CN102405844B - 东亚砂藓组织培养过程中配子体消毒方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种东亚砂藓配子体的消毒方法，步骤如下：（1）取培养一段时间后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段，放到空的培养瓶中，用纱布盖好，放在水龙头下用自来水冲洗几小时；（2）用洗洁精溶液浸泡10min左右，于流水下冲洗30min左右，放到无菌水中浸泡；（3）在超净工作台上用滤纸吸干材料表面水分，放入0.01%-0.1%的升汞溶液中消毒15s-60s；（4）用无菌水反复冲洗7-8次，无菌滤纸吸干表面水分，接种于MS培养基上。本发明消毒方法简单，成本低，既可有效的去除配子体表面所藏大量细菌，又能最大限度的降低对大多为单层细胞的配子体的损伤，保证了后续实验的成功。
Description
技术领域
本发明属于苔藓植物组织培养技术，确切地说是涉及东亚砂藓组织培养过程中配子体的消毒方法。
背景技术
目前，苔藓植物中的小立碗藓在国外已成为研究植物分子生物学的理想实验材料和研究基因功能的模式植物，土生墙藓还成为研究耐旱藓类生理生态和抗旱机理的主要模型。然而与之形成鲜明对比的是国内外有关于紫萼藓科植物的研究报道在却少之又少，为了填补这一空白，我们开展了东亚砂藓配子体再生体系建立方法的课题研究，虽然整个研究过程都进展得比较顺利，并取得了理想的实验效果，然而在研究中我们也遇到了这样一个问题，就是在我们的部分培养试验中所得到的东亚砂藓配子体再生体系很不稳定，通过分析发现其主要原因是出在培养过程中的消毒环节。据此我们曾采用了许多种常规的消毒方法进行弥补，但是其效果都不够理想，因为苔藓植物的配子体与大多数高等植物不同，它是由单层细胞组成的，消毒不彻底染菌率高，消毒过度会褐化死亡，对消毒液的种类、浓度、消毒时间等许多因素都很难把握。多年来有关用配子体作为实验材料的报道之所以特别少见，苔藓植物配子体的消毒困难显然是其中的一个主要原因，通过长时间不断的探索，我们终于取得了突破性的进展，本发明就是对于这项内容所做的具体总结。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合于东亚砂藓配子体的消毒方法，以克服组织培养过程中无法利用孢子体、配子体消毒难的问题。
本发明公开的东亚砂藓组织培养过程中配子体的消毒方法按以下步骤：
（1）取培养一段时间后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段，放到空的培养瓶中，用纱布盖好，放在水龙头下用自来水冲洗几小时；
（2）用洗洁精溶液浸泡10min左右，于流水下冲洗30min左右，于无菌水中冲洗数次；
（3）在超净工作台上用无菌滤纸吸干材料表面水分，放入0.01%-0.1%的升汞溶液中消毒15s-60s；
（4）用无菌水反复冲洗7-8次，无菌滤纸吸干表面水分，接种于MS培养基上。
所述方法中需挑选粗壮、长势好的东亚砂藓，剪成长度为0.5-1cm的小段。
所述方法中浸泡用的洗洁精溶液浓度为1%-2%。
所述方法中灭菌处理用0.02%的升汞处理配子体45s。
本发明消毒方法在解决苔藓植物的配子体方法方面取得了重要的进展，这一成功为东亚砂藓配子体再生体系建立方法的课题研究提供了重要的支持和保证。虽然从技术方面看并不十分复杂，但是却成功地解决了一项长期困扰该项课题的一大难题，克服了以往苔藓植物组织培养中主要以孢子体作为原始材料的弊端，填补了现有技术的空白。本发明消毒方法效果特别好，消毒后的配子体污染率低，损伤率小。同时，本发明消毒方法还有操作简单，成本低，省时省力等优点。
具体实施方式
本发明东亚砂藓组织培养过程中配子体的消毒方法，包括如下步骤：
1．试验材料：试验材料采自于黑龙江省五大连池风景区石龙，现保存于齐齐哈尔大学生命科学与农林学院标本室，编号为20090627。将材料采回后进行培养，选取长势较好的用于实验。
2．试验方法
（1）器材：试验中所用到的镊子、剪刀、培养皿、组培瓶等器材均经过高压蒸汽灭菌法121℃灭菌30min。
（2）培养基的灭菌：所用培养基为MS培养基。采用高压蒸汽灭菌法121℃灭菌15min。
（3）配子体的消毒：选取长势较好的东亚砂藓配子体，自顶端往下依次剪成小段，放到空的培养瓶中，用纱布盖好，放在水龙头下用自来水冲洗几小时；再用洗洁精溶液浸泡10min左右，同时设置对照：不用洗洁精溶液浸泡，流水下冲洗30min左右，于无菌水中冲洗数次，转入超净工作台。在超净工作台上用无菌滤纸吸干材料表面水分，放入0.01%-0.1%的升汞溶液中消毒15s-60s。不同消毒处理如下：
