CN102439159A - 得自梭菌属的发酵终产物的制备 - Google Patents

得自梭菌属的发酵终产物的制备 Download PDF

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Abstract

在一个方面中，本发明公开了通过梭菌微生物体(例如Clostridium phytofermentans)由多种供料来增强乙醇和其他发酵终产物的制备的方法。本发明描述了通过使用分批补料策略来改善梭菌微生物体(例如Clostridium phytofermentans)的发酵性能的方法、以及在包含脂肪酸化合物和/或降低的pH下通过发酵梭菌微生物体(例如Clostridium phytofermentans)来制备发酵终产物(例如醇和/或化学品)的方法。

Description

得自梭菌属的发酵终产物的制备
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年3月9日提交的美国临时申请系列No.61/158,581、2009年3月9日提交美国临时申请系列No.61/158,600、2009年4月20日提交的美国临时申请系列No.61/171,077的优先权，其中的每一份申请均以引用方式全文并入本文。
背景技术
石油类的运输燃料的成本的增加、逐渐减少的石油储量以及对石油燃料燃烧对环境冲击的关注驱使人们强烈需要可行的备选物来替代石油类燃料。特别是，近年来突出了对通过生物转化(与酶以及酵母/细菌系统)多种预处理生物质材料(例如木质纤维素材料、淀粉或农业肥料/副产物)来制备生物燃料的预期。具体的挑战为研发技术，其具有能够经济地将包含多糖的材料(例如木本或非木本植物材料)以及得自植物体加工的肥料和副产物转化为高热值运输燃料及其他能量形式、或者化学原料的可能性。这些包含多糖的材料的多个实例包括纤维素的、木质纤维素的以及半纤维素材料；包含胶质的材料；淀粉；木材；玉米秸秆；柳枝稷；纸张；以及纸浆。
用于将这些包含多肽的材料转化为生物燃料(例如乙醇)的一些方法首先需要将经过预处理的生物质底物(例如包含淀粉或纤维素的材料)通过(例如)酶水解来转化为单糖(糖化作用)；以及将这些单糖通过酵母菌的发酵作用随后转化(发酵作用)生物燃料(例如乙醇)。但是，当前的生物转化技术面临着高制备成本以及由食物供料转变为农产品的问题。
在用于制备乙醇的一些发酵作用中，获得单糖(例如蔗糖)并使其直接发酵形成乙醇。例如，在Brazil中使用这种方法来将蔗糖(cane sugar)转化为燃料级乙醇。这些方法在地理学上局限于单糖来源廉价的地方，例如在甘蔗生长的区域。此外，这些方法具有不理想的方面，即，将珍贵的食物来源(例如糖)转变为工业用途而非食物用途。
用于制备乙醇的一些发酵作用使用了首先需要水解、或者在转化为乙醇之前转化为低级复合物或者低分子量的糖的材料。此类方法通常被描述用于使用衍生自破碎的玉米的淀粉来制备玉米乙醇(例如通过加入的酶)，然后使用有机体(例如Saccharomyces或酵单胞菌属)最终转化为乙醇。使用其他材料(例如纤维素、半纤维素或木质纤维素材料)通常还需要使用加入的酶水解，或者大量研究的主题为通过其他化学/热方式，但是历史上少有成功。
由成本以及所述加工设备通常局限于容易购得的那些酶的事实来考虑，加入到所述方法中的使用的这些酶是不理想的。历史上，选择可购得的酶来用于诸如将淀粉转化为单糖(例如葡萄糖或果糖)、洗衣店应用以及谷物食物之类的方法。这些酶通常是高度特异性的，其是指单一的酶通常不能用于广泛变化的食物材料。反而，通常使用多种酶并且将它们组合到“酶混合物”中。使用此类混合物取得的活性越广泛，与这种越广泛的活性伴随而言的则是明显更高的价格，由此仅加入一部分酶可以用于任一特定批次中使用的特定的底物。作为所述混合物中的一部分的其他酶在一种底物上是不具有活性的，但是被包含在所述的混合物中以便为可以使用的其他供料底物提供用途。结果，在任一特定的批次中，所加入的至少一部分酶可能不会明显地有助于加工，因此被浪费掉。
因此，需要由多种原料以高产率和制备率来制备乙醇或其他所需产物的发酵方法。
得自包含纤维素、木质纤维素、胶质、多聚葡萄糖和/或多聚果糖的生物质的乙醇发酵可以为世界能量问题提供更需要的溶液。已经报导酵母菌、真菌以及细菌的菌种能够将单糖的纤维素生物质转化为乙醇。但是，许多这种微生物体仅产生较低浓度的乙醇。这种局限可能是由于所述的有机体通常缺乏对乙醇的耐受，或者所述有机体中存在的反馈抑制或阻抑机制，或者是某些其他的机制，以及这些机制的某种组合。这种乙醇的制备局限除了可以影响乙醇的效价以外，还可以影响乙醇的制备率。
已经描述了多种野生型及基因改善的有机体通过发酵来制备醇。这些有机体有嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanoicus)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、Clostridium beijerinickii、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、热硫化氢梭菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)、Moorella ssp.、Carboxydocella ssp.、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、重组E.Coli、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、Clostridium beijerickii以及其他微生物体。在使用这些或其他微生物体来用于工业规模的醇制备中的困难可以包括在相对低的醇浓度下的细胞毒性，在相对低的醇浓度下细胞生长减少或生存能力降低，醇效价低或者醇制备率低。醇耐受是高度菌种及菌株依赖性的。例如，在某些发酵方法中，醇制备在大约10-20g/L醇下会减慢或完全停止。在大约20g/L醇(例如乙醇)的条件下，一些有机体死亡或被严重损害。
发明概述
在一个方面中，本文提供了用于制备发酵终产物的方法，该方法包括：将包含梭菌的培养基在适用于制备所述发酵终产物的条件下培养第一段时间；在收获发酵终产物之前的时间内向包含梭菌的培养基中加入一种或多种营养物；将包含梭菌的培养基培养第二段时间；以及由所述的培养基中收获发酵终产物。在一个实施方案中，所述的梭菌菌株为Clostridiumphytofermentans。在另一个实施方案中，所述的发酵终产物为乙醇。在另一个实施方案中，所述的培养基包含纤维素和/或木质纤维素材料。在另一个实施方案中，所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶的酶处理。
在一个方面中，本文提供了用于制备发酵终产物的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养Clostridium phytofermentans菌株；将所述培养基中糖化合物的总浓度保持在至少大约18g/L；以及由所述培养基中收获发酵中产物。在一个实施方案中，保持糖化合物的总浓度包括在培养过程中至少一次将一种或多种培养基成分(其中至少一种成分包含一种或多种糖化合物)加入到所述的培养基中，其中所述的培养基成分被加入到装有培养物的容器中。在另一个实施方案中，对于培养部分而言，将所述培养基中糖化合物的总浓度保持在大约1g/L至大约100g/L。在另一个实施方案中，在发酵终产物制备期间，所述培养基中糖化合物的总浓度变化低于大约25％。在另一个实施方案中，所述的发酵终产物为乙醇。在另一个实施方案中，在发酵过程期间，进一步包括至少一次将包含一种或多种含氮材料的培养基成分加入到所述的培养基中，并且其中将所述的培养基成分加入到包含所述培养物的容器中。在另一个实施方案中，一种或多种培养基成分包含一种或多种含氮材料。在另一个实施方案中，所述的培养基包含纤维素或木质纤维素材料。在另一个实施方案中，所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶的酶处理。
在另一个方面中，本文提供了制备发酵终产物的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养梭菌属的菌株；以及在培养梭菌的过程中将一种或多种培养基成分加入到所述的培养基中，其中一种或多种培养基成分包含一种或多种糖化合物，并且根据被梭菌转化为其他化合物的糖的量来加入一种或多种糖化合物。在一个实施方案中，一种或多种培养基成分包含氮源。在另一个实施方案中，所述氮源包括脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。在另一个实施方案中，培养基成分包含纤维素或木质纤维素材料。在另一个实施方案中，所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶的酶处理。
在一个方面中，本文提供了制备发酵终产物的方法，该方法包括：将梭菌菌株的第一接种物加入到培养基中；在适用于制备乙醇的条件下培养梭菌；在将所述的梭菌第一接种物加入到所述培养基中的5个小时之后，将梭菌菌种的其他可行的细胞加入到所述的培养基中；以及由所述培养基中收获发酵终产物。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在加入梭菌的第一接种物之后将一种或多种培养基成分加入到所述的培养基中。在另一个实施方案中，加入培养基成分以及加入可行的细胞可依次发生或同时发生。
在一个方面中，本文提供了制备乙醇的方法，该方法包括以下步骤：由不纯的乙醇材料中除去杂质，从而制备经纯化的乙醇材料，其中所述的经纯化的乙醇材料为高于大约90％(wt.)的乙醇，并且不纯的乙醇材料衍生自通过在分批补料培养物中培养Clostridium phytofermentans细胞而得到的发酵培养基，并且其中所述发酵培养基中的乙醇浓度高于大约7g/L。
在一个方面中，本文提供了制备发酵终产物的方法，该方法包括以下步骤：培养包含Clostridium phytofermentans菌株的培养基，其中所述的发酵终产物以至少大约3g/L-天的瞬间制备率制备。
在一个方面中，本文提供了制备发酵终产物的方法，该方法包括：提供纤维素材料，其中所述的纤维素材料未经外来供给的化学品或酶的处理；将纤维素材料与微生物在培养基中结合，其中所述的培养基不包含外来供给的酶；以及将所述的纤维素材料在足以制备发酵终产物的条件和时间内进行发酵。
在一个方面中，本文提供了制备发酵终产物的方法，该方法包括：在pH调节剂存在下，使Clostridium phytofermentans细胞发酵，其中发酵终产物得以制备。在一个实施方案中，所述的发酵终产物为乙醇。在另一个实施方案中，在大约6.0至大约7.2的pH下使所述细胞发酵。在另一个实施方案中，所述的pH为大约6.5。
在一个方面中，本文提供了制备发酵终产物的方法，该方法包括：在加入的脂肪酸材料存在的条件下，使Clostridium phytofermentans细胞发酵，其中发酵终产物得以制备。在一个实施方案中，包含所述的脂肪酸的材料包含一种或多种玉米油、葵花油、红花油、加拿大油菜油、大豆油、或者油菜籽油。在另一个实施方案中，包含所述的脂肪酸的材料包含磷脂或溶血磷脂。
在一个方面中，本文提供了发酵培养基，该培养基包含Clostridiumphytofermentans细胞以及pH调节剂，其中发酵终产物得以制备。
在一个方面中，本文提供了发酵培养基，该培养基包含Clostridium菌株的细胞以及包含加入的脂肪酸的化合物，其中发酵终产物得以制备。
在一个方面中，本文提供了发酵培养基，该培养基包含Clostridiumphytofermentans的菌株、氮源(包括脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸)以及纤维素或木质纤维素材料。
在一个方面中，本文提供了制备醇的方法，该方法包括：使Clostridium菌株的细胞发酵，并存在pH调节剂和脂肪酸材料，其中发酵终产物得以制备。
在一个方面中，本文提供了燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridium phytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的发酵罐被设置成保持在发酵过程中变化低于大约25％的水平的糖化合物的量。
在一个方面中，本文提供了燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridium phytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的发酵罐被设置成周期性补充所述的培养基以及额外的培养基成分、或者Clostridiumphytofermentans的其他可行细胞。
在一个方面中，本文提供了燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridium phytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的培养基包含pH调节剂以及纤维素或木质纤维素材料。在一个实施方案中，所述的培养基进一步包含脂肪酸材料。
在一个方面中，本文提供了燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridium phytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的培养基包含氮源(包括脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸)以及纤维素或木质纤维素材料。
在一个方面中，本文提供了燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridium phytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的培养基包含脂肪酸材料以及纤维素或木质纤维素材料。
在一个方面中，本文提供了通过在培养基中使用Clostridiumphytofermentans菌株使纤维素或木质纤维素材料发酵来制备的发酵终产物，其中所述的培养基包含在发酵过程中变化低于大约25％的水平的量的糖化合物。
在一个方面中，本文提供了通过在包含pH调节剂的培养基中使用Clostridium phytofermentans菌株使纤维素或木质纤维素材料发酵来制备的发酵终产物。
在一个方面中，本文提供了通过在包含脂肪酸的培养基中使用Clostridium phytofermentans菌株使纤维素或木质纤维素材料发酵来制备的发酵终产物。
在一个方面中，本文提供了通过在包含氮源的培养基中使用Clostridium phytofermentans菌株使纤维素或木质纤维素材料发酵来制备的发酵终产物，其中所述的氮源包含脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。
在本发明的另一个方面中，公开了用于制备乙醇的方法。所述方法包括：(1)使用Clostridium phytofermentans菌株接种于生长培养基中，从而形成培养液；(2)在适于Clostridium phytofermentans生长的条件下培养培养液，并使Clostridium phytofermentans制备乙醇；(3)在Clostridiumphytofermentans存在的同时向所述的培养液中加入一种或多种营养物；以及(4)在适于Clostridium phytofermentans生长的条件下持续培养所述的培养液，并使Clostridium phytofermentans制备乙醇，其中所述的乙醇在培养液中的浓度为大约5g/L或更高。
在上述方法的一个实施方案中，乙醇在培养液中的浓度为大约7g/L或更高。在另一个实施方案中，乙醇在培养液中的浓度为大约9g/L或更高。在另一个实施方案中，乙醇在培养液中的浓度为大约11g/L或更高。在另一个实施方案中，乙醇在培养液中的浓度为大约13g/L或更高。在另一个实施方案中，乙醇在培养液中的浓度为大约10-14g/L。
在另一个实施方案中，所述的生长培养基包含纤维素和/或木质纤维素材料。在另一个实施方案中，所述的生长培养基包含纤维素和/或木质纤维素材料，其中所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶的酶处理。
在另一个方面中，本发明的一个优选的实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)在培养液中培养Clostridium phytofermentans菌株；(2)将培养液中糖化合物的总浓度保持在高于大约18g/L；以及(3)制备浓度为大约10g/L或更高的乙醇。在上述方法的一个实施方案中，在培养过程中的某些时间内，所述培养液包含高于大约7g/L的乙醇。
在另一个实施方案中，保持糖化合物的总浓度包括在培养过程中至少一次向所述的培养液中加入一种或多种培养基补料，其中至少一种补料包含一种或多种糖化合物，其中将所述的培养基补料加入到装有培养物的容器中。
在另一个实施方案中，对于培养部分而言，将所述培养液中糖化合物的总浓度保持在高于大约25g/L。在另一个实施方案中，对于培养部分而言，将所述培养液中糖化合物的总浓度保持在大约30g/L至大约100g/L。
在另一个实施方案中，保持糖化合物的总浓度包括在培养过程中至少一次向所述的培养液中加入一种或多种培养基补料，其中至少一种补料包含一种或多种糖化合物，并且一种或多种培养基补料包含六磷酸肌醇，其中将所述的培养基补料加入到装有培养物的容器中。
在另一个实施方案中，将所述培养液中的糖化合物的总浓度保持一段时间，其中所述的时间段为至少大约10个小时。
在另一个实施方案中，将所述培养液中的糖化合物的总浓度保持一段时间，其中所述的时间段为至少大约10个小时，并且所述培养液中糖化合物的总浓度在所述的时间段内变化低于大约25％。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在发酵过程中至少一次将包含一种或多种含氮材料的培养基补料加入到培养液中，并且其中将所述的培养基补料加入到包含培养物的容器中。
在另一个实施方案中，保持糖化合物的总浓度包括在培养过程中至少一次将一种或多种培养基补料加入到培养液中，其中至少一种培养基补料包含一种或多种糖化合物，并且一种或多种培养基补料包含一种或多种含氮材料，其中将所述的培养基补料加入到包含培养物的容器中。
在另一给实施方案中，所述的培养液包含纤维素或木质纤维素材料。在另一个实施方案中，所述的培养液包含纤维素或木质纤维素材料，并且所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶的酶处理。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)在培养液中培养Clostridium phytofermentans菌株；(2)在Clostridium phytofermentans的培养过程中将一种或多种培养基成分加入到所述的培养液中，其中一种或多种培养基补料包含一种或多种糖化合物，并且根据被Clostridium phytofermentans转化为其他化合物的糖的量加入一种或多种糖化合物，并且加入多于大约10g/L的乙醇。
在上述方法的一个实施方案中，一种或多种培养基成分包含氮源。在另一个实施方案中，一种或多种培养基成分包含氮源，并且该氮源包含脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。在另一个实施方案中，一种或多种培养基成分包含氮源，其中所述的单元包含脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸，并且提供至少0.9g/L的脯氨酸、甘氨酸、组氨酸或异亮氨酸。
在另一个实施方案中，培养Clostridium phytofermentans包括生长期，并且在生长期将至少一部分培养基成分加入到培养液中。
在另一个实施方案中，培养Clostridium phytofermentans包括稳定期，并且在稳定器将至少一部分培养基补料加入到培养液中。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)在适于生存乙醇的条件下培养包含Clostridiumphytofermentans的培养液；以及(2)收集培养液中由Clostridiumphytofermentans制备的乙醇，其中培养液中乙醇的浓度高于大约8g/L。在上述方法的一个实施方案中，在培养Clostridium phytofermentans的过程中，在某些时间点时所述培养液中乙醇的浓度为大约8至大约14g/L。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括在适于制备乙醇的条件下培养包含Clostridiumphytofermentans的培养液，其中所述的培养液包含浓度高于大约8g/L的乙醇。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)将Clostridium phytofermentans的第一接种物加入到培养基中，从而形成培养液；(2)在适于制备乙醇的条件下培养包含Clostridium phytofermentans的培养液；(3)在将Clostridium phytofermentans的第一接种物加入到培养基中之后5个小时以上再将Clostridiumphytofermentans的额外的可行细胞加入到所述的培养液中；以及(4)持续培养所述的培养液，其中制备出高于大约8g/L的乙醇。
在上述方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括在加入Clostridium phytofermentans的第一接种物之后，将一种或多种培养基成分加入到所述的培养液中。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在加入Clostridiumphytofermentans的第一接种物之后，将一种或多种培养基成分加入到所述的培养液中，并且加入培养基成分以及加入可行的细胞可以依次发生或同时发生。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)除去不纯乙醇材料中的杂质，从而制备经纯化的乙醇材料，其中所述的经纯化的乙醇材料高于大约90％(wt)乙醇，并且不纯的乙醇材料衍生自通过在分批补料培养物中培养Clostridium phytofermentans细胞而得到的发酵培养基，并且其中所述发酵培养液中的乙醇浓度高于大约7g/L。
在上述方法的一个实施方案中，由不纯的乙醇材料中除去的杂质包括水。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)使用Clostridium phytofermentans的微生物体接种培养基，从而形成培养液；(2)在示于微生物体生长以及该微生物体制备乙醇的条件下培养所述的培养液；(3)在微生物体存在的同时通过向培养液中加入培养基来增大培养液的体积；以及(4)在适于微生物体生长以及该微生物体制备乙醇的条件下持续培养所述的培养液，其中微生物体的生长期被延长至大约6个小时以上。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)在示于制备乙醇的条件下，培养包含Clostridiumphytofermentans菌株以及氮源的培养液，其中所述氮源包括脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸，其中乙醇的浓度高于或等于大约8g/L。
在上述方法的一个实施方案中，提供至少大约0.09g/L的脯氨酸、甘氨酸、组氨酸或异亮氨酸。在另一个实施方案中，至少一部分氮源得自玉米浆或玉米粉。在另一个实施方案中，所述的培养液进一步包含至少大约0.4g/L的六磷酸肌醇。在另一个实施方案中，所述的培养液进一步包含纤维素或木质纤维素。在另一个实施方案中，所述的培养液进一步包含纤维素或木质纤维素，其中所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶的酶处理。在另一个实施方案中，所述的培养液进一步包含至少大约0.4g/L六磷酸肌醇，并且提供浓度为至少大约0.09g/L的脯氨酸、甘氨酸、组氨酸或异亮氨酸。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)在适于制备浓度高于或等于大约8g/L的乙醇的条件下，培养包含Clostridium phytofermentans的菌株、氮源和六磷酸肌醇的培养液，其中所述的六磷酸肌醇的浓度为大约0.4g/L或更高。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)培养包含Clostridium phytofermentans菌株的培养液，其中以至少大约3g/L-天的瞬间制备率制备乙醇。在所述方法的一个实施方案中，以大约3g/L-天至大约15g/L-天的瞬间速率制备乙醇。在另一个实施方案中，以大约5g/L-天至大约12g/L-天的瞬间制备率制备乙醇。在另一个实施方案中，以大约7g/L-天至大约10g/L-天的瞬间制备率制备乙醇。
在另一个实施方案中，所述的培养液包含六磷酸肌醇。在另一个实施方案中，所述的培养液包含脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。在另一个实施方案中，所述的培养液包含纤维素或木质纤维素材料。在另一个实施方案中，所述的培养液包含纤维素或木质纤维素材料，其中所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶的酶处理。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)使用Clostridium phytofermentans的培养物接种于适于Clostridium phytofermentans生长的培养基，得到Clostridiumphytofermentans的培养液，其中所述的Clostridium phytofermentans培养物之前用于制备乙醇。
在上述方法的一个实施方案中，该方法进一步包括使Clostridiumphytofermentans培养液在适于制备乙醇的条件下生长，制备乙醇，以及回收培养液中的包含乙醇的材料。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使Clostridiumphytofermentans的培养液在高于大约6g/L的乙醇浓度下生长。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使Clostridium phytofermentans的培养液在大约6g/L至大约180g/L的乙醇浓度下生长。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使Clostridium phytofermentans的培养液在大约15g/L至大约160g/L的乙醇浓度下生长。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使Clostridium phytofermentans的培养液在大约20g/L至大约100g/L的乙醇浓度下生长。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使Clostridiumphytofermentans的培养液在大约30g/L至大约80g/L的乙醇浓度下生长。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使Clostridium phytofermentans的培养液在大约8g/L至大约14g/L的乙醇浓度下生长。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使Clostridium phytofermentans培养液在适于制备乙醇的条件下生长，制备乙醇，以及回收培养液中的包含乙醇的材料。
