CN102409107B - 一种热带假丝酵母菌pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒。本发明的技术方案为提供一种热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物和荧光探针A，所述引物分为上游引物A和下游引物A；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。

Description

一种热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种热带假丝酵母菌菌株PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，由于广谱抗生素的广泛应用，肿瘤化疗、器官移植的开展以及免疫力低下患者尤其是艾滋病患者的增多，由真菌尤其是念珠菌引起的深部感染机会日益增多。

念珠菌属于真菌界-半知菌亚门-芽孢菌纲-隐球酵母目-隐球酵母科。是双相型单细胞酵母菌。念珠菌是一种芽生的酵母状真菌，一种典型的条件致病菌。已知可以致病的常见念珠菌有：白念(candidaalbican)、热带(Candida tropicalis)、近平滑(Candida.parapsilosis)、克鲁斯(Candida krusei)、星状(Candidastellatoidea)、季也蒙(Candida guilliermondii)和光滑念珠菌(Candida.glabrata)等八种在人体中，无症状时常表现为酵母细胞型；侵犯组织和出现症状时常表现菌丝型。

念珠菌是一种腐物寄生菌，广泛存在于自然界。是人体正常菌群之一，平时主要生存于人体的口腔、皮肤、粘膜、消化道、阴道及其他脏器中。正常人群白色的带菌率可高达40％；从阴道粘膜分离出来的念珠菌85％～90％为白色，而白色念珠菌(candida albican)的致病性最强。

白色念珠菌(简称白念，Candida albicans，CA)、热带假丝酵母菌(简称热带，Candida tropicalis，CT)和光滑假丝酵母菌(简称光滑，Candida glabrata，CG)是其中的主要致病菌，其分布广泛，感染类型多样，已成为临床抗感染治疗的难点。

目前临床应用的念珠菌的检测方法有以下几种：

常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法。其优点是简便、快速和价廉，当天出结果；缺点是敏感性低，特异性差，无法辨别死菌与活菌。通常需用科玛嘉念珠菌显色培养基进一步证实。

沙氏培养基是念珠菌感染诊断较为常用的培养基，但临床上念珠菌感染症有的为混合感染，不同的念珠菌在沙氏培养基上生长均呈现白色菌落，要进一步鉴定不同的菌种，有时还必须要做念珠菌的发酵试验和芽管试验，给实验室的诊断带来很大的不便。

科玛嘉(CHROMagar)培养基培养法，该培养基含有特殊显色物质，无需通过任何仪器，仅通过观察菌落颜色即能在24～48小时(大多为48小时，30～37℃)用肉眼对念珠菌等进行定性和定量分析。但是培养所用的时间相对较长，不利于快速诊断。

另外，随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段。如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等。这些快速鉴定系统大多数是应用于临床酵母菌的鉴定，如假丝酵母属、隐球酵母属等，针对性较强，能鉴定的酵母菌种类较少，其中API 20C能鉴定的酵母菌种类为37种，ATB 32C能鉴定的酵母菌种类为69种。虽然，目前我国已累计引进Biolog微生物自动分析系统有100余台，但主要是应用于细菌的鉴定分析，应用于酵母菌鉴定的研究成果很少。

乳胶凝集反应、放免测定以及酶联免疫吸附测定，也可以作为念珠菌的辅助检测手段，但它们的敏感性和特异性均较差。

RAPD分型法，又称任意引物聚合酶链反应(Arbitrarily primedPCR)，AP-PCR)，是一种以PCR为基础揭示基因组多态性的方法。该法采用随机合成的单个寡核苷酸引物。在未知模板DNA序列情况下，以低退火温度与基因DNA两条链的多个非特异位点通过错配而复性，扩增产物经琼脂凝胶电泳分离产生指纹图谱。由于不同种细菌或同种细菌的不同菌株与引物结合的退火点的亲和性、数量和位置不同，所产生的指纹图谱均有各自的特征，以此反映种系发育过程中的相互联系及不同克隆间的差异。

该方法目前在日常医院感染的监测与预防控制中占主导地位，但存在分辨率低、影响因素多、重复性较差等诸多不足。

发明内容

本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对热带假丝酵母菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断热带假丝酵母菌的存在，对热带假丝酵母菌感染的辅助诊断。

