CN102410879A - 荧光强度校正方法、校正程序、计算方法和计算装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了荧光强度校正方法、校正程序、计算方法和计算装置。荧光强度校正方法包括：接收从荧光染料发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，并且获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组；将所获取的光谱组分离成多个小光谱组；将所分离的小光谱组与预先所获取的每种荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将该小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱；将在没有被指定的小光谱组和一个或多个指定的小光谱组之间的差分光谱与预先所获取的未被指定的荧光染料的荧光波长分布进行比较，并且将该差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱；并且计算从每种荧光染料发出的荧光的强度。

Description

荧光强度校正方法、校正程序、计算方法和计算装置
技术领域
本发明涉及荧光强度校正方法或荧光强度计算方法、荧光强度计算装置和荧光强度校正程序。更具体地，本发明涉及用于精确计算从多重标记在微粒上的多种荧光染料中的每个中发出的荧光强度的荧光强度校正方法等。
背景技术
在过去，已经使用通过使用荧光染料标记诸如细胞的微粒并测量通过激光照射所激发的荧光染料所发出的荧光的强度和图案来测量微粒特性的装置(例如，流式细胞仪)。近年来，为了更详细分析细胞等的特性，已经执行了使用多种荧光染料标记微粒并通过具有不同光接收波长带的多个光检测器(诸如PMT)测量从每种荧光染料所发出的光的多颜色测量。在多颜色测量中，通过根据使用的荧光染料的荧光波长选择光检测器侧的光学滤波器来执行荧光检测。
另一方面，当前使用的荧光染料(例如，FITC、PE(藻红蛋白)等)具有在荧光光谱中彼此重叠的波长带。因此，在当组合这些荧光染料执行多颜色测量时的情况下，即使通过光学滤波器通过波长带分离从每种荧光染料中所发出的荧光，来自不是目标的荧光染料的荧光也可能漏入每个光检测器。如果荧光漏入发生，则在通过每个光检测器所测量的荧光强度与来自目标荧光染料的真实荧光强度之间产生误差，从而引起测量误差。
为了校正该测量误差，执行从通过光检测器所测量的荧光强度中扣除漏入的荧光强度的荧光校正。为了使在光检测器中所测量的荧光强度变为来自目标荧光染料的真实荧光强度，荧光校正将电学或数学校正加入脉冲。
作为在数学上执行荧光校正的方法，使用通过将在每个光检测器中所测量的荧光强度表示为向量并且将预先设定的漏入矩阵组(leak-in matrixset)的逆矩阵应用至向量来计算来自目标荧光染料的真实荧光强度的方法(参照图9和图10以及日本未审查专利申请公开第2003-83894号)。通过分析每种荧光染料单独标记并且每种荧光染料的荧光波长分布被排列为列向量的微粒的荧光波长分布来建立漏入矩阵。漏入矩阵的逆矩阵也称为“校正矩阵”。在图9和图10中，例如，示出了使用五种(FITC、PE、ECD、PC5、PC7)荧光染料和5个光检测器执行5种颜色测量的情况。
发明内容
在使用校正矩阵的荧光校正方法中，需要识别每种荧光染料的荧光波长分布。由于该原因，在过去，已经通过在每次样品分析时分析单独标记的微粒来获取每种荧光染料的荧光波长分布，或者执行将参考荧光波长分布预先存储在装置中。
然而，在使用预先存储在装置中的参考荧光分布时的情况下，不能消除每次样品分析时产生的测量误差的影响，并且为了执行荧光强度的精确测量，经常需要手动操作校正。此外，在当使用通过分析单独标记的微粒所获取的荧光波长分布时的情况下，颜色越多，在样品测量之前的制备过程中越花时间和精力。
近年来，用户增加能够用于更详细分析细胞等特性的荧光染料的数量的需求已经增加。因此，根据本发明的优点，期望提供一种荧光校正方法，其中，能够使用每种荧光染料的荧光波长分布执行荧光校正，而无需在每次样品分析时分析单独标记的微粒，并且能够简单精确地计算来自每种荧光染料的荧光强度。
根据发明的实施方式，提供了荧光强度校正方法或荧光强度计算方法，包括如下：
通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上所激发的荧光染料所发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，并且获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组；
将所获取的光谱组分离成多个小光谱组；
