CN102409061A - 一种基于egfp的t载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于EGFP的T载体及制备方法，涉及基因工程领域。本发明制备的T载体，采用组成型强启动子介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达，外源DNA的插入可阻断EGFP的表达，使阳性菌落呈现白色，载体自连产生的假阳性菌落在日光下即可呈现绿色荧光。本发明设计的T载体应用于T-A克隆时，由于T-A克隆时不需要使用X-Gal和IPTG，本发明既可节约实验成本，又可避免X-Gal和IPTG失活或涂布不匀导致的假阳性。

Description

一种基于EGFP的T载体的制备方法

 

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种T载体及其制备方法。

背景技术

PCR是分子生物学和基因工程领域中最基本的技术之一，它是在体外获得大量目的基因或DNA片段的有效手段。PCR过程是由具有热稳定性的DNA聚合酶介导催化。当使用高保真DNA聚合酶扩增时，可得到具有平末端的PCR产物，而使用普通的TaqDNA聚合酶扩增时，可得到3’末端都具有单个凸起的A的PCR产物。这是因为普通的TaqDNA聚合酶除了正常的合成功能之外，还具有不依赖于DNA模板的合成能力，能够在PCR产物的3’末端额外地添加一个脱氧核苷酸，通常为dATP，使PCR产物并不是具有平末端的双链DNA，而是两个3’末端都多了一个A的双链DNA。正是这类PCR产物所具有的凸起的A，为PCR产物的直接克隆提供了便利，即可使用T-A克隆的方法，对PCR产物不作限制性内切酶处理的情况下，就可以在DNA连接酶的作用下，直接将PCR产物连接到T载体上。

在进行T-A克隆时，比较关键的是制备T载体，即在两个3’末端都具有一个凸起的T的线性化载体。T载体是处理构建好的前T载体而得到的，通常有两种策略：一种是利用能产生平末端的限制性内切酶（如EcoR V、Sma I）切割前T载体，得到具有平末端的线性化载体，然后在普通TaqDNA聚合酶的催化下，将dTTP添加到线性化载体的3’末端；另一种是利用特殊的限制性内切酶（如Xcm I、Eam1105 I）切割前T载体，直接产生两个3’末端都具有一个凸起的T的线性化载体。与第一种方法相比，使用第二种方法制备T载体时更加简便。

在构建前T载体时，不同的开发者往往使用不同的筛选标记基因，已商品化的T载体上的筛选标记基因主要是b-半乳糖苷酶a肽段基因（lacZ’）、细胞死亡控制基因（ccdB）等。使用lacZ’基因作为筛选标记基因时，可以根据a-互补原理，利用蓝白斑实现阳性克隆的筛选，但需要使用lacZ’缺陷型大肠杆菌菌株，还需要使用价格昂贵的X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），另外，这两种试剂的失效或在平板上涂布不匀，都可能导致显色失败，产生假阳性结果。使用ccdB基因作为筛选标记基因时，由于ccdB产物的毒性，不产生载体自连的菌落，极大地提高了T-A克隆的效率，但在构建前T载体时需要使用特殊的菌株。

增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）也可作为筛选标记基因，借助紫外线的激发甚至日光的照射，可以观察到绿色荧光，因此，可以直接根据绿色荧光的有无，简便地筛选到阳性克隆。但是，由于EGFP基因连接在诱导型强启动子（如lac启动子、T7启动子等）下游，在实现阳性克隆的筛选时，还需使用IPTG作为诱导剂，且绿色荧光不够强，需在紫外灯下进行筛选，而紫外线的照射可能对菌落或目的基因造成损伤，或者在37℃下进行长时间的培养，通常为16-18小时，在这样的条件下很容易产生卫星菌落。这两个因素限制了EGFP基因在T-A克隆中的应用。因此，要有效地利用EGFP基因作为筛选标记，最关键的是在EGFP基因上游采用组成型强启动子，无需紫外线照射或长时间培养，在日光或日光灯照射下，就能够看到菌落是否具有明显的绿色荧光。大肠杆菌lpp基因启动子是一个组成型强启动子，?krlj等人报道了突变的脂蛋白（lpp）基因的启动子（Pm），它具有更强转录活性。本发明将该突变启动子构建到EGFP基因上游，成功构建了以EGFP基因作为筛选标记的T载体，应用该T载体进行T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在37℃培养12小时后，在日光照射下即可呈现明显的绿色荧光，极大地提高了T-A克隆的效率。

