CN102430119A - 一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，包括选择家兔，家兔注射免疫药物，在药物干预的15-20天进行卡介苗免疫注射和进行细菌性和病理学检查，从而构建病理模型。本发明的优点在于：建立了药物干预家兔皮肤结核的病理模型，症状明显，对结核病病理和细菌致病性进行直观研究，为疫苗和治疗结核病坏死液化空洞的药物筛选提供直观的动物模型，模型稳定、可重复；为研究药物干预结核肉芽肿液化形成过程，建立了药物干预的程序和观察指标；为探讨结核病液化空洞形成的免疫机制提供研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种疾病动物模型的构建方法，具体地说是一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，属于医疗领域。
背景技术
结核病是一种和全身免疫状况密切相关的疾病，但主要表现为一种局部病理损伤。随着结核耐药问题越来越严重，传统针对结核分枝杆菌的抗结核化学药物治疗对部分疾病不再有效，人们亟需开发新的药物来治疗结核病。结核病干酪样坏死和液化以及空洞的形成是人肺结核病特征性的危险的病理改变，常常成为播散的病源。坏死组织液化是人肺结核病向恶性方向发展的关键环节，液化组织可为结核杆菌细胞外生长提供丰富的培养基，大量生长活化的结核杆菌释放高水平的结核菌素样产物，造成组织迟发型超敏反应，破坏性很强。空洞的形成又为结核菌的肺外播散提供有利条件，大量结核杆菌通过空气传播，导致人群感染。虽然对于肺结核的免疫病理已有一些研究基础，然而坏死组织液化的发生机制和影响因素仍不明确。
人类疾病的动物模型(animal model of human disease)是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便，更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。
动物模型对于了解结核性肉芽肿转归的过程和免疫机制有重要价值。已有多种动物模型被用于结核的病理学研究，常用的动物模型中，小鼠不会发生液化坏死，猿猴和家兔可形成与人体结核病灶近似的坏死和液化。其中，家兔感染结核杆菌后，病理学特点与人近似，尤其是可以形成液化和空洞。家兔感染牛分枝杆菌后可形成以干酪样坏死为中心的慢性纤维空洞型结核，与结核杆菌在人体中引起的病变相似。肺部模型虽然病理改变更接近人肺结核，但由于观察不便，一定程度上限制了疾病的研究和药物筛选模型的建立。所以建立结核皮肤病理模型，尤其是液化病理模型，对结核病病理和细菌致病性可以进行直观研究，可以用于对相关病理进行干预的药物筛选模型。
研发调节机体免疫应答的药物，通过干预免疫病理进程来治疗结核是一个有效的途径。目前还缺乏有效的直观的动物模型来评价针对结核免疫病理的药物。
发明内容
本发明的目的在于，针对人类结核病的治疗，建立了一种家兔皮肤结核模型，利用家兔皮肤结核病理模型来评价干预结核免疫病理的药物，为结核性肉芽肿的形成和坏死组织的液化的治疗提供研究模型。
阻止坏死液化空洞形成的药物是临床上治疗结核病患者的措施之一，有效的药物应该可以阻止液化空洞的形成和扩大，控制液化空洞内结核杆菌的生长繁殖和活化，防止病原播散，减轻迟发型超敏反应破坏组织的程度，这些方面对于结核病人的治疗以及防止病原传播具有极其重要的意义。免疫相关药物对于结核病人机体内局部或全身的免疫状态有一定影响，可能调动一些免疫因子的活化，启动相关的免疫程序，调动细胞免疫或体液免疫，对结核病的转归产生影响。
本发明的技术方案为：一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，包括以下步骤：
（1）选择家兔；
（2）每天对家兔注射免疫药物，选择家兔的腹部两侧皮内注射；
（3）对上述步骤（2）中的家兔在注射免疫药物的第15-20天进行卡介苗免疫注射；
在BCG注射前15-20天给家兔注射或口服所要评价的免疫调节药物有助于使得在BCG注射时机体免疫状况达到了药物所拟调节的状态，从而有效评价药物。BCG注射后要继续观察30天左右，因为一定量卡介苗免疫注射家兔皮肤后，会发生明显的皮肤病理改变（如肉芽肿、脓肿液化、破溃等），病理特征随时间的趋势有所变化。
