CN102429944B - 用于治疗心脑血栓性疾病的药物活性成分和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗心脑血栓性疾病的药物活性成分豨莶精醇，其纯度大于等于98％。本发明还涉及其制备方法以及应用制剂。该制剂包括作为药物活性成分的豨莶精醇及其相关的制剂。本发明制备豨莶精醇的方法，操作简便，生产成本低，环境污染低，所制备的豨莶精醇纯度高达98％以上，收率高。采用本发明所提供的方法所制备的豨莶精醇和制剂不仅稳定性良好，安全可靠，而且质量稳定，治疗效果显著，特别是用于治疗心脑血栓性疾病的药物。

Description

用于治疗心脑血栓性疾病的药物活性成分和应用

技术领域

本发明涉及一种药物活性成分的制备及应用。

背景技术

血栓是指血液成分在血液流动过程中，在血管或心脏内膜表面形成的一种半凝块状物质。血栓形成与心脑血管疾病密切相关，是威胁中老年人身体健康的重要疾病之一。促使血栓形成的因素较多，主要有血管内皮损伤、内外凝血系统异常和血流动力学异常等。随着对血栓形成机制研究的进一步阐明，针对血栓形成的特点和原因，国内外研究和开发很多抗血栓形成的新药，既有抑制血栓(抗凝血)形成和抑制血小板聚集的药物，又有溶解血栓的药物。前二者主要是对血栓和增大具有抑制作用，后者主要是将已形成的血栓进行溶解，从而消除血栓性疾病对人类造成的危害。

近几年来，抗血栓药物的研究和开发迅猛发展，大量抗血栓形成、抑制血小板活性和溶解血栓的药物不断出现，为血栓相关疾病的治疗和预防建立了坚实的基础。但是，我们应该清醒的看到，这些药物并不是十全十美，还存在很多缺点和问题，为了开发出更适合临床使用的抗血栓药物，仍需要国内外医药科研人员的不断努力奋斗。

豨莶草为常用中药，始载于《新修本草》，《中国药典》(2005年版)规定豨莶为菊科植物腺梗豨莶Sigesbeckia pubescens Makino，东方豨莶S.orientalis L.和毛梗豨莶S.glabrescensMakino的干燥地上部分。豨莶草，味苦性寒，入肝肾经。具有祛风湿，利筋骨的功能，临床常用其治疗四肢麻痹、筋骨疼痛、风湿痹痛，半身不遂、风疹湿疮等症。

豨莶草从古到今的临床应用主要用于治疗风湿性关节炎及类风湿性关节炎，进行性肌萎缩性侧索硬化症，银屑病，截瘫，中风，高血压，冠心病，白癜风等，常以单味药或入药复方制剂以治疗上述疾病，特别是在中医临床治疗和预防中风方面该药的使用频率较多，随着现代科学的发展和研究的日益深入，豨莶草在心血管系统、抗炎、免疫系统、抗病原微生物以及抗早孕方面均具有较好的作用，传统用于治疗急慢性风湿性关节炎、痹痛等症，近年来在心血管方面疾病，对高血压、冠心病、高胆固醇血症、中风的早期预防及后遗症、面神经瘫痪等治疗均具有较好的临床疗效，豨莶通栓丸是临床上治疗脑血栓的中成药，该药能够明显抑制血小板聚集，降低血粘度，抗缺氧，增加脑血流量，抗血栓的作用，而且毒性较低。近年来药理方面的研究证明豨莶草水煎剂经胃给药的急性毒性LD50为19.2708g/kg-1相当于生药的414.3g/kg，小鼠腹腔注射最大耐受量为人用量400倍。对抗炎作用：豨桐丸水煎剂，对大鼠因注射甲醛或鸡蛋清所产生的关节肿有明显的抗炎作用，其疗效与水杨酸钠300mg/kg腹腔注射相似，采用蛋白热凝固法和大鼠脚肿胀法实验，也具有抗炎作用。抗血栓作用：家兔静脉注射豨莶草提取物，可使血栓明显减轻，抑制率为51.4％。孟倩超、俞桂新等人筛选了豨莶草的抗凝血、抗血栓作用的有效部位，结果令人满意。说明豨莶草有抗血栓作用、抗炎作用、及细胞免疫和体液免疫有明显的抑制作用。

目前已经从国内外文献可知三种供药用的豨莶属植物中分得九十余个化合物，主要为二萜及其苷和倍半萜类，少量的黄酮和甾醇类化合物。

从化学成分的研究来看豨莶草植物的成分主要为二萜类化合物。详细分析文献资料可知有关豨莶草药理作用的物质基础没有明确阐明，特别是近年来的药理实验及我们对豨莶草的化学和药理研究的结果可知，其抗凝血、抗血栓作用、免疫抑制、抗炎和镇痛是明确的，同时由于其毒性小，在临床上未见报道其毒副作用，从有明确疗效的传统中药和天然药物中发展抗血栓药物是目前研制新型抗血栓药物的有效途径之一。