在另一个方面中，本发明的优选实施方案公开了用于制备乙醇的方法。该方法包括：(1)使用一定体积的Clostridium phytofermentans培养物接种一定体积的适于Clostridium phytofermentans生长的培养基，从而得到Clostridium phytofermentans培养液；培养物与培养基培养物的体积比为高于大约0.1至大约1；以及(2)使Clostridium phytofermentans培养液在适于制备乙醇的条件下生长，以及由Clostridium phytofermentans培养液中回收包含乙醇的材料。
在上述方法的一个实施方案中，在使所述培养液生长的同时存在大约8至大约150g/L浓度的乙醇。在另一个实施方案中，培养物与培养基培养物的体积比为高于大约0.2至大约1。在另一个实施方案中，在使所述培养液生长的同时存在高于大约8g/L浓度的乙醇。
本文提供了用于制备燃料的另一种方法和组合物。在一个方面中，本发明提供了用于制备醇的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在加入的pH调节剂存在下使Clostridium phytofermentans细胞发酵，由此制备醇。在一些实施方案中，所述的醇为乙醇。
在该方面的一些实施方案中，在一定的pH下发生细胞发酵，其中所述的pH为大约6.0至大约7.2。在其他实施方案中，在pH下发生细胞发酵，其中所述的pH为大约6.2至大约6.8。
在该方面的一些实施方案中，制备浓度为大约15至大约200g/L的醇。在其他实施方案中，制备浓度为大约15至大约150g/L的醇。在其他实施方案中，制备浓度为大约18至大约100g/L的醇。在其他实施方案中，制备浓度为大约20至大约60g/L的醇。
在本发明的另一个方面中，提供了通过在包含加入的脂肪酸材料存在下使Clostridium phytofermentans细胞发酵来制备醇的方法，由此制备醇。在一些实施方案中，所述的包含脂肪酸的材料为可食用的脂肪或油。在一些实施方案中，所述的包含脂肪酸的材料包含在δ-9位置处为不饱和的脂肪酸。在一些实施方案中，所述的包含脂肪酸的材料包含在o-9位置处为不饱和的脂肪酸。在一些实施方案中，所述的包含脂肪酸的材料包含一种或多种油酸及亚油酸。在一些实施方案中，所述的包含脂肪酸的材料包含一种或多种玉米油、葵花油、红花油、加拿大油菜油、大豆油、或者油菜籽油。在一些实施方案中，所述的包含脂肪酸的材料包含磷脂或溶血磷脂。
在另一个方面中提供了发酵培养液，该培养液包含Clostridiumphytofermentans细胞以及加入的pH调节剂，由此制备醇。
在另一个方面中提供了发酵培养液，该培养液包含Clostridiumphytofermentans细胞以及包含加入的脂肪酸的化合物，由此制备醇。
在本发明的另一个方面中，提供了制备醇的方法，该方法包括使Clostridium phytofermentans细胞发酵，并存在pH调节剂及包含脂肪酸的材料，由此制备醇。
以引用方式并入
本说明书中提及的所有公开、专利以及专利申请均以引用方式并入本文，如同每一份单独的公开、专利以及专利申请都特意且单独地说明以引用方式并入本文。
附图简述
本发明的新型特征在所附的权利要求书中详细列出。通过参见列出了示例性实施方案(其中使用了本发明的原理)以及附图的以下详细描述可以更好地理解本发明的特征以及优势，其中所述附图为：
图1为使用Clostridium phytofermentans分批发酵的底物与乙醇浓度的图。
图2为使用Clostridium phytofermentans分批补料发酵的底物与乙醇浓度的图。
图3为在Clostridium phytofermentans与酵母提取物的发酵过程中作为时间函数的乙醇浓度的图。
图4示出了针对不同的脂肪酸的发酵条件，在一定时间内的乙醇浓度的图。
图5示出了针对不同的pH发酵条件，在一定时间内的乙醇浓度的图。
图6示出了针对不同的脂肪酸和pH的发酵条件，在一定时间内的乙醇浓度的图。
图7为用于转化Clostridium phytofermentans的质粒pIMPT1029的图谱。
图8为由生物质制备发酵终产物的方法的实例，其中所述的生物质是通过在高温和高压下，在水解单元中首先使用酸来处理生物质而得到。
图9描绘了通过将生物质装料到发酵容器中来由生物质制备发酵终产物的方法。
优选实施方案的详述
定义
除非另作说明，否则本文所用的技术及科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
“大约”是指参照数值指示加上或者减去该参照数值指示的10％。例如，术语大约4包括3.6至4.4。
“发酵终产物”在本文中用于包括生物燃料，化学品，适于用作液体燃料的化合物，气体燃料，试剂，化学供料，化学添加剂，加工助剂，食品添加剂以及其他产物。发酵终产物的实例包括但不限于：1，4-二酸(琥珀酸、富马酸以及苹果酸)、2，5-呋喃二羧酸、3-羟丙酸、天冬氨酸、葡萄糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羟丁内酯、甘油、山梨醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、丁二醇、丁醇、甲烷、甲醇、乙烷、乙烯、乙醇、n-丙烷、1-丙烯、1-丙醇、丙醛、丙酮、丙酸酯、n-丁烷、1-丁烯、1-丁醇、丁醛、丁酸、异丁醛、异丁醇、2-甲基丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、2-丁烯、2-丁醇、2-丁酮、2，3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二酮、乙苯、乙烯苯、2-苯乙醇、苯乙醛、1-苯基丁烷、4-苯基-1-丁烯、4-苯基-2-丁烯、1-苯基-2-丁烯、1-苯基-2-丁醇、4-苯基-2-丁醇、1-苯基-2-丁酮、4-苯基-2-丁酮、1-苯基-2，3-丁二醇、1-苯基-3-羟基-2-丁酮、4-苯基-3-羟基-2-丁酮、1-苯基-2，3-丁二酮、n-戊烷、乙基苯酚、乙烯苯酚、2-(4-羟基苯基)乙醇、4-羟基苯乙醛、1-(4-羟基苯基)丁烷、4-(4-羟基苯基)-1-丁烯、4-(4-羟基苯基)-2-丁烯、1-(4-羟基苯基)-1-丁烯、1-(4-羟基苯基)-2-丁醇、4-(4-羟基苯基)-2-丁醇、1-(4-羟基苯基)-2-丁酮、4-(4-羟基苯基)-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-2，3-丁二醇、1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-丁酮、4-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-2，3-丁二酮、吲哚乙烷、吲哚乙烯、2-(吲哚-3-)乙醇、n-戊烷、1-戊烯、1-戊醇、戊醛、戊酸、2-戊烯、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、4-甲基戊醛、4-甲基戊醇、2，3-戊二醇、2-羟基-3-戊酮、3-羟基-2-戊酮、2，3-戊二酮、2-甲基戊烷、4-甲基-1-戊烯、4-甲基-2-戊烯、4-甲基-3-戊烯、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-戊酮、4-甲基-2，3-戊二醇、4-甲基-2-羟基-3-戊酮、4-甲基-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-2，3-戊二酮、1-苯基戊烷、1-苯基-1-戊烯、1-苯基-2-戊烯、1-苯基-3-戊烯、1-苯基-2-戊醇、1-苯基-3-戊醇、1-苯基-2-戊酮、1-苯基-3-戊酮、1-苯基-2，3-戊二醇、1-苯基-2-羟基-3-戊酮、1-苯基-3-羟基-2-戊酮、1-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-1-苯基戊烷、4-甲基-1-苯基-1-戊烯、4-甲基-1-苯基-2-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊醇、4-甲基-1-苯基-2-戊醇、4-甲基-1-苯基-3-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2，3-戊二醇、4-甲基-1-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-1-苯基-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-羟基-3-戊酮、1-(4-羟基苯基)戊烷、1-(4-羟基苯基)-1-戊烯、1-(4-羟基苯基)-2-戊烯、1-(4-羟基苯基)-3-戊烯、1-(4-羟基苯基)-2-戊醇、1-(4-羟基苯基)-3-戊醇、1-(4-羟基苯基)-2-戊酮、1-(4-羟基苯基)-3-戊酮、1-(4-羟基苯基)-2，3-戊二醇、1-(4-羟基苯基)-2-羟基-3-戊酮、1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-戊酮、1-(4-羟基苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)戊烷、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-戊烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-戊烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-1-戊烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-戊醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-戊醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-戊酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-戊酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-戊二醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-羟基-3-戊酮、1-吲哚-3-戊烷、1-(吲哚-3)-1-戊烯、1-(吲哚-3)-2-戊烯、1-(吲哚-3)-3-戊烯、1-(吲哚-3)-2-戊醇、1-(吲哚-3)-3-戊醇、1-(吲哚-3)-2-戊酮、1-(吲哚-3)-3-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、1-(吲哚-3)-2-羟基-3-戊酮、1-(吲哚-3)-3-羟基-2-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3-)戊烷、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-1-戊烯、4-甲基-2-(吲哚-3)-3-戊醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-戊酮、n-己烷、1-己烯、1-己醇、己醛、己酸、2-己烯、3-己烯、2-己醇、3-己醇、2-己酮、3-己酮、2，3-己二醇、2，3-己二酮、3，4-己二醇、3，4-己二酮、2-羟基-3-己酮、3-羟基-2-己酮、3-羟基-4-己酮、4-羟基-3-己酮、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2-甲基-2-己烯、2-甲基-3-己烯、5-甲基-1-己烯、5-甲基-2-己烯、4-甲基-1-己烯、4-甲基-2-己烯、3-甲基-3-己烯、3-甲基-2-己烯、3-甲基-1-己烯、2-甲基-3-己醇、5-甲基-2-己醇、5-甲基-3-己醇、2-甲基-3-己酮、5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮、2-甲基-3，4-己二醇、2-甲基-3，4-己二酮、5-甲基-2，3-己二醇、5-甲基-2，3-己二酮、4-甲基-2，3-己二醇、4-甲基-2，3-己二酮、2-甲基-3-羟基-4-己酮、2-甲基-4-羟基-3-己酮、5-甲基-2-羟基-3-己酮、5-甲基-3-羟基-2-己酮、4-甲基-2-羟基-3-己酮、4-甲基-3-羟基-2-己酮、2，5-二甲基己烷、2，5-二甲基-2-己烯、2，5-二甲基-3-己烯、2，5-二甲基-3-己醇、2，5-二甲基-3-己酮、2，5-二甲基-3，4-己二醇、2，5-二甲基-3，4-己二酮、2，5-二甲基-3-羟基-4-己酮、5-甲基-1-苯基己烷、4-甲基-1-苯基己烷、5-甲基-1-苯基-1-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己烯、5-甲基-1-苯基-3-己烯、4-甲基-1-苯基-1-己烯、4-甲基-1-苯基-2-己烯、4-甲基-1-苯基-3-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己醇、5-甲基-1-苯基-3-己醇、4-甲基-1-苯基-2-己醇、4-甲基-1-苯基-3-己醇、5-甲基-1-苯基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-3-己酮、4-甲基-1-苯基-2-己酮、4-甲基-1-苯基-3-己酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二醇、4-甲基-1-苯基-2，3-己二醇、5-甲基-1-苯基-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-2-羟基-3-己酮、4-甲基-1-苯基-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-苯基-2-羟基-3-己酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)己烷、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-1-己烯、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己烯、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-1-己烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己烯、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己醇、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己醇、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己酮、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己酮、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-羟基-3-己酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-羟基-3-己酮、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3-)己烷、5-甲基-1-(吲哚-3)-1-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-1-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二酮、n-庚烷、1-庚烯、1-庚醇、庚醛、庚酸、2-庚烯、3-庚烯、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2，3-庚二醇、2，3-庚二酮、3，4-庚二醇、3，4-庚二酮、2-羟基-3-庚酮、3-羟基-2-庚酮、3-羟基-4-庚酮、4-羟基-3-庚酮、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、6-甲基-2-庚烯、6-甲基-3-庚烯、2-甲基-3-庚烯、2-甲基-2-庚烯、5-甲基-2-庚烯、5-甲基-3-庚烯、3-甲基-3-庚烯、2-甲基-3-庚醇、2-甲基-4-庚醇、6-甲基-3-庚醇、5-甲基-3-庚醇、3-甲基-4-庚醇、2-甲基-3-庚酮、2-甲基-4-庚酮、6-甲基-3-庚酮、5-甲基-3-庚酮、3-甲基-4-庚酮、2-甲基-3，4-庚二醇、2-甲基-3，4-庚二酮、6-甲基-3，4-庚二醇、6-甲基-3，4-庚二酮、5-甲基-3，4-庚二醇、5-甲基-3，4-庚二酮、2-甲基-3-羟基-4-庚酮、2-甲基-4-羟基-3-庚酮、6-甲基-3-羟基-4-庚酮、6-甲基-4-羟基-3-庚酮、5-甲基-3-羟基-4-庚酮、5-甲基-4-羟基-3-庚酮、2，6-二甲基庚烷、2，5-二甲基庚烷、2，6-二甲基-2-庚烯、2，6-二甲基-3-庚烯、2，5-二甲基-2-庚烯、2，5-二甲基-3-庚烯、3，6-二甲基-3-庚烯、2，6-二甲基-3-庚醇、2，6-二甲基-4-庚醇、2，5-二甲基-3-庚醇、2，5-二甲基-4-庚醇、2，6-二甲基-3，4-庚二醇、2，6-二甲基-3，4-庚二酮、2，5-二甲基-3，4-庚二醇、2，5-二甲基-3，4-庚二酮、2，6-二甲基-3-羟基-4-庚酮、2，6-二甲基-4-羟基-3-庚酮、2，5-二甲基-3-羟基-4-庚酮、2，5-二甲基-4-羟基-3-庚酮、n-辛烷、1-辛烯、2-辛烯、1-辛醇、辛醛、辛酸、3-辛烯、4-辛烯、4-辛醇、4-辛酮、4，5-辛二醇、4，5-辛二酮、4-羟基-5-辛酮、2-甲基辛烷、2-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛烯、7-甲基-3-辛烯、3-甲基-3-辛烯、3-甲基-4-辛烯、6-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛醇、7-甲基-4-辛醇、3-甲基-4-辛醇、6-甲基-4-辛醇、2-甲基-4-辛酮、7-甲基-4-辛酮、3-甲基-4-辛酮、6-甲基-4-辛酮、2-甲基-4，5-辛二醇、2-甲基-4，5-辛二酮、3-甲基-4，5-辛二醇、3-甲基-4，5-辛二酮、2-甲基-4-羟基-5-辛酮、2-甲基-5-羟基-4-辛酮、3-甲基-4-羟基-5-辛酮、3-甲基-5-羟基-4-辛酮、2，7-二甲基辛烷、2，7-二甲基-3-辛烯、2，7-二甲基-4-辛烯、2，7-二甲基-4-辛醇、2，7-二甲基-4-辛酮、2，7-二甲基-4，5-辛二醇、2，7-二甲基-4，5-辛二酮、2，7-二甲基-4-羟基-5-辛酮、2，6-二甲基辛烷、2，6-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛烯、3，7-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛醇、3，7-二甲基-4-辛醇、2，6-二甲基-4-辛酮、3，7-二甲基-4-辛酮、2，6-二甲基-4，5-辛二醇、2，6-二甲基-4，5-辛二酮、2，6-二甲基-4-羟基-5-辛酮、2，6-二甲基-5-羟基-4-辛酮、3，6-二甲基辛烷、3，6-二甲基-3-辛烯、3，6-二甲基-4-辛烯、3，6-二甲基-4-辛醇、3，6-二甲基-4-辛酮、3，6-二甲基-4，5-辛二醇、3，6-二甲基-4，5-辛二酮、3，6-二甲基-4-羟基-5-辛酮、n-壬烷、1-壬烯、1-壬醇、壬醛、壬酸、2-甲基壬烷、2-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬烯、8-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬醇、8-甲基-4-壬醇、2-甲基-5-壬酮、8-甲基-4-壬酮、8-甲基-4，5-壬二醇、8-甲基-4，5-壬二酮、8-甲基-4-羟基-5-壬酮、8-甲基-5-羟基-4-壬酮、2，8-二甲基壬烷、2，8-二甲基-3-壬烯、2，8-二甲基-4-壬烯、2，8-二甲基-5-壬烯、2，8-二甲基-4-壬醇、2，8-二甲基-5-壬醇、2，8-二甲基-4-壬酮、2，8-二甲基-5-壬酮、2，8-二甲基-4，5-壬二醇、2，8-二甲基-4，5-壬二酮、2，8-二甲基-4-羟基-5-壬酮、2，8-二甲基-5-羟基-4-壬酮、2，7-二甲基壬烷、3，8-二甲基-3-壬烯、3，8-二甲基-4-壬烯、3，8-二甲基-5-壬烯、3，8-二甲基-4-壬醇、3，8-二甲基-5-壬醇、3，8-二甲基-4-壬酮、3，8-二甲基-5-壬酮、3，8-二甲基-4，5-壬二醇、3，8-二甲基-4，5-壬二酮、3，8-二甲基-4-羟基-5-壬酮、3，8-二甲基-5-羟基-4-壬酮、n-癸烷、1-癸烯、1-癸醇、癸酸、2，9-二甲基癸烷、2，9-二甲基-3-癸烯、2，9-二甲基-4-癸烯、2，9-二甲基-5-癸醇、2，9-二甲基-5-癸酮、2，9-二甲基-5，6-癸二醇、2，9-二甲基-6-羟基-5-癸酮、2，9-二甲基-5，6-癸二酮-十一烷、1-十一烷、1-十一醇、十一醛、十二烷酸、n-十二烷、1-十二烯、1-十二醇、十二醛、十二烷酸、n-十二烷、1-decadecene、1-十二醇、ddodecanal、十二烷酸、n-十三烷、1-十三烯、1-十三醇、十三醛、十三烷酸、n-十四烷、1-十四烯、1-十四醇、十四醛、十四烷酸、n-十五烷、1-十五烯、1-十五醇、十五醛、十五烷酸、n-十六烷、1-十六烯、1-十六醇、十六醛、十六酸、n-十七烷、1-十七烯、1-十七醇、十七醛、十七酸、n-十八烷、1-十八烯、1-十八醇、十八醛、十八酸、n-十九烷、1-十九烯、1-十九醇、十九醛、十九酸、二十烷、1-二十烯、1-二十醇、二十醛、二十酸、3-羟基丙醛、1，3-丙二醇、4-羟基丁醛、1，4-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二醇、1，5-戊二醇、高柠檬酸、高异柠檬酸酯、b-羟基己二酸、戊二酸、戊二酰半醛、戊二醛、2-羟基-1-环戊酮、1，2-环戊二醇、环戊酮、环戊醇、(S)-2-乙酰乳酸、(R)-2，3-二羟基-异戊酸、2-氧代异戊酸酯、异丁酰-CoA、异丁酸酯、异丁醛、5-氨基戊醛、1，10-二氨基癸烷、1，10-二氨基-5-癸烯、1，10-二氨基-5-羟基癸烷、1，10-二氨基-5-癸酮、1，10-二氨基-5，6-癸二醇、1，10-二氨基-6-羟基-5-癸酮、苯基乙酰乙醛、1，4-二苯基丁烷、1，4-二苯基-1-丁烯、1，4-二苯基-2-丁烯、1，4-二苯基-2-丁醇、1，4-二苯基-2-丁酮、1，4-二苯基-2，3-丁二醇、1，4-二苯基-3-羟基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-苯基丁烷、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-1-丁烯、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-2-丁烯、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-2-丁醇、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-2，3-丁二醇、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-3-羟基-2-丁酮、1-(吲哚-3)-4-苯基丁烷、1-(吲哚-3)-4-苯基-1-丁烯、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁烯、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁醇、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁酮、1-(吲哚-3)-4-苯基-2，3-丁二醇、1-(吲哚-3)-4-苯基-3-羟基-2-丁酮、4-羟基苯基乙酰乙醛、1，4-二(4-羟基苯基)丁烷、1，4-二(4-羟基苯基)-1-丁烯、1，4-二(4-羟基苯基)-2-丁烯、1，4-二(4-羟基苯基)-2-丁醇、1，4-二(4-羟基苯基)-2-丁酮、1，4-二(4-羟基苯基)-2，3-丁二醇、1，4-二(4-羟基苯基)-3-羟基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3-)丁烷、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-1-丁烯、1-二(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁烯、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁醇、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2，3-丁二醇、1-(4-羟基苯基-4-(吲哚-3)-3-羟基-2-丁酮、吲哚-3-乙酰乙醛、1，4-二(吲哚-3-)丁烷、1，4-二(吲哚-3)-1-丁烯、1，4-二(吲哚-3)-2-丁烯、1，4-二(吲哚-3)-2-丁醇、1，4-二(吲哚-3)-2-丁酮、1，4-二(吲哚-3)-2，3-丁二醇、1，4-二(吲哚-3)-3-羟基-2-丁酮、琥珀酸半醛、己烷-1，8-二羧酸、3-己烯-1，8-二羧酸、3-羟基-己烷-1，8-二羧酸、3-己酮-1，8-二羧酸、3，4-己二醇-1，8-二羧酸、4-羟基-3-己酮-1，8-二羧酸、岩藻依聚糖、碘、叶绿素、类胡萝卜素、钙、镁、铁、钠、钾、磷酸、乳酸、乙酸、甲酸、类异戊二烯和聚异戊二烯包括橡胶。此外，此类产物可以包括琥珀酸、丙酮酸、酶(例如纤维素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木质酶以及半纤维素酶)，并且可以以纯的化合物、混合物或者不纯或稀释的形式存在。