将所分离的小光谱组与预先所获取的每种荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将该小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱。这里，光谱组可以通过单独成分分析、主要成分分析等被分离成多个小光谱组；
将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个指定的小光谱组之间的差分光谱与预先所获取的未被指定的荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将该差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱；以及
关于该小光谱组或该差分光谱被指定的荧光染料，使用该小光谱组或该差分光谱的荧光波长分布，关于该小光谱组或该差分光谱没有被指定的荧光染料，使用预先所获取的荧光波长分布来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
通过荧光强度校正方法等，能够从通过多重标记有荧光染料的微粒的测量所获取的光谱组中提取每种荧光染料的荧光波长分布，并将其用于荧光强度的计算。此外，在存在其荧光波长分布不能被提取的荧光染料的情况下，仅对于这些荧光染料，使用预先所获取的荧光波长分布来计算荧光强度。
具体地，例如，关于该小光谱组或该差分光谱被指定的荧光染料，将该小光谱组或该差分光谱的荧光波长分布排列为列向量，关于该小光谱组或该差分光谱没有被指定的荧光染料，使用将预先所获取的荧光波长分布排列为列向量的漏入矩阵的逆矩阵来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
此外，本发明的另一实施方式提供包括以下部分的荧光强度计算装置。
测量部，通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上所激发的荧光染料所发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，并获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组；
计算部，通过将所获取的光谱组分离成多个小光谱组，将所分离的小光谱组与所存储的每种荧光的荧光波长分布进行比较，并将小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱，并且将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个指定的小光谱组之间的差分光谱与所存储的未被指定荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将该差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱，并且关于该小光谱组或该差分光谱被指定的荧光染料，使用该小光谱组或该差分光谱的荧光波长分布，关于该小光谱组或该差分光谱没有被指定的荧光染料，使用所存储的荧光波长分布来计算从每种荧光染料所发出的荧光强度
荧光强度计算装置还可包括：输入部，接收关于在微粒的荧光标记中所使用的荧光染料的信息的输入；以及存储部，存储被预先所获取的每种荧光染料的荧光波长分布。
另外，本发明的再另一个实施方式提供执行以下操作的荧光强度校正程序：
通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上所激发的荧光染料所发出的荧光从每个光检测器收集检测值，获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组，并将该光谱组分离成多个小光谱组；
将所分离的小光谱组与所存储的每种荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将该小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱；
将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个指定的小光谱组之间的差分光谱与所存储的未被指定的荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将该差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱；并且
关于该小光谱组或该差分光谱被指定的荧光染料，使用该小光谱组或该差分光谱的荧光波长分布，关于该小光谱组或该差分光谱没有被指定的荧光染料，使用预先所获取的荧光波长分布来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