本发明的技术方案为提供一种热带假丝酵母菌核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物A和下游引物A；

所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述试剂盒还包括DNA提取液，dNTPs、tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。

优选的，所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP。

优选的，所述DNA提取液包括：聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、正辛酸，所述聚乙二醇辛基苯基醚的质量百分数为2％，所述乙基苯基聚乙二醇的质量百分数为1％，所述正辛酸的摩尔浓度为0.04M。

优选的，所述试剂盒还包括提取固形物，所述提取固形物为直径0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比9∶1比例配制出。

优选的，所述试剂盒引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物B核苷酸序列：SEQ IDNO.4；下游引物B核苷酸序列：SEQ ID NO.5；荧光探针B核苷酸序列：SEQ ID NO.6。

优选的，所述荧光探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

本发明的有益效果为利用热带假丝酵母菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断热带假丝酵母菌的存在。本试剂盒具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短(2～3小时)，结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。最低检出限为1.0×10²copies/mL，具有灵敏度高和特异性高等优点。使用了大肠杆菌新霉素基因作为内参照基因，它在热带假丝酵母菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。

附图说明

图1：CT基因灵敏度检测结果图；

图2：CT基因精密度结果图；

图3：CT基因特异性结果图。

具体实施方式

本发明采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(MolecμLA.r beacon)技术对热带假丝酵母菌(简称热带，Candidatropicalis，CT)基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断热带假丝酵母菌的存在。从而指导临床医生对热带假丝酵母菌感染的病人用药，帮助预后判断。

上述高保守特异性核酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核苷酸序列如下：

GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAAAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

内参照原理：试剂盒设置了内参照，该内参照为含大肠埃希氏菌新霉素基因(neo基因)的质粒，neo基因在念珠菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了；但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的；然而目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验视为无效，需再重复。

阳性对照原理：每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。

阴性对照原理：为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。

实施例1本发明试剂盒的组成

主要原材料来源及制备方法：

Tris：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量99.7％，红外合格，pH(5％水)10.3-10.9，水份0.3％，熔点167-171℃，吸收系统合格，杂质最高含量合格。

MgCl₂：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量不少于99％，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。(MgCl2极易吸潮，启用新瓶后放于干燥器下保存)。

EDTA：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99.5％，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。

HCl：分析纯，北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。

纯化水：购买乐百氏桶装纯净水，然后经Millipore公司的Milli-QBiocel型纯水机处理，电阻率16～18MΩ。

引物和探针：本发明所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成，并经Sigma质检合格(含质谱鉴定)；

其中CT基因保守序列最优引物、探针序列组合如下：

5’-GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-3’；

所述下游引物A的核苷酸序列为：

5’-ATTGCTCAACACCAAACCCG-3’；

所述荧光探针A的核苷酸序列为：

5’-FAM-ACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCG-BHQ-3’。

其中neo内参照系统的引物、探针序列组合如下：

上游引物B(SEQ ID NO.4)：5’-GACTAAACTGGCTGACGG-3’；

下游引物B(SEQ ID NO.5)：5’-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3’；

荧光探针B(SEQ ID NO.6)：

5’-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-3’。

用于PCR反应的引物，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5可视为合格引物。-20℃保存。

荧光探针A：在寡核苷酸5’端标记FAM，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，-20℃保存。

neo荧光探针B：在寡核苷酸5’端标记TEXrd，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在TEXrd荧光素的激发波长610nm处有吸收峰。-20℃保存。

dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司，或其他有合格资质的供应商，并经出厂检测合格；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。根据供应商质量标准为HPLC纯，无DNase和RNase污染。-20℃保存。

Taq酶：本产品在研制开发及生产过程中，所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司，或其他有合格资质的供应商。浓度5U/μl，含10×PCRBuffer、25mmol/LMgCl₂，根据供应商质量标准：本品具有DNA聚合酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50％活性。-20℃保存。

UNG酶：本产品在研制开发及生产过程中，所应用的UNG酶购自Promega公司或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。浓度＞1U/μl，根据供应商质量标准：本品具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，1UUNG在50℃2min能降解至少10³copies含dU的模板，使其不能产生扩增产物。-20℃保存。