如本文所用，术语“包含脂肪酸的材料”具有本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括含有一个或多个脂肪酸部分的一种或多种化学化合物及这些化合物的衍生物，以及包含一种或多种这些化合物的材料。包含一个或多个脂肪酸部分的化合物的普通实例包括三乙酰甘油、二乙酰甘油、单乙酰甘油、磷脂、溶血磷脂、游离的脂肪酸、脂肪酸盐、肥皂、包含脂肪酸的氨基化合物、脂肪酸与一羟基醇形成的酯、脂肪酸与多羟基醇(包括多元醇(例如乙二醇、丙二醇等))形成的酯、脂肪酸与丙二醇形成的酯、脂肪酸与聚醚形成的酯、脂肪酸与聚乙二醇形成的酯、脂肪酸与糖形成的酯、脂肪酸与其他含羟基化合物形成的酯等。包含脂肪酸的材料可以为经分离或纯化形式的一种或多种此类化合物。其可以为包含一种或多种类化合物的材料，其中所述化合物可与其他相同或不同的材料结合或共混。其可以为这样的材料，其中包含脂肪酸的材料与其他相同或不同的材料一起形成或者一起提供，例如植物油和动物油；植物油与动物油的混合物；植物油和动物油的副产物；植物油与动物油副产物的混合物；植物与动物蜡酯；植物与动物蜡酯的混合物、衍生物及副产物；种子；经加工的种子；种子副产物；坚果；经加工的坚果；坚果副产物；动物物质；经加工的动物物质；动物物质副产物；玉米；经加工的玉米；玉米副产物；酒糟；豆类；经加工的豆类；豆类副产物；大豆产物；包含液体的植物；鱼或动物物质；经加工的包含液体的植物或动物物质；包含液体的植物、鱼或动物物质的副产物；包含液体的微生物物质；经加工的包含液体的微生物物质；以及包含液体的微生物物质的副产物。此类材料可以以液体或固体形式使用。固体形式包括整体形式，例如细胞、豆类及种子；研磨的、剁碎的、浆化的、提取的、碎片的、磨粉的等等。包含脂肪酸的化合物的脂肪酸部分可以为简单的脂肪酸，例如包含与取代的或非取代的烷基连接的羧基的那些。取代的或非取代的烷基可以为直链的或支化的，饱和的或不饱和的。在烷基上的取代可以包括羟基、磷酸、卤素、烷氧基或芳基。取代的或非取代的烷基可以在直链(具有或不具有侧链和/或取代)上排布有7至29个碳，并且优选的是排布有11至23个碳(例如8至30个碳，并且优选的是12至24个碳，算上羰基)。加入包含脂肪酸的化合物可以通过加入包含具有脂肪酸的化合物的材料来进行。
如本文所用，术语“pH调节剂”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括趋向升高、降低或保持培养液或培养基的pH稳定的任何材料。pH调节剂可以为酸、碱、缓冲剂或者与呈现出起到升高、降低或保持pH稳定的其他材料发生反应的材料。在一些实施方案中，可以使用多于一种的pH调节剂，例如对于一种的酸、对于一种的碱、一种或多种酸与一种或多种碱、一种或多种酸与一种或多种缓冲剂、一种或多种碱与一种或多种缓冲剂、或者一种或多种酸与一种或多种碱与一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，可以在培养液或培养基中或者单独的制备缓冲剂，并且可以用作通过酸或碱分别与碱或酸分别至少部分发生反应的组分。当使用多于一种的pH调节剂时，可以同时或不同时加入它们。在一些实施方案中，可以将一种或多种酸与一种或多种碱结合，从而得到缓冲剂。在一些实施方案中，培养基成分(例如碳源或氮源)也可以用作pH调节剂；合适的培养基成分包括具有高或低pH的那些，或者具有缓冲能力的那些。示例性的培养基成分包括具有残留的酸或碱的酸水解或碱水解的植物多糖，具有残留的氨、乳酸、玉米粉或玉米浆的经氨法爆破(AFEX)处理的植物材料。
如本文所用，术语“发酵”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括在适用于微生物体的培养基中或培养基上培养一组或几组微生物体。所述的微生物体可以为需氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌、异氧生物、自养生物、光合自养生物、光合异氧生物、化能自养生物和/或化能异养生物。所述的微生物体可以在需氧或厌氧条件下生长。它们可以在生长的任何阶段，包括停滞期(或者传导期(conduction))、指数期、过渡期、稳定期、死亡期、潜伏期、繁殖期、孢子形成期等。
“生长期”在本文中用于描述在“初始期”之后且在“稳定期”和“死亡期”之前发生的细胞生长类型。生长期有时称为指数期或对数期或对数生长期。
如本文所用，术语“植物多糖”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括糖及糖衍生物的一种或多种聚合物，以及糖聚合物的衍生物和/或治安植物物质中形成的其他聚合物材料。植物多糖的实例包括木质素、纤维素、淀粉、胶质和半纤维素。其他实例为壳质、磺化多糖(例如藻酸)、琼脂糖、角叉菜胶、金属卟啉、红藻胶和海萝聚糖。通常，所述的多肽可以具有两个或多个糖单元或者糖单元的衍生物。通常，所述糖单元和/或糖单元的衍生物可以以规则图案或其他方式重复。所述的糖单元可以为己糖单元或戊糖单元、或者它们的组合。糖单元的衍生物可以为糖醇、糖酸、氨基糖等。所述的多糖可以为线性、支化、交联或它们的混合物。一种类型或种类的多肽可以与另一种类型或种类的多糖交联。
如本文所用，术语“可发酵的糖”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括可以用作微生物体的碳源的一种或多种糖和/或糖衍生物，包括单体、二聚体、以及这些化合物的聚合物(包括这些化合物中的两种或多种)。在一些情况下，所述的有机体可以在引入破裂的材料之前(例如)通过水解将这些聚合物破裂。示例性的可发酵的糖包括但不限于葡萄糖、木糖、树胶醛糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和果糖。
如本文所用，术语“糖化作用”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括将植物多糖转化为低分子量的所述有机体临近可用的种类。对于一些有机体而言，糖化作用包括转化为单糖、二糖、三塘、以及至多大约7个单体单元的寡糖，以及相似尺寸的链的糖衍生物，以及糖及糖衍生物的组合。对于一些有机体而言，可行的链长可以更长；而对于一些有机体而言，可行的链长可以更短。
如本文所用，术语“生物质”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括可转化为生物燃料、化学品或其他产物的一种或多种生物材料。生物质的一个示例性来源为植物物质。植物物质可以为(例如)木本植物物质、非木本植物物质、纤维素材料、木质纤维素材料、半纤维素材料、碳水化合物、胶质、淀粉、菊粉、果聚糖、葡聚糖、玉米、甘蔗、草、柳枝稷、竹、海藻以及它们所衍生的材料。可以通过参见存在的化学物质(例如蛋白质、多糖和油)来进一步描述物质物质。多糖包括多种单糖的聚合物以及单糖的衍生物，所述单糖包括葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖等。此外，植物物质还包括农业肥料副产物或侧流，例如果渣、玉米浆、玉米粉、酒糟、果皮、pit、发酵废料、麦秆、木料、污物、垃圾和剩饭菜。这些材料可以得自农场、森林、工业来源、家庭等。生物质的另一个非限定性实例为动物物质，包括(例如)牛奶、肉、脂肪、动物加工废料以及动物废料。“供料”通常用于指用于加工的生物质，例如本文所述的那些。
“培养液”在本文中用于指处于生长的任何阶段的接种培养基，包括在接种后即刻的时间点以及在任何或者所有细胞活性终止之后的时期，并且可以包括在发酵加工后的材料。培养液包括可溶及不可溶物质、悬浮物质、细胞和培养基的组合的全部内含物(如果合适)。
如本文所用，术语“制备率”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括在给定体积给定时间内制备的所关注材料的质量。单位可以为(例如)克/升-小时，或者质量、体积及时间的一些其他组合。在发酵中，制备率通常用于表征可以在给定的发酵体积下以多快来制备产物。所述体积可以指发酵容器的总体积、发酵容器的工作体积或者发酵培养液的实际体积。短语的内容是指本领域的技术人员所认为的含义。制备率不同于“效价”，在于制备率包括时间项，而效价与浓度相似。通常可以在发酵过程中在任何时间(在开始、结束或者在一些中间时间)测量效价和制备率，其中效价与在所关注的时间点下存在的或所产生的特定材料的量有关，而制备率与在给定时间量中每升所产生的特定材料的量有关。在确定制备率中使用的时间量可以为由发酵开始或者由一些其他时间开始并持续到发酵结束，例如当无额外材料产生时或者当进行收获时，或者如所用术语的内容所示的一些其他时间。“总体制备率”是指通过使用最终效价以及总体发酵时间所确定的制备率。“制备率与最大效价”是指使用最大效价以及取得最大效价的时间来确定的制备率。“瞬间制备率”是指在一段时间内的某一刻的制备率，并且对于所关注的化合物可以由效价与时间曲线的斜率确定，或者通过由操作环境以及语言内容所确定的其他合适的方式。“增量制备率”是指经历一部分发酵时间的制备率，例如几分钟、一小时或几小时。通常，增量制备率用于暗示或接近瞬间制备率。根据表明应该怎样确定所述值的内容，可以良好地使用其他类型的制备率。
“效价”是指在发酵培养液中存在的特定材料的量。其与浓度相似，并且可以指在得自所有发酵循环的培养液中由有机体制得的材料的量，或者在当前发酵循环或在给定的时间段内制得的材料的量，或者由任何来源(例如由有机体产生或者加入到培养液中)中存在的材料的量。根据在某些情况下、表明哪一个系统与所预计的两个参照系统一起使用的内容，通常，可溶物质的效价是指不溶物质被除去的培养液的液体部分，并且不溶物质的效价是指存在不溶物质的培养液的总量，而且，可溶物质的效价可以指培养液的总体积，而不溶物质的效价可以指液体部分。通常，参照一个系统所确定的值可以与参照其他系统的值相同或者足够接近。当“浓度”用于指培养液中的材料时，其通常是指由所有来源中存在的材料的量，无论是有机体制备的还是加入到培养液中的。浓度可以指可溶物质或不溶物质，并且就“效价”而言，可以指培养液的液体部分或者培养液的总体积，
如本文所用，术语“生物催化剂”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括一种或多种酶及微生物体，包括溶液、悬浮液以及酶与微生物体的混合物。在一些内容中，所述词语是指酶或微生物体的可行的用途，从而起到特定的功能，在其他内容中，所述词语是指酶与微生物体的结合用途，而在其他内容中，所述词语仅指酶与微生物体中的一者。所述短语的内容表明了本领域技术人员所预计的含义。
如本文所用，术语“转化效率”或“产率”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括由底物质量得到的产物的质量。该术语可以表达为由底物起始质量得到的产物的百分产率。就由葡萄糖来制备乙醇而言，净反应通常公认为：
C6H12O6→2C2H5OH+2CO2
并且理论最大转化效率或产率为51％(wt)。通常，所述的转化效率是指理论最大值，例如“理论最大值的80％”。在将葡萄糖转化为乙醇的情况下，该陈述表明转化效率为41％(wt)。所述短语的内容是指本领域的技术人员所预计的底物和产物。
如本文所用，“预处理”或“预处理的”是指任何机械、化学、热、生物化学过程或者不管是在结合步骤中或者是依次实施的这些过程的组合，其使得所述生物质被破坏或膨胀，从而使得所述的生物质更容易受到酶和/或微生物的攻击。在一些实施方案中，预处理可以包括除去或破坏木质素，使得植物生物质中的纤维素和半纤维素聚合物更容易受到纤维素水解酶和/或微生物的作用，例如通过使用酸或碱进行处理。在一些实施方案中，预处理可以包括使用一种类型的微生物体从而使得植物多糖更容易受到另一种类型的微生物体的作用，例如通过使用酸或碱进行处理。在一些实施方案中，预处理还可以包括使纤维素和/或半纤维素材料被破坏或膨胀。蒸汽爆破和氨纤维膨胀(或爆破)(AFEX)是公知的热/化学技术。可以采用水解方法(包括使用酸、碱和/或酶的方法)。此外，还可以使用其他热、化学、生物化学、酶技术。
“分批补料”或“分批补料发酵”在本文中包括这样的方法，在培养过程中向发酵罐中供入营养物、其他培养基成分或生物催化剂(例如包括酶、新鲜的有机体、细胞外培养液等)的条件下培养微生物体，但是直到发酵结束才由所述的发酵罐中收获培养物培养液，而且所述方法还可以包括“自我接种”或“部分收获”的技术，其中发酵罐体积的一部分被收获，然后将新鲜的培养基加入到发酵罐中剩余的培养液中，并且至少一部分接种物为留在发酵罐中的培养液。在分批补料发酵过程中，通过在发酵有机体存在的同时向培养液中加入培养基或营养物可以至少在一段时间内使培养液的体积增加。在一些分批补料发酵中，培养液的体积对于加入的营养物是不灵敏的，并且在一些情况下，培养液的体积并未因为加入营养物而改变。可以使用的合适的营养物包括可溶的、不溶的以及部分可溶的那些，包括气体、液体和固体。在一些实施方案中，分批补料可以称为诸如“具有细胞增量的分批补料”之类的短语。该短语可以包括其中加入营养物和细胞的操作，或者其中加入不具有大量营养物的细胞的操作。更通常的短语“分批补料”也同样涵盖了这些操作。其中使用了这些短语中的任何一个短语的内容都已经向所考虑的技术领域的技术人员表明。
如本文所用，术语“六磷酸肌醇”具有本领域的技术人员已知的普通含义，并且可以包括质子酸、其盐、其结合形式以及这些物质的组合。
“糖化合物”在本文中包括单糖类的糖，包括但不限于己糖和戊糖；糖醇；糖酸；糖胺；包含通过共价键或离子键直接或间接连接在一起的两种或多种上述物质的化合物；以及它们的混合物。二糖、三糖、寡糖、多糖以及任意长度的支化和/或线性的糖链都被包含在本说明书中。
“细胞干重”在本文中是指确定培养液或接种物的细胞含量以及如此确定的体积的方法。通常，所述方法包括漂洗或洗涤一定体积的培养液，然后干燥并称重残余物，但并非一定如此。在一些情况下，将培养液样品简单离心，并收集含细胞的层，干燥并称重。通常，将培养液离心，然后悬浮于水或者水与其他组分(例如缓冲剂、能够产生等渗条件的组分、能够控制渗透压的任何变化的组分等)的混合物中。如果需要，可以重复离心悬浮步骤，并可以使用不同的悬浮溶液，然后进行最终的离心和干燥。当存在不溶的培养基成分时，可以忽略不溶成分的存在，并按照上文所述确定所述的体积。当存在不溶的培养基成分时，优选的方法包括其中不溶成分与可溶形式反应、溶解或提取到可以包含水的不同溶剂中、或者通过合适的方法(例如通过离心、组分离心、浮式离心、过滤、其他合适的技术或这些技术的组合)分离的那些。
描述
以下叙述和实例详细说明了本公开发明的一些示例性实施方案。本领域的技术人员认识到存在大量的被本发明的范围所涵盖的本发明的变态和修改。因此，对于某些示例性实施方案的叙述不应该认为限定了本发明的范围。
C.phytofermentans(″Q微生物″)包括美国模式菌株保藏中心700394T，并且在一些实施方案中可以根据培养菌株(ISDgT(Warnick et al.，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，52：1155-60，2002))的表现型和基因型特征来定义。本发明的几个方面通常包括用于制备燃料(例如乙醇和/或其他有用的有机产物)的系统、方法和组合物，包括(例如)菌株ISDgT和/或菌种Clostridium phytofermentans的任何其他菌株，包括可以由菌株ISDgT衍生的到的那些，通常包括基因改性的菌株或单独分离的菌株。可以使用标准的分类系统考量来定义一些示例性的菌种(Stackebrandt and Goebel，International Journal of Systematic Bacteriology，44：846-9，1994)：与模式菌株(ISDgT)的16S rRNA序列同源性值为97％且更高的菌株，并且DNA复性值(re-association value)为至少大约70％的菌株可以认为是Clostridium phytofermentans。存在大量的证据表明DNA复性值为70％或更高的许多微生物还具有至少96％的DNA序列一致性，并且共有定义了菌种的表现型特征。对Clostridium phytofermentans菌株ISDgT的基因组序列的分析表明存在大量的可能涉及植物多糖发酵的机制和途径的基因和基因座，从而形成该微生物的独特的发酵性质，其中所述性质可以在菌种Clostridium phytofermentans的所有或者几乎所有的菌株中找打。Clostridium phytofermentans菌株可以为天然分离的，或者为基因修饰的菌株。
C.phytofermentans的特性
对于生物质向乙醇以及其他产物的转化而言，所述的“Q”微生物提供了有用的益处。Q微生物的一个益处为其能够制备能够将多糖以及更高分子量的糖水解为低分子量的糖(例如寡糖、二糖和单糖)的酶。Q微生物能够产生光谱的水解酶，这些酶可以有利于多种生物质材料的发酵，其中所述的材料包括：纤维素、半纤维素、木质纤维素材料；胶质；淀粉；木料；纸张；农产物；森林废料；树木的废料；树皮；树叶；草；锯齿草；木本植物物质；非木本植物物质；碳水化合物；胶质；淀粉；菊粉；果聚糖；葡聚糖；玉米；甘蔗；草；竹、海藻以及由这些材料衍生的材料。所述的有机体通常可以根据需要制备这些酶，并且通常不会过多的制备不需要的水解酶，或者在一些实施方案中，可以加入一种或多种酶从而进一步改善有机体的制备能力。在生物质的发酵(特别是未使用单糖作为供料的那些发酵)中，制备多种水解酶的能力使得Q微生物以及相关技术具有不同的益处。各种发酵条件可以增强有机体的活性，从而得到更高的产率、更高的制备率、更高的产物选择性和/或更高的转化效率。在一些实施方案中，发酵条件可以包括分批补料操作以及具有细胞增量的分批补料操作；加入复合氮源，例如玉米粉或酵母提取物；加入特定氨基酸，包括脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和/或组氨酸；加入包含这些氨基酸中的一种或多种的复合材料；加入其它营养物或其它化合物，例如六磷酸肌醇、蛋白酶或多糖酶。在一个实施方案中，发酵条件可以包括补充具有有机氮源的培养基。在另一个实施方案中，发酵条件可以包括补充具有无机氮源的培养基。在一些实施方案中，加入一种材料可以提供满足多于一种类别的补充物，例如提供氨基酸和六磷酸肌醇。
在一些实施方案中，例如在用于发酵的制备中，所述的Q微生物有机体可以用于将生物质中存在的多种高级糖(较高的分子量)水解成低级糖(较低分子量)，由此生成乙醇、氢或者其它化学品，例如有机酸(包括甲酸、乙酸和乳酸)。Q微生物的另一个益处为其能够将包含己糖单元或包含戊糖单元、以及包含这二者的多糖和高级糖水解成低级糖，在一些情况下，水解成单糖。这些酶和/或水解物可以用于发酵中，从而制备包括燃料和其它化学品在内的多种产物。Q微生物的另一个益处为其能够由低级糖(较低分子量，例如单糖)制备乙醇、氢以及其它燃料或化合物，例如有机酸，包括乙酸、甲酸和乳酸。Q微生物的另一个益处为其能够进行结合步骤：将包含糖和/或高级糖或多糖的较高分子量的生物质水解成低级糖；以及将这些低级糖发酵形成所需的产物，包括乙醇、氢以及其它化合物，例如有机酸，包括甲酸、乙酸和乳酸。
所述的Q微生物的另一个益处为其能够在包含较高浓度的乙醇、高浓度的糖以及低浓度的糖的条件下生长，能够使用不溶碳源和/或在厌氧条件下操作。这些特征(以多种组合的方式)可以用于取得在较长的发酵周期下操作，并且可以与分批发酵、分批补料发酵、自我接种/部分收获发酵以及得自最终发酵的细胞作为接种物的再循环相结合。
通常，诸如细胞再循环以及部分收获发酵之类的技术由于这些技术所固有的多种问题而并非经常用于制备规模的操作中。例如，“培养物耗尽”(其中简单而言，细胞不能如同原始或早期发酵那样以充足或相似的产率和/或制备率提供随后的发酵)是常见的。此外，使用用于延长时间的单一培养物的操作(特别是当培养液被收获，并且存在发生贫瘠的风险时)可以导致培养物以及使用该培养物的污染的显著问题。结果，用于细胞再循环和/或部分收获发酵的有机体的适用性通常不被预期。
在一些情况下，用于将生物质材料转化为乙醇的方法包括对生物材料(例如“供料”)进行预处理；将经过预处理的生物质水解从而将多糖转化为寡糖；将所述的寡糖进一步水解为单糖；以及将所述的单糖转化为乙醇。在一些情况下，所述的生物质可以直接被水解成单糖或者其他糖，其中所述的单糖或其他糖可以被发酵有机体利用从而制备乙醇或其他产物。如果需要不同的终产物，可以在特定化合物的生物合成中使用所述的单糖，其中所述的终产物例如为碳水化合物；氢；甲烷；羟基化合物，例如醇(例如丁醇、丙醇、甲醇等)；羰基化合物，例如醛和酮(例如丙酮、甲醛、1-丙醛等)；有机酸；有机酸的衍生物，例如酯(例如蜡酯、甘油酯等)；以及其他官能化合物，包括但不限于1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、酶(例如纤维素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木质酶以及半纤维素酶)。可以使用的生物质材料包括木本植物物质、非木本植物物质、纤维素材料、木质纤维素材料、半纤维素材料、碳水化合物、胶质、淀粉、菊粉、果聚糖、葡聚糖、玉米、甘蔗、草、柳枝稷、竹以及它们所衍生的材料。然后，根据所需的终产物的性质所示，来分离和/或纯化所述的终产物。在一些情况下，还可以使用与糖有关的化合物(例如糖醇或糖酸)。
在这种实施方案中，可以在给定的时间发生多于一步的所述这些步骤。例如，经预处理的供料的水解以及寡糖的水解可以同时发生，并且这些步骤中的一步或多步可以与单糖向乙醇的转化过程同时发生。
在一些情况下，酶可以直接将多糖转化为单糖。在一些情况下，酶可以将多糖水解成寡糖，并所述的酶或者另一种酶可以将寡糖水解成单糖。
在一个实施方案中，在发酵中存在的酶可以单独制备，然后加入到发酵物中，或者它们可以通过发酵物中存在的微生物体制备。在另一个实施方案中，发酵物中存在的微生物体可以制备一些酶，并且一些酶可以单独制备并加入到所述的发酵物中。
对于在较高的速率下发生的经过预处理的生物质完全转化为终产物而言，各个转化步骤需要存在具有足够高活性的各种必需的酶。如果这些酶中的一种酶缺失或者存在的量不足，则乙醇或者其他所需产物的制备速率就会降低。此外，如果负责单糖转化为产物的微生物体仅仅缓慢地用去单糖和/或仅具有有限的移动在转化为乙醇的过程中所产生的单糖和中间体的能力，则制备速率也可能会降低。
在一个实施方案中，所述方法的酶是由Q微生物本身产生的，包括适用于在发酵方法中使用的生物质材料的多种水解酶。在一个实施方案中，Q微生物是在适于减少和/或促进多糖的糖化作用所需的酶的制备的条件下生长的。这些酶的制备可以在单独的容器中进行，例如种子发酵罐或者其他发酵容器，或者在其中发生乙醇制备的制备发酵罐中进行。当在单独的容器中制备酶时，所述的微生物可以(例如)与细胞一起转移至制备发酵罐中，或者作为具有酶的、包含细胞的相对游离溶液液体的细胞内培养基。当在单独的容器中制备酶时，它们还可以被干燥和/或纯化，然后将它们加入到制备发酵罐中。适于制备所述酶的条件通常通过使细胞在培养基(其包含生物质)中生长来管理，使得所述细胞在随后的发酵步骤中预计被水解。其他培养基成分(例如盐补充物、生长因子以及辅助因子，包括但不限于六磷酸肌醇、氨基酸以及肽)还可以在所相互产物的制备中帮助被微生物体使用的酶的制备。
供料以及供料的预处理
可以包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的供料可以衍生自农作物、农作物残余物、树木、木片、锯末、纸张、硬纸板、草以及其他来源。
纤维素为葡萄糖的线性聚合物，其中所述的葡萄糖单元通过β(1→4)键连接。半纤维素为大量糖单体的支化聚合物，其中所述的糖单体包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、以及树胶醛糖，并且半纤维素还可以具有糖酸，例如甘露糖醛酸以及半乳糖醛酸。木质素为大部分的对香豆醇、conferyl醇以及芥基(sinapyl)醇的交联外消旋大分子。这三种聚合物在植物生物质的木质素纤维素材料中一起形成。这三种聚合物的不同特征使得它们的组合难以水解，这是因为各种聚合物往往会保护其他聚合物被酶攻击。
在本发明的一个方面中，提供了在生物燃料和乙醇的发酵以及制备中使用的供料的预处理方法。预处理步骤可以包括机械、热、压力、化学、热化学和/或生物化学测试预处理，然后用于生物加工，以用于制备燃料和化学品，但是未经预处理的生物质材料也可以用于所述的加工中。机械加工可以减小生物质材料的粒径，使得所述材料可以在生物加工中更方便处理，并且增大供料的表面积从而有利于与化学品/生物化学品/生物催化剂相接触。机械加工还可以将一种类型的生物质材料与另一种生物质材料分离。所述的生物质材料还可以经历热和/或化学预处理，使得植物聚合物更容易获得。此外，还可以使用多个处理步骤。
机械加工包括但不限于洗涤、浸渍、磨粉、尺寸减小、筛选、剪切、尺寸分类、以及密度分类加工。化学加工包括但不限于漂白、氧化、还原、酸处理、碱处理、亚硫酸盐处理、酸性亚硫酸盐处理、碱性亚硫酸盐处理、氨水处理以及水解。热加工包括但不限于灭菌、氨纤维膨胀或爆破(AFEX)、争气爆破、保持在高温下、加压或减压、水存在或水缺乏、以及冷冻。生物化学加工包括但不限于使用酶进行处理以及使用微生物体进行处理。可以使用的多种酶包括纤维素酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶、以及其他多糖酶；溶解酶；漆酶、以及其他改性木质素的酶；脂肪氧合酶、过氧化物酶以及其他氧化酶；蛋白酶；以及脂肪酶。机械、化学、热、热化学以及生物化学加工中的一种或多种可以结合或者单独使用。这种结合的加工还可以包括在制备纸张、纤维素产物、微晶纤维素以及纤维素中使用的那些，并且开业包括制浆、硫酸盐法制浆、酸性亚硫酸盐加工。所述供料可以为对生物质材料(例如纤维素、半纤维素或木质纤维素材料)使用一个或多个所述这些加工的工厂的侧流或废料流。实例包括造纸厂、纤维素植物棉加工厂、以及微晶纤维素厂。此外，所述供料还包括包含纤维素或包含纤维素废料。此外，所述供料还可以为生物质材料，例如树木、草、玉米、淀粉、或糖，它们均为按照预计供料制备或收获的，以用于(例如)Clostridium phytofermentans制备乙醇或其他产物。
在其他实施方案中，本发明的方法使用了在美国专利及专利申请US20040152881、US20040171136、US20040168960、US20080121359、US20060069244、US20060188980、US20080176301、5693296、6262313、US20060024801、5969189、6043392、US20020038058、US5865898、US5865898、US6478965、5986133、US20080280338中公开的预处理方法，其中所述的文献通过引用方式全文并入本文。
在另一个实施方案中，AFEX加工可以用于生物质的预处理。在优选的实施方案中，AFEX加工用于发酵成乙醇或其他产物的纤维素、半纤维素或木质纤维素材料的制备。该加工通常包括将供料与氨结合，在压力下加热，以及突然释放压力。可以存在各种量的水。AFEX加工为许多专利及出版物的主题。
在另一个实施方案中，生物质的预处理包括将氢氧化钙加入到生物质中，从而使所述的生物质容易降解。预处理包括将氢氧化钙和水加入到生物质中，从而形成混合物；以及将所述的混合物保持在相对高的温度下。备选地，可以在压力下将选自氧气及含氧气体的氧化剂加入到混合物中。carbon hydroxide处理的实例在Holtzapple and S.Kim and M.T.Holzapple，Bioresource Technology，96，(2005)1994的美国专利中有所公开，其中所述文献以引用方式全文并入本文。
在其他实施方案中，生物质的预处理包括稀释酸的水解。稀释酸水解处理的实例在T.A.Lloyd and C.E Wyman，Bioresource Technology，(2005)96，1967)中有所公开，其中所述文献以引用方式全文并入本文。
在其他实施方案中，生物质的预处理包括pH受控的液体热水处理。pH受控的液体热水处理的实例在N.Mosier et al.，Bioresource Technology，(2005)96，1986中有所公开，其中所述文献以引用方式全文并入本文。
在其他实施方案中，生物质的预处理包括氨水再循环加工(ARP)。氨水再循环加工的实例在T.H.Kim and Y.Y.Lee，Bioresource Technology，(2005)96，2007中有所公开，其中所述文献以引用方式全文并入本文。