 

发明内容

本发明为了克服上述现有技术中的不足，提供一种制备T载体的方法，以提高T-A克隆的效率。

本发明以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为筛选标记，用组成型强启动子Pm介导EGFP基因的表达，并将能切割前T载体制备T载体的限制性内切酶（EcoR V、Xcm I等）识别位点引入EGFP基因上游。

1、一种基于增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的T载体，所述T载体的两个末端位于组成型启动子和EGFP基因之间，所述T载体应用于T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在日光下呈现绿色荧光，携有外源DNA的阳性菌落呈现白色；

2、本发明提供由前T载体pPmG1制备T载体的方法，按照下述步骤进行：

（1）制备含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒的前T载体pPmG1，所述表达盒包括组成型启动子Pm、EGFP基因，以及位于两者之间的平末端酶切位点；

（2）用相应的限制性内切酶切割所述的前T载体，利用Taq DNA聚合酶将dTTP合成到线性化前T载体pPmG1的3’末端，使之具有凸起的T尾，制备成熟的T载体；

3、本发明提供由前T载体pPmG2制备T载体的方法，按照下述步骤进行：（1）制备含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒的前T载体pPmG2，所述表达盒包括组成型启动子Pm、EGFP基因，以及位于两者之间的两个串联的Xcm I酶切位点；

（2）用限制性内切酶Xcm I切割所述的前T载体pPmG2，直接获得在3’末端具有凸起的T尾的成熟的T载体。

本发明的优点

本发明以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为筛选标记基因构建T载体，应用本发明设计的T载体进行T-A克隆时，外源DNA的插入可阻断EGFP的表达，使阳性菌落呈现白色，载体自连产生的假阳性菌落在日光下即可呈现绿色荧光，因此，可直接依据菌落的绿色荧光表型简便快速地筛选出阳性克隆。由于T-A克隆时不需要使用X-Gal和IPTG，本发明既可节约实验成本，又可避免X-Gal和IPTG失活或涂布不匀导致的假阳性。

附图说明

图1：前T载体pPmG1和pPmG2的图谱。

图2：根据绿色荧光/白色表型筛选阳性菌落，其中箭头所指的菌落具有绿色荧光，为假阳性菌落；其余白色菌落为阳性菌落。

图3：菌落PCR法鉴定阳性克隆，其中泳道1-22为白色菌落的PCR产物，泳道23为阳性对照，泳道24为绿色荧光菌落的PCR结果。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例一：基于EGFP的前T载体pPmG1及T载体的制备方法

以表达载体pET-28a和克隆载体pUC18为出发载体，按如下步骤和方法实施：

1、前T载体pPmG1的构建

（1）化学合成两条经5’磷酸化的DNA（序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述DNA序列），高温变性后退火，形成具有Bgl II、Xba I所对应粘性末端的双链DNA，连入经Bgl II和Xba I双酶切的pET-28a，筛选出具有组成型强启动子的中间载体pETPm。

（2）设计和合成1对引物（序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述DNA序列），在上游引物中引入BamH I和EcoR V酶切位点，在下游引物中引入Hind III酶切位点，采用PCR技术获得EGFP基因，经BamH I和Hind III进行双酶切后，与经同样的酶切割的中间载体pETPm连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在日光下筛选出具有绿色荧光的菌落，即获得能组成型表达EGFP的中间载体pETPmG1。

（3）设计和合成1对引物（序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所述DNA序列），并在引物5’末端均引入Sma I酶切位点，从中间载体pETPmG1上PCR扩增EGFP表达盒，用Sma I切割PCR产物，与经Pvu II酶切的pUC18连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在日光下筛选出具有绿色荧光的菌落，即获得能组成型表达EGFP的前T载体pPmG1（见图1）。

2、T载体pPmG1-T的制备

（1）EcoR V酶切2~5 mg前T载体pPmG1，反应条件依据EcoR V供应商提供的说明书，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化的载体。