经过反复试验筛选发现豨莶精醇对体外、内血栓形成、血小板聚集和粘附、优球蛋白溶解时间、血栓模型血液流变学和血栓素B2(TXB2)、前列环素I2(PGI2)以及对出、凝血时间的影响有较好的作用，为有活性的化合物，它在植物中的含量为0.08-0.2％，含量较高。化合物为无色针形结晶。ESIMS测得化合物分子量为345.2353[M+Na]⁺，分子式为C₂₀H₃₄O₃。IR光谱中有羟基与双键的特征吸收峰，分别为3448cm^-1与1637cm^-1。测定其旋光值为[α]²⁵ _D-3.22(c 0.15，MeOH)。分析化合物的¹³C-NMR及DEPT谱，可知化合物结构中含4个C，5个CH，7个CH₂，4个CH₃(位移值分别为δ29.07，δ23.32，δ16.60，δ14.95)。结合H谱与HSQC谱，可将H质子信号与相应C信号进行归属。分析HMBC谱，δ29.07 CH₃与δ78.22 CH，δ54.65 CH，δ39.56 C，δ16.60 CH₃存在远程相关，δ23.32 CH₃与δ129.49 CH，δ76.76 CH，δ38.05 C，δ32.94CH₂存在远程相关，δ16.60 CH₃与δ78.22 CH，δ54.65 CH，δ39.56 C，δ29.07 CH₃存在远程相关，δ14.95 CH₃与δ54.65 CH，δ50.98 CH，δ38.31 C，δ37.55 CH₂存在远程相关，据此可搭建一系列结构片段。进一步分析¹H-¹H COSY谱，δ28.48 CH₂与δ37.55 CH₂，δ78.22 CH，δ22.71 CH₂与δ54.65 CH，δ36.46 CH₂，δ18.77 CH₂与δ50.98 CH，δ32.94 CH₂，以及δ76.76 CH与δ64.01 CH₂存在COSY相关，结合HMBC相关信号可搭建出化合物的平面结构。分析化合物NOESY相关谱，H-3，H-5，H-9与H-17存在相关信号，说明这几个H空间位置接近，提示其空间取向相同。H-18与H-20存在相关信号，提示其空间取向一致。H-5与H-20无NOESY相关，提示其空间取向相反，AB环反式稠和。根据以上信息得化合物结构式为：

豨莶精醇NMR数据归属如下：

发明内容

本发明所解决的技术问题首先是提供一种用于治疗心脑血栓性疾病的药物活性成分，其含豨莶精醇纯度大于98％，稳定性良好，用其所制备的制剂稳定性优良，疗效好，治疗效果明显。

本发明进一步的目的是提供上述药物活性成分的制备方法，所述制备方法用于制备豨莶精醇，所制备的豨莶精醇纯度高达98％以上，损耗少、收率高、纯度高、稳定性好，适合规模化工业化生产。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于治疗心脑血栓性疾病的药物活性成分，其中豨莶精醇纯度大于等于98％。

上述药物活性成分的制备方法，包括以下步骤：

包括以下步骤：

(1)将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)，加入有机溶剂，回流提取，提取若干次(优选三次)，每次2-3小时，每次加入的溶剂体积与生药的体积比为10～16∶1，将提取液合并过滤，滤液减压回收溶剂，至无溶剂味，得提取液；药渣弃去或凉干另用；

(2)将步骤(1)获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙酯进行萃取，萃取若干次(优选三次)，每次使用的萃取溶剂量与提取液的体积比为0.3～1.0∶1.0；合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物；

(3)将步骤(2)获得的浸膏状物，加入50-60℃热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为2～4∶1，将此液过大孔树脂(如HP-20、AB-8、D101或XAD-2)为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的体积比为1∶15～100，以水洗脱至流出液无色，再以30％、50％、和70％的甲醇或乙醇溶液进行梯度洗脱，收集含豨莶精醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏；

(4)步骤(3)所得浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的体积比为1∶1.2～2.5；上样硅胶与上柱色谱硅胶的体积比为1∶4～20，以二元有机溶剂系统梯度洗脱，以TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液；

(5)将步骤(4)含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，将粘稠物溶于少量甲醇、乙醇或丙酮中，加入少量乙酸乙酯，甲醇、乙醇或丙酮与乙酸乙酯的体积比为1∶1～2，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，重复上述操作3-5次，直至豨莶精醇几乎全部析出，合并析出的豨莶精醇晶体；

