CN102408472A

CN102408472A - 一种Bt蛋白Cry62Aa1、其编码基因及应用

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Publication number: CN102408472A
Application number: CN2011103877492A
Authority: CN
Inventors: 郑爱萍; 李平; 梁红霞; 朱军; 王世全; 邓其明; 李双成; 王玲霞; 刘怀年
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: CN102408472B

Abstract

本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry62Aa1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本发明提供的Bt蛋白Cry62Aa1具有杀灭癌细胞的作用，可用于制备抗癌药物，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

一种Bt蛋白Cry62Aa1、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性好氧细菌，它在形成芽孢的过程中，会在菌体的一端或两端形成一个或多个独特的伴胞晶体蛋白，这是唯一能区分两个分类学上的近缘物种B.thuringiensis和B.cereus的特征。不同菌株晶体蛋白的形状、大小和组分均各不相同，并且常常存在特异的杀虫活性，故称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。这种蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等都具有特异的杀虫活性(Faust RM.，et al.1983.Plasmid，9：98-103.)，而对哺乳动物没有任何有害作用，广泛应用于卫生与农业害虫的防治(Schnepf HE，et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev，62：775-806)。Bt的杀虫晶体蛋白主要包含两个结构上无任何相关性的蛋白家族：Cry蛋白和Cyt蛋白，前者对特异的昆虫有毒性，而后者对无脊椎动物和脊椎动物细胞具有广泛的溶细胞活性，包括昆虫和哺乳动物红细胞。目前，Cry蛋白现在已被划分为69个不同类型：Cry1-Cry69，而Cyt仅有三个类型：Cyt1、Cyt2和Cyt3(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt)(Crickmore N，Zeigler DR，Feitelson J.1998.Microbiol Mol Biol Rev，62：807-813.)。

至今人们已从世界各地的昆虫、土壤和植物体表等样本中分离到数万株Bt菌株，但其中绝大部分Bt菌株没有杀虫活性，因此这些菌株一直不受重视，它们的生物学特征也很少被研究过。直到1999年，日本学者Mizuki才对这类能产生晶体蛋白，而没有杀虫活性的Bt菌进行深入研究(Mizuki E.et al.1999.J Appl Microbiol，86：477-486)。他发现Bt菌株A1190所产生的81kDa伴孢晶体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞(人白血病T细胞MOLT-4、人子宫颈癌细胞等)具有杀伤能力，而且无溶血作用。此外，由于Cyt类杀虫晶体蛋白的溶细胞活性，Al-yahaeet等将Cyt2蛋白与肿瘤细胞抗体融合为一个特异破坏肿瘤细胞的融合蛋白进行临床研究，结果表明Cyt2蛋白对癌细胞具有抑制作用(Al-yahaee SAand Ellar DJ.1996.Bioconjug Chem，7：451-460)。该研究是继发现Bt以色列变种之后又一个与医学联系的全新领域，可能为抗癌药物的研究与发展开辟新的方向，引起了许多科学家的关注，并将这类具有抗癌活性的蛋白统称为Parasporin，具体定义为“Bt及其相关细菌产生的无溶血作用但可优先杀死癌细胞的伴胞晶体蛋白”(Kitada S，et al.2005.Victoria B C：Minireview，1-8.)。2006年，成立了以MichioOhba为首的Parasporin分类和命名国际委员会(Committee ofParasporin Classification and Nomenclature)，并构建了抗癌晶体蛋白完善的分类系统。与Cry及Cyt蛋白的分类命名一样，根据氨基酸序列的同源性，把现已发现的Parasporin(PS)蛋白分划为4种不同类型：Parasporin 1-4(http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/intro.html)。通过对目前已有的4类PS进化分析，结果表明它们存在很少的亲缘关系，而这四种PS蛋白在抗癌毒性谱和活性水平上有显著差别。两种分子量较低的蛋白PS2和PS4具有相对较宽的杀细胞谱，每个都能诱导6个人类癌细胞系死亡，而具有典型三域结构的PS3蛋白具有最窄的活性谱，仅对两个癌细胞系HL-60和HepG2存在中度细胞毒性。与Cry和Cyt蛋白的活化相似，Bt菌株合成的抗癌晶体蛋白也属于无活性的原毒素，需要在碱性溶液中经过蛋白酶水解之后才能产生有活性的抗癌蛋白，并且不同的蛋白酶处理对不同菌株蛋白的活化效果也有很大差异。上述四种PS蛋白未经蛋白酶处理时，不具有杀死癌细胞的活性，或由于内源酶的水解活化而具有极低的抗癌活性。