在一些实施方案中，上文提及的方法具有两个步骤：预处理步骤，其会形成洗涤流；以及经预处理的生物质的酶水解步骤，其制备了水解产物流。在上述方法中，在实施预处理的pH包括酸水解，热水预处理，或者基于碱性试剂的方法(AFEX、ARP以及石灰预处理)。稀释酸及热水处理方法使得大部分的半纤维素溶解，而使用碱性试剂的方法在预处理步骤中除去了大部分的木质素。结果，在前述方法中的预处理步骤得到的洗涤流包含大部分基于半纤维素的糖，而对于高pH方法而言，所述的洗涤流具有大部分的木质素。残余生物质的随后的酶水解在基于碱性的预处理方法中得到混合的糖(C5和C6)，而葡萄糖为得自低至中性pH方法的水解产物中的主要产物。对于高pH方法而言，残余生物质的酶消化性稍微好些，这是由于除去了能够干扰纤维素酶对纤维素的接近的木质素。
在一些实施方案中，生物质的预处理包括离子液体预处理。可以通过与离子液体温育、然后与诸如醇或水之类的洗涤溶剂进行IL提取来对生物质进行预处理。然后，可以通过离心或过滤由离子液体/洗涤溶剂溶液来分离经过预处理的生物质，并将其提送至糖化反应器或容器。离子液体预处理的实例在美国公开No.2008/0227162中有所公开，其中所述文献以引用方式全文并入本文。
预处理方法的实例在Dale的美国专利No.4600590、Chou的美国专利No.4644060、Dale的美国专利No.5037663、Holtzapple，et al.的美国专利No.5171592、Karstens，et al.的美国专利No.5939544、Bredereck，et al.的美国专利No.5473061、Karstens.的美国专利No.6416621、Dale，et al.的美国专利No.6106888、Dale，et al.的美国专利No.6176176、Dale，et al.的PCT公开WO2008/020901、Felix，A.，et al.，Anim.Prod.51，47-61(1990)、Wais，A.C.，Jr.，et al.，Journal of Animal Science，35，No.1，109-112(1972)中有所公开，其中所述文献以引用方式全文并入本文。
在一些实施方案中，生物质的预处理包括酶水解。在一个实施方案中，可以使用酶或酶混合物(例如核酸内切酶、核酸外切酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、配糖水解酶、糖基转移酶、裂解酶、酯酶以及包含碳水化合物结合模块的蛋白质)对生物质进行预处理。在一些实施方案中，所述酶或酶混合物可以为具有不同活性的单独的酶。在一些实施方案中，所述酶或酶混合物可以为具有特定催化活性的酶结构域。例如，具有多种活性的酶可以具有多个酶结构域，包括(例如)配糖水解酶、糖基转移酶、裂解酶和/或酯酶催化结构域。
在一些实施方案中，生物质的预处理包括使用一种或多种得自C.phytofermentans的酶的酶水解。在一些实施方案中，生物质的预处理包括使得一种或多种得自C.phytofermentans的酶的酶水解，其中一种或多种酶选自核酸内切酶、核酸外切酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、配糖水解酶、糖基转移酶、裂解酶、酯酶以及包含碳水化合物结合模块的蛋白质。在一些实施方案中，可以使用在C.phytofermentans中确认的水解酶对生物质进行预处理。在C.phytofermentans中确认的水解酶的实例包括但不限于Cphy3367、Cphy3368、Cphy0430、Cphy3854、Cphy0857、Cphy0694以及Cphy1929(www.genome.jp/)。
在一些实施方案中，生物质的预处理包括使用表1、表2、表3或表4中列出的一种或多种酶的酶水解。表1-4分别示出了预计在C.phytofermentans中存在的配糖水解酶、裂解酶、酯酶以及包含碳水化合物结合模块家族成员的蛋白质中的一些酶的已知活性的实例。已知的活性通过活性以及由国际生物化学及分子生物学联盟确定的相应PC号列出。
表1：配糖水解酶家族成员的已知活性
Figure BPA00001448768700341
Figure BPA00001448768700351
Figure BPA00001448768700361
Figure BPA00001448768700371
Figure BPA00001448768700381
表2.多糖裂解酶家族成员的已知活性
Figure BPA00001448768700382
表3.碳水化合物酯酶家族成员的已知活性
Figure BPA00001448768700383
表4：碳水化合物结合模块家族成员的已知活性
Figure BPA00001448768700392
Figure BPA00001448768700401
Figure BPA00001448768700411
在一些实施方案中，降解多糖的酶可以用于生物质的预处理，并且可以包括降解纤维素的酶，即，纤维素酶。一些纤维素酶的实例包括纤维素内切酶(EC 3.2.1.4)和纤维素外切酶(EC 3.2.1.91)，并水解β-1，4-葡萄糖甙键。
C.phytofermentans中可以用于对生物质进行预处理的所预计的纤维素内切酶的实例包括以下基因：GH家族，例如Cphy3368；Cphy1163和Cphy2058；GH8家族，例如Cphy3207；以及GH9家族，例如Cphy3367。C.phytofermentans中可以用于对生物质进行预处理的所预计的纤维素外切酶的实例包括以下基因：GH48家族，例如Cphy3368。一些纤维素外切酶将多糖水解为葡萄糖的2至4个单元的寡糖，从而得到纤维糊精二糖(纤维二糖)、三糖(三糖)或者四糖(纤维四糖)。GH5、GH9和GH48家族的成员可以具有纤维素外切酶及纤维素内切酶活性。
在一些实施方案中，降解多糖的酶可以用于生物质的预处理，并且可以包括具有降解半纤维素(即，半纤维素酶)的能力的酶(Leschine，S.B.in Handbook on Clostridia(ed Durre，P.)(CRC Press，Boca Raton，2005))。半纤维素可以为植物生物质的主要成分，并且可以包含戊糖和己糖的混合物，例如D-吡喃木糖、L-阿拉伯呋喃糖、D-吡喃甘露糖、D-吡喃葡萄糖、D-吡喃半乳糖、D-吡喃葡萄糖基熊果酸等(Aspinall，G.O.The Biochemistryof Plants 473，1980；Han，J.S.& Rowell，J.S.in Paper and composites fromagro-based resources 83，1997)。在某些实施方案中，C.phytofermentans中可确认的可以用于对生物质进行预处理的所预计的半纤维素酶包括对半纤维素的线性主链具有活性的酶，例如β-1，4-D-木聚糖内切酶(EC3.2.1.8)，例如GH5、CH10、GH11和GH43家族的成员；1，4-β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，例如GH30、GH43和GH3家族的成员；以及β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，例如GH26家族的成员。
在更多的实施方案中，C.phytofermentans中可确认的可以用于对生物质进行预处理的所预计的半纤维素酶包括对半纤维素的侧基和取代基具有活性的酶，例如a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)，例如GH3、GH43和GH51家族的成员；α-木糖苷酶，例如GH31家族的成员；α岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)，例如GH95和GH29家族的成员；半乳糖苷酶，例如GH1、GH2、GH4、GH36、GH43家族的成员；以及乙酰基-木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)，例如CE2和CE4。
在一些实施方案中，降解多糖的酶可以用于生物质的预处理，并且可以包括具有降解胶质的能力的酶，即，果胶酶。在植物细胞壁中，交联的纤维素网格可以嵌入到胶质的基质中，其中所述的胶质可以以共价方式与木糖葡萄糖及某些结构蛋白质交联。胶质可以包含均聚半乳糖醛酸(HG)或者鼠李聚糖半乳糖醛酸(RH)。
在更多的实施方案中，生物质的预处理包括C.phytofermentans中可确认的可以水解HG的果胶酶。HG可以由可以被乙酰化及甲基化的D-半乳糖醛酸(D-galA)构成。水解HG的酶可以包括(例如)1，4-α-D-聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.2)，例如PL1、PL9和PL11家族的成员；葡萄糖醛酸基转移酶，例如GH88和GH105家族的成员；胶质乙酰基酯酶，例如CE12家族的成员；以及胶质甲酯酶，例如CE8家族的成员。
在甚至更多的实施方案中，生物质的预处理包括包括C.phytofermentans中可确认的可以水解RH的果胶酶。RH可以为由交替的1，2-α-L-鼠李糖(L-Rha)和1，4-α-D-半乳糖醛酸残基构成的主链(Lau，J.M.，McNeil M.，Darvill A.G.& Albersheim P.Structure of the backbone ofrhamnogalacturonan I，a pectic polysaccharide in the primary cell walls ofplants.Carbohydrate research 137，111(1985))。所述主链的鼠李糖残基可以具有与C4连接的作为侧链的半乳糖、阿拉伯糖或阿拉伯半乳糖。水解HG的酶可以包括(李锐)鼠李糖半乳糖醛酸内切酶，例如GH28家族的成员；以及鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶，例如PL11家族的成员。
在一些实施方案中，生物质的预处理包括可以水解淀粉的酶。C.phytofermentans可以降解淀粉和壳质(Wamick，T.A.，Methe，B.A.&Leschine，S.B.Clostridium phytofermentans sp.nov.，a cellulolytic mesophilefrom forest soil.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.52，1155-1160(2002)；Leschine，S.B.in Handbook on Clostridia(ed Dürre，P.)(CRC Press，Boca Raton，2005)；Reguera，G.& Leschine，S.B.Chitin degradation by cellulolytic anaerobes andfacultative aerobes from soils and sediments.FEMS Micro biol.Lett.204，367-374(2001))。水解淀粉的酶包括α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶、外-α-1，4-葡聚糖内切酶和直链淀粉酶。C.phytofermentans中可确认的所预计的酶的实例涉及淀粉水解，包括GH13家族的成员。
在更多实施方案中，生物质的预处理包括水解酶，其可以包含水解壳质的酶。可以水解壳质的酶的实例包括GH18和GH19家族的成员。在甚至更多的实施方案中，水解酶可以包括水解地衣的酶，即，苔聚糖酶，例如GH16家族的成员，例如Cphy3388。
在一些实施方案中，生物质的预处理包括水解酶，其为包含碳水化合物结合模块的家族成员(CBM)的蛋白质。不希望被任何一种理论所束缚，CBM结构域可以起到将酶复合物定位于特定底物上的功能。C.phytofermentans中可确认可以结合纤维素的所预计的CBM家族的实例包括CBM2、CBM3、CBM4、CBM6和CBM46家族的成员。在更多的实施方案中，CBM结构域家族的成员可以起到稳定酶复合物的作用。
在一些实施方案中，在通过上述任何一种方法进行预处理之后，所述的供料包含纤维素、半纤维素、可溶的寡聚物、单糖、木质素、挥发物以及灰。预处理参数可以随着经预处理的供料的成分浓度的变化而改变。例如，在一些实施方案中，选择预处理，使得可溶寡聚物的浓度较高，并且在预处理之后木质素的浓度较低。预处理参数的实例包括温度、压力、时间和pH。
在一些实施方案中，预处理参数随着经预处理的供料的成分浓度的变化而改变，使得在所述的经预处理供料中的成分的浓度对于使用诸如Q微生物之类的微生物发酵而言是最佳的。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可得纤维素的浓度为1％、5％、10％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、19％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可得纤维素的浓度为5％至30％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可得纤维素的浓度为10％至20％。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可得半纤维素的浓度为1％、5％、10％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可得半纤维素的浓度为5％至40％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可得半纤维素的浓度为10％至30％。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可溶寡聚物的浓度为1％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。可溶寡聚物的实例包括但不限于纤维二糖和木二糖。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可溶寡聚物的浓度为30％至90％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可溶寡聚物的浓度为45％至80％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可溶寡聚物的浓度为45％至80％，并且可溶寡聚物主要为纤维二糖和木二糖。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的单糖的浓度为1％、5％、10％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、19％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的单糖的浓度为0％至20％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的单糖的浓度为0％至5％。单糖的实例包括但不限于C5至C6单体和二聚体。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的木质素的浓度为1％、5％、10％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、19％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的木质素的浓度为0％至20％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的木质素的浓度为0％至5％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的木质素的浓度为低于1％至2％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的酚的浓度最少。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的糠醛及低分子量的木质素的浓度为低于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的糠醛及低分子量的木质素的浓度为低于1至2％。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在经预处理的供料中的可得的纤维素的浓度为10％至20％，半纤维素的浓度为10％至30％，可溶寡聚物的浓度为45％至80％，单糖的浓度为0％至5％，木质素的浓度为0％至5％，以及糠醛及低分子量的木质素的浓度为低于1至2％。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，从而得到高浓度的半纤维素和低浓度的木质素。在一些实施方案中，改变预处理的参数，从而得到高浓度的半纤维素和低浓度的木质素，使得在经预处理的供料中的多种成分的浓度对于使用诸如Q微生物之类的微生物的发酵而言是最佳的。
在一些实施方案中，在pH8至12下对供料进行预处理，从而在经预处理的供料中得到高浓度的半纤维素和低浓度的木质素。在一些实施方案中，在pH8至12下对供料进行预处理，从而得到高浓度的半纤维素和低浓度的木质素，使得在经预处理的供料中的多种成分的浓度对于使用诸如Q微生物之类的微生物的发酵而言是最佳的。可以改变诸如温度和时间之类的其他参数，从而得到所需的结果。例如，在一些实施方案中，在pH8至12下、在低温下对供料预处理较长的时间。从而在经预处理的供料中得到高浓度的半纤维素和低浓度的木质素。
在一些实施方案中，改变预处理的参数，从而得到最大数量的C5构成的碳水化合物。在一些实施方案中，改变预处理的参数，使得在所述供料中的多种成分的晶体不高于天然的量。
在一些实施方案中，在变化的条件下，使用诸如NaOH、KOH和Ca(OH)2之类的碱性化合物对供料进行处理，从而在经预处理的供料中得到所需浓度的成分。例如，在一些实施方案中，在变化的条件下，使用诸如NaOH、KOH和Ca(OH)2之类的碱性化合物对供料进行处理，使得在处理后半纤维素的浓度较高而木质素的浓度较低。碱性处理可以与诸如过氧化氢或脲之类的试剂结合进行。
在一些实施方案中，在变化的条件下，使用诸如NaOH、KOH和Ca(OH)2之类的碱性化合物对供料进行处理，使得在经预处理的供料中的多种成分的浓度对于使用诸如Q微生物之类的微生物的发酵而言是最佳的。碱性处理可以与诸如过氧化氢或脲之类的试剂结合进行。
在一些实施方案中，使用NaOH对供料进行处理，使得经预处理的供料中的各种成分的浓度对于使用Q微生物的发酵而言是最佳的。NaOH预处理可以与诸如过氧化氢或脲之类的试剂结合进行。可以在60℃、80℃、90℃、100℃、120℃、140℃、160℃或180℃下实施单独的NaOH的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的NaOH的预处理。单独的NaOH的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的NaOH的预处理可以实施10、15、20、30、35、40、50分钟；或者1、5、7、9、10、11、15、20、25、30、35或36小时。
在一些实施方案中，使用KOH对供料进行处理，使得经预处理的供料中的各种成分的浓度对于使用Q微生物的发酵而言是最佳的。在一个实施方案中，KOH预处理可以与诸如过氧化氢或脲之类的试剂结合进行。在另一个实施方案中，可以在大约60℃至180℃下实施单独的Ca(OH)2的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的Ca(OH)2的预处理。在另一个实施方案中，可以在大约60℃、80℃、90℃、100℃、120℃、140℃、160℃或180℃下实施单独的KOH的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的KOH的预处理。在一个实施方案中，单独的KOH的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的KOH的预处理可以实施大约10、15、20、30、35、40或50分钟；或者大约1、5、7、9、10、11、15、20、25、30、35、36、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或96小时。
在一个实施方案中，使用Ca(OH)2对供料进行处理，使得经预处理的供料中的各种成分的浓度对于使用Q微生物的发酵而言是最佳的。在另一个实施方案中，Ca(OH)2预处理可以与诸如过氧化氢或脲之类的试剂结合进行。在另一个实施方案中，可以在大约60℃至180℃下实施单独的Ca(OH)2的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的Ca(OH)2的预处理。在另一个实施方案中，可以在大约60℃、80℃、90℃、100℃、120℃、140℃、160℃或180℃下实施单独的Ca(OH)2的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的Ca(OH)2的预处理。在一个实施方案中，单独的Ca(OH)2的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的Ca(OH)2的预处理可以实施大约1-60分钟。在另一个实施方案中，单独的Ca(OH)2的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的Ca(OH)2的预处理可以实施大约1-96小时。在另一个实施方案中，单独的Ca(OH)2的预处理、或者与过氧化氢或脲相结合的Ca(OH)2的预处理可以实施大约10、15、20、30、35、40或50分钟；或者大约1、5、7、9、10、11、15、20、25、30、35、36、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或96小时。
乙醇或其他发酵终产物的回收
在本发明的另一个方面中，提供了回收发酵终产物(例如醇，例如乙醇、丙醇、甲醇、丁醇等)、另一种生物燃料或化学产物的方法。在一个实施方案中，在发酵过程中的某一时间点处收获培养液，并回收发酵终产物或产物。待回收乙醇的培养液包含乙醇和杂质。杂质包括诸如水、细胞团、细胞碎片、过量的碳底物、过量的氮底物、其他剩余的营养物、非乙醇的代谢物、其他培养基成分或者消化的培养基成分之类的材料。在加工培养液的过程中，所述培养液可以加热和/或与多种试剂反应，从而在培养液中得到其他的杂质。
在一个实施方案中，回收乙醇的加工步骤通常包括多个分离步骤，包括(例如)由纯度低的含乙醇材料中蒸馏高浓度的乙醇材料。在其他实施方案中，将高浓度的乙醇材料进一步浓缩，从而得到极高浓度的乙醇，例如98％、99％或99.5％(wt)或者甚至更高。此外，其他分离步骤(例如过滤、离心、提取、吸附等)也可以为作为产物或生物燃料、或者其他生物燃料或化学产物的乙醇的某些回收方法的一部分。
在一个实施方案中，可以将方法定级为制备市售可用的生物燃料。在另一个实施方案中，使用Q微生物来制备醇(例如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇)或燃料(例如碳氢化合物、氢、甲烷和羟基化合物)。在另一个实施方案中，使用Q微生物来制备羰基化合物，例如醛或酮(例如丙酮、甲醛、1-丙醛等)；有机酸、有机酸的衍生物，例如酯(例如蜡酯、甘油酯等)、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸；或者酶，例如纤维素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木质酶及半纤维素酶。
在一个实施方案中，描述了用于制备发酵终产物的分批补料发酵。在另一个实施方案中，描述了用于制备乙醇的分批补料发酵。分批补料培养为一种微生物方法，其中在培养过程中，将培养基成分供入到发酵罐中，但是并非在同时收获等体积的培养物培养物，其中所述的培养基成分例如为碳底物、氮底物、微生物、矿物质、生长因子、辅助因子等；或者生物催化剂(例如包括新鲜的有机体、在分离发酵过程中由Q微生物制备的酶、由其他有机体制备的酶或者这些物质的组合)。为了改善可溶底物向不溶底物(例如可以在生物燃料制备中使用的那些)之间的生物转化，可以使用多种供料策略来改善产率和/或制备率。该技术可以用于在给定的时间内得到高的细胞密度。此外，所述技术还可以用于保持用于生物转化方法的营养物和底物的良好供入。此外，所述技术还可以用于得到所需产物的较高的效价和制备率(否则可能会较慢的取得或者根本不能取得)。
在另一个实施方案中，所述的供料策略平衡了细胞制备速率及制备乙醇的生物质供料的水解速率。加入足量的培养基成分，其量得以取得持续的细胞制备以及制备乙醇的生物质供料的水解。在一些实施方案中，加入足量的碳底物和氮底物，其量得以取得新鲜细胞的持续制备和将多糖转化为低级糖的水解酶、以及低级糖进入新鲜细胞并形成乙醇的持续转化。
在另一个实施方案中，当培养基的成分被有机体消耗或用去时，通过加入其它培养基成分将培养基成分的水平保持在所需的水平。培养基成分的实例包括但不限于碳底物、氮底物、微生物、矿物质、生长因子、辅助因子和生物催化剂。可以以连续的方式或者以规则或不规则的间隔方式加入培养基成分。在一些实施方案中，在培养基的培养基成分被完全耗尽之前加入其它的培养基成分。在一些实施方案中，完全耗尽可以有效地用于(例如)开启不同的代谢途径，使下游操作简单化，或者用于其它原因。在一些实施方案中，可以使培养基成分围绕中点变化大约10％，在一些实施方案中，可以使培养基成分围绕中点变化大约30％，并且在一些实施方案中，可以使培养基成分围绕中点变化大约60％或者更多。在一些实施方案中，可以通过使培养基成分耗尽到合适的水平、然后通过将培养基成分的水平增加至另一个合适的水平的操作来保持培养基成分的水平。在一个实施方案中，在发酵方法中，至两个不同的时间点时加入培养基成分，例如维生素。例如，在发酵开始时加入维生素总量的一半，并在发酵中点时加入另一半。
在另一个实施方案中，当氮被有机体消耗或用去时，通过加入其它含氮材料将氮的水平保持在所需的水平。可以以连续的方式或者以规则或不规则的间隔方式加入含氮材料。在一些实施方案中，在培养基中可利用的氮源被完全耗尽之前加入其他的含氮材料。在一些实施方案中，完全耗尽可以有效地用于(例如)开启不同的代谢途径，使下游操作简单化，或者用于其它原因。在一些实施方案中，可以使氮的水平(通过每升培养液中含氮材料中实际氮的克数来测量)围绕中点变化大约10％，在一些实施方案中，可以使氮的水平围绕中点变化大约30％，并且在一些实施方案中，可以使氮的水平围绕中点变化大约60％或者更多。在一些实施方案中，可以通过使氮被耗尽到合适的水平、然后通过将氮的水平增加至另一个合适的水平的操作来保持氮的水平。有用的氮的水平包括大约5至大约10g/L的水平。在一个实施方案中，还可以有利地使用大约1至大约12g/L的水平。在另一个实施方案中，使用诸如0.5g/L、0.1g/L或者甚至更低的水平，并且使用诸如20g/L、30g/L或者甚至更高的较高水平。在另一个实施方案中，可用的氮的水平为大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2223、24、25、26、27、28、29或30g/L。这种氮的水平可用有利于新鲜细胞以及水解酶的制备。增加氮的水平会导致酶的水平更高和/或细胞的制备更强，并且使得所需产物的制备率更高。氮可以以下形式提供：简单的含氮材料，例如铵化合物(例如硫酸铵、氢氧化铵、氨水、硝酸铵、或者包含铵部分的任何其他化合物或混合物)；硝酸盐或亚硝酸盐化合物(例如钾盐、钠盐、铵盐、钙盐、或者包含硝酸部分或亚硝酸部分的其他化合物或混合物)；或者更复杂的含氮材料，例如氨基酸、蛋白质、水解的蛋白质、水解的酵母、酵母提取物、啤酒酵母粉、酵母水解产物、大豆蛋白质、水解的大豆蛋白质、发酵产物、以及经加工的玉米粉或未经加工的富含蛋白质的植物或动物物质(包括衍生自豆科植物、种子、豆类蔬菜、坚果、牛奶、猪、牛、哺乳动物、鱼以及植物的其他部分和其他类型的动物)。此外，用于多种实施方案中的含氮材料还包括含有含氮材料的那些，包括但不限于简单或更加复杂的含氮材料与碳源、另一种含氮材料、其他营养物或非营养物、以及AFEX处理的植物物质混合的混合物。