a）0.01% 15s、30s、45s、60s
b）0.02% 15s、30s、45s、60s
c）0.05% 15s、30s、45s、60s
d）0.10% 15s、30s、45s、60s
（4）接种：将消毒完后的材料于无菌水中反复冲洗7-8次，每次至少停留1min钟以上，尽可能洗掉残留的升汞，减少对配子体的损害。每个处理重复3次。
（5）培养：将材料接种于MS培养基上，放入T=20±2℃、光照12h/12h、光强3000-5000lux光照培养箱中进行培养，每天观察其生长情况。
3．结果分析
观察实验现象发现，未用洗洁精溶液浸泡的配子体在接种第二天就有部分染菌，约3天后基本上全部染菌；而用洗洁精溶液浸泡过的配子体在3天后开始部分染菌，总体效果较好。
同时，由表1可以看出，不同消毒液浓度和消毒时间对外植体的污染率和成功率会产生不同的影响。在升汞浓度为0.01%、0.02%时，随着处理时间的延长，污染率降低，成活率升高；在升汞浓度为0.05%、0.1%时，随着处理时间的延长，污染率降低，成活率降低，甚至全部死亡。最后结果得出：将配子体用2%洗洁精溶液浸泡10min后，用0.02%的升汞处理45s消毒效果最佳。
表1 东亚砂藓配子体不同处理方法及结果
| 升汞浓度 | 消毒时间 | 污染率 | 成活率 |
| 0.01% | 15s | 88% | 12% |
| 30s | 72% | 28% | |
| 45s | 54% | 46% | |
| 60s | 40% | 60% | |
| 0.02% | 15s | 44% | 56% |
| 30s | 18% | 72% | |
| 45s | 12% | 76% | |
| 60s | 6% | 76% | |
| 0.05% | 15s | 12% | 70% |
| 30s | 10% | 60% | |
| 45s | 2% | 8% | |
| 60s | 2% | 4% | |
| 0.1% | 15s | 2% | 2% |
| 30s | 2% | 2% | |
| 45s | 0 | 0 | |
| 60s | 0 | 0 |
综上所述，仅是本发明的较佳实例而已，并非对本发明的实施范围进行限制，还可以有许多修饰。凡依据本发明技术对以上实施例进行变形，均属于本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种东亚砂藓配子体的消毒方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）取适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段，放到空的培养瓶中，用纱布盖好，放在水龙头下用自来水冲洗几小时；
（2）用浓度为1-2%洗洁精溶液浸泡10min左右，于流水下冲洗30min左右，于无菌水中冲洗数次；
（3）在超净工作台上用无菌滤纸吸干材料表面水分，放至浓度为0.02%升汞溶液中消毒30-60 s；
（4）用无菌水反复冲洗7-8次，无菌滤纸吸干表面水分，接种于MS培养基上。
2.根据权利要求1 所述的消毒方法，其特征在于：用浓度为0.05%的升汞溶液代替步骤（3）中浓度为0.02%的升汞溶液，消毒时间15-30 s。
3.根据权利要求1 所述的消毒方法，其特征在于：步骤（1）中需挑选粗壮、长势较好的东亚砂藓，剪成长度为0.5-1cm的小段。
4.根据权利要求1 所述的消毒方法，其特征在于：步骤（3）灭菌处理用0.02%的升汞处理配子体40s。
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| 东亚砂藓取材部位对提取其总RAN及DDTR-PCR的影响;沙伟等;《广西植物》;20080531;第28卷(第3期);29-301 * |
| 两种生境下的8种藓类植物茎结构的比较解剖学研究;詹琪芳等;《西北植物学报》;20061231;第26卷(第2期);0217-0225 * |
| 沙伟等.东亚砂藓取材部位对提取其总RAN及DDTR-PCR的影响.《广西植物》.2008,第28卷(第3期),29-301. |
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