目前的抗癌药物最大的缺陷是不能特异的作用于癌细胞，在杀死癌细胞的同时也会杀死正常体细胞。而活化的Bt抗癌晶体蛋白能区别癌细胞与正常细胞，特异地或优先杀死癌细胞。同时，不同菌株的水解产物对不同的癌细胞的杀伤力也有很大区别。如PS2蛋白能优先杀死来自于肝脏和结肠癌组织的癌细胞，而不影响正常细胞(Akio Ito，et al.2004.J Biol Chem，279(20)：21282-21286.)。它对人肝癌细胞有很强的杀细胞活性，但对人正常肝细胞和人子宫颈癌细胞细胞无毒性作用。抗癌蛋白引发的细胞和线粒体肿胀与Cry杀虫蛋白在体内和体外对鳞翅目和双翅目昆虫细胞引发的症状相似，而Cyt蛋白导致的细胞病变没有经历细胞肿胀阶段而直接裂解(Cooksey K.E.1971.London：Academic Press，247-274.)。

从非杀虫Bt菌株中发现具有识别并特异杀死癌细胞能力的伴胞晶体蛋白意义重大。有必要大规模发掘我国抗癌Bt蛋白新资源，筛选出高效、新型的Bt菌株，以及发现新的抗癌蛋白基因对于推动我国抗癌研究工作的进展以及研发新型的更有效、更安全的抗癌药物都具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新的Bt蛋白Cry62Aa1。

本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。

本发明的第三个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。

本发明提供的菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)ST7，该菌株已于2010年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCCNo.3922。

通过对ST7的毒力测试表明，ST7对鳞翅目、鞘翅目等害虫等均不具有毒力。通过PCR扩增根据抗癌Cry类蛋白基因保守序列设计1对特异引物，扩增其基因组DNA，进一步设计其全长基因引物，克隆得到cry62Aa1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，全长为2046bp，分析表明，GC含量为39.69％，编码681个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry62Aa1。本发明进一步分析了Cry62Aa1蛋白的氨基酸组成(表1)。在softberry网站采用bacterial sigma7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列。Cry62Aa1蛋白的氨基酸组成如表1。该蛋白的活性中心位于(2)区段。

表1 Cry62Aa1蛋白的氨基酸组成

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	5.58	Met(M)：	1.76
Cys(C)：	1.32	Asn(N)：	6.17
				Asp(D)：	5.58	Pro(P)：	4.70
Glu(E)：	4.11	Gln(Q)：	4.70
				Phe(F)：	3.67	Arg(R)：	5.29
Gly(G)：	7.78	Ser(S)：	6.75
				His(H)：	2.06	Thr(T)：	8.52
Ile(I)：	7.05	Val(V)：	5.29
				Lys(K)：	3.96	Trp(W)：	2.35
Leu(L)：	8.37	Tyr(Y)：	4.85

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cry62Aa1的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第22位的Pro替换为Met，将第30位的Ala替换为Ser，将第70位的Ser缺失，将第86位增加一个His或增加Trp，不影响其活性。因此，本发明的Bt蛋白Cry62Aa1还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt蛋白Cry62Aa1同等活性的由Cry62Aa1衍生得到的蛋白质。

本发明基因包括编码所述蛋白Cry62Aa1的核苷酸序列。

本发明提供了编码上述Bt蛋白Cry62Aa1的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的基因和蛋白质可以从菌株ST7中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转cry62Aa1基因的转化体，例如微生物、粮食作物、水果、蔬菜等，使其对人类癌细胞有杀灭活性。

在本发明的一个实施例中，Bt蛋白Cry62Aa1重组表达载体的获得是通过将cry62Aa1基因插入到表达载体pET-32a(+)上构建得到重组表达载体pET-62Aa。

本发明提供了一种含有蛋白Cry62Aa1或其编码基因的抗癌药物。

优选地，上述抗癌药物为抗乳腺癌药物。

本发明还提供了Cry62Aa1蛋白或其编码基因或含有该基因的表达载体在制备抗癌药物中的应用。

本发明提供了Bt蛋白Cry62Aa1或其编码基因或含有该基因的重组表达载体在制备转基因植物或微生物中的应用。

所述的转基因植物为粮食作物、水果、蔬菜。

本发明提供Cry62Aa1蛋白是一种新的Bt蛋白，该蛋白不具有杀虫活性，但对人类癌细胞具有杀灭能力。因此本发明的Bt蛋白Cry62Aa1和编码基因cry62Aa1可用于研制抗癌作用的药物，也可用于制备具有抗癌能力的转基因植物或转基因微生物，为推动我国抗癌研究工作的发展提供新的研究资料，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1是cry62Aa1基因的PCR扩增结果电泳图，其中M.DNAmarker，1.cry62Aa1基因；

图2是重组质粒PET-62Aa的酶切鉴定图，1.重组质粒pET-62Aa，2.BamH I+Sal I双酶切pET-32a，3.BamH I+Sal I双酶切pET-62Aa，4.插入的DNA，M1.DNA marker；

图3是cry62Aa1基因在E.coli BL21(DE3)中的SDS-PAGE检测，其中M.蛋白marker；1.空载体(pET-32a)在E.coii BL21(DE3)中的表达，2.裂解液上清，3.包涵体中的Cry62Aa1蛋白。