在另一个实施方案中，当糖被有机体消耗或用去时，通过加入糖化合物或含糖化合物的材料(“含糖材料”)将碳的水平保持在所需的水平。可以以连续的方式或者以规则或不规则的间隔方式加入含糖材料。在一些实施方案中，在培养基中可利用的糖化合物被完全耗尽之前加入其他的含糖材料。在一些实施方案中，完全耗尽可以有效地用于(例如)开启不同的代谢途径，使下游操作简单化，或者用于其它原因。在一些实施方案中，可以使碳的水平(通过每升培养液中含糖材料中存在的糖的克数来测量)围绕中点变化大约10％，在一些实施方案中，可以使氮的水平围绕中点变化大约30％，并且在一些实施方案中，可以使氮的水平围绕中点变化大约60％或者更多。在一些实施方案中，可以通过使碳被耗尽到合适的水平、然后通过将碳的水平增加至另一个合适的水平的操作来保持碳的水平。在一些实施方案中，可以将碳的水平保持在大约5至大约120g/L的水平。但是还可以有利地使用大约30至大约100g/L的水平、以及大约60至大约80g/L的水平。在一个实施方案中，对于部分培养而言，可以将碳的水平保持在高于25g/L。在另一个实施方案中，可以将碳的水平保持在大约5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、71g/L、72g/L、73g/L、74g/L、75g/L、76g/L、77g/L、78g/L、79g/L、80g/L、81g/L、82g/L、83g/L、84g/L、85g/L、86g/L、87g/L、88g/L、89g/L、90g/L、91g/L、92g/L、93g/L、94g/L、95g/L、96g/L、97g/L、98g/L、99g/L、100g/L、101g/L、102g/L、103g/L、104g/L、105g/L、106g/L、107g/L、108g/L、109g/L、110g/L、111g/L、112g/L、113g/L、114g/L、115g/L、116g/L、117g/L、118g/L、119g/L、120g/L、121g/L、122g/L、123g/L、124g/L、125g/L、126g/L、127g/L、128g/L、129g/L、130g/L、131g/L、132g/L、133g/L、134g/L、135g/L、136g/L、137g/L、138g/L、139g/L、140g/L、141g/L、142g/L、143g/L、144g/L、145g/L、146g/L、147g/L、148g/L、149g/L或150g/L。
碳底物与氮底物相似，是细胞制备和酶制备所必须的，但是与氮底物不同，碳底物作为乙醇的原材料。通常，碳底物越多得到的制备的乙醇越多。
在另一个实施方案中，有利的是，在至少一部分发酵时间内以彼此相关的方式操作碳水平和氮水平。在一个实施方案中，碳与氮的比例保持在大约30∶1至大约10∶1内。在另一个实施方案中，碳与氮的比例保持在大约20∶1至大约10∶1，或者更优选的是大约15∶1至大约10∶1。在另一个实施方案中，碳与氮的比例为大约30∶1、29∶1、28∶1、27∶1、26∶1、25∶1、24∶1、23∶1、22∶1、21∶1、20∶1、19∶1、18∶1、17∶1、16∶1、15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。
将碳与氮的比例保持在特定的范围内可以有利于诸如碳底物的水解比例之类的操作，其中所述的水解比例取决于碳底物的量以及存在的酶的量和活性，从而与乙醇的制备比例相平衡。例如，由于高浓度低分子量糖类的存在能够会抑制细胞活性，以及在其中存在较长链的糖类并且该糖类有利于水解的情况下需要在整个发酵时期内保持酶的水解活性，所述的平衡可能是重要的。碳与氮的比例的平衡可以(例如)有利于持续地制备所述的这些酶从而替代已经失去活性的那些酶。
在另一个实施方案中，碳、氮或其他培养基成分的加入量和/或加入时间可以与在发酵过程中所采用的测量方法有关。例如，可以测量单糖存在的量、不溶的多糖存在的量、多糖的活性、乙醇存在的量、细胞材料(例如细胞压积、细胞干重等)的量和/或氮(例如硝酸盐、亚硝酸盐、氨水、脲、蛋白质、氨基酸等)存在的量。可以考虑特定物种的浓度、发酵罐中存在的物种的总量、发酵运行的小时数以及发酵罐的体积。在多个实施方案中，这些测量项目可以彼此比较和/或它们可以与之前的相同发酵或另一个发酵所采用的相同参数的早期测量项目相比较。例如，可以通过改变包含培养基成分的流的流速或者通过改变加入该成分的频率来完成对培养基成分的量的调节。在一个实施方案中，当单糖水平的升高快于乙醇水平的升高时，可以减少多糖的量。在另一个实施方案中，当单糖的量或水平减少而乙醇的制备大致保持稳定时，可以增加多糖的量。在另一个实施方案中，当单糖水平的升高快于可利用的细胞水平时，可以增加氮的量。此外，当细胞制备的增加快于乙醇的制备时，还可以增加多糖的量。在另一个实施方案中，当酶的活性水平降低时，可以增加氮的量。
在另一个实施方案中，可以有效地使用不同水平的或者完全耗尽的培养基成分，从而(例如)开启不同的代谢途径或者改变发酵方法的不同产物的产率。例如，不同水平或者完全耗尽的培养基成分可以有效地用于增加乙醇的产率和制备率、改善碳的利用(例如乙醇的克数/所发酵的糖的克数)以及减少酸的制备(例如酸的克数/乙醇的克数、以及酸的克数/所发酵的糖的克数)。在一些实施方案中，不同水平或者完全耗尽的氮可以有效地用于增加乙醇的产率和制备率、改善碳的利用(例如乙醇的克数/所发酵的糖的克数)以及减少酸的制备(例如酸的克数/乙醇的克数、以及酸的克数/所发酵的糖的克数)。在一些实施方案中，不同水平或者完全耗尽的碳可以有效地用于增加乙醇的产率和制备率、改善碳的利用(例如乙醇的克数/所发酵的糖的克数)以及减少酸的制备(例如酸的克数/乙醇的克数、以及酸的克数/所发酵的糖的克数)。在一些实施方案中，至少一部分发酵时间内的碳水平与氮水平的比例可以有效地用于增加乙醇的产率和制备率、改善碳的利用(例如乙醇的克数/所发酵的糖的克数)以及减少酸的制备(例如酸的克数/乙醇的克数、以及酸的克数/所发酵的糖的克数)。
在另一个实施方案中，可以使用分批补料操作，其中在发酵过程中在发酵终止之前未除去部分培养液以用于收获的条件下加入培养基成分和/或新鲜的细胞。在一个实施方案中，分批补料方法是根据向微生物体的培养物中供入生长限制性营养物培养基来实施的。在一个实施方案中，供料培养基被高度浓缩，以避免生物反应器被稀释。在另一个实施方案中，受控的加入营养物会直接影响培养物的生长速率，并避免代谢物(例如副代谢物的形成)的溢出。在一个实施方案中，生长限制性营养物为氮源或糖类来源。
在另一个实施方案中，可以使用经修改的分批补料操作，其中在不连续的时间时收获部分培养液。当(例如)使用极长期的发酵周期时，可以有利地使用这种经修改的分批补料操作。在极长期的发酵条件下，发酵罐内的液体体积增加。为了在极长期的时间内进行操作，有利的是部分倒空发酵罐，例如，在体积几乎装满时。由于作业时间减少(例如设备的清洁和灭菌)，部分收获培养液、然后补充新鲜的培养基组分(例如采用分批补料操作)可以改善发酵罐的利用，并且可以有利于使工厂获得更高的制备量。当使用“部分收获”类型的操作时，可以使用保留在发酵罐中的培养液、或者新鲜的接种物、或者使用这二者的混合物来接种发酵物。此外，培养液可以作为单独的新鲜接种物或者与其他新鲜的接种物相组合来循环再利用。
在一些实施方案中，可以使用分批补料操作，其中在发酵过程中，当培养液的水解活性降低时加入培养基成分和/或新鲜的细胞。在一些实施方案中，在发酵过程中，当培养液的水解活性降低大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，加入培养基成分和/或新鲜的细胞。
虽然Q微生物可以用于长期或短期发酵周期中，但是其特别适用于长期的发酵周期，并且由于发酵的厌氧条件、醇的存在、有机体的快的生长速率以及在某些实施方案中使用了固体碳底物(无论是否会导致培养液中的低糖浓度)，Q微生物可以用于具有部分收获、自我接种以及培养液循环再利用操作的发酵中。
在另一个实施方案中，通过在具有高浓度的一种或多种碳源的培养基中培养Q微生物的菌株、和/或在发酵过程中加入新鲜的Q微生物的新鲜细胞使培养物增量来进行制备乙醇的发酵。与分批方法相比，所述的乙醇的制备可以多达1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍并且在某些情况下多达10倍及更高的容积制备率，并取得接近理论最大值的碳转化效率。理论最大值可以随着底物和产物而改变。例如，葡萄糖转化为乙醇的通常可接受的最大效率为0.51g乙醇/g葡萄糖。在一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约40-100％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约40％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约50％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约70％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约90％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约95％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约99％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约100％的乙醇。在另一个实施方案中，Q微生物可以产生理论最大产率的大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.99％或100％的乙醇。
可以以Q微生物细胞能够制备用于水解制备培养基的成分的相关方式来制备或处理用于种子接种物或用于细胞增量的Q微生物细胞。例如，在一个实施方案中，在Q微生物被转移到制备培养基或制备发酵罐中之后可以制备有用的酶。在另一个实施方案中，Q微生物细胞在转移到制备培养基或制备发酵罐之前已经制备出有用的酶。在另一个实施方案中，Q微生物细胞一旦被转移到制备培养基或制备发酵罐中就可以容易地制备有用的酶，或者Q微生物细胞可以具有这些酶制备特征的某些组合。在一个实施方法中，种子可以在包含单糖源(例如玉米浆)的培养基中进行初始生长，然后过渡到制备培养基的碳源，之后转移到制备培养基中。在另一个实施方案中，种子可以在单糖与制备培养基碳源的组合物上生长，然后转移到制备培养基中。在另一个实施方案中，种子可以开始就在制备培养基碳源上生长。在另一个实施方案中，种子在一种制备培养基碳源上生长，然后过渡到另一种制备培养基碳源上，之后转移到制备培养基中。在另一个实施方案中，种子在制备培养基碳源的组合物上生长，然后转移到制备培养基中。在另一个实施方案中，种子在这样的碳源上生长，其中所述碳源有利于制备对制备培养基的成分具有活性的水解酶。
在另一个实施方案中，通过培养Q微生物体的菌株、并在发酵罐中的所述细胞正在生长的同时加入新鲜的培养基成分和新鲜的Q微生物细胞来进行制备乙醇的发酵。按照本文所公开的方法，加入培养基成分(例如碳、氮以及它们的组合)以及足以保持所述培养基中的营养物的有效水平的其他营养物，包括维生素、因子、辅助因子、酶、矿物质、盐等。培养基及Q微生物细胞可以同时加入或者一次加入一种。在另一个实施方案中，当水解酶活性降低时，特别是当对存在的醇更敏感的那些水解酶的活性降低时，可以加入新鲜的Q微生物细胞。在加入新鲜的Q微生物细胞之后，可以加入氮供料或者氮与碳供料的组合和/或其他培养基成分，从而延长酶的制备或所述细胞的其他活性。在另一个实施方案中，可以将所述细胞与足量的碳和氮一起加入，从而足以将酶的制备或者所述细胞的其他活性延长至新鲜细胞的下一次加入为止。在另一个实施方案中，当发酵罐中存在的氮水平和碳水平增加时，可以加入新鲜的Q微生物细胞。在另一个实施方案中，当可利用的细胞的量减少时，特别是当氮的水平相对稳定或增加时，可以加入新鲜的Q微生物细胞。在另一个实施方案中，当大量的可利用的细胞处于孢子形成过程或者已经形成孢子时，可以为加入新鲜的细胞。当一部分细胞处于孢子形成过程或者已经形成孢子(例如大约2％至大约100％、大约10％至大约75％、大约20％至大约50％、或者大约25％至大约30％的细胞处于孢子形成过程或已经形成孢子)时，可以为加入新鲜的Q微生物细胞的合适时间。
在其他实施方案中，通过培养循环再利用细胞作为接种物来进行制备乙醇的发酵。较高的群体密度可以用于增加乙醇的制备。合适水平的接种物包括使用低于大约0.01％(v/v)或者大约0.01％至大约0.1％(v/v)、大约0.1％至大约1％(v/v)、大约1％至大约3％(v/v)、大约3％至大约5％(v/v)、或者甚至高达10％(v/v)或者甚至更高。可以通过多种方式测量接种的细胞含量，例如通过光学密度、显微镜分析、细胞压积、细胞干重、DNA分析等。接种物中合适的细胞水平可以为大约0.01g/mL至大约0.05g/mL细胞干重(DCW)、大约0.05g/mL至大约0.1g/mL细胞干重(DCW)、或者大约0.1g/mL至大约0.3g/mL细胞干重(DCW)。可以通过将细胞水平(例如通过细胞干重或其他合适的方法测定)与接种物水平相关联来测定接种到发酵培养基中的细胞的总量。优选的细胞总量包括使用大约0.0001至大约0.001g干细胞/ml培养液、大约0.001至大约0.01g干细胞/ml培养液、或者大约0.01至大约0.03g干细胞/ml培养液，但是在某些情况下，可以使用更高或更低的总量。可以通过诸如改变循环再利用的细胞的量、改变细胞被循环再利用的时间长短、改变培养基成分的水平(例如碳和氮的水平，以分开方式或者协同方式，例如本文所述的方法)以及改变培养基成分的来源(例如碳和/或氮源，例如本文所述的方法)之类的技术来取得较高的乙醇效价。通过包括所述这些技术在内的技术，可以取得高的乙醇浓度。在一个实施方案中，可以通过本文所述的方法取得乙醇浓度为大约20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、71g/L、72g/L、73g/L、74g/L、75g/L、76g/L、77g/L、78g/L、79g/L、80g/L、81g/L、82g/L、83g/L、84g/L、85g/L、86g/L、87g/L、88g/L、89g/L、90g/L、91g/L、92g/L、93g/L、94g/L、95g/L、96g/L、97g/L、98g/L、99g/L、100g/L、101g/L、102g/L、103g/L、104g/L、105g/L、106g/L、107g/L、108g/L、109g/L、110g/L、111g/L、112g/L、113g/L、114g/L、115g/L、116g/L、117g/L、118g/L、119g/L、120g/L、121g/L、122g/L、123g/L、124g/L、125g/L、126g/L、127g/L、128g/L、129g/L、130g/L、131g/L、132g/L、133g/L、134g/L、135g/L、136g/L、137g/L、138g/L、139g/L、140g/L、141g/L、142g/L、143g/L、144g/L、145g/L、146g/L、147g/L、148g/L、149g/L、150g/L、151g/L、152g/L、153g/L、154g/L、155g/L、156g/L、157g/L、158g/L、159g/L、160g/L、161g/L、162g/L、163g/L、164g/L、165g/L、166g/L、167g/L、168g/L、169g/L、170g/L、171g/L、172g/L、173g/L、174g/L、175g/L、176g/L、177g/L、178g/L、179g/L、180g/L或181g/L。
在另一个实施方案中，在发酵罐中的细胞处于细胞膨胀期(例如种子期)和/或发酵的最终发酵期时通过培养Q微生物的菌株并加入循环再利用的Q微生物细胞来进行制备乙醇的发酵。不想被任何理论所限制，本文所述的结果表明，循环再利用的细胞能够耐受较高浓度的乙醇，并且能够在这种环境中生长。因此，这种耐受以及能够可以用于诸如细胞膨胀期(例如种子期)以及发酵的最终发酵期之类的情况中，其中所述的情况为存在所述浓度的乙醇，包括乙醇的制备发酵、或者在这种浓度的乙醇存在下用于制备其他产物。
培养基的组成
在多种实施方案中，特定的培养基成分可以对发酵的实施产生有利的影响，例如增加所需产物的效价、或者增大所需产物的制备速率。特定的化合物可以作为特定的纯的组分(例如特定的氨基酸)提供，或者可以作为更加复杂的组分的成分提供，例如使用作为培养基组分的微生物、植物或动物产物，从而提供特定的氨基酸、促进剂、辅助因子或其他有利的化合物。在一些情况下，培养基组分中所提供的特定化合物可以与由所述有机体提供的其他化合物组合，从而得到有利于发酵的化合物。这种情况的一个实例为其中培养基组分提供了特定的氨基酸，所述的有机体利用这种氨基酸来形成有利于发酵的酶。其他实例可以包括用于产生生长或产物促进剂等的培养基成分。在这种情况下，可以通过补充酶、促进剂、生长抑制等或者加入它们的前体来得到有利于发酵的结果。在一些情况下，其中培养基成分有利于发酵的具体机制是未知的，仅得到有利的结果。
在一个实施方案中，可以通过加入酵母提取物来得到有利的发酵结果。酵母提取物的典型的组成示于表8中。加入酵母提取物可以在分批发酵中得到增加的乙醇效价、改善的制备率以及减少制备的副产物(例如有机酸)。在一个实施方案中，在多种实施方案的方法(使用水平为大约0.5至大约50g/L、大约5至大约30g/L、或者大约10至大约30g/L)中，可以得到使用酵母提取物的有利结果。在另一个实施方案中，酵母提取物的使用水平为大约0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2g/L、2.1g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L、2.6g/L、2.7g/L、2.8g/L、2.9g/L、3g/L、3.1g/L、3.2g/L、3.3g/L、3.4g/L、3.5g/L、3.6g/L、3.7g/L、3.8g/L、3.9g/L、4g/L、4.1g/L、4.2g/L、4.3g/L、4.4g/L、4.5g/L、4.6g/L、4.7g/L、4.8g/L、4.9g/L、5g/L、5.1g/L、5.2g/L、5.3g/L、5.4g/L、5.5g/L、5.6g/L、5.7g/L、5.8g/L、5.9g/L、6g/L、6.1g/L、6.2g/L、6.3g/L、6.4g/L、6.5g/L、6.6g/L、6.7g/L、6.8g/L、6.9g/L、7g/L、7.1g/L、7.2g/L、7.3g/L、7.4g/L、7.5g/L、7.6g/L、7.7g/L、7.8g/L、7.9g/L、8g/L、8.1g/L、8.2g/L、8.3g/L、8.4g/L、8.5g/L、8.6g/L、8.7g/L、8.8g/L、8.9g/L、9g/L、9.1g/L、9.2g/L、9.3g/L、9.4g/L、9.5g/L、9.6g/L、9.7g/L、9.8g/L、9.9g/L、10g/L、10.1g/L、10.2g/L、10.3g/L、10.4g/L、10.5g/L、10.6g/L、10.7g/L、10.8g/L、10.9g/L、11g/L、11.1g/L、11.2g/L、11.3g/L、11.4g/L、11.5g/L、11.6g/L、11.7g/L、11.8g/L、11.9g/L、12g/L、12.1g/L、12.2g/L、12.3g/L、12.4g/L、12.5g/L、12.6g/L、12.7g/L、12.8g/L、12.9g/L、13g/L、13.1g/L、13.2g/L、13.3g/L、13.4g/L、13.5g/L、13.6g/L、13.7g/L、13.8g/L、13.9g/L、14g/L、14.1g/L、14.2g/L、14.3g/L、14.4g/L、14.5g/L、14.6g/L、14.7g/L、14.8g/L、14.9g/L、15g/L、15.1g/L、15.2g/L、15.3g/L、15.4g/L、15.5g/L、15.6g/L、15.7g/L、15.8g/L、15.9g/L、16g/L、16.1g/L、16.2g/L、16.3g/L、16.4g/L、16.5g/L、16.6g/L、16.7g/L、16.8g/L、16.9g/L、17g/L、17.1g/L、17.2g/L、17.3g/L、17.4g/L、17.5g/L、17.6g/L、17.7g/L、17.8g/L、17.9g/L、18g/L、18.1g/L、18.2g/L、18.3g/L、18.4g/L、18.5g/L、18.6g/L、18.7g/L、18.8g/L、18.9g/L、19g/L、19.1g/L、19.2g/L、19.3g/L、19.4g/L、19.5g/L、19.6g/L、19.7g/L、19.8g/L、19.9g/L、20g/L、20.1g/L、20.2g/L、20.3g/L、20.4g/L、20.5g/L、20.6g/L、20.7g/L、20.8g/L、20.9g/L、21g/L、21.1g/L、21.2g/L、21.3g/L、21.4g/L、21.5g/L、21.6g/L、21.7g/L、21.8g/L、21.9g/L、22g/L、22.1g/L、22.2g/L、22.3g/L、22.4g/L、22.5g/L、22.6g/L、22.7g/L、22.8g/L、22.9g/L、23g/L、23.1g/L、23.2g/L、23.3g/L、23.4g/L、23.5g/L、23.6g/L、23.7g/L、23.8g/L、23.9g/L、24g/L、24.1g/L、24.2g/L、24.3g/L、24.4g/L、24.5g/L、24.6g/L、24.7g/L、24.8g/L、24.9g/L、25g/L、25.1g/L、25.2g/L、25.3g/L、25.4g/L、25.5g/L、25.6g/L、25.7g/L、25.8g/L、25.9g/L、26g/L、26.1g/L、26.2g/L、26.3g/L、26.4g/L、26.5g/L、26.6g/L、26.7g/L、26.8g/L、26.9g/L、27g/L、27.1g/L、27.2g/L、27.3g/L、27.4g/L、27.5g/L、27.6g/L、27.7g/L、27.8g/L、27.9g/L、28g/L、28.1g/L、28.2g/L、28.3g/L、28.4g/L、28.5g/L、28.6g/L、28.7g/L、28.8g/L、28.9g/L、29g/L、29.1g/L、29.2g/L、29.3g/L、29.4g/L、29.5g/L、29.6g/L、29.7g/L、29.8g/L、29.9g/L、30g/L、30.1g/L、30.2g/L、30.3g/L、30.4g/L、30.5g/L、30.6g/L、30.7g/L、30.8g/L、30.9g/L、31g/L、31.1g/L、31.2g/L、31.3g/L、31.4g/L、31.5g/L、31.6g/L、31.7g/L、31.8g/L、31.9g/L、32g/L、32.1g/L、32.2g/L、32.3g/L、32.4g/L、32.5g/L、32.6g/L、32.7g/L、32.8g/L、32.9g/L、33g/L、33.1g/L、33.2g/L、33.3g/L、33.4g/L、33.5g/L、33.6g/L、33.7g/L、33.8g/L、33.9g/L、34g/L、34.1g/L、34.2g/L、34.3g/L、34.4g/L、34.5g/L、34.6g/L、34.7g/L、34.8g/L、34.9g/L、35g/L、35.1g/L、35.2g/L、35.3g/L、35.4g/L、35.5g/L、35.6g/L、35.7g/L、35.8g/L、35.9g/L、36g/L、36.1g/L、36.2g/L、36.3g/L、36.4g/L、36.5g/L、36.6g/L、36.7g/L、36.8g/L、36.9g/L、37g/L、37.1g/L、37.2g/L、37.3g/L、37.4g/L、37.5g/L、37.6g/L、37.7g/L、37.8g/L、37.9g/L、38g/L、38.1g/L、38.2g/L、38.3g/L、38.4g/L、38.5g/L、38.6g/L、38.7g/L、38.8g/L、38.9g/L、39g/L、39.1g/L、39.2g/L、39.3g/L、39.4g/L、39.5g/L、39.6g/L、39.7g/L、39.8g/L、39.9g/L、40g/L、40.1g/L、40.2g/L、40.3g/L、40.4g/L、40.5g/L、40.6g/L、40.7g/L、40.8g/L、40.9g/L、41g/L、41.1g/L、41.2g/L、41.3g/L、41.4g/L、41.5g/L、41.6g/L、41.7g/L、41.8g/L、41.9g/L、42g/L、42.1g/L、42.2g/L、42.3g/L、42.4g/L、42.5g/L、42.6g/L、42.7g/L、42.8g/L、42.9g/L、43g/L、43.1g/L、43.2g/L、43.3g/L、43.4g/L、43.5g/L、43.6g/L、43.7g/L、43.8g/L、43.9g/L、44g/L、44.1g/L、44.2g/L、44.3g/L、44.4g/L、44.5g/L、44.6g/L、44.7g/L、44.8g/L、44.9g/L、45g/L、45.1g/L、45.2g/L、45.3g/L、45.4g/L、45.5g/L、45.6g/L、45.7g/L、45.8g/L、45.9g/L、46g/L、46.1g/L、46.2g/L、46.3g/L、46.4g/L、46.5g/L、46.6g/L、46.7g/L、46.8g/L、46.9g/L、47g/L、47.1g/L、47.2g/L、47.3g/L、47.4g/L、47.5g/L、47.6g/L、47.7g/L、47.8g/L、47.9g/L、48g/L、48.1g/L、48.2g/L、48.3g/L、48.4g/L、48.5g/L、48.6g/L、48.7g/L、48.8g/L、48.9g/L、49g/L、49.1g/L、49.2g/L、49.3g/L、49.4g/L、49.5g/L、49.6g/L、49.7g/L、49.8g/L、49.9g/L或50g/L。