（4）对上述步骤（3）中的免疫后的家兔皮肤处发生的病理变化进行直观观察测量及细菌性和病理学检查，构建病理模型。
所述的步骤（1）中的家兔为健康的新西兰白兔。
所述的步骤（2）中的免疫药物为，免疫增强剂：重组人白介素-2和重组人干扰素-r；免疫抑制剂：环磷酰胺和地塞米松。
所述的步骤（3）的卡介苗免疫注射时间为注射免疫药物的第17天。
所述的步骤（3）的卡介苗为5×107 CFU/ml的菌液。
所述的步骤（3）的卡介苗注射于上述新西兰白兔腹部两侧表皮上。
本发明的优点在于：建立了药物干预家兔皮肤结核的病理模型，症状明显，对结核病病理和细菌致病性进行直观研究，为疫苗和治疗结核病坏死液化空洞的药物筛选提供直观的动物模型，模型稳定、可重复；为研究药物干预结核肉芽肿液化形成过程，建立了药物干预的程序和观察指标；为探讨结核病液化空洞形成的免疫机制提供研究基础。
附图说明
图1为不同给药组家兔皮肤病理变化曲线图；
图2为IFN-r给药组脓液培养后菌落抗酸染色涂片；
图3为对照给药组脓液培养后菌落抗酸染色涂片；
图4为环磷酰胺给药组脓液培养后菌落抗酸染色涂片；
图5为地塞米松给药组脓液培养后菌落抗酸染色涂片。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
一、实验材料及方法
1、实验材料
(1)实验菌株：卡介苗（BCG），使用前配成5×107CFU /ml（每毫升样品中含有的细菌群落总数）的菌液待用。
(2)药物：重组人白介素-2（IL-2），重组人干扰素-r（IFN-ｒ），环磷酰胺，地塞米松磷酸钠注射液。药物按如下方法分装，每次使用前用生理盐水溶解。
药物规格及分装剂量如下：
2、实验动物：健康新西兰白兔。
3、实验动物分组：共6组，每组2只。
实验组1：IL-2干预组；
实验组2：IFN-ｒ干预组；
实验组3：环磷酰胺干预组；
实验组4：地塞米松高剂量组；
实验组5：地塞米松低剂量组；
实验组6：对照组。
4、给药程序：在免疫前开始给药，每组给予相应药物。
家兔给药剂量及程序如下：
5、免疫程序：给药第17天进行BCG免疫，以5×107CFU /ml浓度的菌液0.1 ml，于新西兰兔腹部两侧皮内注射。
6、日常观察：每日观察动物皮肤肿块的颜色变化、质地变化、形成时间，体积，有无破溃发生以及动物进食、精神状态、活动等情况。
7、皮肤组织的细菌学检查：以无菌技术取皮肤组织脓液，行抗酸染色和革兰染色等微生物学检查，并进行培养，做cfu计数及菌落涂片染色，具体操作流程如下：
（1）实验材料
75℅乙醇；
生理盐水；
Middlebrook7H10固体培养基：MiddleBrook 7H10琼脂；甘油；OADC（oleic acid-albumin-dextrose-catalase）增菌液10％；Amp(氨苄青霉素)0.01mg/ml。
OADC增菌液（100ml体系）：NaCl、0.05g；小牛血清组分ⅴ、5g（4℃冰箱保存）；葡萄糖、2g；过氧化氢酶、0.003g（-20℃冰箱保存）。
氨苄青霉素（Amp）：用蒸馏水配制为50mg/mL的浓度，共50mL，过膜（d=0.22??m）除菌，分装为1mL/管，-20℃保存。
称取7H10 38g溶于超纯水中，加入甘油10ml，再用超纯水定容至1800ml，高压灭菌10分钟后，待液体自然冷却到40℃左右，添加OADC增菌液200ml，同时添加抗菌素氨苄青霉素（0.01mg/ml），将液体均匀倒于90mm直径的一次性无菌培养皿中。
染色玻片，无菌剪刀，镊子，吸管， EP管（微量离心管），微量加样器。
（2）操作方法
①无菌操作，分别取各组家兔未破溃结节中的脓液；
②称取各组脓液重量；
③取脓液抗酸染色，革兰染色；
④各组脓液分别用1ml生理盐水稀释混匀，作为“原液”，再依次用生理盐水做10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释；
⑤将原液、10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释的脓液分别取300ul涂布于7H10固体培养基上；
⑥将涂好脓液匀浆的培养皿置于37℃培养箱，5%CO2，培养3周，期间每天观察培养皿中细菌生长情况；
⑦3周后，挑取菌落涂片，抗酸染色，革兰染色，证实是抗酸杆菌，做CFU计数；
⑧计算结核菌载量：结果以Log10（CFU）表示；
计算方法：CFU/克=A×10n×（C+D）/D/B
