CN102417933A - 基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测ev71病毒基因 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，肠道病毒检测网络实验室，哨点医院等用于对以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状的疑似手足口病病人的咽拭子、血清、粪便等标本的人肠道病毒EV71型VP1基因的检测和监测。具体是应用基因颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，通过生物信息学专业软件分析人肠道病毒EV71型VP1基因的保守序列，设计出六条引物完全与识别的VP1靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，反应前加入HNB(羟基萘酚蓝)染料，只需一步就可完成在65℃等温环境中扩增1小时，最后用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果，与传统的RT-PCR方法比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。
Description
发明领域
本发明是用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测手足口病病原体-肠道病毒EV71型VP1基因。用于各级疾病预防控制机构，肠道病毒检测网络实验室，哨点医院对EV71病毒的检测和监测。
发明背景
手足口病(Hand-foot-mouth Disease，HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。引起手足口病的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组、B组、肠道病毒71型(Human Enterovirus 71，EV71)、埃可病毒等。2008年以来引起国内爆发多次手足口病的病原主要为EV71型肠道病毒。
为有效阻止疫情的爆发和发生疫情后的应急处置，根据卫生部应对手足口疫情防控要求，我国已决定在各地增加肠道病毒检测实验室和哨点医院，扩大监测网络的覆盖范围。将网络实验室扩大到整个地市一级，目标是使全国300多个地市都具备能够进行肠道病毒检测的能力，切实做到早发现、早报告、早处置。本专利成功建立的基于颜色的RT-LAMP检测人肠道病毒EV71基因方法，将为提高我国疾病监测网络实验室和哨点医院的肠道病毒监测能力，实现对手足口病人的快速筛查提供了有力的技术保障。
基于颜色的RT-LAMP技术在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到两小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在65℃等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁白色沉淀，HNB染料在扩增前加入，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物和反应管内颜色的变化，可以直接判定检测结果。
发明内容：
1.本发明是对目前对EV71病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。第三，所有的扩增过程都可在65℃同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求，由于HNB染料在扩增前加入，可以肉眼直接判定检测结果，无需电泳。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。
2.选择人肠道病毒EV71型VP1基因的3028-3226位的相对保守区设计相应的RT-LAMP引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(Loop1、Loop2)。所有引物的具体序列见表1。
表1：RT-LAMP检测人肠道病毒EV71型VP1基因的引物序列
| Primer names | Sequences(5′-3′) |
| F3 | TGCGAGTGCTTATCAATGGT |
| B3 | AGTTCTGGTTACGCATCGG |
| FIP | ACTGAGAACGTGCCCATCATGTATCCCACATTCGGAGAACAC |
| BIP | CTGTGGGGACCTCCAAGTCCAAGGTATCCACGCCCTGAC |
| loop1 | CGTATTCAAGATCTTTCTCCTGTTT |
| loop2 | AGTACCCTTTAGTGGTTAGGATT |
3.建立了如下的检测过程，详见如下：
(1)合成探针：使用北京英杰生命技术有限公司合成仪合成并纯化。
(2)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。
(3)RT-LAMP反应。
(4)阳性反应结果用肉眼可观察到白色沉淀和颜色从紫色变成天蓝色，也可用650nm的吸光值判定
具体实施方式
实施方案1：基于颜色的RT-LAMP检测人肠道病毒EV71型的特异性
按Qiagen试剂盒说明提取其它肠道病毒柯萨奇病毒A组、B组、埃可病毒和肠道病毒EV71型RNA。建立如下扩增反应体系：1μl RNA样品、2.5μl Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)、1μl Bst DNA聚合酶(8U/μL)、1μl AMV反转录酶(10U/μL)、2.5μl dNTP(10mmol/L)、8μl Betaine(250mmol/L)、1μl MgSO4(150mmol/L)、1μl HNB(3mmol/L)，对应于HA基因的六条引物各1μl(引物浓度为F3与B3：5pmol/μL、BIP与FIP：40pmol/μL、Loop-1与Loop-2：20pmol/μL)、1μl dH2O。混匀，65℃，水浴1h，85℃，2min终止反应，，观察颜色变化和白色沉淀。只有肠道病毒EV71型有特异性扩增。
实施方案2：基于颜色的RT-LAMP检测人肠道病毒EV71型的灵敏度
经过病毒滴定的EV71参考株(FY17.08/AN/CHN/2008，GenBank accession no.EU703812)，提取RNA后进行系列稀释，RT-LAMP检测的体系同实施方案1。检测的灵敏度可达到0.33TCID50/ml的水平。
实施方案3：基于颜色的RT-LAMP检测人肠道病毒EV71型的结果可用肉眼(观察颜色变化和白色沉淀)或比色值判定
RT-LAMP反应完成后，用肉眼观察颜色的变化和管底的白色沉淀，也可取20μl测定650nm的吸收值。阳性反应管用肉眼可在管底观察到白色沉淀，管内颜色从反应前的紫色变成了反应后的天蓝色，650nm的吸光值≥0.31。
Claims (5)
1.一种用于手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)病原体Enterovirus 71型(EV71)病毒VP1基因检测的基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，其中包括：用于EV71病毒VP1基因检测的6条寡核苷酸引物和HNB(羟基萘酚蓝)染料。
2.权力要求1所述的EV71病毒VP1基因检测的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权力要求1所述的EV71病毒VP1基因检测的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)包括EV71病毒及其变异株。
4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，肠道病毒检测网络实验室，哨点医院用于EV71病毒VP1基因的检测和监测。
5.权力要求1所述的EV71病毒VP1基因检测的基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)的反应程序和检测程序。
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|---|---|---|---|---|
| CN105219886A (zh) * | 2015-11-02 | 2016-01-06 | 广东省第二人民医院 | 可避免假阴性的手足口病毒ev71恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN114540548A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-27 | 贵州安康医学检验中心有限公司 | 一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器 |
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