（2）在88 mL线性化载体中，加入10 mL 10×PCR Buffer，1 mL dTTP（100 mM），1 mL Taq DNA聚合酶（5U/mL），72℃反应2 h，利用PCR产物回收试剂盒回收加尾产物，即T载体pPmG1-T，测定DNA浓度，将浓度调整为50 ng/mL，分装，-20℃冰箱中保存。

3、T-A克隆验证

用普通的Taq DNA聚合酶获得750bp的PCR产物，取适量PCR产物与1 mL T载体pPmG1-T建立连接反应，热击法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12 h。在日光灯照射下，可见白色菌落和绿色荧光菌落（见图2），分别挑取100个白色菌落和1个绿色荧光菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养3 h，低速离心收集时，100个白色菌落培养物中沉淀的细胞全为白色，而绿色荧光菌落培养物的沉淀细胞呈现绿色荧光。进一步利用菌落PCR法对上述细菌培养物进行鉴定，100个白色菌落中均含有插入的外源DNA片段（见图3）。

实施例二：基于EGFP的前T载体pPmG2及T载体的制备方法

以表达载体pET-28a和克隆载体pUC18为出发载体，按如下步骤和方法实施：

1、前T载体pPmG2的构建

（1）具组成型强启动子的中间载体pETPm的构建方法与实施方式一中相应的方法相同。

（2）设计和合成1对引物（序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.4所述DNA序列），在上游引物中引入BamH I和两个串联的Xcm I酶切位点，并保证开放阅读框正确，在下游引物中引入Hind III酶切位点，采用PCR技术获得EGFP基因，经BamH I和Hind III进行双酶切后，与经同样的酶切割的中间载体pETPm连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在日光下筛选出具有绿色荧光的菌落，即获得能组成型表达EGFP的中间载体pETPmG2。

（3）将中间载体pETPmG2的EGFP表达盒克隆到pUC18上，获得能组成型表达EGFP的前T载体pPmG2（见图1）的方法，与实施方式一中相应的方法相同。

2、T载体pPmG2-T的制备

Xcm I酶切2~5 mg前T载体pPmG2，反应条件依据Xcm I供应商提供的说明书，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化的载体，即为成熟的T载体pPmG2-T，测定DNA浓度，将浓度调整为50 ng/mL，分装，-20℃冰箱中保存。

3、T-A克隆验证

T-A克隆及阳性克隆的验证方法与实施方式一中相应的方法相同。

 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏大学

 

<120>  一种基于EGFP的T载体及制备方法

 

<130> 

 

<160>  7   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

GATCTTGACA  ACATAAAAAA  CTTTGTGTTA  TACT                          34

 

<210>  2

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

CTAGAGTATA  ACACAAAGTT  TTTTATGTTG  TCAA                          34

 

<210>  3

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

ATTGGATCCG  ATATCGTGAG  CAAGGGCGAG  GA                            32

 

<210>  4

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

CGCAAGCTTT  TACTTGTACA  GCTCGTCCAT                                  30

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

AAACCCGGGA  AACAAGCGCT  CATGA                                       25

 

<210>  6

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

AAACCCGGGC  AATCCGGATA  TAGTTCCTC                                   29

 

<210>  7

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

TTGGATCCCC  ATGCATCAGA  TGGGAATTCC CATGCAATGC                   40

ATGGGTGAGC  AAGGGCGAG                                                59                                                        

 

Claims (3)

1.一种基于EGFP的T载体，其特征在于其中所述T载体的两个末端位于组成型启动子和EGFP基因之间，所述T载体应用于T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在日光下呈现绿色荧光，携有外源DNA的阳性菌落呈现白色。

2.根据权利要求1所述的一种基于EGFP的T载体的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）制备含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒的前T载体pPmG1，所述表达盒包括组成型启动子Pm、EGFP基因，以及位于两者之间的平末端酶切位点；

（2）用相应的限制性内切酶切割所述的前T载体，利用Taq DNA聚合酶将dTTP合成到线性化前T载体pPmG1的3’末端，使之具有凸起的T尾，制备成熟的T载体。

3.根据权利要求1所述的一种基于EGFP的T载体的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）制备含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒的前T载体pPmG2，所述表达盒包括组成型启动子Pm、EGFP基因，以及位于两者之间的两个串联的Xcm I酶切位点；

（2）用限制性内切酶Xcm I切割所述的前T载体pPmG2，直接获得在3’末端具有凸起的T尾的成熟的T载体。

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