基础试剂配制：

10×浓缩清洗液A：配制0.2N NaOH，5mL/管分装；

10×浓缩清洗液B：配制10×TE缓冲液(pH8.0)，10mL/管分装；

DNA提取液：

按Triton X-100 2％、NP-40 1％、正辛酸0.04M浓度配制成DNA提取液，充分混匀后按5mL/管分装。

提取固形物：取直径为0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比约为：0.5mm∶1.0mm＝9∶1比例配制出提取固形物，每管约0.15g分装。

10mmol/L Tris-HCl溶液的配制：称取0.12114g的Tris，加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100mL，翻转容量瓶使之充分混匀。移入试剂瓶并标记名称、浓度、配置时间。

dNTPs的配制如表1。

表1

名称	dATP	dCTP	dGTP	dUTP	超纯水
						体积	100μL	100μL	100μL	150μL	550μL

从冰柜中取出所需试剂，平衡至室温。按上述比例加入所有试剂后用磁力搅拌器混匀。

引物和探针的稀释：

取出合成的引物和探针，在高速台式冷冻离心机上离心8000r/min，3min。取出待测引物和探针，计算并加超纯水稀释引物和探针到100μM，在涡旋混匀器上混合均匀，取出后在手掌型离心机离心。

内参照：组成为10³copies/mL含内参照基因质粒；领用经分光光度计精确定量的含内参照基因的高浓度质粒，用1×TE作10倍梯度稀释至10³copies/mL作为内参照，1mL/管分装。

阳性对照：组成为10⁶copies/mL-10⁷copies/mL含目的片段质粒；领用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至10⁶copies/mL-10⁷copies/mL作为阳性对照，1mL/管分装。阳性对照品为含目的基因的质粒，目的基因来自美国菌种保藏中心(ATCC)的原始菌株。

阴性对照：组成为1×清洗液B，将配制好的10×清洗液B用纯化水作10倍稀释，制得1×清洗液B作为阴性对照，1mL/管分装。

CT-PCR反应液配方如表2(44.3μl)：

表2

本试剂盒组成部分如表3。

表3

实施例2本发明试剂盒的使用

一、试剂准备：

1.取出10×浓缩清洗液A和10×浓缩清洗液B，用无菌纯水按1∶9(体积比)进行稀释，放于4℃冰箱中备用。

2.将Taq DNA Polymerase和Uracil N-Glycosylase(UNG)瞬时离心后，放于-20℃冰箱中备用。

3.确定需要进行的反应管数n(标本数+阴性、阳性对照)后，取出CT-PCR反应液，将n×44.3μl CT-PCR反应液，n×0.5μl Taq DNAPolymerase和n×0.2μl Uracil N-Glycosylase(UNG)加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应管中分装45μl，盖上管盖后转移到加样区，避光放于4℃冰箱备用。

4.将提取固形物及阳性对照、阴性对照、内参照转移到样品处理区，放于4℃冰箱中备用。

二、样本处理：

1.适用标本类型：痰液

1.1向玻璃管中加入4倍体积的1×清洗液A，摇匀，室温放置15-30min待液化；

1.2取液化后的标本1mL至1.5mL离心管，13000r/min离心5min；1.3弃上清，沉淀加清洗液B1mL混匀，13000r/min离心5min；1.4弃上清，沉淀加清洗液B1mL混匀，13000r/min离心5min；1.5弃上清，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。

2.适用标本类型：分泌物拭子

2.1分泌物拭子加入1mL清洗液B1mL(保证清洗液能没过无菌拭子取样部位)，将标本管用震荡器高速震荡2min制成标本悬浮液。

2.2取出全部悬浮液放入1.5mL离心管中，13000r/min离心5min弃上清，

2.3加入1mL清洗液B震荡重悬，13000r/min离心5min弃上清。

2.4加入100μL DNA提取液将沉淀重悬。

三、样本DNA提取：

1、向上述样本处理中处理好的各样本管中分别加入1管提取固形物(轻弹管底尽量将固形物倒净)，用强力震荡器(如美国Vortex-Genie)高速涡旋震荡5min，瞬时离心，加入20μl内参照。

2、阴性对照样本制备：取出阴性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl内参照。

阳性对照样本制备：(同阴性对照)