n：稀释梯度；A：培养基生长菌落数（个）；B：接种体积（ml）；C：乳钵内的悬液体积（ml）；D：组织重量（g）。
8、病理学及细菌学检查：解剖家兔，分离各脏器，观察有无病变，并将脾脏，肺脏，胸腺，肾上腺称重。分离的脏器及皮肤肿块小心固定，做病理切片，具体操作流程如下：
（1）实验材料
10%甲醛（配制）；75%酒精 (配制)；碘伏；7H10固体培养基（配制方法同上）；无菌生理盐水
固定家兔的手术台；固定家兔用的绳子；手术刀，手术剪，止血钳；剪刀；镊子；酒精棉球；研钵；200μl，1000μl枪头；5ml EP管；2mlEP管；10ml注射器；微量加样器；电子天平；体重计；动物剃毛刀。
（2）操作方法
①麻醉并处死家兔，解剖位固定在兔架上；
②打开腹腔，分离脾脏，肺脏，淋巴结，肾上腺等组织，观察有无病变；
③病理取材：
Ⅰ、取脾脏组织；
Ⅱ、取有病变处肺叶或统一取右上肺叶；
Ⅲ、取皮肤（BCG病理结节处）；
④取材的组织放入含有10%甲醛的玻璃瓶（肺脏用纱布包住）固定；
⑤固定好的组织做病理切片：采用石蜡切片苏木精-伊红（HE）染色法染色，包括固定、冲洗、脱水、浸蜡、包埋、切片和染色等步骤。
二、实验结果
1．新西兰白兔一般状况观察
给药及BCG免疫后，IFN-ｒ，IL-2，对照组家兔无全身症状，精神状况好，进食和饮水如常，毛发整齐；环磷酰胺组中一只家兔有脱毛现象；地塞米松高剂量组及地塞米松低剂量组家兔较消瘦，精神状况较差，进食较少。
2．新西兰白兔皮肤病理变化观察
BCG免疫家兔后，IL-2组，IFN-ｒ组，环磷酰胺组及对照组在BCG免疫后第3天皮肤肿块形成；地塞米松低剂量组在BCG免疫后第6天有皮肤肿块形成，但体积较小，颜色较淡；地塞米松高剂量组在BCG免疫后始终无肿块形成，接种部位皮肤为淡红色，各组病理变化程度有显著性差异，结果见表1。
表1.不同给药组家兔皮肤病理改变
—：无肉芽肿,液化,溃疡；
±：无明显肉芽肿、液化、溃疡；
+：加号的数目代表病理改变的程度，加号数目越多，代表肉芽肿,液化及溃疡越严重；
*p<0.05：IL-2组vs IFN-ｒ组vs对照组vs环磷酰胺组。
如图1所示，图中每个数值点代表各组家兔（每组2只家兔，每只4个BCG接种点）皮肤病理结节的平均值和标准差，统计学分析显示不同处理组在不同时间点的病理结节大小均值是不一样的，具有显著差异，p<0.01。
如图1所示，IL-2组家兔形成的结核性肉芽肿的肿块体积较大、局部炎症反应强烈，炎症反应在BCG免疫后6天左右达到高峰并形成液化，第6天时已发生破溃，第10天液化达到高峰；IFN-ｒ组家兔形成的结核性肉芽肿的肿块体积较IL-2组略小、局部炎症反应强烈，炎症反应在BCG免疫后10天左右达到高峰并形成液化，第10天时发生破溃，第15天液化达到高峰；对照组家兔形成的肿块较IL-2组及IFN-ｒ组小，局部炎症反应也比前两组轻，炎症反应在BCG免疫后10天左右达到高峰并形成液化，第10天时发生破溃，第15天液化达到高峰；环磷酰胺组肿块体积略较对照组小、局部炎症反应较轻，第11天时发生破溃；地塞米松低剂量组在BCG免疫后第6天有皮肤肿块形成，但体积较小，颜色较淡，局部炎症反应轻，质地较硬，在BCG免疫后20天左右肿块中央有结痂，但未发现明显液化及溃破；地塞米松高剂量组在BCG免疫后始终无肿块形成，接种部位皮肤为淡红色；肿块溃破后，坏死液化组织流出，肿块体积逐渐缩小。
IL-2组和IFN-ｒ组皮肤结核性肿块快速恢复，在BCG免疫后35天已完全恢复。对照组皮肤肿块逐渐恢复，在BCG免疫后37天左右完全恢复。环磷酰胺组恢复较慢，在BCG免疫后40天时还未完全恢复；地塞米松低剂量组在BCG免疫后20天左右肿块中央有结痂，结痂逐渐增大，在40天时结痂面积为0.8 cm×0.8cm，仍无明显液化。高剂量组BCG接种部位始终无明显病理变化。
3．细菌学检查
各组新西兰兔皮肤组织脓液细菌抗酸染色阳性，革兰氏染色未发现病原体。
IL-2组，IFN-ｒ组，环磷酰胺组，对照组脓液培养结果显示，培养基有白色，透明，
圆形的菌落生长。菌落涂片行抗酸染色，如图2-5所示，结果显示均为抗酸染色阳性菌，培养3周后CFU计数显示，环磷酰胺组菌落数大于对照组，IFN-ｒ组菌落数小于对照组，结果见表2。
表2. 不同给药组脓液培养3周后结核菌载量（CFU计数）
4. 统计学分析
采用SAS9.1统计学软件，图1中各组数据采用多组重复测量资料分析方法进行分析。表1中组间差异采用SNK检验，p < 0.05 认为有统计学意义。