此外，在完整发酵的过程或者部分发酵过程中以连续的方式或间隔的传递方式供入酵母提取物。在一个实施方案中，使用水平包括将氮的浓度保持在大约0.05g/L至大约3g/L(对氮而言)，其中至少部分氮是由玉米粉供入的；或者保持在大约0.3g/L至1.3g/L；或者保持在0.4g/L至大约0.9g/L。在另一个实施方案中，氮的浓度为大约0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L、0.11g/L、0.12g/L、0.13g/L、0.14g/L、0.15g/L、0.16g/L、0.17g/L、0.18g/L、0.19g/L、0.2g/L、0.21g/L、0.22g/L、0.23g/L、0.24g/L、0.25g/L、0.26g/L、0.27g/L、0.28g/L、0.29g/L、0.3g/L、0.31g/L、0.32g/L、0.33g/L、0.34g/L、0.35g/L、0.36g/L、0.37g/L、0.38g/L、0.39g/L、0.4g/L、0.41g/L、0.42g/L、0.43g/L、0.44g/L、0.45g/L、0.46g/L、0.47g/L、0.48g/L、0.49g/L、0.5g/L、0.51g/L、0.52g/L、0.53g/L、0.54g/L、0.55g/L、0.56g/L、0.57g/L、0.58g/L、0.59g/L、0.6g/L、0.61g/L、0.62g/L、0.63g/L、0.64g/L、0.65g/L、0.66g/L、0.67g/L、0.68g/L、0.69g/L、0.7g/L、0.71g/L、0.72g/L、0.73g/L、0.74g/L、0.75g/L、0.76g/L、0.77g/L、0.78g/L、0.79g/L、0.8g/L、0.81g/L、0.82g/L、0.83g/L、0.84g/L、0.85g/L、0.86g/L、0.87g/L、0.88g/L、0.89g/L、0.9g/L、0.91g/L、0.92g/L、0.93g/L、0.94g/L、0.95g/L、0.96g/L、0.97g/L、0.98g/L、0.99g/L、1g/L、1.01g/L、1.02g/L、1.03g/L、1.04g/L、1.05g/L、1.06g/L、1.07g/L、1.08g/L、1.09g/L、1.1g/L、1.11g/L、1.12g/L、1.13g/L、1.14g/L、1.15g/L、1.16g/L、1.17g/L、1.18g/L、1.19g/L、1.2g/L、1.21g/L、1.22g/L、1.23g/L、1.24g/L、1.25g/L、1.26g/L、1.27g/L、1.28g/L、1.29g/L、1.3g/L、1.31g/L、1.32g/L、1.33g/L、1.34g/L、1.35g/L、1.36g/L、1.37g/L、1.38g/L、1.39g/L、1.4g/L、1.41g/L、1.42g/L、1.43g/L、1.44g/L、1.45g/L、1.46g/L、1.47g/L、1.48g/L、1.49g/L、1.5g/L、1.51g/L、1.52g/L、1.53g/L、1.54g/L、1.55g/L、1.56g/L、1.57g/L、1.58g/L、1.59g/L、1.6g/L、1.61g/L、1.62g/L、1.63g/L、1.64g/L、1.65g/L、1.66g/L、1.67g/L、1.68g/L、1.69g/L、1.7g/L、1.71g/L、1.72g/L、1.73g/L、1.74g/L、1.75g/L、1.76g/L、1.77g/L、1.78g/L、1.79g/L、1.8g/L、1.81g/L、1.82g/L、1.83g/L、1.84g/L、1.85g/L、1.86g/L、1.87g/L、1.88g/L、1.89g/L、1.9g/L、1.91g/L、1.92g/L、1.93g/L、1.94g/L、1.95g/L、1.96g/L、1.97g/L、1.98g/L、1.99g/L、2g/L、2.01g/L、2.02g/L、2.03g/L、2.04g/L、2.05g/L、2.06g/L、2.07g/L、2.08g/L、2.09g/L、2.1g/L、2.11g/L、2.12g/L、2.13g/L、2.14g/L、2.15g/L、2.16g/L、2.17g/L、2.18g/L、2.19g/L、2.2g/L、2.21g/L、2.22g/L、2.23g/L、2.24g/L、2.25g/L、2.26g/L、2.27g/L、2.28g/L、2.29g/L、2.3g/L、2.31g/L、2.32g/L、2.33g/L、2.34g/L、2.35g/L、2.36g/L、2.37g/L、2.38g/L、2.39g/L、2.4g/L、2.41g/L、2.42g/L、2.43g/L、2.44g/L、2.45g/L、2.46g/L、2.47g/L、2.48g/L、2.49g/L、2.5g/L、2.51g/L、2.52g/L、2.53g/L、2.54g/L、2.55g/L、2.56g/L、2.57g/L、2.58g/L、2.59g/L、2.6g/L、2.61g/L、2.62g/L、2.63g/L、2.64g/L、2.65g/L、2.66g/L、2.67g/L、2.68g/L、2.69g/L、2.7g/L、2.71g/L、2.72g/L、2.73g/L、2.74g/L、2.75g/L、2.76g/L、2.77g/L、2.78g/L、2.79g/L、2.8g/L、2.81g/L、2.82g/L、2.83g/L、2.84g/L、2.85g/L、2.86g/L、2.87g/L、2.88g/L、2.89g/L、2.9g/L、2.91g/L、2.92g/L、2.93g/L、2.94g/L、2.95g/L、2.96g/L、2.97g/L、2.98g/L、2.99g/L或3g/L。
可以通过向发酵物中加入玉米粉来取得有利的发酵结果。在另一个实施方案中，玉米粉的典型组成示于表1-2中。加入玉米粉可以在分批发酵中得到增加的乙醇效价、改善的制备率以及减少制备的副产物(例如有机酸)。在一个实施方案中，在多种实施方案的方法(使用水平为大约3至大约20g/L、大约5至大约15g/L、或者大约8至大约12g/L)中，可以得到使用玉米粉的有利结果。在另一个实施方案中，使用水平为大约3g/L、3.1g/L、3.2g/L、3.3g/L、3.4g/L、3.5g/L、3.6g/L、3.7g/L、3.8g/L、3.9g/L、4g/L、4.1g/L、4.2g/L、4.3g/L、4.4g/L、4.5g/L、4.6g/L、4.7g/L、4.8g/L、4.9g/L、5g/L、5.1g/L、5.2g/L、5.3g/L、5.4g/L、5.5g/L、5.6g/L、5.7g/L、5.8g/L、5.9g/L、6g/L、6.1g/L、6.2g/L、6.3g/L、6.4g/L、6.5g/L、6.6g/L、6.7g/L、6.8g/L、6.9g/L、7g/L、7.1g/L、7.2g/L、7.3g/L、7.4g/L、7.5g/L、7.6g/L、7.7g/L、7.8g/L、7.9g/L、8g/L、8.1g/L、8.2g/L、8.3g/L、8.4g/L、8.5g/L、8.6g/L、8.7g/L、8.8g/L、8.9g/L、9g/L、9.1g/L、9.2g/L、9.3g/L、9.4g/L、9.5g/L、9.6g/L、9.7g/L、9.8g/L、9.9g/L、10g/L、10.1g/L、10.2g/L、10.3g/L、10.4g/L、10.5g/L、10.6g/L、10.7g/L、10.8g/L、10.9g/L、11g/L、11.1g/L、11.2g/L、11.3g/L、11.4g/L、11.5g/L、11.6g/L、11.7g/L、11.8g/L、11.9g/L、12g/L、12.1g/L、12.2g/L、12.3g/L、12.4g/L、12.5g/L、12.6g/L、12.7g/L、12.8g/L、12.9g/L、13g/L、13.1g/L、13.2g/L、13.3g/L、13.4g/L、13.5g/L、13.6g/L、13.7g/L、13.8g/L、13.9g/L、14g/L、14.1g/L、14.2g/L、14.3g/L、14.4g/L、14.5g/L、14.6g/L、14.7g/L、14.8g/L、14.9g/L、15g/L、15.1g/L、15.2g/L、15.3g/L、15.4g/L、15.5g/L、15.6g/L、15.7g/L、15.8g/L、15.9g/L、16g/L、16.1g/L、16.2g/L、16.3g/L、16.4g/L、16.5g/L、16.6g/L、16.7g/L、16.8g/L、16.9g/L、17g/L、17.1g/L、17.2g/L、17.3g/L、17.4g/L、17.5g/L、17.6g/L、17.7g/L、17.8g/L、17.9g/L、18g/L、18.1g/L、18.2g/L、18.3g/L、18.4g/L、18.5g/L、18.6g/L、18.7g/L、18.8g/L、18.9g/L、19g/L、19.1g/L、19.2g/L、19.3g/L、19.4g/L、19.5g/L、19.6g/L、19.7g/L、19.8g/L、19.9g/L或20g/L可以得到使用玉米粉的有利结果。
在一个实施方案中，在完整发酵的过程或者部分发酵过程中以连续的方式或间隔的传递方式供入玉米粉。在另一个实施方案中，使用水平包括将氮的浓度保持在大约0.05g/L至大约3g/L(对氮而言)，其中至少部分氮是由玉米粉供入的；或者保持在大约0.3g/L至1.3g/L；或者保持在0.4g/L至大约0.9g/L。在另一个实施方案中，氮的水平为大约0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L、0.11g/L、0.12g/L、0.13g/L、0.14g/L、0.15g/L、0.16g/L、0.17g/L、0.18g/L、0.19g/L、0.2g/L、0.21g/L、0.22g/L、0.23g/L、0.24g/L、0.25g/L、0.26g/L、0.27g/L、0.28g/L、0.29g/L、0.3g/L、0.31g/L、0.32g/L、0.33g/L、0.34g/L、0.35g/L、0.36g/L、0.37g/L、0.38g/L、0.39g/L、0.4g/L、0.41g/L、0.42g/L、0.43g/L、0.44g/L、0.45g/L、0.46g/L、0.47g/L、0.48g/L、0.49g/L、0.5g/L、0.51g/L、0.52g/L、0.53g/L、0.54g/L、0.55g/L、0.56g/L、0.57g/L、0.58g/L、0.59g/L、0.6g/L、0.61g/L、0.62g/L、0.63g/L、0.64g/L、0.65g/L、0.66g/L、0.67g/L、0.68g/L、0.69g/L、0.7g/L、0.71g/L、0.72g/L、0.73g/L、0.74g/L、0.75g/L、0.76g/L、0.77g/L、0.78g/L、0.79g/L、0.8g/L、0.81g/L、0.82g/L、0.83g/L、0.84g/L、0.85g/L、0.86g/L、0.87g/L、0.88g/L、0.89g/L、0.9g/L、0.91g/L、0.92g/L、0.93g/L、0.94g/L、0.95g/L、0.96g/L、0.97g/L、0.98g/L、0.99g/L、1g/L、1.01g/L、1.02g/L、1.03g/L、1.04g/L、1.05g/L、1.06g/L、1.07g/L、1.08g/L、1.09g/L、1.1g/L、1.11g/L、1.12g/L、1.13g/L、1.14g/L、1.15g/L、1.16g/L、1.17g/L、1.18g/L、1.19g/L、1.2g/L、1.21g/L、1.22g/L、1.23g/L、1.24g/L、1.25g/L、1.26g/L、1.27g/L、1.28g/L、1.29g/L、1.3g/L、1.31g/L、1.32g/L、1.33g/L、1.34g/L、1.35g/L、1.36g/L、1.37g/L、1.38g/L、1.39g/L、1.4g/L、1.41g/L、1.42g/L、1.43g/L、1.44g/L、1.45g/L、1.46g/L、1.47g/L、1.48g/L、1.49g/L、1.5g/L、1.51g/L、1.52g/L、1.53g/L、1.54g/L、1.55g/L、1.56g/L、1.57g/L、1.58g/L、1.59g/L、1.6g/L、1.61g/L、1.62g/L、1.63g/L、1.64g/L、1.65g/L、1.66g/L、1.67g/L、1.68g/L、1.69g/L、1.7g/L、1.71g/L、1.72g/L、1.73g/L、1.74g/L、1.75g/L、1.76g/L、1.77g/L、1.78g/L、1.79g/L、1.8g/L、1.81g/L、1.82g/L、1.83g/L、1.84g/L、1.85g/L、1.86g/L、1.87g/L、1.88g/L、1.89g/L、1.9g/L、1.91g/L、1.92g/L、1.93g/L、1.94g/L、1.95g/L、1.96g/L、1.97g/L、1.98g/L、1.99g/L、2g/L、2.01g/L、2.02g/L、2.03g/L、2.04g/L、2.05g/L、2.06g/L、2.07g/L、2.08g/L、2.09g/L、2.1g/L、2.11g/L、2.12g/L、2.13g/L、2.14g/L、2.15g/L、2.16g/L、2.17g/L、2.18g/L、2.19g/L、2.2g/L、2.21g/L、2.22g/L、2.23g/L、2.24g/L、2.25g/L、2.26g/L、2.27g/L、2.28g/L、2.29g/L、2.3g/L、2.31g/L、2.32g/L、2.33g/L、2.34g/L、2.35g/L、2.36g/L、2.37g/L、2.38g/L、2.39g/L、2.4g/L、2.41g/L、2.42g/L、2.43g/L、2.44g/L、2.45g/L、2.46g/L、2.47g/L、2.48g/L、2.49g/L、2.5g/L、2.51g/L、2.52g/L、2.53g/L、2.54g/L、2.55g/L、2.56g/L、2.57g/L、2.58g/L、2.59g/L、2.6g/L、2.61g/L、2.62g/L、2.63g/L、2.64g/L、2.65g/L、2.66g/L、2.67g/L、2.68g/L、2.69g/L、2.7g/L、2.71g/L、2.72g/L、2.73g/L、2.74g/L、2.75g/L、2.76g/L、2.77g/L、2.78g/L、2.79g/L、2.8g/L、2.81g/L、2.82g/L、2.83g/L、2.84g/L、2.85g/L、2.86g/L、2.87g/L、2.88g/L、2.89g/L、2.9g/L、2.91g/L、2.92g/L、2.93g/L、2.94g/L、2.95g/L、2.96g/L、2.97g/L、2.98g/L、2.99g/L或3g/L。
在另一个实施方案中，可以使用其他相关的产物，例如玉米液体或玉米固体。当使用玉米液体时，使用比例与基于固体的玉米固体大致相同。在另一个实施方案中，以与存在的或者加入的碳底物的量相关的方式加入玉米粉(或者玉米固体或液体)。当以这种方式加入时，玉米粉(或者玉米液体或固体)的有利的量可以包括大约1∶1至1∶6g/g的碳、大约1∶1至1∶5g/g的碳、或者大约1∶2至1∶4g/g的碳。在另一个实施方案中，可以使用高达大约1.5∶1g/g的碳或者大约3∶1g/g的碳、或者低至大约1∶8g/g的碳或者大约1∶10g/g的碳。在另一个实施方案中，所述的比例为2∶1g/g的碳、1.9∶1g/g的碳、1.8∶1g/g的碳、1.7∶1g/g的碳、1.6∶1g/g的碳、1.5∶1g/g的碳、1.4∶1g/g的碳、1.3∶1g/g的碳、1.2∶1g/g的碳、1.1∶1g/g的碳、1∶1g/g的碳、1∶1.1g/g的碳、1∶1.2g/g的碳、1∶1.3g/g的碳、1∶1.4g/g的碳、1∶1.5g/g的碳、1∶1.6g/g的碳、1∶1.7g/g的碳、1∶1.8g/g的碳、1∶1.9g/g的碳、1∶2g/g的碳、1∶2.1g/g的碳、1∶2.2g/g的碳、1∶2.3g/g的碳、1∶2.4g/g的碳、1∶2.5g/g的碳、1∶2.6g/g的碳、1∶2.7g/g的碳、1∶2.8g/g的碳、1∶2.9g/g的碳、1∶3g/g的碳、1∶3.1g/g的碳、1∶3.2g/g的碳、1∶3.3g/g的碳、1∶3.4g/g的碳、1∶3.5g/g的碳、1∶3.6g/g的碳、1∶3.7g/g的碳、1∶3.8g/g的碳、1∶3.9g/g的碳、1∶4g/g的碳、1∶4.1g/g的碳、1∶4.2g/g的碳、1∶4.3g/g的碳、1∶4.4g/g的碳、1∶4.5g/g的碳、1∶4.6g/g的碳、1∶4.7g/g的碳、1∶4.8g/g的碳、1∶4.9g/g的碳、1∶5g/g的碳、1∶5.1g/g的碳、1∶5.2g/g的碳、1∶5.3g/g的碳、1∶5.4g/g的碳、1∶5.5g/g的碳、1∶5.6g/g的碳、1∶5.7g/g的碳、1∶5.8g/g的碳、1∶5.9g/g的碳、1∶6g/g的碳、1∶6.1g/g的碳、1∶6.2g/g的碳、1∶6.3g/g的碳、1∶6.4g/g的碳、1∶6.5g/g的碳、1∶6.6g/g的碳、1∶6.7g/g的碳、1∶6.8g/g的碳、1∶6.9g/g的碳、1∶7g/g的碳、1∶7.1g/g的碳、1∶7.2g/g的碳、1∶7.3g/g的碳、1∶7.4g/g的碳、1∶7.5g/g的碳、1∶7.6g/g的碳、1∶7.7g/g的碳、1∶7.8g/g的碳、1∶7.9g/g的碳、1∶8g/g的碳、1∶8.1g/g的碳、1∶8.2g/g的碳、1∶8.3g/g的碳、1∶8.4g/g的碳、1∶8.5g/g的碳、1∶8.6g/g的碳、1∶8.7g/g的碳、1∶8.8g/g的碳、1∶8.9g/g的碳、1∶9g/g的碳、1∶9.1g/g的碳、1∶9.2g/g的碳、1∶9.3g/g的碳、1∶9.4g/g的碳、1∶9.5g/g的碳、1∶9.6g/g的碳、1∶9.7g/g的碳、1∶9.8g/g的碳、1∶9.9g/g的碳或者1∶10g/g的碳。
表5.玉米粉的组成特征(来源(除非另作说明)：用于喷雾干燥的玉米液体Roquette，Solulys 095E的产品数据表)。
Figure BPA00001448768700651
表6.玉米液体中典型氨基酸的含量(来源：J.Nielsen，″PhysiologicalEngineering Aspects of Penicillium Chrysogenum，″表8.3，p.243(WorldScientific 1997))
Figure BPA00001448768700661
在一个实施方案中，可以将玉米粉与酵母提取物相组合加入到发酵物中来得到有利的发酵结果。在多个实施方案的方法中，玉米粉的使用水平为大约3至大约20g/L、大约5至大约15g/L、或者大约8至大约12g/L、并且酵母提取物的使用水平为大约3至50g/L、大约5至大约30g/L、或者大约10至大约30g/L可以得到玉米粉与酵母提取物相组合的有利的结果。此外，可以在完整发酵的过程或者部分发酵过程中以连续的方式或间隔的传递方式供入玉米粉及发酵提取物。
在其它实施方案中，可以将得自玉米粉和/或酵母提取物的有利化合物(例如甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、六磷酸肌醇以及这些化合物的组合)加入到培养基或培养液中，从而得到有利的作用。
本发明的多个实施方案提供了多个益处：通过在包含一种或多种化合物(包含特定的脂肪酸部分)的培养基中培养所述的有机体、和/或在受控的pH条件下培养有机体来改善Clostridium phytofermentans制备的醇的效价和/或制备率。
制备高水平的醇需要所述的有机体通常能够在高水平的醇存在下茁壮成长、以及能够持续地制备醇而不会过度地受到醇和/或其它存在的成分的抑制或阻抑。对于每一种情况而言，通常涉及不同的代谢途径。例如，与细胞生长有关的途径通常包括与蛋白质的制备、膜制备以及细胞生存所必须的所有细胞亚系统的制备有关的那些。与醇的制备有关的途径通常更具有特异性，例如与糖的代谢(从而制备出醇)、以及制备醇和中间体所必须的酶有关的那些途径。用于一种醇(例如乙醇)的途径可以共有一些相似的酶等，但是还具有对于所述途径而言是独特的酶和底物。尽管在这些多套途径之间可以存在一些重叠，但是不能预计一个途径的增强会自动地增强另一个途径。
在一些情况下，醇耐受或者醇诱导的毒性可以与由高水平的醇引起细胞膜渗透有关，从而导致细胞内的酶和营养物漏出。在一些其他情况下，醇耐受以及制备高效价的醇的能力与细胞内的酶能够承受由存在的醇(例如在细胞中)(无论是由细胞本身制备还是得自穿过细胞膜的运送)引起的变性有关。在一些情况下，更坚固的膜可以在穿过细胞膜时存在较高的醇梯度，由此可以使细胞在较高的外部醇浓度的条件下生长和/或持续制备醇。对于Clostridium phytofermentans已经证明，在一些发酵方法中，在培养液中保持有碳底物的条件下，乙醇浓度在分批发酵大约36-48小时之后达到大约15g/L的停滞时期。在一个实施方案中，将发酵pH降低至大约6.5和/或加入不饱和的脂肪酸会制得所述有机体制备的乙醇的量显著升高，并且在72小时的发酵之后在培养液中观察到大约35g/L的乙醇。在另一个实施方案中，观察到乙醇的效价较低时，所述有机体的制备率较高(至大约0g/L-d)，而当乙醇的浓度较高时，所述制备率较低(至大约2g/L-d)。在降低的pH下和/或在加入脂肪酸的条件下发酵会制得乙醇的制备速率增加大约5倍。
在一个实施方案中，使Q微生物在大约pH5-8.5下与底物发酵。在一个实施方案中，使Q微生物在pH为大约5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5下发酵。
脂肪酸培养基成分
在一个方面中，本发明提供了用于制备醇(例如乙醇)的组合物，其中醇的制备包括在包含含脂肪酸的化合物的培养基中培养Clostridiumphytofermentans。此外，所述的培养基还可以包括生物质的碳源，例如农作物，农作物残余物，树木，木屑，锯末，纸张，硬纸板或包含纤维素、半纤维素、木质纤维素、胶质、多聚葡萄糖、多聚果糖和/或它们的水解形式的其他材料(统称为“供料”)。可以存在其他营养物，包括含硫和含氮的化合物，例如氨基酸、蛋白质、水解的蛋白质、氨水、脲、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆、大豆衍生物、酪蛋白、酪蛋白衍生物、奶粉、牛奶衍生物、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶酵母、玉米液体、玉米固体、谷氨酸一钠和/或其他发酵氮源、维生素、辅助因子和/或矿物质补充物。所述供料可以经过预处理或未经预处理，例如在2008年2月27日提交的美国临时专利申请No.61/032048或者2009年3月9日与所述申请同时提交的作为美国临时专利申请No.61/158,581的美国临时申请中所述的那样，其中所述的文献以引用方式全文并入本文。用于使所述的有机体生长从而生出燃料或其他所需的化学品等的工序和技术在所引用的美国临时专利申请No.61/032048或者于2009年3月9日与所述申请同时提交的作为美国临时专利申请No.61/158,581的美国临时申请中有所描述，其中所述的文献以引用方式全文并入本文。
在一个实施方案中，所述组合物的含脂肪酸化合物可以为游离的脂肪酸、脂肪酸盐或肥皂、三乙酰甘油、二乙酰甘油、单乙酰甘油、磷脂、溶血磷脂、脂肪酸酯或脂肪酸氨基化合物。所述的脂肪酸酯可以包含长链醇、短链醇、中等链的醇、一羟基醇、二羟基醇、三羟基醇、多羟基醇、支化的醇或者包含羟基的其他化合物。优选的酯包括甲醇(脂肪酸甲酯)、乙醇(脂肪酸乙酯)、n-丙醇(脂肪酸丙酯)和异丙醇(脂肪酸异丙酯)的那些，但是其他醇(例如具有4至20个碳的那些)也可以使用。在一些情况下，还可以使用长链醇和多水合醇。合适的长链或多羟基醇包括二醇(例如乙二醇、丙二醇等)、甘油、木糖醇、甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖醇或诸如聚醚(包含一个或多个羟基)和聚乙二醇之类的化合物。当存在多于一个的羟基时，这些基团中的一个或多个可以与另一个化学部分(例如酯、氨基化合物、醚等)结合，或者它们可以为游离的羟基。
在另一个实施方案中，脂肪酸可以包含8至40个碳的碳链，并且优选的是12至24个碳的碳链。具体的实施方案可以使用单一的脂肪酸或者脂肪酸的混合物。当使用多羟基醇时，所述的脂肪酸可以仅与一个羟基结合，或者与多于一个的羟基结合。在一些实施方案中，多于一个的脂肪酸物质可以与单一的多羟基醇结合。与单一的多羟基醇结合的多种脂肪酸的实例包括脂肪和油，例如由动物和织物衍生得到的那些，包括玉米、加拿大油菜、红花、油菜籽、葵花、大豆、橄榄、花生、棕榈、棕榈仁、鱼、蓖麻子、牛脂、猪油、以及部分甘油酯和磷脂。
尽管可以使用任何C8-C30的脂肪酸，但是优选的脂肪酸包括不饱和脂肪酸，例如具有1、2、3或更多的碳-碳双键的那些。特别优选的是在o-9(由非羧基末端测量得到)或δ-9(由羧基末端测量得到)的位置处为不饱和的那些。这些位置中的一处或多处的不饱和还可以伴随其他位置的不饱和。此外，尽管可以使用碳链为8至30个碳的脂肪酸，但是碳链为8至28、12至24或者16至18个碳的那些是优选的。此类脂肪酸的实例包括油酸、硬脂酸、棕榈酸、棕榈油酸、亚油酸、亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、二十二酸、鳕油酸、moroctic或aractidonic acid。在一些情况下，碳-碳双键可以为顺式构造，而在一些情况下，碳-碳双键可以为反式构造。在一些情况下，可以存在多于一个的碳-碳双键。一些合适的脂肪酸可以具有一个或多个顺式碳-碳双键、以及一个或多个反式碳-碳双键，例如共轭的亚油酸以及一些其他的脂肪酸；而一些合适的脂肪酸可以都具有顺式构造或反式构造的碳-碳双键。
在一个实施方案中，可以在Clostridium phytofermentans的发酵方法的早期、中期或晚期将包含一个或多个脂肪酸(“脂肪酸类”)的化合物加入到所述的培养基中。在一个实施方案中，可以在发酵的一个或多个种子期加入脂肪酸化合物。在多个实施方案中，可以在用Clostridiumphytofermentans接种培养基之前、或者接种之后、或者接种同时加入脂肪酸化合物。在另一个实施方案中，可以将脂肪酸加入到最终的发酵培养基中，并且可以在用Clostridium phytofermentans接种培养基之前、或者接种之后、或者接种同时加入脂肪酸。在一些实施方案中，可以在至少一部分的发酵过程中多剂量或连续地加入脂肪酸。更优选的是，可以在醇(例如乙醇)开始在发酵物中累积之后加入脂肪酸。在一个实施方案中，当醇的浓度达到大约2g/L至50g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约2g/L至10g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约5g/L至40g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约10g/L至30g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约2g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约5g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约10g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约15g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约20g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约25g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约30g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约35g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约40g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约45g/L时加入脂肪酸。在另一个实施方案中，当醇的浓度达到大约50g/L时加入脂肪酸。在一些实施方案中，可以将脂肪酸与一种或多种培养基成分一起加入、或者在发酵快开始的时加入，以及在发酵过程中补充脂肪酸。在一个实施方案中，当醇的浓度为2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L或50g/L时，加入脂肪酸。
在一个实施方案中，脂肪酸可以作为溶于醇(例如乙醇)中的溶液形式加入。在另一个实施方案中，脂肪酸可以作为胶体形式加入。在另一个实施方案中，脂肪酸可以与表面活性剂一起加入。
