CN102433270A - 一种耐有机溶剂的产葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐有机溶剂的产葡萄糖苷酶地衣芽孢杆菌及其应用，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011319。所筛糖苷酶菌株可以在12h内高效对槲皮素进行转糖基作用，经发酵初步优化后转化率达到14.81％，槲皮素产量达到0.148g L-1，转化率远远高于国内有关槲皮素糖基化的报道。该菌株及其产生的葡萄糖苷酶亦可通过糖基转移反应将糖添加到大蛋白质和脂类物质中，且具有这一作用的耐有机溶剂转苷酶具有良好的应用前景。

Description

一种耐有机溶剂的产葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产葡萄糖苷酶的芽胞杆菌及其应用，尤其是一种耐有机试剂的产葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌及其应用。

背景技术

α-转移葡萄糖苷酶(α-transglucosidase)又称α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，它可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖或将游离出的葡萄糖残基以α-1，6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(以下简称IMO，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖等)糖脂或糖肽等。在微生物中，细菌、酵母、霉菌等某些菌株能分泌仅.葡萄糖苷酶。已报道的能产此酶的菌种有曲霉，其中以黑曲霉产酶量较高，以及乳酸菌，包括干酪乳杆菌、双歧杆菌等。在动物肠道中也有a.葡萄糖苷酶的分泌，用来帮助消化吸收麦芽糖和麦芽低聚糖，如王志江，魏红福在蜜蜂的腹部组织中分离纯化到α-葡萄糖苷酶。关于嗜热微生物的耐高温α-葡萄糖苷酶基因也已有专利和文献报道。

糖基化合物又称糖苷类化合物或配糖体，在生物，医药，食品等领域均有着广泛的利用价值。在合成糖苷化合物方面，糖苷酶较糖基转移酶来源广泛，比较稳定，能接受不同结构的底物，可直接以非保护或非活化的糖作为糖基供体，因此，广泛用于酶促糖苷化反应合成各类糖基化合物。目前国内外糖基化合物的研究热点主要是黄酮衍生物的合成，但是由于大多数黄酮苷元及其黄酮苷类在水相中溶解度低，限制了其制剂的开发。已报道的黄酮类化合物的糖苷化反应主要是采用植物细胞、微生物和游离酶的生物转化。植物细胞中含多种酶系，因此以植物细胞进行生物转化的糖基化位置较多，糖基化产物也相对复杂；且底物在植物细胞悬浮液中溶解度会更低，影响产率。以微生物细胞进行的生物转化由于底物溶解度等问题通常产率也较低。比较多的报道是关于国外采用基因工程技术改造生成糖基转移酶用于黄酮类物质的糖基化作用，但是这种方法无法改善底物溶解度低的问题，故产率依然很低。非水相反应可解决酶催化反应时底物溶解度低的问题。

传统的酶催化反应主要在水中进行，但随着对酶的深入研究，发现酶反应在非水相介质中具有许多水相不具备的优势，如增加非极性底物的溶解性，通过控制反应平衡移动的方向极大地提高产率等。近年来，有关在有机介质中的酶催化反应研究是酶工程中一个活跃的领域，耐有机溶剂葡萄糖苷酶的应用前景更为广阔。目前国内外关于耐有机溶剂产糖苷酶菌株的报道比较少，还未见有关于地衣芽胞杆菌产耐有机溶剂糖苷酶的报道，且此菌株糖基化槲皮素生成槲皮苷的产量较高，优势较为明显。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种耐有机溶剂的产葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)BBE11-1，可应用于食品工业、药物合成、饲料加工。

所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)BBE11-1于2011年9月18藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011319。

所述地衣芽胞杆菌初始发酵用培养基组成如下：可溶性淀粉5g/L，蛋白胨25g/L，酵母粉3g/L磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH自然。

所述地衣芽胞杆菌的最佳产酶培养基为：蔗糖7.5g/L，胰蛋白胨25g/L，酵母粉4.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.250g/L。

本发明提供的菌株，具有在耐二甲基甲酰胺特性并且葡萄糖苷酶活性较高，为国内首例有关α-葡萄糖苷酶的地衣芽胞杆菌菌株；采用本发明所筛选的菌株对槲皮素进行糖基化反应，经分析后可以产生至少一种糖基衍生物；采用本发明筛选的菌株发酵12小时的葡萄糖氧化酶活最高达到227.8U L^-1，转化率达到14.81％，槲皮素产量达到0.148g L^-1，转化率远远高于国内有关槲皮素糖基化的报道。