在本发明中，“微粒”广泛包括诸如细胞、微生物和脂质体的生物微粒以及诸如乳胶颗粒、凝胶颗粒和工业颗粒的合成颗粒等。
生物微粒包括构成各种类型的细胞的染色体、脂质体、线粒体、细胞器官等。细胞包括动物细胞(造血细胞等)和植物细胞。微生物包括诸如大肠杆菌的细菌、诸如烟草花叶病毒的病毒和诸如酵母菌的真菌。此外，生物微粒也可以包括诸如核酸、蛋白质和其复合物的生物高聚物。此外，例如，工业颗粒可以为有机或无机高聚物材料、金属等。有机高聚物材料包括聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯苯、聚(甲基丙烯酸甲酯)等。无机高聚物材料包括玻璃、硅石和磁性材料。金属包括胶体金、铝等。虽然通常微粒的形状为球形是正常的，但是它们可以为非球形，并且其大小和质量不被特别限制。
根据发明的实施方式，提供了一种荧光校正方法，其中，能够使用每种荧光染料的荧光波长分布来执行荧光校正，而无需在每次样品分析时分析单独标记的微粒，并且能够简单精确地计算来自每种荧光染料的荧光强度。
附图说明
图1是示出了描述根据发明实施方式的荧光校正方法的过程的流程图；
图2是详细描述步骤S60的过程的流程图；
图3A是通过测量由FITC、PE、PE-TR和PE-Cy5四种荧光染料多重标记的微粒所获取的光谱组的光谱图，图3B至图3G是从光谱组中分离的小光谱组的光谱图；
图4是FITC的参考数据的光谱图；
图5是PE的参考数据的光谱图；
图6是PE-TR的参考数据的光谱图；
图7是PE-Cy5的参考数据的光谱图；
图8是示出了根据发明实施方式的荧光强度计算装置的功能结构的框图；
图9是描述使用现有技术的校正矩阵的荧光校正方法的示图；以及
图10是描述现有技术的校正矩阵的矩阵元的示图。
具体实施方式
下文中，将参照附图详细描述发明的优选实施方式。此外，以下描述的实施方式为本发明实施方式的代表性实例，并且本发明的范围不应理解为由此限定。这里，将以下面顺序给出描述。
1.荧光强度校正方法
1步骤S10：荧光染料信息的输入
2步骤S20：负控制的测量
3步骤S30：样品的测量
4步骤S40：分析的微粒组的选通
5步骤S50：分离成小光谱组
6步骤S60：指定每种荧光染料的荧光光谱
6-1步骤S100：小光谱组的选择
6-2步骤S200：参考数据的参照
6-3步骤S300：差分光谱的计算
6-4步骤S400：参考数据的参照
7步骤S70：荧光校正操作
8步骤S80：数据显示
2.步骤S50(分离成成小光谱组)和步骤S60(指定每种荧光染料的荧光光谱)的处理的具体实例
1步骤S50：分离成小光谱组
2步骤S60：指定每种荧光染料的荧光光谱
3.荧光强度计算装置和荧光强度计算程序
1.荧光强度校正方法
图1和图2是描述根据发明实施方式的荧光校正方法的过程的流程图。图2是详细描述图1中的步骤S60的过程的流程图。根据发明实施方式的荧光强度校正方法包括以下过程。
“步骤S30”：通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上而激发的荧光染料所发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，并获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组的过程。
“步骤S50”：将所获取的光谱组分离成多个小光谱组的过程；
“步骤S60(S200)”：将所分离的小光谱组与预先所获取的每种荧光染料的荧光波长分布(参考数据)进行比较，并将小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱的过程。
“步骤S60(S600和S700)”：将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个指定的小光谱组之间的差分光谱与未被指定的荧光染料的参考数据进行比较，并将差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱的过程。
“步骤S70”：关于该小光谱组或该差分光谱被指定的荧光染料，使用该小光谱组或该差分光谱的荧光波长分布，关于该小光谱组或该差分光谱没有被指定的荧光染料，使用预先所获取的荧光波长分布来计算从每种荧光染料发出的荧光强度的过程。
例如，稍后参照图8详细描述的荧光强度计算装置1用在根据发明实施方式的荧光强度校正方法中。荧光强度校正装置1包括流式细胞仪和CPU、存储器、硬盘、用户界面等。
1步骤S10：荧光染料信息的输入