6)将步骤(5)析出的豨莶精醇晶体，加入甲醇、乙醇或丙酮；加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到纯度≥98％豨莶精醇。

上述制备方法，其中所述步骤(1)中有机溶剂为可以充分提取出药物活性成分的常用有机溶剂，如10～100％乙醇、10～100％甲醇、10～100％丙酮、乙酸乙酯、氯仿中的一种或几种的混合溶剂。

上述制备方法，其中所述步骤(4)中洗脱用的二元有机溶剂系统为石油醚和乙酸乙酯、石油醚和丙酮、乙酸乙酯和甲醇、乙酸乙酯和乙醇、氯仿和丙酮、氯仿和乙酸乙酯、氯仿和乙醇、氯仿和甲醇、二氯甲烷和丙酮、二氯甲烷和乙醇、二氯甲烷和甲醇溶剂系统中的任一种，洗脱梯度是30∶1～1∶1。

上述制备方法得到的药物活性成分，含纯度≥98％豨莶精醇，经试验验证，对心脑血管栓塞疾病具有良好治疗效果，可用于制备治疗心脑血管栓塞疾病的药物制剂。所述药物制剂的每制剂单位可以含所述药物活性成分1-200mg。在临床应用时，可以将所述药物制剂制备成各种不同的剂型，方便临床使用。

所述药物制剂可以为口服固体制剂，包括片剂、胶囊、微丸、颗粒剂、和缓释剂；每制剂单位含药物活性成分5-200mg。采用本领域技术人员常用的方法制备，优选采用如下方法制备：向药物活性成分豨莶精醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙姆；95％乙醇；羟丙基纤维素；微晶纤维素；25％淀粉浆；硬质酸镁)，制粒，制成颗粒剂、胶囊剂或压成片剂。或向药物活性成分豨莶精醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙姆；95％乙醇；羟丙基纤维素；淀粉浆)，制成微丸剂。或向豨莶精醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙姆；95％乙醇；羟丙基纤维素；25％淀粉浆；硬质酸镁)，制粒，制成缓释片剂或胶囊剂。

所述药物制剂还可以为液体制剂，包括口服液、冻干粉针剂或小水针注射剂；每制剂单位含药物活性成分5-200mg。

其中小水针注射剂优选采用如下方法制备：向药物活性成分豨莶精醇中加入助溶剂，再加入注射用水，加热溶解，稀释至1000ml，过滤，滤液超滤，灌装，封口制成1000只，灭菌，检验，即得。

冻干粉针剂优选采用如下方法制备：向药物活性成分豨莶精醇中加入助溶剂，再加入支架剂和注射用水，加热过滤，滤液超滤，分装，冷冻干燥后压盖即得。冷冻干燥分为四个阶段：(1)预冻3-4小时，温度在-30～-45℃；(2)减压干燥14小时，温度在-30～-45℃；(3)升温干燥4小时，温度在-15～-10℃；(4)二次升温干燥4小时，温度在30℃。

上述制剂中使用的助溶剂为泊洛沙姆和氨基酸或其盐酸盐，泊洛沙姆即能溶于水也能溶于有机溶剂，无论是固体制剂还是液体制剂都具有良好助溶作用，氨基酸或其盐酸盐优选天门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、络氨酸、缬氨酸、组氨酸或L-半胱氨酸盐酸盐，更优选天门冬氨酸。本发明中用泊洛沙姆和氨基酸或其盐酸盐作为助溶剂，增加了豨莶精醇在水中的溶解性。

上述制剂中使用的支架剂为甘露醇、甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐、葡萄糖或右旋糖酐，优选甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐，更优选比为5∶1的甘露醇-葡萄糖或4∶1的甘露醇-右旋糖酐。

本发明中，所述的制剂单位是指片剂的每片、胶囊剂的每粒胶囊、颗粒剂的每袋等药学上常规制剂的剂型单位。

本发明取得的技术效果是：

(1)本发明提供一种用于治疗心脑血管栓塞疾病的药物活性成分，其中豨莶精醇纯度大于98％，稳定性良好，所制备的制剂稳定性优良，疗效好，治疗效果明显。

(2)本发明所提供的制备方法制备豨莶精醇，损耗少、收率高、纯度高、稳定性好，适合规模化工业化生产；制备方法中不需采用活性炭吸附，采用两次柱色谱，大孔树脂柱色谱富集豨莶精醇，同时具有除杂质和脱色的作用，再用硅胶柱色谱精制；不仅能有效地除去杂质，还减少了提取时间，使豨莶精醇的损失减少到最低限度。制备方法中的整个提取分离过程中均保持较低温度处理，避免了温度对豨莶精醇造成破坏。