具体实施方式

实施例1产葡萄糖苷酶菌株的初筛筛选方法

1.样品来源为无锡当地化工厂附近的土壤，取适量土样放入含无菌水和玻璃珠的三角瓶中，置37℃摇床混匀、打碎做成菌悬液；

2.将菌悬液加入到初筛培养基中，37℃200rpm，培养24h；

初筛培养基(LB)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，DMF10％.pH自然；

3.将菌悬液过滤稀释成10^-4、10^-5、10^-6 3个稀释度涂布LB平板。涂布后37℃培养24h；

4.选取不同形态的单菌落(耐DMF)，从菌落形态上分辨及可以筛选出5株菌；

5.将以上LB平板中筛选的菌株按不同菌落形态的单菌落接入显色培养基基，从显色上分辨可以筛选出3株菌。

显色培养基：1.0％(v/v)蛋白胨-水，0.5％(v/v)NaCl和4一硝基苯-a-D-吡喃-葡萄糖苷(pNPG，0.01g/ml)，pH自然。

6.将以上在显色培养基中显色的菌株稀释后在LB培养基上涂布，划线纯化并保藏于甘油管中。

实施例2产葡萄糖苷酶菌株的复筛筛选方法

将初筛得到的菌株经发酵培养后进行转化反应：将初筛得到的菌株发酵培养12h后取3ml发酵液于10ml反应体系中(槲皮素1mg/mL，麦芽糖3.3mg/mL，DMF10％)37℃，220rpm反应时间12h。将反应后产物进行HPLC检测，并由LC-MS确定目标产物分子量。检测结果显示一株菌株可成功转一个糖基单元到槲皮素-3-位。

选择最优菌株测序鉴定为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011319。

实施例3：产葡萄糖苷酶筛选出发菌株的培养基优化

以CCTCC NO：M2011319为出发菌株，培养基优化后，发酵12小时葡萄糖氧化酶活最高可达14.5U/L^-1。

培养基优化：

1.选取不同的碳源，氮源和无机盐，对所筛选菌株进行培养基优化，发酵时间为12小时。通过槲皮素葡萄糖苷转化率作为优化目的参数。结果如表所1示。

表1

由表格中各因素对应的产物转化率结果显示蔗糖转苷酶活最高，故作为碳源作为下一步研究。胰蛋白胨(Tryptone)作为最优氮源，酵母粉(Yeast extract)为辅助氮源。FeSO₄·7H₂O能够促进产物转化率的提高，故FeSO₄·7H₂O作为最佳无机盐。

2.蔗糖，酵母粉，胰蛋白胨，FeSO₄·7H₂O浓度优化结果如下：综上结果显示，蔗糖5.0g/L，胰蛋白胨30g/L，酵母粉3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.25g/L条件下转苷酶活活性最高，故相应浓度作为正交实验水平因素(表2)。

表2

3.表3为正交实验水平：

表3

正交实验结果如下(表4)：

经培养基优化后转化率最高为14.81％，此时培养基成分为：蔗糖7.5g/L，胰蛋白胨25g/L，酵母粉4.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.250g/L为最佳培养基成分，此时生物量及转苷酶活最高。

出发菌株经过培养基优化后，发酵12小时的葡萄糖氧化酶活最高达到227.8U L^-1。转化率达到14.81％，槲皮素产量达到0.148g L^-1，转化率远远高于国内有关槲皮素糖基化的报道。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种耐有机溶的产葡萄糖糖苷酶地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)BBE11-1，于2011年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011319。

2.权利1所述地衣芽胞杆菌应用于糖基化合物的合成。

3.权利1或2所述地衣芽胞杆菌应用于槲皮素转糖基作用生成槲皮素苷。

4.权利要求1或2所述地衣芽胞杆菌应用于葡萄糖糖苷酶的发酵生产。

5.权利要求3所述的应用，其特征在于最佳产酶量的培养基组成为：蔗糖7.5g/L，胰蛋白胨25g/L，酵母粉4.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.250g/L。