首先，使用多种荧光染料多重标记作为测量对象的微粒。能够通过现有技术中公知的方法执行微粒的荧光染料标记。例如，在当测量对象为细胞时的情况下，面对细胞表面分子的荧光标记抗体和细胞混合，并且抗体结合至细胞表面分子。荧光标记抗体可以为具有直接结合荧光染料的抗体，并且可以具有与抗生物素蛋白标记抗体结合的荧光染料，其中，抗生物素蛋白通过生物素亲和素反应结合至该抗生物素蛋白标记抗体。此外，抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
现有技术中公知的两种或多种物质能够组合并用作荧光染料。例如，藻红蛋白(PE)、FITC、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7、菲啶溴红、碘化丙啶、烟酸己可碱33258/33342、DAPI、吖啶橙、色霉素、光神霉素、橄榄霉素、派若宁Y、噻唑橙、罗丹明101异硫氰酸盐、BCECF、BCECF-AM、C.SNARF-1、C.SNARF-1-AMA、发光蛋白质、Indo-1、Indo-1-AM、Fluo-3、Fluo-3-AM、Fura-2、Fura-2-AM、oxonol、德克萨斯红、罗丹明123、10-N-壬基吖啶橙、荧光素、荧光素二乙酸酯、羧基荧光素、二醋酸羧基荧光素、羧基二氯荧光黄和二醋酸羧基二氯荧光黄。
在图1的步骤S10中，用户将关于用在微粒的荧光标记中的荧光染料的信息(下文中，称为“荧光染料信息”)输入荧光强度计算装置1。使用诸如鼠标或键盘的用户界面输入荧光染料信息。作为关于每种荧光染料的基准的荧光波长分布(下文中，也被称为“参考数据”)被存储在荧光强度计算装置1中。存储在装置中的数据或通过预先测量每种荧光染料的荧光波长分布所获取的数据被用作参考数据。在每次样品分析时不执行参考数据的获取，一旦参考数据被获取并存储在装置中，则需要在每次样品分析时执行参考数据的获取。例如，在该步骤中输入的荧光染料信息为荧光染料的名称、索引号等，并且表示与存储的每种荧光染料的参考数据相对应的信息。
2步骤S20：负控制的测量
在图1的步骤S20中，用户执行没有被荧光染料标记的微粒(负控制)的测量。能够使用现有技术中公知的多颜色测量流式细胞仪通过相同的方法执行微粒的测量。在当前的步骤中，获取微粒的自发荧光的荧光光谱(背景值)，并且同时确认样品的荧光染料标记的特异性。
3步骤S30：样品的测量
在图1的步骤S30中，用户执行由荧光染料标记的微粒(样品)的测量。在本步骤中，通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒，具有不同光接收波长带的多个光检测器接收从激发的荧光染料发出的荧光。此外，从每个光检测器收集检测值，并且获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组。
4步骤S40：分析的微粒组的选通(gating)
图1的步骤S40为根据需要由用户所执行的步骤，其中，从样品中提取要执行分析的微粒组(选通)。例如，在当仅从血液细胞样品中分析淋巴细胞时的情况下，或在当仅从样品中分析活细胞时的情况下，执行本步骤。在当样品仅由要被分析的微粒组构成时的情况下，本步骤是不需要的。通过执行该步骤，能够从每个光检测器的检测值中适当地提取与分析的微粒组相对应的荧光光谱组。
能够通过类似于现有技术中公知的流式细胞仪的方法执行选通。具体地，使用诸如显示器、鼠标或键盘的用户界面，在二维相关图上指定要被分析的微粒组，其中，正向散射光(正向散射：FSC)为x轴，并且侧向散射光(侧向散射：SSC)为y轴。这里，本步骤可以为通过程序自动执行的过程。
5步骤S50：分离成小光谱组
在图1的步骤S50中，用户或程序从步骤S30中所获取的光谱组中分离出多个主要成分组(下文中，称为“小光谱组”)。在当由用户通过在光谱组的光谱图上指定成分组执行时的情况下，使用诸如显示器、鼠标或键盘的用户界面执行小光谱组的分离。此外，在当通过程序分离小光谱组时的情况下，应用诸如单独成分分析或主要成分分析的通常使用的成分分析算法。
在步骤S30中所获取的光谱组在从其数据值(荧光强度)中减去在步骤S20中所获取的背景值之后被分离成小光谱组。
6步骤S60：指定每种荧光染料的荧光光谱
在图1的步骤S60中，通过使用在步骤S50中所分离的小光谱组和预先所获取的每种荧光染料的荧光波长分布(参考数据)的程序来指定每种荧光染料的荧光光谱。将参照图2详细描述本步骤的过程。
6-1步骤S100：小光谱组的选择
在本步骤中，首先，选择在步骤S50中所分离的多个小光谱组中的一个。在步骤S50中所分离的多个小光谱组内所选择的小光谱组优选为从其他小光谱组中最明确分离出的一个。
6-2步骤S200：参考数据的参照
在本步骤中，将在步骤S100中所选择的小光谱组与参考数据进行比较，并且检索其中荧光波长分布图案与小光谱组匹配的参考数据。
在当匹配的参考数据存在时的情况下，根据与参考数据相对应的荧光染料信息，所选择的小光谱组被确定为相关荧光染料的荧光光谱并被存储。此外，在当匹配的参考数据不存在时的情况下，所选择的小光谱组被存储作为不匹配组(步骤S300)。