(3)现有技术中，很多天然产物的提取分离纯化技术，操作繁琐，工艺复杂，难以进行规模性工业化大生产。本发明中采用特定的方法提取豨莶精醇，不仅所得的豨莶精醇纯度高，而且以其为原料药所制备的制剂，稳定性好，溶解性好，疗效显著。

(4)本发明提供的药物活性成分制备而成的药物制剂，不仅水溶性良好，而且稳定性良好，安全可靠，质量稳定，不需在特定温度下的冰箱中保存，室温下贮存期可达5年以上，大大节约了贮藏、运输成本，方便医疗使用。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

[实施例1]原料药豨莶精醇的制备

将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入12倍量的70％乙醇回流提取，提取三次，每次2-3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，每次使用的萃取溶剂量与提取液的比例为0.5∶1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其比重为1.1-1.2。将浸膏状物，加入50-60℃热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为4∶1，将此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的体积比为1∶50，以水洗脱至流出液无色，再以30％、50％、70％甲醇或乙醇液进行梯度洗脱，收集含豨莶精醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱：将获得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的体积比为1∶2；浸膏与柱色谱硅胶的体积比为1∶10，以乙酸乙酯和甲醇溶剂系统梯度洗脱，梯度30∶1～1∶1，以TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液。含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，将粘稠物溶于少量甲醇中，加入少量乙酸乙酯，甲醇与乙酸乙酯的体积比为1∶1.2，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至豨莶精醇几乎全部析出，合并析出的豨莶精醇晶体。将析出的豨莶精醇晶体，加入甲醇或丙酮或乙醇，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到450g；纯度≥98％的豨莶精醇。

[实施例2]原料药豨莶精醇的制备

将原料药材豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入12倍量的50％甲醇回流提取，提取三次，每次2-3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，每次使用的萃取溶剂量与提取液的比例为0.8∶1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其比重为1.1-1.2。将浸膏状物，加入50-60℃热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为4∶1，将此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的体积比为1∶80，以水洗脱至流出液无色，再以30％、50％、70％甲醇或乙醇溶液进行梯度洗脱，收集含豨莶精醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱：将获得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的体积比为1∶2；浸膏与柱色谱硅胶的体积比为1∶10，以乙酸乙酯和甲醇溶剂系统梯度洗脱，梯度30∶1～1∶1，以TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液。含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，将粘稠物溶于少量甲醇中，加入少量乙酸乙酯，甲醇与乙酸乙酯的比例为1∶1.2，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至豨莶精醇几乎全部析出，合并析出的豨莶精醇晶体。将析出的豨莶精醇晶体，加入甲醇或丙酮或乙醇，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到458g；纯度≥98％的豨莶精醇。

[制剂实施例1]豨莶精醇片剂的制备

实施例1制得的豨莶精醇100g；微晶纤维素70g；泊洛沙姆10g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素15g；25％淀粉浆120ml；硬酸镁5g，制粒，60℃干燥，12目筛整粒，压成片剂；1000片；每片含100mg左右豨莶精醇。

[制剂实施例2]豨莶精醇胶囊剂的制备

实施例2制得的豨莶精醇100g；微晶纤维素80g；泊洛沙姆10g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素25g；25％淀粉浆120ml；12目筛制粒，60℃干燥，14目筛整粒，填入空胶囊；得1000粒胶囊；每粒胶囊含100mg左右豨莶精醇。

[制剂实施例3]豨莶精醇颗粒剂的制备

实施例1制得的豨莶精醇100g；淀粉120g；泊洛沙姆10g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素15g；25％淀粉浆120ml；糖粉20g；硬酸镁5g，14目筛制粒，60℃干燥，14目筛整粒，分装成袋；1000袋；每袋含100mg左右豨莶精醇。

[制剂实施例4]豨莶精醇缓释片剂的制备

实施例2制得的豨莶精醇100g；微晶纤维素70g；泊洛沙姆10g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素150g；25％淀粉浆100ml；微粉硅胶20g；硬酸镁5g，滑石粉20g；14目制粒，60℃干燥，12目筛整粒，压成片剂；1000片；每片含100mg左右豨莶精醇。

[制剂实施例5]豨莶精醇微丸剂的制备

实施例1制得的豨莶精醇100g；微晶纤维素180g；泊洛沙姆10g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素20g；25％淀粉浆100ml；微粉硅胶20g；滚动制丸，60℃干燥，制成微丸，填入空胶囊；1000粒；每粒含100mg左右豨莶精醇。