三、结论
各组新西兰兔分别给予免疫相关药物，免疫增强剂重组人白介素-2（IL-2）和重组人干扰素-r（IFN-ｒ），免疫抑制剂环磷酰胺和地塞米松。药物干预17天后用BCG皮内注射免疫新西兰兔，之后持续药物干预。连续观察皮肤组织的病理学变化，并行细菌学及病理学检查。观察到各组新西兰兔皮肤病理变化（肉芽肿、脓肿液化、破溃等改变）严重程度不同，病理变化随时间的趋势有显著差异，各组肉芽肿、液化高峰、破溃的时间点不同，其中IL-2组比对照组液化高峰及破溃发生时间早5天左右。脓液细菌学检查发现IFN-ｒ组脓液含菌量低于对照组，环磷酰胺组高于对照组。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）选择家兔；
（2）对家兔注射免疫药物；
（3）对上述步骤（2）中的家兔在15-20天进行卡介苗免疫注射；
（4）对上述步骤（3）中免疫后的家兔的注射组织进行观察测量及细菌性和病理学检查，构建此病理模型。
2.根据权利要求1所述的一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，其特征在于所述的步骤（1）中的家兔为健康的新西兰白兔。
3.根据权利要求1所述的一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，其特征在于所述的步骤（2）中的免疫药物为，免疫增强剂：重组人白介素-2和重组人干扰素-r；免疫抑制剂：环磷酰胺和地塞米松。
4.根据权利要求1所述的一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，其特征在于所述的步骤（3）的卡介苗免疫注射时间为注射免疫药物的第17天。
5.根据权利要求1所述的一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，其特征在于所述的步骤（3）的卡介苗为5×107CFU/ml的菌液。
6.根据权利要求1所述的一种结核病家兔皮肤病理药物评价模型的构建方法，其特征在于所述的步骤（3）的卡介苗注射于上述新西兰白兔腹部两侧表皮上。
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| CN109464471A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-03-15 | 广西医科大学 | 一种铜绿假单胞菌家兔脓胸脓絮状物生物膜模型建立方法 |
| CN113907037A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-01-11 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种气管支气管结核感染动物模型及其构建方法 |
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2010
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN109464471A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-03-15 | 广西医科大学 | 一种铜绿假单胞菌家兔脓胸脓絮状物生物膜模型建立方法 |
| CN109464471B (zh) * | 2019-01-17 | 2023-09-19 | 广西医科大学 | 一种铜绿假单胞菌家兔脓胸脓絮状物生物膜模型建立方法 |
| CN113907037A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-01-11 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种气管支气管结核感染动物模型及其构建方法 |
| CN113907037B (zh) * | 2021-09-30 | 2023-04-28 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种气管支气管结核感染动物模型及其构建方法 |
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