4(hCTLA4.27A.C4)、10D1和CP-675,206与交换突变体的结合。为此，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，使用分别表达人CTLA-4(hCTLA-4)、小鼠CTLA-4(mCTLA-4)(SEQ ID NO:45)、Hum-Mou-CTLA-4和Mou-Hum-CTLA-4的pCI-Neo载体瞬时转染CHO-K1细胞。将转染的细胞在培养基(具有5％新生牛血清(Biowest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中在37℃、5％CO2和95％湿度下培养，直至汇合。随后，将细胞胰蛋白酶化并且接种在组织培养板中并且在37℃、5％CO2和95％湿度下在培养基中培养，直到汇合。然后，去除培养基并且将细胞与hCTLA-4抗体在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用PBS/0.05％Tween(PBST)洗涤并且在37℃、5％CO2和95％湿度下与1:2,000山羊抗人IgG-HRP(Jackson Immunoresearch)一起孵育1小时。此后，将细胞用PBST洗涤3次并且使用TMB稳定发色团(Invitrogen)观察抗-CTLA-4免疫响应性。用0.5M H2SO4停止反应并且在450和610nm下读取吸光度。hCTLA4.27A.C4显示与人-小鼠交换突变体的结合，而10D1和CP-675,206可结合至小鼠-人交换突变体(图5)。
实施例11：映射hCTLA-4与hCTLA4.27A之间的相互作用界面
通过涉及变性化学交联、随后酶促消化并使用质谱法检测的程序说明hCTLA4.27A至hCTLA-4的结合表位。首先，将抗体hCTLA4.27A和抗原rhCTLA-4/Fc/6His(R&D systems；SEQ ID NO:59)孵育以促进结合并且通过装备有HM4相互作用模块(CovalX)的UltraflexIII MALDI ToF质谱仪(Bruker)证实完整性和聚集水平。对于这些对照实验，制备10μL抗体或抗原样品的稀释系列(1至128倍稀释，以1mg/mL开始)。在每种样品中，使用K200MALDI MS分析试剂盒根据制造商的说明书(CovalX)使9μL经受交联，并且孵育180分钟，同时将1μL直接用于质谱分析(高质谱MALDI)。质谱分析显示抗体和抗原具有预期的分子量，分别为152.25kDa(160.94kDa和交联剂)和88.25kDa(95.19kDa和交联剂)。对于抗原抗体复合物的表征，使用2倍过量抗原(抗原:抗体比率4μM:2μM)制成混合物。根据制造商的说明书使用K200MALDI MS分析试剂盒使9μL抗原抗体混合物样品经受交联，同时将1μL直接用于质谱分析。抗体(149.916kDa)和抗原(88.211)的检测质量对应于如先前所检测的分子量。在交联之后，抗原抗体复合物被检测为具有1:1(239.113kDa)和1:2(326.415kDa)化学计量(hCTLA4.27A:rhCTLA-4/Fc)的两种非共价复合物。未检测到非共价结合的抗体和抗原、非共价聚集物或非特异性多聚物。
接着，执行rhCTLA-4/Fc的肽质量指纹图谱分析。按照制造商的说明书，使样品经受ASP-N、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶(Roche Diagnostic)蛋白水解，接着通过nLC-LTQ Orbitrap MS/MS使用与LTQ Orbitrap XL光谱仪(Thermo Scientific)一致的Ultimate 3000(Dionex)系统进行分析。此蛋白水解阵列的结果引起92.52％的序列被鉴定的多肽覆盖。
为了以高分辨率确定抗体hCTLA4.27A在rhCTLA-4/Fc抗原上的表位，将抗体/抗原复合物(抗原:抗体比率4μM:2μM)与变性交联剂d0/d12(K200MALDI试剂盒)一起孵育180分钟，并且使其经受使用酶ASP-N、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的多酶裂解。在将交联的肽富集之后，通过高分辨率质谱仪(nLC-Orbitrap MS)分析样品并且使用XQuest[Y.J.Lee,Mol.BioSyst.,2008,4,816–823]和Stavrox[ M等人J Am SocMass Spectrom.2012Jan；23(1):76-87]分析所生成的数据。由这些不同蛋白水解方法产生的交联肽示出在图6中。将hCTLA4.27A的结合表位鉴定为SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO:53)，并且明显不同于抗-CTLA-4抗体10D1(Ramagopal等人PNAS 2017；114(21):E4223–E4232)和CP-675,206(Lee等人Nat Commun.2016；7:13354)的表位。
本领域技术人员将容易了解的是，本发明非常适于执行所提及的目标并获得结果和优点以及其中固有的那些。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。
应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。
虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。
本领域技术人员将容易了解的是可以对本文所公开的发明作为不同取代和修改而不背离本发明的范围和精神。
说明书中提及的全部专利和公布指示本发明所属领域技术人员的水平。
在本文中适当地示例性说明的发明可以在任何一个或多个要素、本文未特别公开的一个或多个限制不存在下实践。因此，应理解尽管本发明已由优选实施方案和任选特征特别公开，本文所公开的概念的修改和变化由本领域技术人员所利用，并且此类修改和变化被认为处于本发明的如所附权利要求书所限定的范围内。
其他实施方案在以下权利要求书中说明。

Claims (37)

1.一种结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含a-f中限定的多肽序列中的一个或多个，以及任选地a-c中限定的多肽序列中的每一个和/或d-f中限定的多肽序列中的每一个：
a.重链可变区CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列；
b.重链可变区CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列；
c.重链可变区CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列；
d.轻链可变区CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列；
e.轻链可变区CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列，以及
f.轻链可变区CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6相异1、2、3或更多个保守性取代的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含a-f中限定的多肽序列中的任一个，以及任选地a-c中限定的多肽序列中的每一个和/或d-f中限定的多肽序列中的每一个：
a.包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；
b.包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2；