[制剂实施例6]豨莶精醇缓释胶囊剂的制备

实施例2制得的豨莶精醇100g；微晶纤维素80g；泊洛沙姆10g；95％乙醇50ml；羟丙基纤维素150g；25％淀粉浆100ml；微粉硅胶20g；硬酸镁5g，14目制粒，60℃干燥，12目筛整粒，压成片剂；1000片；每片含100mg左右豨莶精醇。

[制剂实施例7]豨莶精醇冻干粉针剂的制备

实施例1制得的豨莶精醇100g；泊洛沙姆2g；加入5.0g谷氨酸，加入10.0g甘露醇，加入注射用水，加热溶解，稀释至2000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。制成1000只，每只含豨莶精醇100mg左右。

上述冷冻干燥分为四个阶段：(1)预冻3.6小时，温度在-33℃；(2)减压干燥14小时，温度在-36℃；(3)升温干燥4小时，温度在-13℃；(4)二次升温干燥4小时，温度在30℃。

[制剂实施例8]豨莶精醇注射剂的制备

实施例2制得的豨莶精醇100g；泊洛沙姆2g；加入5.0g谷氨酸，加入注射用水，加热溶解，稀释至2000ml，过滤、滤液超滤，灌装、灭菌。制成1000只，每只含豨莶精醇100mg左右。

[试验例]

1、试验目的：选择适当的动物模型和方法，观察本发明的药物活性成分其抗栓、溶栓、抗凝及对血液流变学的影响，为临床应用提供科学依据。

2、试验材料

动物：昆明种小白鼠，体重19-21g，雌雄均用；Wistar大鼠，体重200-300g，雌雄均用；均购于吉林大学基础医学院动物实验中心，动物许可证号：SCXK-(吉)2006-0001。

药物：豨莶精醇，纯度98％，本发明实施例1制得。阳性对照药阿司匹林肠溶片(试验中给药量以成药表示)，沈阳奥吉娜药业有限公司生产，批号：080904；血塞通分散片，湖南一格制药有限公司生产，批号：080902。血栓心脉宁片，吉林华康药业有限公司生产，批号：090909。上述药物均灌胃给药，对照组同时给同体积的蒸馏水20ml/kg。

仪器：BT87-3型实验性体内血栓测定仪，包头医学院心血管研究室制造。SPA-4型多功能血小板聚集仪，上海科达测试仪器厂。体外血栓形成和血小板粘附两用仪，江苏无锡医疗电子仪器厂。YDA-IV型全自动血液粘度计，北京宏润达科技发展有限公司。LDZ-52型自动平衡离心机。

3、试验方法及结果

(1)、对大鼠体内血栓形成的影响

A、单次给药对大鼠体内血栓形成的影响

取大鼠60只，随机分为六组，第一组为溶媒对照组，第二组为阿司匹林10mg/kg，第三、四、五、六组分别为豨莶精醇10、8、4和2mg/kg，一次灌胃给药，体积为20ml/kg。于药后1小时，以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，分离颈总动脉。试验前0.5小时将机器预热，机器输出端接刺极电极，输入端接温控电极，刺激电极接颈总动脉近心端，温控电极接颈总动脉远心端。调μA表至右侧+80，调mA表至2mA，刺激时间调至3分钟。使刺激、温控电极与颈总动脉充分接触，用塑料薄膜将电极与肌肉分离。先将计时秒表清零，计时、刺激同时接通，待刺激到180秒后，听到刺激报警结束后，关掉刺激电极，记录形成血栓后报警时间。结果见表1。

表1 对大鼠体内血栓形成时间的影响

注：与溶媒对照组比较^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001(下表同)

由表1结果可见，一次灌胃给药后，豨莶精醇10mg/kg和阿司匹林10mg/kg均可明显延长大鼠体内血栓形成时间，与溶媒对照组比较，差异显著(p＜0.05)，且二者作用强度相同；豨莶精醇8mg/kg有一定的作用，但无明显统计学差异。

B、三次给药对大鼠体内血栓形成的影响

取大鼠50只，随机等分为五组，第一组为溶媒对照组，第二组为阿司匹林10mg/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇20、10和5mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续3日。于末次给药后1小时，将大鼠以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，分离颈总动脉。试验前0.5小时将机器预热，机器输出端接刺极电极，输入端接温控电极，刺激电极接颈总动脉近心端，温控电极接颈总动脉远心端。调μA表至右侧+80，调mA表至2mA，刺激时间调至3分钟。使刺激、温控电极与颈总动脉充分接触，用塑料薄膜将电极与肌肉分离。先将计时秒表清零，计时、刺激同时接通，待刺激到180秒后，听到刺激报警结束后，关掉刺激电极，记录形成血栓后报警时间。结果见表2。