在随后的步骤S400中，确定在步骤S50中所分离的多个小光谱组的全部处理是否完成。在当存在处理没有完成的小光谱组时的情况下，关于该小光谱组，通过返回步骤S100来继续该处理，并且重复该步骤，直至所有小光谱组的处理完成。
6-3步骤S600：差分光谱的计算
在步骤S500中，关于在步骤S10中输入了荧光染料信息的所有荧光染料，确认参考数据和荧光波长分布图案匹配的小光谱组是否被确定。即，关于用在微粒的荧光标记中的所有荧光染料，确认被认为是其荧光光谱的小光谱组是否被确定(参照步骤S500)。
这里，在当关于所有荧光染料确定小光谱组时的情况下，处理结束。另一方面，在当存在小光谱组没有被确定的荧光染料时的情况下，在步骤S600中执行下面的处理。即，首先，计算在没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱并且在步骤S300中被存储作为不匹配组的小光谱组和一个或多个指定的小光谱组之间的差分光谱(步骤S600)。通过组合一个、两个或多个指定的小光谱组并进行差分来从存储为不匹配组的小光谱组中的一个来计算多个差分光谱。
在没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱并且在直至步骤S400的处理过程中没有被存储为不匹配组的小光谱组中，多种荧光染料的光谱信息经受卷积运算。在本步骤中，通过从不匹配小光谱组的数据值中减去已经被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组的数据值来取消卷积运算的影响。
6-4步骤S700：参考数据的参照
在步骤S700中，将在步骤S600中所计算的差分光谱与参考数据进行比较，并且检索其中荧光波长分布图案匹配差分光谱的参考数据。
在当匹配的参考数据存在时的情况下，根据与参考数据相对应的荧光染料信息，所计算的差分光谱被确定为相关的荧光染料的荧光光谱并被存储。此外，在当匹配的参考数据不存在时的情况下，所计算的差分光谱被存储为不匹配组(步骤S800)。
在随后的步骤S900中，关于在步骤S10中输入荧光染料信息的所有荧光染料，确认荧光波长分布图案与参考数据或差分光谱匹配的小光谱组是否被确定。即，关于用在微粒的荧光标记中的所有荧光染料，确认被认为是其荧光光谱或差分光谱的小光谱组是否被确定。
这里，在对于所有荧光染料确定小光谱组或差分光谱时的情况下，处理结束。
在步骤S900中，在当小光谱组或差分光谱没有被确定的荧光染料存在时的情况下，进一步确认在步骤S300中被存储为不匹配组的小光谱组的全部处理是否完成(步骤S1000)。在当处理没有被完成的小光谱组存在时的情况下，关于该小光谱组，通过返回步骤S600来继续处理，并且重复该步骤被重复，直至所有小光谱组的处理完成。
在步骤S1000中，在当确认所有小光谱组已经处理时的情况下，处理结束。在这个阶段，小光谱组或差分光谱没有被确定的荧光染料存在的情况也是可能的。小光谱组或差分光谱没有被确定的荧光染料很可能没有具体标记在微粒上。
7步骤S70：荧光校正操作
在图1的步骤S70中，使用通过步骤S60中的程序所指定的每种荧光染料的荧光光谱来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
此时，关于在步骤S60中指定小光谱组或差分光谱的荧光染料，使用小光谱组或差分光谱的荧光波长分布来计算荧光强度。此外，在步骤S60中，关于没有指定小光谱组或差分光谱的荧光染料，使用参考数据来计算荧光强度。
具体地，例如，通过关于小光谱组或差分光谱被指定的荧光染料将小光谱组或差分光谱的荧光波长分布排列为列向量，并且关于小光谱组或差分光谱没有被指定的荧光染料使用作为被排列为列向量的参考数据的漏入矩阵的逆矩阵来校正来自每个光检测器的检测值。这里，荧光强度的计算不限于使用漏入矩阵的逆矩阵的方法。
8步骤S80：数据显示
在图1的步骤S80中，荧光强度的计算结果通过程序被显示在诸如显示器的用户界面上。能够通过类似于现有技术中公知的流式细胞仪的方法执行本步骤。具体地，能够采用通过二维相关图的显示，其中，关于每个微粒的两种不同类型的荧光染料的荧光强度均标示在x轴或y轴上。
在过去，在使用校正矩阵的荧光校正方法中，已经通过在每次样品分析时分析单独标记的微粒来获取每种荧光染料的荧光波长分布，或者将参考数据预先存储在装置中。然而，在使用现有技术的参考数据的方法中，不可去除每次样品分析时引起的测量误差的影响。此外，在当使用通过分析单独标记的微粒所获取的荧光波长分布时的情况下，颜色越多，在样品测量前的制备中越花时间和精力。
通过根据发明实施方式的荧光强度校正方法，能够通过从多重标记荧光染料的样品的测量所获取的光谱组中提取每种荧光染料的荧光波长分布来建立校正矩阵。此外，仅使用关于荧光波长分布不被提取的荧光染料的参考数据来构成校正矩阵元。因此，根据荧光强度校正方法，不需要每次样品分析时都分析单独标记的微粒，并且通过使每次样品分析时所引起的测量误差的影响最小化，能够简单精确地计算来自每种荧光染料的荧光强度。