3、将待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后95℃干浴2min，即刻冰浴2-5min后13000r/min离心1min；上清液用于PCR扩增。

四、PCR反应

1、加样(样品处理区或者加样区)

向准备好的PCR反应液管中分别加入5μl上清液(注意避免吸入固形提取物)待测样品，阴性对照样品，阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时低速离心。(注意PCR反应管管壁上不可沾有反应液，不可有气泡)

2、PCR扩增(检测区)

将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按表4循环参数进行扩增反应。

表4

CT-PCR反应体系中包括：CT检测和内参照；利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样品Ct值如表5。

表5

五、检验结果的分析

1.结果分析条件设定

1.1ABI 7500基线(baseline)设定：取2个到最小Ct值前3个循环值作为基线，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct＝30或者“Undet.”为准。

1.2STRATAGENE Mx3000P基线设定：选择“适合基线(Adaptivebaseline)”设定时的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct＝30或者“No Ct”为准。

2.质控标准

本试剂盒阴阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效：

2.1阴性质控：热带(FAM)Ct值＝30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)，内参照(Texas Red)Ct值＜30。

2.2阳性质控：热带(FAM)Ct值≤23，且有较好的对数增长曲线；内参照(Texas Red)Ct值≤30。

3、结果

3.1热带假丝酵母菌阴性(低于检测下限)：热带(FAM)Ct值＝30或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)，内参照(TexasRed)Ct值＜30。

3.2热带假丝酵母菌阳性：热带(FAM)Ct值≤23，且有较好的对数增长曲线；内参照(Texas Red)Ct值≤30。

3.3反应无效，应重新测定：建议重新测定：热带(FAM)Ct样本＝30或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)，内参照(Texas Red)Ct值＝30或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI7500)。

3.4样本检测灰度区：热带(FAM)23＜Ct样本＜30，因检测核酸浓度较低，且实验存在系统及人为不确定性因素，建议重复检验确认。

请参阅图1、图2、图3，通过对本发明试剂盒灵敏度和精密度进行研究，显示其具备以下性能：

图1为CT基因灵敏度参比品检测结果图，所测浓度依次为1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/ml，最低检出限为1.0×10²copies/mL。

图2：CT基因精密度检测结果图，依次1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁴copies/ml，各重复十次。重复10次，内参照结果为阳，PCR反应体系以及操作正常，如图2所示，如图2所示本实验结果精密度达到100％。

图3：CT基因特异性结果图；如图所测为1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁴copies/ml的阳性对照，近平滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、丘陵假丝酵母、季也蒙假丝酵母、清酒假丝酵母、乳酒假丝酵母、罗伦隐球酵母、黄曲霉、白色念珠菌、光滑假丝酵母菌，结果如图3所示除阳性对照外结果全为阴性。

本试剂盒具有的特点：

1、DNA提取效果好；

2、具有很高的准确性、灵敏度和特异性；

3、无须PCR后处理，完全闭管扩增和检测，采用了dUTP-UNG系统，有助于避免扩增产物的污染；

4、操作简单、耗时短(2～3小时)；

5、结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。

经过我们前期的研究实验及最后的临床验证等证明，该产品明显优于目前临床主要采用的科玛嘉培养基鉴别方法，适于临床样本检测热带假丝酵母菌使用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针A，所述引物分为上游引物A和下游引物A；

所述上游引物A的核苷酸序列为：

5’-GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-3’；

所述下游引物A的核苷酸序列为：

5’-ATTGCTCAACACCAAACCCG-3’；

所述荧光探针A的核苷酸序列为：

5’-FAM-ACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCG-BHQ-3’；

所述热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒还包括DNA提取液，dNTPs、taq酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照，所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP，所述DNA提取液包括：聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、正辛酸，所述聚乙二醇辛基苯基醚的质量百分数为2%，所述乙基苯基聚乙二醇的质量百分数为1%，所述正辛酸的摩尔浓度为0.04M。

2.按权利要求1所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括提取固形物,所述提取固形物为直径0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比9:1比例配制出。

3.按权利要求1所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统的引物、探针序列组合如下：

上游引物B：5’-GACTAAACTGGCTGACGG-3’；

下游引物B：5’-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3’；

荧光探针B：5’-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-3’。

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