表2 对大鼠体内血栓形成时间的影响

由表2结果可知，连续灌胃给药3次后，豨莶精醇20、10mg/kg和阿司匹林10mg/kg均可明显延长大鼠体内血栓形成时间，与溶媒对照组比较，差异非常显著(p＜0.01)，且在相同剂量条件下二者作用强度相近；豨莶精醇5mg/kg有一定的延长趋势。

C、七次给药对大鼠体内血栓形成的影响

取大鼠50只，随机等分为五组，第一组为溶媒对照组，第二组为阿司匹林10mg/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇20、10和5mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续7日。于末次给药后1小时，将大鼠以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，分离颈总动脉。试验前0.5小时将机器预热，机器输出端接刺极电极，输入端接温控电极，刺激电极接颈总动脉近心端，温控电极接颈总动脉远心端。调μA表至右侧+80，调mA表至2mA，刺激时间调至3分钟。使刺激、温控电极与颈总动脉充分接触，用塑料薄膜将电极与肌肉分离。先将计时秒表清零，计时、刺激同时接通，待刺激到180秒后，听到刺激报警结束后，关掉刺激电极，记录形成血栓后报警时间。结果见表3。

表3 对大鼠体内血栓形成时间的影响

由表3结果可知，连续灌胃给药7次后，豨莶精醇20、10、5mg/kg和阿司匹林10mg/kg均可明显延长大鼠体内血栓形成时间，与溶媒对照组比较，差异非常显著(p＜0.001)，且在相同剂量条件下二者作用强度相似；豨莶精醇抗血栓作用有一定的量效关系。

(2)、对大鼠体外血栓形成的影响

取大鼠50只，随机等分为五组，第一组为溶媒对照组，第二组为阿司匹林20mg/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇20、10和5mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续5日。于末次给药后1小时，将大鼠以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，腹主动脉取血1.8ml，注入已硅化的体外血栓胶管内，管的两端对接好后，放置在体外血栓形成仪上，测量血栓的长度，干、湿重量。结果见表4。

表4 对大鼠体外血栓形成时间的影响

由表4结果可知，连续灌胃给药5次后，豨莶精醇20mg/kg和阿司匹林20mg/kg均可明显抑制大鼠体外血栓形成的长度、干重，对大鼠体外血栓的湿重有一定的抑制作用，但无显著性差异。

(3)、对大鼠血小板聚集性和粘附率的影响(陈奇主编.中药药理研究方法学)

A、五次体内给药对大鼠血小板聚集性和粘附率的影响

取大鼠50只，随机等分为五组，第一组为溶媒对照组，第二组为阿司匹林20mg/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇20、10和5mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续5日。于末次给药后1小时，将大鼠以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，腹主动脉取血1.8ml，放入0.2ml 3.8％的枸橼酸钠的试管中，混匀，先将抗凝血离心800转/分钟，离心5分钟，小心吸取上层富含血小板血浆，其余继续离心3000转/分钟，离心10分钟，小心吸取上层贫血小板血浆。以ADP为诱导剂，采用SPA-4型多功能血小板聚集仪，测定血小板最大聚集率。另取血1.8ml，放入0.2ml 3.8％的枸橼酸钠的试管中，混匀，取1ml，置球形瓶中，于体外血栓形成和血小板粘附两用仪上，以3.5转/分钟运转15分钟，以转动前后血小板数计算血小板粘附率。结果见表5。

表5 五次体内给药对大鼠血小板聚集性和粘附率的影响(n＝10)

由表5结果可见，豨莶精醇20mg/kg和阿司匹林20mg/kg均可明显抑制血小板最大聚集率；阿司匹林20mg/kg可明显抑制血小板粘附率。

B、七次体内给药对大鼠血小板聚集性和粘附率的影响

取大鼠50只，随机等分为五组，第一组为溶媒对照组，第二组为阿司匹林20mg/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇20、10和5mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续7日。于末次给药后1小时，将大鼠以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，腹主动脉取血1.8ml，放入0.2ml 3.8％的枸橼酸钠的试管中，混匀，先将抗凝血离心800转/分钟，离心5分钟，小心吸取上层富含血小板血浆，其余继续离心3000转/分钟，离心10分钟，小心吸取上层贫血小板血浆。以ADP为诱导剂，采用SPA-4型多功能血小板聚集仪，测定血小板最大聚集率。另取血1.8ml，放入0.2ml 3.8％的枸橼酸钠的试管中，混匀，取1ml，置球形瓶中，于体外血栓形成和血小板粘附两用仪上，以3.5转/分钟，运转15分钟，以转动前后血小板数计算血小板粘附率。结果见表6。