c.包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3；
d.包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；
e.包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2；
f.包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3。
3.一种结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下各项组成的组的轻链免疫球蛋白、重链免疫球蛋白或轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白两者：
a.抗体或其抗原结合片段，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的可变重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的可变轻链；
b.抗体或其抗原结合片段，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20的可变重链和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:22、24、26或30的可变轻链；
c.抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者包含至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变重链和/或与SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者包含至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变轻链；以及
d.抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者包含至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变重链和/或与SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者包含至少90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的可变轻链，其中任何序列变化在所述抗体或抗原结合片段的框架区中发生；
e.抗体或其抗原结合片段，其包含含有关于SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变重链和/或含有关于SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变轻链；以及
f.抗体或其抗原结合片段，其包含含有关于SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变重链和/或含有关于SEQ ID NO:22、24、26或30中的任一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的可变轻链，其中任何所述取代在抗体或抗原结合片段的框架区中发生。
4.如权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其片段具有以下特征中的一种、两种、三种或全部四种：
i.结合至人CTLA-4，如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)所测量的，其KD值为至少约1x 10-9M；
ii.阻断hCTLA-4与hCD80的结合，其IC50为约100nM或更低；
iii.阻断hCTLA-4与hCD86的结合，其IC50为约100nM或更低；
iv.结合至与伊匹单抗或曲美木单抗不同的CTLA-4表位。
5.一种结合至人CTLA-4的表位的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不结合至SEQ ID NO:44的小鼠-人嵌合CTLA-4分子。
6.一种与包含可变重链SEQ ID NO:7和可变轻链SEQ ID NO:8的抗体结合至人CTLA-4的相同表位的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段不结合至SEQ ID NO:44的小鼠-人嵌合CTLA-4分子，并且具有以下特征中的至少一种：
a.结合至人CTLA-4，如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)所测量的，其KD值为至少约1x 10-9M；
b.阻断hCTLA-4与hCD80的结合，其IC50为约100nM或更低；
c.阻断hCTLA-4与hCD86的结合，其IC50为约100nM或更低；
d.结合至与伊匹单抗或曲美木单抗不同的CTLA-4表位。
7.一种结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合至人CTLA4的包含至少8个连续残基SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO:53)的表位。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位由SFVCEYASPGKAT(SEQID NO:53)组成。
9.一种结合至人CTLA-4的抗体或其抗原结合片段，其中人CTLA-4在序列SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO:53)内的一个或多个突变防止所述抗体与人CTLA4的结合。
10.一种抗体或其抗原结合片段，其与抗体hCTLA4.27A竞争结合至人CTLA-4。
11.如以上权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其为包含两条重链和两条轻链的人源化抗体。
12.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:1-8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或30中任一者的氨基酸序列。
13.一种分离的核酸，其编码以下各项：如权利要求1-11所述的抗体或抗原结合片段中的任一种或如权利要求12所述的多肽中的任一种。
14.一种表达载体，其包含如权利要求13所述的分离的核酸。
15.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-14中任一项所述的抗体、结合片段、多肽、多核苷酸或表达载体。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其为毕赤酵母属细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
17.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-11中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂。
18.如权利要求17所述的组合物，其还包含选自由以下各项组成的组的剂：
抗-PD1抗体或其抗原结合片段；
抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；
抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；
抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；
抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；
抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；
抗-CD27抗体或其抗原结合片段；
抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；
抗-CD70抗体或其抗原结合片段；
抗-CD137抗体或其抗原结合片段；
抗-OX40抗体或其抗原结合片段；
抗-CD28抗体或其抗原结合片段；
抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；
抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；
抗-GITR抗体或其抗原结合片段；
抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；
抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；
抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；
抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；
抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；
抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；
抗-4-1BB抗体或其抗原结合片段；
抗-NK2GA抗体或其抗原结合片段；
抗-NK2GC抗体或其抗原结合片段；
抗-NK2GE抗体或其抗原结合片段；
抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；
STING激动剂；以及
抗-IL10抗体或其抗原结合片段。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所述抗-PD1抗体或其抗原结合片段选自由以下各项组成的组：派姆单抗或其抗原结合片段和纳武单抗或其抗原结合片段。
20.如权利要求17所述的组合物，其还包含选自由由以下各项组成的组的化合物：ADU-S100，美法仑，长春新碱，氟达拉滨，苯丁酸氮芥，苯达莫司汀，依托泊苷，多柔比星，环磷酰胺，顺铂，免疫调节剂诸如皮质类固醇例如地塞米松或强的松，沙利度胺类似物例如沙利度胺、来那度胺或泊马度胺，激酶抑制剂例如依鲁替尼，idealisib，靶向CD20的抗体例如利妥昔单抗、奥法木单抗或奥托珠单抗，靶向CD52的抗体例如阿仑单抗，靶向CD38的抗体例如达雷木单抗，靶向IL-6或IL-6受体的抗体例如萨瑞鲁单抗或托珠单抗，靶向CS-1的抗体例如埃罗妥珠单抗，靶向BCMA的抗体例如GSK2857916，靶向BAFF或BLyss的抗体例如它布鲁单抗，双膦酸盐例如帕米膦酸盐或唑来膦酸，硼替佐米或其组合。
21.一种产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：
在有利于编码如权利要求1-11所述的抗体或抗原结合片段中的任一种的重链和/或轻链的多核苷酸的表达的条件下培养包含所述多核苷酸的宿主细胞；以及
任选地，从所述宿主细胞和/或培养基回收所述抗体或抗原结合片段。
22.一种治疗受试者优选地人受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的抗体或抗原结合片段或介导所述抗体或抗原结合片段在所述受试者中表达的表达载体，任选地与另一种治疗剂或治疗程序结合。
23.一种治疗受试者优选地人受试者中的感染或感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的抗体或抗原结合片段或介导所述抗体或抗原结合片段在所述受试者中表达的表达载体，任选地与另一种治疗剂或治疗程序结合。
24.一种疫苗，所述疫苗包含如权利要求1-11中任一项所述的抗体或抗原结合片段和抗原。
25.一种用于检测样品中CTLA-4肽或其片段的存在的方法，所述方法包括使所述样品与如权利要求1-11中任一项的抗体或片段接触，以及检测所述抗体或片段与所述肽之间的复合物的存在；其中检测到所述复合物指示所述CTLA-4肽的存在。
26.一种增加免疫细胞的活性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或抗原结合片段或者介导所述抗体或抗原结合片段在所述受试者内表达的表达载体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述方法用于：
治疗癌症；
治疗感染或感染性疾病；或者
用作疫苗佐剂。
28.一种根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或抗原结合片段或者介导所述抗体或抗原结合片段在所述受试者内表达的表达载体，其用于制备药物以：
增加免疫细胞活化；
治疗癌症；或者
治疗感染或感染性疾病。
29.权利要求1-11所述的抗体或抗原结合片段用于制造用以治疗癌症的药物的用途，所述药物用于：增加免疫细胞活化；治疗癌症；或治疗感染或感染性疾病。
30.如权利要求1-11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述片段为Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFV)。
31.如权利要求1-11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、优选IgG1或IgG4的重链恒定区以及选自轻链恒定区κ或λ的轻链恒定区。
32.如权利要求31所述的抗体或其抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:50的位置228处具有Ser→Pro突变的人IgG4重链恒定区。
33.一种刺激受试者中的免疫响应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效刺激所述免疫响应的量的如权利要求1-11所述的抗体或其抗原结合片段。
34.根据权利要求22所述的治疗癌症的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：肺癌、黑素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、血液癌、淋巴瘤、骨髓瘤、或白血病或癌症的转移病灶。
35.根据权利要求22所述的治疗癌症的方法，其中所述抗体分子与一种或多种治疗剂或程序组合施用，其中所述第二治疗剂或程序选自由以下各项组成的组：STING激动剂、化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤细胞药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、辐射程序、共刺激分子的活化剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体分子与选自由以下各项组成的组的一种或多种共刺激分子的激动剂的组合施用：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体分子与选自由以下各项组成的组的免疫检查点分子的一种或多种抑制剂组合施用：PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR。
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