2.步骤S50(分离成小光谱组)和步骤S60(指定每种荧光染料的荧光光谱)的处理的具体实例
将参照图3至图7描述根据发明实施方式的荧光强度校正方法的步骤S50和S60的具体处理细节。图3A中例举了通过使用32通道多色彩测量流式细胞仪测量由FITC、PE、PE-TR和PE-Cy5四种荧光染料多重标记的微粒(参照步骤S30)所获取的光谱组。图3B至图3G中例举了从光谱组分离出的小光谱组的光谱图。图4至图7中分别例举了关于FITC、PE、PE-TR和PE-Cy5通过单独标记的微粒的分析而预先获取的荧光波长分布(参考数据)的光谱图。由于参考数据为包括被提供用于防止激发激光(640nm)漏入的陷波滤波器的特性的数据，所以参考数据变为装置所特有的，而与染料本身的光谱信息不能完美匹配。
微粒由对FITC、PE、PE-TR和PE-Cy5这四种荧光染料表现出不同染色性的多个种群构成，并且通过测量微粒所获取的图3A的光谱组具有每个种群的数据的混合。
1步骤S50：分离成小光谱组
通过从图3A的光谱组分离出小光谱组，可根据对每个种群的染色性的特性进行分离。例如，首先，可通过通道25的检测值的水平(或者存在或不存在)来进行分离。当通过通道25的检测值进行分离时，图3A的光谱组被分离成图3B和图3C的小光谱组。接下来，如果通过通道16的检测值的水平分离图3C的小光谱组，则可分离成图3D和图3E的小光谱组。此外，如果通过通道16的检测值的水平分离图3E的小光谱组，则可分离成图3F和图3G的小光谱组。
通过上面的处理，从图3A的光谱组分离出图3B、图3D、图3F和图3G四个小光谱组。
2步骤S60：指定每种荧光染料的荧光光谱
在步骤S100中选择图3B的小光谱组。当在步骤S200中参照参考数据时，图3B的小光谱组匹配FITC的荧光波长分布图案(参照图4)。因此，在步骤S300中，图3B的小光谱组被确定为FITC的荧光光谱并被存储。由于图3D、图3F和图3G的小光谱组没有在步骤S400中处理，所以返回步骤S100。
在步骤S100中选择图3D的小光谱组。当在步骤S200中参照参考数据时，没有与荧光波长分布图案匹配的数据。因此，在步骤S300中，图3D的小光谱组被保存为不匹配组。由于图3F和图3G的小光谱组没有在步骤S400中处理，所以返回步骤S100。
在步骤S100中选择图3F的小光谱组。当在步骤S200中参照参考数据时，没有与荧光波长分布图案匹配的数据。因此，在步骤S300中，图3F的小光谱组被保存为不匹配组。由于图3G的小光谱组没有在步骤S400中处理，所以返回步骤S100。
在步骤S100中选择图3G的小光谱组。当在步骤S200中参照参考数据时，没有与荧光波长分布图案匹配的数据。因此，在步骤S300中，图3G的小光谱组被保存为不匹配组。由于所有小光谱组都已经在步骤S400中处理，所以前进至步骤S500。
在步骤S500中，由于迄今为止仅FITC的图3B的小光谱组已经被确认，所以前进至步骤S600。
在步骤S600中，计算在步骤S300中没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱并且被保存为不匹配组的图3D、图3F和图3G的小光谱组和被指定为FITC的荧光光谱的图3B的小光谱组之间的差分光谱。
这里，首先，获取图3D的小光谱组与图3B的小光谱组之间的差分光谱(H)。如果参照参考数据，则光谱差分(H)与PE的荧光波长分布图案匹配(参照图5)。因此，在步骤S800中，差分光谱(H)被确定为PE的荧光光谱并被存储。由于在步骤S900中PE-TR和PE-Cy5的差分光谱没有被确定，所以步骤前进至步骤S1000。此外，由于在步骤S1000中没有处理图3F和图3G的小光谱组，所以返回步骤S600。
在步骤S600中，计算在图3F的小光谱组与被指定为FITC的荧光光谱的图3B的小光谱组和/或被指定为PE的荧光光谱的差分光谱(H)之间的差分光谱。如果参照参考数据，则通过从图3F的小光谱组中扣除图3B的小光谱组所获取的差分光谱(I)与PE-TR的荧光波长分布图案匹配(参照图6)。因此，在步骤S800中，差分光谱(I)被确定为PE-TR的荧光光谱并被存储。由于在步骤S900中PE-Cy5的差分光谱没有被确定，所以步骤前进至步骤S1000。此外，由于在步骤S1000中没有处理图3G的小光谱组，所以步骤返回步骤S600。
在步骤S600中，通过从图3G的小光谱组中扣除被指定为FITC的荧光光谱的图3B的小光谱组、被指定为PE的荧光光谱的差分光谱(H)和被确定为PE-TR的荧光光谱的差分光谱(I)中的一个、两个或多个来计算差分光谱。如果参照参考数据，则通过从图3G的小光谱组中扣除图3B的小光谱组所获取的差分光谱(J)与PE-Cy5的荧光波长分布图案匹配(参照图7)。因此，在步骤S800中，差分光谱(J)被确定为PE-Cy5的荧光光谱并被存储。由于在步骤S900中所有荧光染料的差分光谱被确定，所以步骤S60结束，并且步骤前进至步骤S70。