表6 七次给药对大鼠血小板聚集性和粘附率的影响(n＝10)

由表6结果可见，豨莶精醇20、10、5mg/kg和阿司匹林20mg/kg均可明显抑制血小板最大聚集率和粘附率，其作用强度和结果与其抗血栓作用相同，并且有一定的量效关系。

C、体外对大鼠血小板聚集性的影响

将大鼠用3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，腹主动脉取血1.8ml，放入0.2ml 3.8％的枸橼酸钠的试管中，混匀，先将抗凝血离心1000转/分钟，离心5分钟，小心吸取上层富含血小板血浆(PRP)，其余继续离心3000转/分钟，离心10分钟，小心吸取上层贫血小板血浆(PPP)，取PRP 200ml，放到测试杯内，同时加入10ml不同浓度的药液。以ADP为诱导剂，采用SPA-4型多功能血小板聚集仪，测定血小板最大聚集率。结果见表7。

表7 体外给药对大鼠血小板聚集性的影响(n＝10)

表7结果可见，豨莶精醇10、5、2mg/kg和阿司匹林10mg/kg均可明显抑制体外给药血小板最大聚集率，其抑制作用超过同剂量的阿斯匹林。

(4)、对大鼠优球蛋白溶解时间的影响

取大鼠50只，饲养3天后随机分为五组：第一组为对照组，第二组为血栓心脉宁阳性对照组1g/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇20、10和5mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续5日，末次给药后1小时，将大鼠以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，腹主动脉取血，用3.8％的枸橼酸钠抗凝，3000rpm/min×10min，按(李仪奎主编，中药药理实验方法学)方法进行。结果见表8。

表8 对大鼠优球蛋白溶解时间的影响(n＝10)

由表8结果可见，与对照组比较，豨莶精醇20、10mg/kg和血栓心脉宁1g/kg均可明显缩短优球蛋白溶解时间，豨莶精醇5mg/kg对其有一定的缩短作用，但无显著性差异。

(5)、对血瘀模型大鼠血液流变学和血栓素B₂及前列环素I₂的影响

取大鼠72只，饲养3天后随机分为六组：第一组为正常对照组，第二组为模型对照组，第三组为血栓心脉宁阳性对照组1g/kg，第四、五、六组分别为豨莶精醇20、10和5mg/kg，灌胃给药，每日一次，连续7日，正常对照组和模型对照组给予蒸馏水，体积均为20ml/kg。于第2、3日给药后1小时，皮下注射0.1％肾上腺素0.15ml/只，30分钟后将大鼠放入1.5℃水中游泳5分钟，第4天给药后1小时，仅皮下注射0.1％肾上腺素0.15ml/只。于末次给药后1小时，将大鼠以3％的水合氯醛0.3g/kg ip麻醉，腹主动脉取血8ml，其中5ml注入内含有肝素钠抗凝剂的试管中，测全血粘度和血浆粘度，2ml注入内含抗凝剂的试管中，离心后取血浆，采用放免法测血栓素B₂，1ml血液注入试管中，离心取血清，采用酶联法测前列环素I₂。结果见表9、表10。

表9 对血瘀模型大鼠血液流变学的影响(n＝10)

由表9结果可见，与对照组比较，模型组的高、中、低切均较对照组明显升高，豨莶精醇20mg/kg和血栓心脉宁1g/kg均可明显抑制其升高，豨莶精醇10、5mg/kg对其有一定的抑制作用，但无显著性差异。

表10 对血瘀模型大鼠血栓素B₂及前列环素I₂的影响(n＝10)

由表10结果可见，与对照组比较，模型组的血栓素B₂明显升高，豨莶精醇20、10、5mg/kg均可明显降低血栓素B₂含量，血栓心脉宁1g/kg对其有一定的抑制作用，但无显著性差异。(6)、对小鼠出、凝血时间的影响(陈奇主编.中药药理研究方法学)

A、对小鼠出血时间的影响(顾云，孟娟如.介绍一种简易的抗血栓药物体内筛选法(J).中国药理学通报，1991；7(4)：317)

取小鼠50只，随机等分为五组，第一组为溶媒对照组，第二组为阿司匹林28mg/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇28、14和7mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续7日。末次给药后1小时，于小鼠尾尖2mm用剪刀剪掉，将尾部放入37℃盐水中，记录出血时间。结果见表11。

表11.对小鼠出血时间的影响

由表11结果可知，豨莶精醇28、14mg/kg和阿司匹林28mg/kg均可明显延长小鼠出血时间，与对照组比较有显著差异(p＜0.05)。豨莶精醇7mg/kg有延长小鼠出血时间的趋势，但无显著性。