图4为Cry62Aa1晶体蛋白对乳腺癌细胞MDA-MB-231的毒杀情况，其中图4A为Cry62Aa1晶体蛋白对人正常T细胞作用的对照，图4B为48h后，凋亡的乳腺癌细胞MDA-MB-231。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 Cry62Aa1基因的克隆

本发明从四川省成都温江地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株ST7，该菌株已于2010年06月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCC No.3922。

通过如下方法克隆得到cry62Aa1基因的全长序列。

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株ST7的总DNA。并设计引物序列如下：

P1：5’-ATGAATCAAAATTGTAAAAAAG-3’

P2：5’-TTATGCCGGAATAAATTCGATTT-3’

25μl PCR反应体系：

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，43℃退火50s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为2kb的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列大小一致。

实施例2 Cry62Aa1蛋白的获得

根据cry62Aa1基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异性引物：cryF：5’-GGAATTCATGAATCAAAATTGTAAAAAAG-3’；cryR：5’-CGCGTCGACTTATTATGCCGGAATAAATTCGATTT-3’，5’端引物下划线部分碱基分别为BamH I和Sal I酶切位点。以ST7质粒DNA为模板进行扩增，扩增的产物采用BamH I和Sal I进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-32a(+)连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，将重组质粒命名为pET-62Aa。重组质粒的酶切电泳验证插入片断大小符合目的片段后(图2)再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)，含重组质粒的重组子命名为E.coli.BL21(62Aa)。然后转接阳性转化子于LB培养基中，在210r/min、37℃培养条件下，当OD₆₀₀值为0.6时，加入0.6mmol/L IPTG进行诱导表达20h。SDS-PAGE分析表明cry62Aa1基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中(图3)，分子量约为70kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。然后利用Ni琼脂糖凝胶(北京康为世纪生物科技有限公司)进行蛋白的纯化。

实施例3 Cry62Aa1蛋白对乳腺癌细胞杀灭活性检测

(1)Cry62Aa1蛋白浓度的测定及其酶处理活化

将实施例2获得的纯化晶体蛋Cry62Aa1 37℃下在裂解液(50mmol/L pH10.0Na₂CO₃，10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA)中溶解60min。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量，并用Lowry法测定蛋白含量为3mg/L。用蛋白酶K处理晶体蛋白，30μg/mL蛋白酶K 37℃作用90min，加入蛋白酶抑制剂1mmol/L PMSF终止酶解反应，最终调节pH至7.2，过滤除菌备用。得到活化的Cry62Aa1蛋白。

(2)Cry62Aa1对乳腺癌细胞杀灭活性检测：将乳腺癌细胞MDA-MB-231(成都晶肽生物科技有限公司)培养于含10％新生小牛血清、100U/ml青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中。分别取MDA-MB-231和人正常T细胞(成都晶肽生物科技有限公司)的对数生长期细胞，以0.25％胰酶与0.02％EDTA混合液(1∶1)消化后制成单细胞悬液，血小板计数器计数，调细胞浓度为1.5×10⁵/ml后接种96孔培养板中，每孔100μl细胞悬液，添加正常T细胞的孔为对照孔，添加MDA-MB-231细胞的孔为处理孔。37℃，5％CO₂，24h后，吸去培养液，每孔分别加入步骤(1)中得到的活化晶体蛋白Cry62Aa1【用含10％新生小牛血清的RPMI1640培养基把步骤(1)获得的蛋白浓度(3mg/L)稀释一倍作为第一个上药浓度，再作五倍梯度稀释，共作8个稀释浓度】的培养液200μl，继续培养48h。然后，每孔加入50ul 50％三氯乙酸(TCA)，4℃放置1h，弃去固定液，用蒸馏水洗5次，轻轻甩干以除去剩余水分。在对照孔和各处理孔加入50ul 0.4％SRB染液，室温放置20min。吸出染液弃去，用1％醋酸溶液洗涤，每孔至少5次，直至无红色染液为止，轻轻甩干以除去残留液体。按200ul/孔加入10mM Tris碱，振荡10-15s，使其充分溶解混匀。用酶标仪在490nm波长处测定各孔吸光度(OD)值。以Cry62Aa1浓度为横轴，吸光度(OD)值为纵轴作图观察药物对乳腺癌细胞生长的影响。再用专用模板Originpro7.0中四参数方程(y＝A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p))计算半数有效抑制浓度(IC₅₀值)。结果表明，晶体蛋白Cry62Aa1对人正常细胞不具有抑制作用，但可使乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡(见图4)，具有杀灭癌细胞的作用，IC₅₀为30.0mg/L。

Claims

1.一种Bt蛋白Cry62Aa1，其氨基酸序列是：

1)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.由权利要求4所述表达载体转化的宿主细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其为植物或微生物宿主细胞。

7.含有权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因的抗癌药物。

8.如权利要求7所述的抗癌药物，其为抗乳腺癌药物。

9.权利要求1所述的蛋白或其编码基因或权利要求4所述表达载体在制备抗癌药物中的应用。

10.权利要求1所述的蛋白或其编码基因或权利要求4所述表达载体在制备转基因植物或转基因微生物中的应用。