虽然待加入的脂肪酸化合物的量可以随着脂肪酸化合物的形式(例如三乙酰甘油或磷脂)、以及特定的脂肪酸或加入的脂肪酸的组合(例如油酸或棕榈油酸)而改变，但是脂肪酸化合物的合适的量可以为大约1g/L至大约3g/L(可称为游离脂肪酸)。在一些实施方案中，包括在延长时期的运行或者制备大量乙醇或细胞生长的时期，可以将脂肪酸的水平保持在大约1g/L至大约3g/L、或者在大约1g/L至大约3g/L的范围内循环(可称为表面活性剂中存在的、被吸附到细胞表面或固体表面(例如基底或设备)上的游离脂肪酸)。用于测量脂肪酸水平的合适的技术包括在加入或未加入溶解助剂的条件下由培养液中分离出至少一部分上清液，以便促进包含脂肪酸的化合物的解吸附或溶解，并针对脂肪酸含量使用(例如)气象色谱来进行分析。当以分批补料的方式操作发酵时，可以一次性加入所有的脂肪酸化合物，或者部分或连续地加入脂肪酸化合物(例如与供入到发酵罐中的培养基成分相关联)。
在一些实施方案中，被有机体用去的脂肪酸的比例通过以下方法来修改：提供与所述有机体仅具有限定的相互作用形式的脂肪酸，然后加入可以与所述的有机体具有增大的相互作用的化合物。在分离期或者不被有机体消耗的时期存在的形式为与有机体具有限定的相互作用形式的实例。增加相互作用的化合物为能够水解存在的脂肪酸形式的那些，例如具有脂肪酶活性、磷脂酶活性、酸性、碱性等的那些；或者能够溶解脂肪酸的那些。
酸性培养条件
在另一个方面中，本发明提供了制备醇(例如乙醇)的方法，该方法包括在受控的pH条件下在培养基中培养Clostridium phytofermentans。在一个实施方案中，Clostridium phytofermentans的培养可以在酸性pH下生长。培养物所生长的培养基包括碳源，例如农作物，农作物残余物，树木，木屑，锯末，纸张，硬纸板，或包含纤维素、半纤维素、木质纤维素、胶质、多聚葡萄糖、多聚果糖和/或它们的水解形式的其他材料(统称为“供料”)。可以存在其他营养物，包括含硫和含氮的化合物，例如氨基酸、蛋白质、水解的蛋白质、氨水、脲、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆、大豆衍生物、酪蛋白、酪蛋白衍生物、奶粉、牛奶衍生物、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶酵母、玉米液体、玉米固体、谷氨酸一钠和/或其他发酵氮源、维生素、辅助因子和/或矿物质补充物。所述供料可以经过预处理或未经预处理，例如在2008年2月27日提交的美国临时专利申请No.61/032048或者2009年3月9日提交的作为美国临时申请No.61/158,581中所述的那样，其中所述的文献以引用方式全文并入本文。用于使所述的有机体生长从而生出燃料或其他所需的化学品等的工序和技术在所引用的美国临时专利申请No.61/032048或者于2009年3月9日提交的作为美国临时申请No.61/158,581中有所描述，其中所述的文献以引用方式全文并入本文。
在一个实施方案中，在至少一部分发酵中将培养基的pH控制在低于大约pH7.2。在优选的实施方案中，将pH控制在大约pH3.0至大约7.1、或者大约pH4.5至大约7.1、或者pH5.0至大约6.3、或者pH5.5至大约6.3、或者pH6.0至大约6.5、或者pH5.5至大约6.9、或者pH6.2至大约6.7。可以通过加入pH调节剂来控制pH。在多个实施方案中，pH调节剂可以为酸、碱、缓冲剂、或者与其他存在的材料反应的材料，从而起到升高或降低pH的作用。在一些实施方案中，可以使用多于一种的pH调节剂，例如多于一种的酸、多于一种的碱、一种或多种酸与一种或多种碱、一种或多种酸与一种或多种缓冲剂、一种或多种碱与一种或多种缓冲剂、或者一种或多种酸与一种或多种碱与一种或多种缓冲剂。当使用多于一种的pH调节剂时，可以同时或不同时加入这些调节剂。在一些实施方案中，一种或多种酸与一种或多种碱可以结合，从而形成缓冲剂。在一些实施方案中，培养基成分(例如碳源或氮源)还可以起到pH调节剂的作用；合适的培养基成分包括具有高或低pH的那些，或者具有缓冲能力的那些。示例性的培养基成分包括具有残余酸或残余碱的酸水解或碱水解的植物多糖、具有残余氨水的经AFEX处理的植物材料、乳酸、玉米固体或玉米液体。
在一些实施方案中，可以将pH调节剂作为培养基成分的一部分加入，然后使用Clostridium phytofermentans接种。在其他实施方案中，还可以在接种Clostridium phytofermentans之后加入pH调节剂。在一些实施方案中，可以通过多种pH调节剂和/或其他培养基成分和/或代谢物的方式将足够的缓冲能力加入到种子发酵中，从而在最终的发酵阶段提供充分的pH控制。在其他情况下，仅在最终的发酵阶段加入pH调节剂。在其他情况下，可以在种子期和最终阶段加入pH调节剂。在一个实施方案中，在整个发酵中监控pH，并响应于发酵中的变化来进行调节。在一个实施方案中，无论在发酵的任何时期，发酵的pH变化大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或更高的pH值，都可以加入pH调节剂。在其他实施方案中，无论发酵的醇含量为大约0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L或更高，都可以加入pH调节剂。在一些情况下，在发酵的不同时期或时间点上都可以使用不同类型的pH调节剂，例如在种子期使用的缓冲剂、在最终发酵物中加入的碱和/或酸、或者在一个时间下使用的酸及在另一个时间下使用的碱。
在一些实施方案中，在整个发酵中可以使用恒定的pH。在一些实施方案中，有利的是在一个pH下开始发酵，然后在发酵过程中降低pH。在其中pH被降低的实施方案中，可以以阶梯的方式或者更加逐步的方式降低pH。用于降低pH的合适的时间包括在细胞生长的延迟期、细胞生长的指数期、细胞生长的稳定期、细胞生长的死亡期或者在细胞增殖之前或增殖过程中。在一些实施方案中，可以在多于一个的生长期降低pH。尽管在一些实施方案中，可以以阶梯方式降低pH(例如在大约10分钟或更少的时间内发生变化)，但是在一些实施方案中，可以通过更逐步地降低pH(例如在10分钟至大约6个小时或更长的时间内)来得到有利的生长。在一些实施方案中，pH降低的时间和/或量可以与细胞的生长条件相关，例如与细胞的计数、所制备的醇、所存在的醇或者醇的制备速率相关。在一些实施方案中，pH的降低可以以与发酵的物理或化学性质(例如粘度、培养基组成、气体的产生、释放气体的组成等)相关的方式进行。
合适的缓冲剂的非限定性实例包括磷酸盐，包括一盐基的、二盐基的、三盐基的盐、这些盐的混合物以及与酸的混合物；柠檬酸盐，包括多种碱性形式、它们的混合物以及与酸的混合物；以及碳酸盐。
可以用作pH调节剂的合适的酸包括与有机体相容的任何液体或气体酸或碱。其实例包括氨水、氢氧化铵、硫酸、乳酸、柠檬酸、磷酸、氢氧化钠和HCl。在一些情况下，酸或碱的选择可以受到酸或碱与用于发酵的设备的相容性的影响。在一些情况下，加入酸以降低pH或者消耗碱、以及加入碱以升高pH或消耗酸都可以用于相同的发酵中。
可以由对发酵罐中内含物pH的测量(例如通过抓毛样品或通过浸渍的pH探针)来确定加入的pH调节剂的时间和量，或者可以根据其他参数(例如进入发酵的时间、气体的生成、粘度、醇的制备、效价等)来确定所述的时间和量。在一些实施方案中，可以使用这些技术的组合。
在一个实施方案中，发酵的pH以中性pH开始，然后当检测到制备出醇之后，将pH降低至酸性pH。在另一个实施方案中，发酵的pH以中性pH开始，然后保持在酸性pH下直到发酵达到生长的稳定期。
脂肪酸培养基成分和酸性培养条件
在另一个实施方案中，可以使用将包含脂肪酸的化合物加入到培养基中以及在降低pH下进行发酵的组合。在一些实施方案中，加入脂肪酸(例如游离的脂肪酸)要达到两个技术：加入脂肪酸化合物，以及降低发酵的pH。在其他实施方案中，可以加入不同的化合物以完成各技术。例如，可以将植物油加入到培养基中以提供脂肪酸，然后可以在发酵过程中加入矿物质酸或有机酸以便将pH降低至合适的水平，如上文所述。当发酵包括控制在降低的pH下以及加入包含脂肪酸的化合物时，可以一起使用用于各种类型的单独操作的本文所述的方法和技术。在一些实施方案中，在低pH下的操作以及包含脂肪酸的化合物的存在的操作可以是同时的。在一些实施方案中，包含脂肪酸化合物的存在将在低pH下的操作之前，而在一些实施方案中，在低pH下的操作将在加入包含脂肪酸的化合物之前。在一些实施方案中，在低pH下的操作以及脂肪酸的存在都在使用Clostridiumphytofermentans接种之前。在一些实施方案中，在低pH下的操作将在使用Clostridium phytofermentans接种之前，并且脂肪酸的存在将在使用Clostridium phytofermentans接种之后或接种过程中。在一些实施方案中，脂肪酸的存在将在使用Clostridium phytofermentans接种之前，而在低pH下的操作将在使用Clostridium phytofermentans接种之后或接种过程中。在其他实施方案中，在低pH下的操作以及脂肪酸的存在将在使用Clostridiumphytofermentans接种之后。在一些实施方案中，在低pH下的操作以及脂肪酸的存在将在发酵的其他时期。
Clostridium phytofermentans的基因修饰
在另一个方面中，本发明提供了通过创建并使用基因修饰的Clostridium phytofermentans来制备燃料(例如一种或多种醇，例如乙醇)的组合物和方法。本发明特别考虑了调节发酵的生物化学途径、糖分解酶的表达或者在Clostridium phytofermentans的发酵过程中增强对环境条件的耐受。在一个实施方案中，使用编码一个或多个基因(用于所关注的途径、酶或蛋白质)的异源多核苷酸来转化Clostridium phytofermentans。在另一个实施方案中，转化Clostridium phytofermentans，以制备用于所关注的途径、酶或蛋白质的多个拷贝的一个或多个基因。在一个实施方案中，使用编码一个或多个基因的异源多核苷酸来转化Clostridium phytofermentans，其中所述的一个或多个基因编码了用于己糖水解和/或发酵的酶，其中所述的基因在充足的水平下表达，所述水平足以赋予所述的Clostridiumphytofermentans转化子以升高浓度、制备率水平或产率的条件(与未经转化的Clostridium phytofermentans相比)下来制备乙醇的能力。按照这种方式，可以得到增强的乙醇制备速率。
在另一个实施方案中，使用编码一个或多个基因的异源多核苷酸来转化Clostridium phytofermentans，其中所述的基因编码了用于多糖的糖化作用的糖水解酶，其中所述的基因在充足的水平下表达，所述水平足以赋予所述的Clostridium phytofermentans转化子以升高浓度、糖化速率或单、二或寡糖产率的条件(与未经转化的Clostridium phytofermentans相比)下来将多糖糖化为单、二或寡糖的能力。按照这种方式，可以得到增强的乙醇制备速率。由宿主产生糖分解酶以及糖分解酶随后被释放到培养基中，减少了将生物质或多糖降解为可发酵的单糖和寡糖所需的市售酶的量。糖分解DNA对于宿主而言可以是天然的，但是更通常的是所述DNA是外来的、异源的。有利的糖分解基因包括降解纤维素、降解木质素及降解淀粉的酶，例如纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶。糖分解酶可以至少部分由宿主分泌，或者它可以在细胞内大量累积以便随后释放。有利的是，当需要通过热诱导的裂解时，可以释放热稳定的细胞内累积的酶。酶的组合可以由异源DNA编码，一部分酶被分泌，而一部分酶被累积。
可以进行其他修饰以增强题述发明的重组细菌的乙醇制备。例如，宿主可以进一步包含其他的异源DNA节段，其表达产物为与单糖和/或寡糖运送到重组宿主中有关的蛋白质。同样，得自糖分解途径的其他基因可以并入到宿主中。以这种方式，可以得到增强的乙醇制备速率。
为了改善生物燃料(例如乙醇)的制备，可以在转录调节子、用于形成有机酸的基因、碳水化合物运送基因、孢子形成基因、影响辅酶因子的形成/再生的基因、影响乙醇耐受的基因、影响盐耐受的基因、影响生长速率的基因、影响氧耐受的基因、影响代谢副产物抑制的基因、影响氢制备的基因、影响重金属抗性的基因、影响酸抗性的基因或者影响醛抗性的基因中进行修饰。
本领域的技术人员将理解的是，可以根据本文举例会说明的方法来进行大量的修饰。例如，多种启动子可以用于驱动异源基因在重组Clostridiumphytofermentans宿主中的表达。受益于本公开的技术人员能够容易地选择并使用可用于上述目的的多种启动子中的任何一种。同样，通常优选的是，技术人员可以使用高拷贝数量的质粒。在另一个实施方案中，可以通过所需基因的染色体整合来制备构建体。外来基因的染色体整合可以提供好于基于质粒的构建的多个益处，对于市售方法而言，基于质粒的构建具有某些限制。乙醇制备基因已经整合到E.coli的染色体中，参见Ohta et al.(1991)Appl.Environ.Microbiol.57：893-900。总体而言，通过纯化DNA片段来上述目的，其中所述的DNA片段包含(1)抗生素抗性基因上游的所需基因，以及(2)得自目标有机体的同源DNA的片段。可以连接该DNA，从而形成不具有复制子的环，并用于转化。因此，所关注的基因可以被引入到诸如E.coli的异源宿主中，而短的随机片段可以分离并连接到Clostridiumphytofermentans中，从而促进同源重组。
生物燃料植物以及制备生物燃料的方法：
得自生物质的大规模的乙醇制备
通常，存在两种使用微生物细胞(特别是C.phytofermentans细胞)由生物质大规模地制备燃料级别的乙醇的基本方法。在第一种方法中，人们首先将包含高分子量碳水化合物的生物质材料水解成低分子量碳水化合物，然后使用微生物细胞发酵低分子量的碳水化合物从而制备乙醇。在第二种方法中，人们在进行化学和/或酶预处理的条件下对生物质材料本身进行发酵。在第一种方法中，可以使用酸(例如Bronsted酸(例如硫酸或氢氯酸)、碱(例如氢氧化钠)、热处理方法、氨纤维爆破方法(“AFEX”)、石灰方法、酶或它们的组合)来完成水解。如果需要，可以捕获并纯化氢以及发酵的其他产物，并处理掉(例如通过燃烧)。例如，氢气可以突然燃烧，或者在以下方法中用作能量来源，所述方法例如为通过(例如)燃烧来驱动蒸汽锅炉。生物质的水解和/或蒸汽处理可以(例如)增加生物质的孔隙率和/或表面积，通常使得纤维素材料更加暴露于微生物细胞，这样可以增加发酵速率和产率。除去木质素可以(例如)提供用于驱动锅炉的易燃燃料，并且还可以(例如)增加生物质的孔隙率和/或表面积，由此通常增加发酵速率和产率。通常，在任何一个以下所述的实施方案中，培养基中碳水化合物的初始浓度高于20mM，例如高于30mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM或者甚至高于500mM。
生物质加工植物以及由生物质制备产物的方法
在一个方面中，本发明特写了燃料工厂，其包含水解单元，该水解单元被构建成水解包含高分子量碳水化合物的生物质材料；发酵罐，其被构建成容纳分散于其中的Clostridium phytofermentans细胞或者另一种C5/C6水解有机体的培养基；以及一个或多个产物回收系统，以便分离一种或多种产物及相关副产物和共制备物。
在另一个方面中，本发明特写了制备一种或多种产物的方法，该方法包括将Clostridium phytofermentans细胞或另一种C5/C6水解有机体、以及生物质供料在培养基中结合；以及在足以制备生物燃料、化学产物或发酵终产物(例如乙醇、丙醇、氢、木质素、萜类化合物等，如第0063段所述)的条件和时间内发酵生物质材料。
在另一个方面中，本发明特写了通过本文所述的任何一种方法制得的产物。
得自生物质的大规模的化学制备
通常，存在两种使用微生物体(例如C.phytofermentans细胞或其他C5/C6水解有机体)由生物质大规模地制备化学产物的基本方法。在所有的方法中，根据生物质的类型及其物理表现，一种方法可以包括通过湿法磨碎或干法磨碎将碳质材料磨碎，从而减小材料的尺寸并增大表面积与体积的比(物理表现)。
在第一种方法中，人们首先将包含高分子量的碳水化合物的生物质材料水解，使其脱木素，或者将碳水化合物与非碳水化合物分离。使用加热、化学品和/或酶处理的任何组合，可以分离水解的材料从而形成液体和脱水的流，这些流体可以或者可以不经过分开的处理，并保持分开或再结合，然后使用Clostridium phytofermentans细胞或另一种C5/C6水解有机体来发酵低分子量的碳水化合物，从而制备一种或多种化学产物。在第二种方法中，在未经加热、化学品和/或酶的预处理的条件下，人们使生物质材料本身发酵。在第一种方法中，可以使用酸(例如硫酸或氢氯酸)、碱(例如氢氧化钠)、热处理方法、氨纤维爆破方法(“AFEX”)、石灰方法、酶或它们的组合来完成水解。生物质的水解和/或蒸汽处理可以(例如)增加生物质的孔隙率和/或表面积，通常使得纤维素材料更加暴露于任何C5/C6水解有机体(例如C.phytofermentans)，这样可以增加发酵速率和产率。生物质的水解和/或蒸汽处理可以(例如)产生副产物或共制备物，这些产物可以被分离或处理，从而改善发酵速率和产率，或者用于动力以运行所述方法，或者用作经过进一步加工或未经进一步加工的产物。除去木质素可以(例如)提供用于驱动锅炉的易燃燃料。如果需要，可以捕获并纯化发酵的气体(例如氢气和CO2)、液体(例如乙醇和有机酸)、以及固体(例如木质素)产物，或者通过(例如)燃烧来处理掉。例如，氢气可以突然燃烧，或者在以下方法中用作能量来源，所述方法例如为通过(例如)燃烧来驱动蒸汽锅炉。离开发酵罐的产物可以经过进一步的加工，例如，乙醇可以被转移以进行蒸馏和精馏，从而制备浓缩的乙醇混合物，或者可以分离固体以用于提供能量或者用作化学产物。应该理解的是，制备发酵终产物或生物燃料的其他方法可以并入所述的任何及所有方法、以及可以以经济或机械方式将这些方法发展成流水线的其他或替代方法，所有这些方法的内容均全部并入本发明的范围内。
图8为通过在高温和高压下使用酸在水解单元中首先对生物质进行处理来由该生物质制备化学产物的方法的实例。可以通过加入热水或蒸汽首先对生物质进行加热。可以通过将二氧化硫气体鼓泡通过悬浮于水中的生物质，或者通过在经过或未经过预热/预汽蒸/加入水的条件下加入强酸(例如硫酸、氢氯酸或硝酸)来酸化生物质。在酸化过程中，将pH保持在低水平下，例如低于大约5。可以在加入酸之后升高温度和压力。除了已经存在于酸化单元中的酸以外，还可以加入可任选的金属盐，例如硫酸亚铁、硫酸铁、氯化铁、硫酸铝、氯化铝、硫酸镁或它们的混合物，以有助于生物质的水解。将酸浸渍的生物质供入到预处理单元的水解部分中。将蒸汽直接注射到预处理单元的水解部分中，以便直接接触并将生物质加热至所需的温度。在加入蒸汽后生物质的温度为大约130℃至220℃。然后，将水解产物卸载到预处理单元的闪蒸罐中，并将该闪蒸罐保持一段时间以便进一步将生物质水解成(例如)寡糖或单糖。此外，蒸汽爆破还可以用于进一步破裂生物质。备选地，对于任何高压预处理方法而言，可以使生物质通过压锁进行卸载。然后，例如在固体浓度为大约15％至60％下，在加入或未加入水的条件下，由预处理反应器中卸载水解产物。
在预处理后，例如通过使用(例如)逆流萃取器、压洗机、压滤机、压力式过滤器、螺旋挤压机或带式真空过滤机进行挤压、离心或过滤来对生物质进行脱水和/或用一定量的水进行洗涤，从而除去酸化的流体。例如在预处理单元的酸化部分中，可以再次使用经过或未经过进一步处理(例如加入碱(例如石灰)和/或氨水(例如磷酸铵))的酸化流体，或者将该流体加入到发酵物中，或者收集该流体以用于其它用途/处理。产物可以衍生自酸化流体(例如石膏或磷酸铵)的处理。可以在预处理过程中加入酶或酶的混合物，从而在高分子量成分的水解中有助于对抗纤维素、半纤维素、胶质和淀粉的成分的活性的(例如)葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、纤维二糖水解酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶、配糖水解酶、糖基转移酶、裂解酶以及酯酶。
向发酵罐中供入水解的生物质、得自生物质预处理的任何液体级分、Clostridium phytofermentans细胞的活性种子培养物、共发酵微生物(例如酵母或E.coli)(如果需要)以及营养物(如果需要)来促进Clostridiumphytofermentans或其它微生物的生长。备选地，可以将经过预处理的生物质或液体级分分到多个发酵罐中，每个发酵罐都包含不同的Clostridiumphytofermentans菌株和/或其它微生物，并且每个发酵罐都在特定的物理条件下操作。在将温度保持在(例如)大约25℃至50℃的同时，使发酵进行一段之间，例如大约15至150小时。将发酵过程中制备的气体吹出发酵罐，并在经过或未经过进一步加工的条件下卸载、收集或扩大，例如，氢气可以被收集并用作动力来源，或者作为共制备物纯化。
在发酵后，转移发酵罐中的内含物，以进行产物回收。提取产物，例如通过蒸馏和精馏来回收乙醇
在未经预处理的条件下得自生物质的化学制备
图9示出了通过将生物质加载到发酵容器中来由该生物质制备化学品的方法。在进行或未进行加热、水、酶或酸/碱的条件下，可以将所述的生物质浸泡一段时间。在加工容器中的压力可以保持在或者高于大气压力。在预处理时间结束时，可以加入酸或碱以用于中和。在预处理时间结束时，或者在预处理开始的同时，加入Clostridium phytofermentans细胞或另一种C5/C6水解有机体的活性种子培养物、共发酵微生物(例如酵母或E.coli)(如果需要)以及促进Clostridium phytofermentans或其他微生物生长的营养物(如果需要)。可以按照上文所述进行发酵。在发酵后，按照上文所述，转移发酵罐的内含物，以进行产物回收。
可以使用化学制备方法和/或特征的任何组合，以便形成混杂的制备方法。在本文所述的任何方法中，可以在任何步骤中除去、加入或组合产物。可以单独使用Clostridium phytofermentans，或者与一种或多种其他微生物(例如酵母、真菌或其他细菌)相组合来协同使用。可以在单一的植物中使用不同的方法以制备不同的产物。
在另一个方面中，本发明特写了燃料工厂，其包含水解单元，该水解单元被设置成水解包含高分子量碳水化合物的生物质材料；发酵罐，其被设置成容纳培养基，并包含分散于其中的Clostridium phytofermentans细胞。
在另一个方面中，本发明特写了制备一种或多种燃料的方法，该方法包括将Clostridium phytofermentans细胞与木质纤维素材料(和/或其他生物质材料)在培养基中结合；以及在足以制备一种或多种燃料(例如乙醇、丙醇和/或氢、或者另一种化学化合物)的条件和时间内发酵木质纤维素材料。
在一些实施方案中，本发明提供了使用酸水解预处理来由生物质制备乙醇和氢的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用酶水解预处理来由生物质制备乙醇和氢的方法。其他实施方案提供了使用未经酶的预处理的生物质来由该生物质制备乙醇和氢的方法。其他实施方案公开了使用未经化学或酶的预处理、但是可任选地经过蒸汽处理的生物质来由该生物质制备乙醇和氢的方法。
在另一个方面中，本发明特写了通过本文所述的任何一种方法制得的产物。
实施例
以下实施例举例说明了某些优选的实施方案和方面，并且不应该解释成限制了本发明的范围。
实施例1.仅供入Q微生物的培养基成分的分批发酵与分批补料发酵的比较
试验条件：
在分批补料模式下操作3个搅拌罐反应器(STR)或发酵罐，以便研究使用Q-微生物的纤维二糖发酵。在分批模式下操作第4个STR作为对照。在0时，无论在分批补料模式还是在分批模式下操作的所有STR都包含30g/L纤维二糖底物。所有试剂都得自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，并且都是试剂级或更高级别的。
接种物的制备：
使用冷冻培养物(储存在-80℃下)来创建接种物，该接种物在35℃下在10mL的管中厌氧繁殖48小时，其中所述的管装有处于DI水中的0.3％纤维二糖、以及4g/L KH2PO4、8g/L K2HPO4、1g/L(NH4)2SO4、0.6g/L半胱氨酸-HCl、6g/L Ambrex 695酵母提取物(Sensient，Juneau，WI)(液体体积为大约10ml)。此后，使接种物在35℃下在使用2％(v/v)的种子量的100mL血清中生长48小时。血清瓶包含处于DI水中的20g/L纤维二糖、1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、2.1g/L脲、2g/L半胱氨酸-HCl、10g/LMOPS缓冲剂、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/L FeSO4·7H2O。在显微镜下针对微生物污染检测生长接种物的等分液，并在3000rpm下离心15分子，从而浓缩生物质(大约2-4g/L总悬浮固体)以用于接种发酵罐。使用相同的接种物制备程序以用于分批和分批补料发酵。
分批发酵(对照)
制备在DI水中包含50g/L纤维二糖、1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、2.1g/L脲、2g/L半胱氨酸-HCl、10g/L MOPS缓冲剂、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/L FeSO4·7H2O的培养基。使用2N NaOH将培养基的pH调节至7.5，并将300ml的培养基转移至各500mL的发酵罐中。在将容器脱气后(在大约室温下对培养基施加600mbar真空至少5分钟，然后用氮气吹扫顶部空间从而将容器压力升至大气压)，通过在121℃的温度以及15psi热压30分钟对容器进行灭菌。一旦热压容器冷却至室温，就可以使用60mL的无菌注射器使用10％(v/v)的接种物(浓缩的种子体积/最终发酵体积)接种。在35℃下将培养液培养151小时，然后在125rpm下搅拌。
每天由发酵罐取样，并使用装备了Aminex
Figure BPA00001448768700821
HPX-87H Exclusion柱(300mmx7.8mm)和RI探测器的HPLC针对纤维二糖、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇进行分析。将0.005N H2SO4用作流动相，流速为0.6mL/分钟，并将柱保持在55℃。
分批补料发酵：
制备在DI水中包含30g/L纤维二糖、1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、2.1g/L脲、2g/L半胱氨酸-HCl、10g/L MOPS缓冲剂、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/L FeSO4·7H2O的培养基。使用2N NaOH将培养基的pH调节至7.5。将培养基(300ml)加入到3个500mL的发酵容器中。按照与分批发酵相同的方式将发酵罐脱气后，在121℃的温度以及15psi热压30分钟。一旦热压容器冷却至室温，就可以使用60mL的无菌注射器使用10％(v/v)的接种物(浓缩的种子体积/最终发酵体积)接种。在35℃下将培养液培养184小时，然后在125rpm下搅拌。肉汤补充25mL新鲜培养基，在DI水中具有250g/L纤维二糖和1.5g/LKH2PO4、2.9g/L K2HPO4、2.1g/L脲、2g/L半胱氨酸-HCl、10g/L MOPS缓冲剂、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/L FeSO4·7H2O，在发酵罐接种后的24、48、72、96、120、144和168小时加入发酵罐。补充培养基已经灭菌。
发酵罐的监测
每天由发酵罐取样，并使用装备了Aminex
Figure BPA00001448768700831
HPX-87H Exclusion柱(300mmx7.8mm)(Bio-Rad，Hercules，CA)和RI探测器的HPLC针对纤维二糖、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇进行分析。将0.005N H2SO4用作流动相，流速为0.6mL/分钟，并将柱保持在55℃。