通过上面的处理，通过作为FITC的荧光光谱的图3B的小光谱组、作为PE的荧光光谱的差分光谱(H)、作为PE-TR的荧光光谱的差分光谱(I)和作为PE-Cy5的荧光光谱的差分光谱(J)指定差分光谱J。
在随后的荧光校正操作(步骤S70)中，关于FITC、PE、PE-TR和PE-Cy5每种荧光染料，使用图3B的小光谱组和差分光谱(H)、(I)和(J)中的每个的荧光波长分布来计算荧光强度。具体地，关于FITC、PE、PE-TR和PE-Cy5每种荧光染料，使用其中图3B的小光谱组和差分光谱(H)、(I)和(J)中的每个的荧光波长分布被排列为列向量的漏入矩阵的逆矩阵来校正来自每个光检测器的检测值。
3.荧光强度计算装置和荧光强度计算程序
根据发明实施方式的荧光强度计算装置和荧光强度计算程序包括用于执行上述荧光强度校正方法的每个过程的多个部分，并且包括执行每个过程的步骤。图8是示出根据发明实施方式的荧光强度计算装置1的功能结构的框图。荧光强度计算装置1包括流式细胞仪10、CPU 20、存储器30、硬盘40和用户界面。
用户界面中包括接收用户的荧光染料信息的输入(参照步骤S10)的诸如鼠标51和键盘52的输入部。荧光强度计算程序和每种荧光染料的参考数据42被存储，并被存储在作为存储部的硬盘40中。
流式细胞仪10执行标记有荧光染料(参照步骤S30)的微粒(样品)的测量。通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上，流式细胞仪10通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收从激发的荧光染料发出的荧光。此外，从每个光检测器中收集检测值，并且获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组。此外，流式细胞仪10也检测从微粒所发出的散射光。
在操作系统(OS)43的控制下，关于所获取的光谱组的信息显示在用户界面(显示器61)上。用户可以使用在显示器61上所显示的光谱组的光谱图，用于使用鼠标51或键盘52来指定光谱组的成分组(参照步骤S50)。此外，包括微粒的散射光信息的二维相关图也显示在显示器61上，并且被用于指定用户执行分析的微粒组(参照步骤S40)。
此外，通过在操作系统(OS)41的控制下启动荧光强度计算程序来处理关于光谱组的信息，并且执行与在上述步骤S50之后的每个处理过程相对应的步骤。
荧光强度计算程序能够记录在计算机可读记录介质上。尽管记录介质只要是计算机可读介质就不被特别限制，但是具体地，例如，可使用诸如软盘或CD-ROM的光盘型记录介质。此外，可使用诸如磁带的带型记录介质。
本发明包含于2010年8月24日向日本专利局提交的日本在先专利申请JP 2010-186949中所公开主题，其全部内容结合于此作为参考。
本领域的技术人员应当理解，根据设计需求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和变形，均应包含在所附权利要求或其等同物的范围之内。

Claims (7)

1.一种荧光强度校正方法，包括：
通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上所激发的荧光染料所发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，并且获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组；
将所获取的光谱组分离成多个小光谱组；
将所分离的小光谱组与预先获取的每种荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将所述小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱；
将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个被指定的小光谱组之间的差分光谱与未被指定的荧光染料的预先获取的荧光波长分布进行比较，并且将所述差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱；以及