B、对小鼠凝血时间的影响

采用玻片法，取小鼠50只，随机等分为五组，第一组为对照组，第二组为血塞通80mg/kg，第三、四、五组分别为豨莶精醇28、14和7mg/kg，灌胃给药，体积为20ml/kg。每日一次，连续5日。于末次给药后1小时，将小鼠右眼球摘去，弃第一滴血，取两滴血于载玻片上，其中一滴血每隔30秒用针头挑一次，直至出现血丝。另一滴供最后复检。记录凝血时间。结果见表12。

表12.对小鼠凝血时间的影响

由表12结果可知，豨莶精醇28、14mg/kg和血塞通80mg/kg均可明显延长小鼠凝血时间，与溶媒对照组比较有显著差异(p＜0.01)。豨莶精醇28mg/kg和血塞通80mg/kg作用强度相近。豨莶精醇抗凝血作用具有一定的量效关系。

4、结论

脑血栓形成是指脑动脉粥样硬化致血栓形成而引起管腔狭窄与闭塞，从而使其灌流领域的脑组织缺血、缺氧，进而坏死软化的病理过程。诱发急性脑血栓形成的三个因素：血管壁损伤，止血、凝血、纤溶系统的失平衡和血流状态的改变。

本试验结果表明，豨莶精醇5、10、20mg/kg一次给药或多次给药均可明显延长大鼠体内血栓形成时间，对体外血栓形成有明显的抑制作用。随着给药次数的增加，其抗血栓作用更为明显，并呈现一定的量效关系，且在相同剂量条件下，其作用强度与阿司匹林相当或强于阿司匹林。能显著抑制大鼠血小板最大聚集率和粘附率，延长优球蛋白溶解时间及小鼠出、凝血时间，对血瘀模型大鼠全血粘度、血浆粘度均有明显的降低作用，改善异常的血液流变学，并可抑制血瘀模型大鼠TXB₂合成，具有明显的抗栓、溶栓、抗凝及改善血液流变学作用。血栓形成与血小板聚集、粘附、血凝、血液流变学及TXB₂合成有关。因此，提示豨莶精醇抗栓作用可能与其抑制血小板聚集与粘附、减少TXB₂合成、改善血液流变学及抗凝作用有关，其确切机制正在进一步探讨中。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种用于治疗心脑血栓性疾病的药物活性成分的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将原料药材菊科植物豨莶草，加入有机溶剂，回流提取，提取若干次，每次2-3小时，每次加入的溶剂体积与生药的体积比为10～16：1，将提取液合并过滤，滤液减压回收溶剂，至无溶剂味，得提取液；药渣弃去或凉干另用；所述有机溶剂为10～100%乙醇或10～100%甲醇；

（2）将步骤（1）获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙酯进行萃取，萃取若干次，每次使用的萃取溶剂量与提取液的体积比为0.3～1.0：1.0；合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物；

（3）将步骤（2）获得的浸膏状物，加入50-60℃热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为2～4：1，将此液过大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的体积比为1：15～100，以水洗脱至流出液无色，再以30%、50%和70%的甲醇或乙醇溶液进行梯度洗脱，收集含豨莶精醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏；

（4）步骤（3）所得浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的体积比为1：1.2～2.5；上样硅胶与上柱色谱硅胶的体积比为1：4～20，以二元有机溶剂系统梯度洗脱，以TLC检测，合并含豨莶精醇部分的洗脱液；所述二元有机溶剂系统为石油醚和乙酸乙酯、石油醚和丙酮、乙酸乙酯和甲醇、乙酸乙酯和乙醇、氯仿和丙酮、氯仿和乙酸乙酯、氯仿和乙醇、氯仿和甲醇、二氯甲烷和丙酮、二氯甲烷和乙醇、二氯甲烷和甲醇溶剂系统中的任一种，洗脱梯度是30:1～1:1；

（5）将步骤（4）含豨莶精醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，将粘稠物溶于少量甲醇、乙醇或丙酮中，加入少量乙酸乙酯，甲醇、乙醇或丙酮与乙酸乙酯的体积比为1：1～2，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，重复上述操作3-5次，直至豨莶精醇几乎全部析出，合并析出的豨莶精醇晶体；

6）将步骤（5）析出的豨莶精醇晶体，加入甲醇、乙醇或丙酮；加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到纯度≥98%豨莶精醇。

2.根据权利要求1所述的药物活性成分的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中有机溶剂为70%乙醇或50%甲醇。

3.根据权利要求1所述的药物活性成分的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中洗脱用的二元有机溶剂系统为乙酸乙酯和甲醇，洗脱梯度是30:1～1:1。