结果：
图1示出了在整个发酵的运行过程中对照发酵罐中的底物(纤维二糖)和产物(乙醇)的浓度，其中所述的对照发酵罐是在分批模式下操作的。该图显而易见的是，在大约30小时之后，培养液中乙醇的浓度达到平稳。尽管对照发酵罐保持运行达6天之多，但是乙醇的浓度并未有较大的增多。
图2示出了在分批补料模式下操作的发酵罐中的底物(纤维二糖)和产物(乙醇)的概况。所示的值为3个发酵的平均值。如图中所示，随着新鲜营养物和底物的供入，乙醇的浓度持续增高。在分批补料操作的整个操作过程中，所取得的最大乙醇浓度为大约12g/L，其为在分批模式下操作的对照发酵罐中取得的效价的二倍之多。
除了较高的乙醇效价之外，分批补料方法(碳底物浓度为大约20-30g/L)还可以得到较高的制备率以及较少的产酸(基于g/g发酵的糖，以及g/g制备的乙醇)，如表7所示。此外，显而易见的是，与所述有机体的现有报道相比，所采用的特定培养基和发酵条件会得到较高的早期制备率(在发酵的早期部分大约4g/L-天)。
表7.分批和分批补料试验的重要发酵参数的比较
  参数   分批   分批补料
  负载的糖，g   9.00   38.75
  发酵的糖，g   3.22   19.63
  乙醇浓度，g/L   4.93   12.29
  乙醇产率，g/g发酵的糖   0.46   0.27
  酸的产率，g/g发酵的糖   0.19   0.02
  乙醇制备率，g/L-d   0.78   1.83
实施例2.使用不溶碳源的分批补料操作
使用不溶碳源(例如微晶纤维素)进行分批和分批补料发酵。按照实施例制备发酵培养基，不同之处在于在最终的制备培养基中使用微晶纤维素替代纤维二糖。(并非或者除了最终的发酵培养基中，在一个或多个其他的发酵或种子期，使用微晶纤维素替代纤维二糖。)使用微晶纤维素趋向的结果与使用纤维二糖的结果相似，与分批操作相比，分批补料中具有较高的乙醇产物和制备率。同样，与分批操作相比，在分批补料操作中，糖较多地转化为乙醇(g乙醇/g发酵的糖)并且糖较少地转化为酸(g酸/g发酵的糖，以及g酸/g乙醇)。使用更复杂的不溶碳源(例如磨木料、研磨植物物质、或者经预处理的磨木料或经预处理的研磨植物物质、以及纤维素、木质纤维素或半纤维素材料或废料流)可以取得相同的结果趋向。但是，与纤维二糖的结果相比，制备乙醇或其他目标产物的绝对比例变得较高或较低，这至少部分是由于在更加复杂的底物中存在其他的营养物或抑制试剂。
实施例3.具有细胞增量的分批补料操作
在发酵过程中在向培养液中加入新鲜细胞的条件下进行分批补料发酵。按照实施例1所示制备并接种发酵培养基。在24小时间隔下，将新鲜的接种物(2-3％v/v)加入到发酵物中，并按照实施例1所示分析培养液的样品。在大约2-4天之后，收获培养液。在收货时，培养液中乙醇的含量高于大约6g/l，表明大量高于分批操作，还表明制备率升高。
相似的结构在实施例2的不溶或更加复杂的碳源系培养基中看见。此外，还可以在其中存在较高浓度的碳底物的条件(例如多达大约100g/L，或者在一些情况下为更高)下使用具有新鲜细胞的增量发酵培养液。
实施例4.具有细胞增量以及加入的培养基的分批补料操作
在发酵过程中在向培养液中加入新鲜细胞和新鲜培养基成分的条件下进行分批补料发酵。按照实施例1所示制备并接种发酵培养基。在24小时间隔下，按照实施例1所示将新鲜的接种物(2-3％v/v)加入到发酵物以及培养基中。按照实施例1所示，分析培养液样品。在大约2-4天之后，收获培养液。在收货时，乙醇的产率和制备率高于不具有细胞增量的分批补料发酵物。同样，与不具有细胞增量的分批补料发酵相比，显示出改善的碳利用(g乙醇/g发酵的糖)以及减少的酸的制备(g酸/g乙醇、以及g酸/g发酵的糖)。
相似的结果在实施例2的不溶及更加复杂的碳源系培养基中看见。
实施例5.具有酵母提取物的分批补料发酵
使用4个搅拌罐反应器(STR)，每个反应器都具有包含25g/L纤维二糖、1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/LFeSO4·7H2O以及不同水平的酵母提取物(Bacto，TM Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)(10，15，20和30g/L)的300mL培养基。Bacto酵母提取物的分析提供于表8中。所有的STR都在35℃、125rpm以及分批补料操作模式下温育，并且每24小时都加入额外的纤维二糖(25ml 200g/l的溶液)。在整个发酵过程中都监测乙醇的制备。表9示出了得自这些试验的乙醇浓度。
表8.Bacto酵母提取物的典型组成(来源：Bacto datasheet，BectonDickinson)。
  总氮   10.9％
  氨基氮   6.0％
  灰   11.2％
  干燥损失   3.1％
  氨基酸分析   游离(％)   总量(％)
  丙氨酸   4.4   5.6
  精氨酸   1.6   5.3
  组氨酸   0.6   1.3
  亮氨酸   3.0   4.1
  蛋氨酸   0.6   0.8
  脯氨酸   0.8   2.0
  苏氨酸   1.1   1.6
  酪氨酸   0.8   1.2
  精氨酸   1.4   2.6
  胱氨酸   0.2   (被水解破坏)
  甘氨酸   1.0   3.0
  异亮氨酸   1.8   3.0
  赖氨酸   1.9   4.6
  苯丙氨酸   2.0   2.6
  丝氨酸   2.6   1.6
  色氨酸   0.5   (被水解破坏)
  缬氨酸   2.2   3.5
表9.在不同时间下针对各培养基配制物以g/L表示的乙醇浓度
对于10、15、20和30g/L的酵母提取物培养基而言，在18小时时针对不同培养基组成的体积制备率分别为2.00、2.69、2.48、3.20g/L-天。
这些结果显示乙醇效价升高，并且随着酵母提取物的量的升高，总体制备率升高，并且显示乙醇制备高达大约15g/L，并且瞬间制备率高于大约10g/L-天。
实施例6.在使用不同植物油补充物下C.phytofermentans的乙醇制备
通过在搅拌条件下使Clostridium phytofermentans培养物在纤维二糖培养基上生长直至停止制备乙醇来评价发酵过程中脂肪酸补充物对乙醇制备的影响。将包含10mL新生长的接种物的新鲜培养基与2g/L植物油结合。对于乙醇的制备再监测100小时。
使用的试剂：
除了植物油以外的所有化学品均为得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)的至少为试剂级的化学品。植物油为Great Value品牌的油，由Wal-Mart(Bentonville，AR)出售。
脱气以及灭菌工序：
在真空下、在氮气吹扫下对用于接种物繁殖的所有反应器和血清小瓶进行脱气。最少实施3个脱气循环。通过在121℃的温度以及15PSI压力下热压30分钟来灭菌容器。
接种物的制备：
使用冷冻培养物(储存在-80℃下)在35℃下在10mL的管中繁殖48小时，其中所述的管装有处于DI水中的0.3％纤维二糖、以及1.5g/LKH2PO4、2.9g/L K2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、1g/L MgCl26H2O、0.15g/L CaCl2 2H2O、0.00125g/L FeSO4 7H2O。用2N NaOH将培养基的pH调节至7.5。热压后，使接种物在35℃下在使用2％(v/v)的种子量的100mL血清中生长24小时。血清瓶包含处于DI水中的20g/L纤维二糖、1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/LFeSO4·7H2O。在3000rpm下将接种物离心15分子，从而浓缩所述细胞(大约2-4g/L总悬浮固体)以用于接种发酵罐。
最终发酵-使用不同油的筛选试验：
将5个搅拌罐反应物填满包含20g/L纤维二糖、1.5g/L KH2PO4、2.9g/LK2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L柠檬酸钠、1g/LMgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/L FeSO4·7H2O、6g/L酵母提取物(Bacto)的50mL培养基。每个反应器都使用得自一个血清瓶的浓缩细胞接种。在批量模式下操作发酵罐直到乙醇的制备停止。各反应器的乙醇浓度示于表10中。在该时间点时培养基中残余的纤维二糖为大约15-20g/L。然后，将每个反应器补充大约10mL的新鲜生长接种物以及2g/L植物油，如表10所示。使发酵再持续100小时。最终的乙醇浓度示于表10中。补充后的整个时期内乙醇的浓度示于图4以及表11中。
表10.培养基补充之前不同反应器中乙醇的浓度
Figure BPA00001448768700871
表11.乙醇浓度与时间
乙醇浓度(g/L)
Figure BPA00001448768700881
结果
向发酵物中加入玉米油、大豆油、加拿大油菜油、椰子油和橄榄油均可以使得乙醇进一步制备。此外，使乙醇增加最多的是得自于油酸高的油的补充(橄榄油、加拿大油菜油、大豆油和玉米油，如表14所示)，并且亚麻酸含量也有助于产率的增加。
实施例7.在降低的pH下Clostridium phytofermentans的乙醇制备
生物反应器装有包含20g/L纤维二糖、1.5g/L KH2PO4、2.9g/LK2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L柠檬酸钠、1g/LMgCl2·6H2O、0.15g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/L FeSO4·7H2O、6g/L酵母提取物(Bacto)的300mL的培养基。在批量补料模式下通过以1.4mL/h流速连续供入包含200g/L纤维二糖的浓缩培养基来操作发酵罐。分别在受控的pH7.5、7和6.5下操作生物反应器。
在整个发酵过程中针对乙醇的浓度监测发酵罐。结果示于表12和图5中。结果显示，在pH低于7.5下发酵使得乙醇的浓度增加以及乙醇的制备率增加。
表12.在不同pH下发酵的乙醇浓度
  BR1   BR2   BR3
  时间，h   pH 7.5   pH 7   pH 6.5
  0   0.04   0.00   0.17
  20.5   2.68   4.19   4.22
  48.5   6.15   9.80   10.7
  68.5   9.00   13.0   13.5
  92.5   11.9   15.3   15.3
  116.5   11.6   15.4   15.3
  144.5   11.5   13.5   16.1
  175.5   11.8   15.6   16.4
实施例8.在加拿大油菜油存在下降低的pH
反应器装有包含处于DI水中的50g/L纤维二糖、3g/L KH2PO4、1.6g/LK2HPO4、2g/L柠檬酸三钠·2H2O、1.2g/L柠檬酸H2O、0.5g/L(NH4)2SO4、1g/L NaCl、0.8g/L MgCl2·6H2O、0.1g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/LFeSO4·7H2O、1g/L半胱氨酸HCl、10g/L酵母提取物(Bacto)以及5g/L的玉米粉的300mL的培养基。在分批模式下操作发酵罐。
针对乙醇浓度监测发酵物。结果示于表13中。较高浓度的乙醇和制备得自于在加拿大油菜油存在下、在低pH下的操作，以及改善的效价和制备率得自于在pH6.5下的操作(与在pH7.0下的操作相比)(图6)。
表13.在加拿大油菜油存在下在变化的pH下的发酵
  时间，h   pH＝6.5   pH＝6.5，加拿大油菜油  时间，h   pH＝7
  0   0.18   0.03   0   0.00
  20.5   6.07   6.26   20   4.05
  48.5   18.67   20.02   44   14.22
  70.5   23.08   24.51   68   15.20
表14.多种可食用脂肪和油的脂肪酸概况；其值以总脂肪酸的百分率表示
Figure BPA00001448768700901
实施例10.Clostridium phytofermentans的基因修饰以增加乙醇、其他生物 燃料和化学产物的制备
使用得自细菌培养物集合的部分质粒构建适用于C.phytofermentans的质粒。质粒Pimp1为非接合质粒，该质粒可以在E.coli中以及一定范围的革兰氏阳性细菌菌种中复制，并且其还编码红霉素的抗性。C.phytofermentans对红霉素高度敏感，因此其不能在浓度为0.5微克红霉素/ml的微生物生长培养基中生长。广谱宿主范围的接合质粒RK2包含所有细菌接合系统所必须的基因，所述系统包括：对接合系统的DNA聚合酶具有特异性的复制起点，接合的DNA复制基因，以及编码合成pili的基因，其中所述的pili能够识别潜在的受体细菌细胞，并且起到导管的作用，通过该导管，单链质粒DNA通过细胞与细胞的接触而由供体细胞转移至受体细胞中。由质粒Prk290获得用于PK2接合系统的转移起点，其中所述的质粒Prk290得自German Collection of Microorganisms and CellCultures(DSMZ)的DSM3928，而RK2的其他接合功能得自Prk2013，其得自DSMZ的DSM5599。使用聚合酶链式反应来扩增得自Prk290的转移区(oriT)的112个碱基对起点，其中所述的Prk290使用了在oriT区的一侧加入了Cla1限制性位点的引物。将该DNA片段插入到pIMP1的Cla1位点，从而形成质粒Pimpt。当Prk2013也呈现出提供其他接合功能时，Pimpt显示出可以由E.coli的一个菌株转移至另一个菌株。但是证明，Pimpt不能由E.coli接合转移至C.phytofermentans。由于在C.phytofermentans中，驱动Pimpt中的红霉素抗性基因的表达的启动子未发挥作用，使用PCR由C.phytofermentans的染色体扩增醇脱氢酶基因C.phytofermentans 1029的启动子，并且使用PCR来替代Pimpt中红霉素基因的启动子从而创建Pimpt1029。当Prk2013也呈现出提供其他接合功能时，Pimpt1029可以由E.coli接合转移至C.phytofermentans。由于包含Pimpt1029的C.phytofermentans衍生物能够在包含至多10微克红霉素/ml的培养基上生长，并且通过使用PCR引物来特异性地扩增对得自C.phytofermentans衍生物的Pimpt1029具有特异性(但是对不包含所述质粒的对照C.phytofermentans培养物不具有特异性)的两个基因区，证明质粒DNA能够成功地转移至C.phytofermentans中。
Pimpt1029由E.coli至C.phytofermentans的接合转移是通过初始构建包含Pimpt1029和Prk2013的E.coli菌株(DH5α)来完成。然后通过使用合适的生长培养基生长至对数中期来获得所述E.coli培养物的新鲜细胞以及C.phytofermentans受体培养物的新鲜细胞(分别为L培养液和QM1培养基)。然后，对两种细菌培养物进行离心，从而得到细胞团，并将该细胞团再次悬浮于相同的培养基中，从而得到浓缩了大约10倍并且细胞密度为大约1010个细胞/ml的细胞悬浮液。然后将这些浓缩的细胞悬浮液混合，从而得到5比1的供体与受体比。然后，将细胞悬浮液点斑到QM1琼脂平板上，并在30℃下厌氧温育24小时。由QM1平板上除去细胞混合物，并放置在包含抗生素的固体或液体QM1培养基上，其中选择抗生素，使得其仅使表达红霉素抗性的C.phytofermentans受体细胞存活。该过程可以通过使用抗生素的组合来完成，其中抗生素由20微克/ml的甲氧苄氨嘧啶、250微克/ml的环丝氨酸以及10微克/ml的红霉素构成。E.coli供体不能在暴露于所述浓度的甲氧苄氨嘧啶和环丝氨酸下存活，而C.phytofermentans受体不能在暴露于所述浓度的红霉素下存活(但是能够耐受所述浓度的甲氧苄氨嘧啶和环丝氨酸)。因此，在厌氧条件下在30℃下将包含所述抗生素的平板或液体培养基温育5至7天后，获得红霉素抗性的C.phytofermentans衍生物，并且这些衍生物如PCR分析所证实的那样随后显示出包含Pimpt1029。
出乎意料的结果是仅仅红霉素抗性的特异性构建的衍生物能够在C.phytofermentans中功能性的表达，其中所述的衍生物包含得自醇的脱氢酶基因的C.phytofermentans启动子。
将所关注的其他基因(得自C.phytofermentans或者得自异源基因)引入到Pimpt构建体中，并用于转化C.phytofermentans，因此，这些基因产物可以用于增加在发酵中间体转化为醇终产物或C.phytofermentans的其他生物燃料中使用的糖分解酶、己糖运送蛋白质以及己糖代谢物的制备。质粒Pimpt1029的图谱示于图7中。
本文引用的所有参考文献(包括但不限于公开或未公开的申请、专利和文献参考，此外还包括但不限于附录中所列的参考文献)以引用方式全文并入本文，并由此构成本说明书的一部分。本文所引用的公开、以及专利和专利申请在一定程度上与本说明书中所包含的公开相矛盾，本说明书将取代和/或超过任何这些相矛盾的材料。
如本文所用，术语“包含”为“包括”、“含有”或“具有……特征”的同义词，并且为包含在内或开发式的，并且不排除额外的未引用的元件或方法步骤。
表示说明书中使用的组分、反应条件等的量的所有数字在所有情况下都理解为由术语“大约”修饰。因此，除非作出相反说明，否则本文所列的数字参数均为可以根据试图获得的所需性质而改变的近似值。在要求本申请的优先权的任何申请中，最低限度并且不尝试限制应用于任何权利要求的范围的等同原则，每个数值参数应该至少根据记录的有效数字的个数并且应用普通的四舍五入技术来解释。
虽然本文示出并描述了本发明的优选实施方案，本领域的技术人员显而易见的时这些实施方案仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的条件下本领域的技术人员当前可作出多种变体、改变或替代。应该理解的是，本文所述的本发明的实施方案的多个备选方案可以用于实施本发明。预期的是，以下权利要求限定了本发明的范围，并由此涵盖了在所述这些权利要求和它们的等价物范围内的方法和结构。

Claims (47)

1.一种用于制备发酵终产物的方法，该方法包括：
将包含梭菌的培养基在适用于制备所述的发酵终产物的条件下培养第一段时间；
在收获所述的发酵终产物之前将一种或多种营养物加入到所述的包含梭菌的培养基中；
将包含梭菌的培养基培养第二段时间；以及
由所述的培养基中收获发酵终产物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的梭菌菌株为Clostridiumphytofermentans。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的发酵终产物为乙醇。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的培养基包含纤维素和/或木质纤维素材料。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶处理。
6.一种制备发酵终产物的方法，该方法包括以下步骤：
在培养基中培养Clostridium phytofermentans菌株；
将所述培养基中的糖化合物的总浓度保持在至少大约18g/L；以及
由所述的培养基中收获发酵终产物。
7.权利要求6所述的方法，其中保持所述的糖化合物的总浓度包括加入一种或多种培养基成分，其中至少一种培养基成分包含一种或多种糖化合物，并在所述的培养过程中至少一次将所述的成分加入到所述的培养基中，其中将所述的培养基成分加入到包含所述培养物的容器中。
8.权利要求6所述的方法，其中所述培养基中糖化合物的总浓度保持在大约1g/L至大约100g/L的范围内以用于部分培养。
9.权利要求6所述的方法，其中在发酵终产物制备的过程中，所述培养基中糖化合物的总浓度变化低于大约25％。
10.权利要求6所述的方法，其中所述的发酵终产物为乙醇。
11.权利要求6所述的方法，进一步包括在所述的发酵过程中，至少一次将包含一种或多种含氮材料的培养基成分加入到所述的培养基中，并且其中将所述的培养基成分加入到包含所述培养物的容器中。
12.权利要求11所述的方法，其中一种或多种所述的培养基成分包含一种或多种含氮材料。
13.权利要求6所述的方法，其中所述的培养基包含纤维素或木质纤维素材料。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶处理。
15.一种制备发酵终产物的方法，该方法包括以下步骤：
在培养基中培养梭菌菌株；以及
在所述的梭菌的培养过程中，将一种或多种培养基成分加入到所述的培养基中，其中一种或多种所述的培养基成分包含一种或多种糖化合物，并且根据被梭菌转化为其他化合物的糖的量来加入一种或多种所述的糖化合物。
16.权利要求15所述的方法，其中一种或多种所述的培养基成分包括单元。
17.权利要求16所述的方法，其中所述的氮源包括脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。
18.权利要求15所述的方法，其中一种或多种所述的培养基成分包含纤维素或木质纤维素材料。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的纤维素或木质纤维素材料并未经过在24小时内将多于15％的所述的纤维素或木质纤维素材料转化为单糖的足量的酶处理。
20.一种制备发酵终产物的方法，该方法包括：
将梭菌的菌株的第一接种物加入到培养基中；
在示于制备乙醇的条件下培养所述的梭菌；
在所述的梭菌的第一接种物加入到所述的培养基中之后的5个小时后，将梭菌的额外的可行的细胞加入到所述的培养基中；以及
由所述的培养基中收获所述的发酵终产物。
21.权利要求20所述的方法，该方法进一步包含在加入所述的梭菌的第一接种物之后，将一种或多种培养基成分加入到所述的培养基中。
22.权利要求20所述的方法，其中加入培养基成分以及加入可行的细胞可依次进行或同时进行。
23.一种制备乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
除去不纯的乙醇材料中的杂质，从而制备经纯化的乙醇材料，其中所述的经纯化的乙醇材料多于大约90％(wt.)的乙醇，并且不纯的乙醇材料衍生自在分批补料培养中通过培养Clostridium phytofermentans而制得的发酵培养基，并且其中在所述的发酵培养基中的所述的乙醇的浓度高于大约7g/L。
24.一种制备发酵终产物的方法，该方法包括以下步骤：
培养包含Clostridium phytofermentans菌株的培养基，其中所述的发酵终产物是在瞬时制备率为至少大约3g/L-天的情形下制备的。
25.一种制备发酵终产物的方法，该方法包括：
提供纤维素材料，其中所述的纤维素材料并未经过外源提供的化学品或酶的处理；
将所述的纤维素材料与微生物在培养基中结合，其中所述的培养基不包含外源提供的酶；以及
在足以制备发酵终产物的条件和时间内发酵所述的纤维素材料。
26.一种制备发酵终产物的方法，该方法包括：在pH调节剂存在下发酵Clostridium phytofermentans细胞，其中产生发酵终产物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述的发酵终产物为乙醇。
28.权利要求26所述的方法，在pH为大约6.0至大约7.2下发酵所述的细胞。
29.权利要求28所述的方法，其中所述的pH为大约6.5。
30.一种制备发酵终产物的方法，所述的方法包括：在加入的脂肪酸材料存在下发酵梭菌菌株的细胞，其中制备发酵终产物。
31.权利要求30所述的方法，其中所述的包含脂肪酸的材料含有玉米油、葵花油、红花油、加拿大油菜油、大豆油或油菜籽油中的一种或多种。
32.权利要求30所述的方法，其中所述的包含脂肪酸的材料包含磷脂或溶血磷脂。
33.一种发酵培养基，该培养基包含Clostridium phytofermentans细胞和pH调节剂，其中制备发酵终产物。
34.一种发酵培养基，该培养基包含梭菌菌株的细胞和加入的包含脂肪酸化合物，其中制备发酵终产物。
35.一种包含Clostridium phytofermentans菌株、氮源以及纤维素或木质纤维素的发酵培养基，其中所述的氮源包含脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。
36.一种制备醇的方法，该方法包括：在pH调节剂和脂肪酸材料存在下发酵梭菌菌株的细胞，其中制备发酵终产物。
37.燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridiumphytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的发酵罐被设置成保持在发酵过程中变化低于大约25％的水平的糖化合物的量。
38.燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridiumphytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的发酵罐被设置成周期性地补充所述的培养基以及额外的培养基成分、或者额外的Clostridiumphytofermentans的可行细胞。
39.燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridiumphytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的培养基包含pH调节剂以及纤维素或木质纤维素。
40.权利要求39所述的燃料工厂，其中所述的培养基进一步包含脂肪酸材料。
41.燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridiumphytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的培养基包含氮源、以及纤维素或木质纤维素，其中所述的氮源包含脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。
42.燃料工厂，该工厂包含被设置成容纳培养基和Clostridiumphytofermentans菌株的发酵罐，其中所述的培养基包含脂肪酸材料、以及纤维素或木质纤维素材料。
43.一种发酵终产物，该产物是使用Clostridium phytofermentans菌株在包含糖化合物的量的水平在发酵过程中变化低于大约25％的培养基中通过发酵纤维素或木质纤维素材料来制备的。
44.一种发酵终产物，该产物是使用Clostridium phytofermentans菌株在包含pH调节剂的培养基中通过发酵纤维素或木质纤维素材料来制备的。
45.一种发酵终产物，该产物是使用Clostridium phytofermentans菌株在包含脂肪酸的培养基中通过发酵纤维素或木质纤维素材料来制备的。
46.一种发酵终产物，该产物是使用Clostridium phytofermentans菌株在包含氮源的培养基中通过发酵纤维素或木质纤维素材料来制备的，其中所述的单元包含脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或异亮氨酸。
47.权利要求43-46所述的发酵终产物，其中所述的发酵终产物为乙醇。
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