对于所述小光谱组或所述差分光谱被指定的荧光染料使用所述小光谱组或所述差分光谱的荧光波长分布、并且对于所述小光谱组或所述差分光谱没有被指定的荧光染料使用预先获取的荧光波长分布，来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的荧光强度校正方法，其中，对于所述小光谱组或所述差分光谱被指定的荧光染料将所述小光谱组或所述差分光谱的荧光波长分布排列为列向量、对于所述小光谱组或所述差分光谱没有被指定的荧光染料使用将预先获取的所述荧光波长分布排列为列向量的漏入矩阵的逆矩阵，来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
3.根据权利要求2所述的荧光强度校正方法，其中，所述光谱组通过单独成分分析或主要成分分析被分离成多个小光谱组。
4.一种荧光强度计算方法，包括：
通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上所激发的荧光染料所发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，并且获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组；
将所获取的光谱组分离为多个小光谱组；
将所分离的小光谱组与预先获取的每种荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将所述小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱；
将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个被指定的小光谱组之间的差分光谱与未被指定的荧光染料的预先获取的荧光波长分布进行比较，并且将所述差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱；以及
对于所述小光谱组或所述差分光谱被指定的荧光染料使用所述小光谱组或所述差分光谱的荧光波长分布、对于所述小光谱组或所述差分光谱没有被指定的荧光染料使用预先获取的荧光波长分布，来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
5.一种荧光强度计算装置，包括：
测量部，通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上所激发的荧光染料所发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，并且获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组；以及
计算部，将所获取的光谱组分离成多个小光谱组，将所分离的小光谱组与所存储的预先获取的每种荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将所述小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱，并且将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个被指定的小光谱组之间的差分光谱与所存储的未被指定的荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将所述差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱，并且，对于所述小光谱组或所述差分光谱被指定的荧光染料使用所述小光谱组或所述差分光谱的荧光波长分布、并且对于所述小光谱组或所述差分光谱没有被指定的荧光染料使用所存储的荧光波长分布，来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
6.根据权利要求5所述的荧光强度计算装置，进一步包括：
输入部，接收关于在微粒的荧光标记中所使用的荧光染料的信息的输入；以及
存储部，存储预先获取的每种荧光染料的荧光波长分布。
7.一种荧光强度校正程序，执行：
通过具有不同光接收波长带的多个光检测器接收通过将光照射在由多种荧光染料多重标记的微粒上所激发的荧光染料所发出的荧光，从每个光检测器收集检测值，获取每种荧光染料的荧光光谱作为一个光谱组，并将所述光谱组分离成多个小光谱组；
将所分离的小光谱组与所存储的每种荧光染料的荧光波长分布进行比较，并将所述小光谱组指定为任意荧光染料的荧光光谱；
将没有被指定为任意荧光染料的荧光光谱的小光谱组和一个或多个被指定的小光谱组之间的差分光谱与所存储的未被指定的荧光染料的荧光波长分布进行比较，并且将所述差分光谱指定为任意荧光染料的荧光光谱；并且
对于所述小光谱组或所述差分光谱被指定的荧光染料使用所述小光谱组或所述差分光谱的荧光波长分布、对于所述小光谱组或所述差分光谱没有被指定的荧光染料使用所存储的荧光波长分布，来计算从每种荧光染料发出的荧光强度。
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