CN102405278A - 可切换的亲和力结合剂 - Google Patents

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Abstract

用于结合和释放生物学靶的方法和试剂盒，所述试剂盒包含结合剂，所述结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关。

Description

可切换的亲和力结合剂
相关申请的交叉参考
本申请是2009年2月20日提交的标题为“可切换的亲和力结合剂”的美国临时专利申请号61/153,990的部分继续申请，其通过引用结合到本文中。
背景
本发明一般涉及在暴露于环境线索后亲和力发生改变的亲和力结合剂(如抗体、肽等)。
随着生物学研究、技术和医学的进步，对以温和、不偏倚的形式探索和/或操作生物学方式的改进组合物和方法的需求逐渐增加。例如，新出现的细胞疗法领域将很快需要以让它们保持未修饰和未活化使并发症或无效治疗的危险最小的方式积极地鉴定、纯化和给予理想细胞的能力。辅助这种鉴定和纯化的策略典型地依赖于特异性、高亲和力抗体。例如，DETACHaBeads(Dynal/Invitrogen)是将B和T细胞捕获至抗体涂覆磁珠上的市售获得产品。然后为了辅助给药，通过输入与第一抗体竞争性结合并释放细胞的第二抗体实现细胞释放。另一种产品，Isolex磁性细胞选择系统(Magnetic Cell Selection System)(Baxter)依赖于类似路径将CD34+干细胞捕获至磁珠上。但是，在这种情况下细胞游离发生在加入与珠结合的次级抗体竞争性结合的释放肽之后。尽管已证明这些系统的实用性，但是必需加入另外的试剂增加了时间、成本，并且加入的抗体或肽可能污染细胞产物。
类似地，在筛选用于疾病诊断和治疗确定的生物学样品，以及用于生物学或防御应用的传感器时，靶鉴定受到使用经典的高亲和力结合剂比如抗体的限制，所述结合剂在不损伤样品的情况下难以除去并减小或消除进一步分析的能力。因为这些局限性，所以仍有强劲的动力发展下一代平台用于生物学鉴定和操作，它保持特异性、高亲和力靶结合的功能优越性，但能够以允许生物学样品完整和未修饰的方式根据指令释放靶。
简述
本发明涉及在暴露于特异性环境线索后亲和力发生显著改变的亲和力结合剂(如抗体、肽等)。在一种环境状态下，这些结合剂证明理想靶的高亲和力、高选择性结合，而在第二种状态下它们对相同靶表现低亲和力和最小的结合。这些可切换的亲和力结合剂通过提供从靶的受控附着(attachment)和释放同时保持高亲和力、高选择性结合剂-靶相互作用的优点，比经典亲和力结合剂明显改善。
用于结合和释放细胞的本发明试剂盒的一个实施方案包含结合剂，所述结合剂包含可在结合细胞的高亲和力状态与释放细胞的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；其中结合剂包含亲和体(affibody)、抗体、肽、其片段，或其组合中的一种或多种。
用于结合和释放靶的本发明试剂盒的一个实施方案包含结合剂，所述结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；其中结合剂包含2-螺旋结合剂。靶可包含细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质、核酸、肽、脂质、多糖，或其组合。
用于结合和释放靶的本发明试剂盒的另一个实施方案包含结合剂，所述结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；其中结合剂包含化学上修饰的抗体或其片段。靶可选自细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质、核酸、肽、脂质、多糖，或其组合。
用于结合和释放细胞的本发明方法的一个实例，包括以下步骤：使一种或多种结合剂接触细胞，其中结合剂包含可在结合细胞的高亲和力状态与释放细胞的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；为开关引入触发器以引起细胞与结合剂结合或从结合剂释放。触发器可包含酸、碱、热、光、磁场、电场、还原剂、盐或其组合的一种或多种。结合剂可包含亲和体、抗体、肽、其片段，或其组合中的一种或多种。
用于结合和释放靶的本发明方法的一个实例，包括以下步骤：使一种或多种结合剂接触靶，其中结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关，其中结合剂包含2-螺旋结合剂；为开关启动触发器以引起靶与结合剂结合或从结合剂释放。靶可选自细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质、核酸、肽、脂质、多糖，或其组合。触发器可包含酸、碱、热、光、磁场、电场、还原剂、盐或其组合中的一种或多种。
用于结合和释放靶的本发明方法的另一个实例，包括以下步骤：使一种或多种结合剂接触靶，其中结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关，其中结合剂包含化学上修饰的抗体或其片段；为开关启动触发器以引起靶与结合剂结合或从结合剂释放。靶可选自细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质和核酸。触发器包含酸、碱、热、光、还原剂、盐或其组合中的一种或多种。
用于检测样品中多个靶的本发明方法的一个实例包括以下步骤：将探针应用于样品以结合感兴趣的靶，探针包含结合剂，所述结合剂包含可在不同亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；检测探针；应用外刺激使探针从感兴趣的靶释放；应用第二探针以结合感兴趣的第二靶；检测第二探针；根据需要多次重复步骤c和d。
附图
当参考附图阅读下列详细说明时，将更好地理解本发明的这些及其它特征、方面和优点，在附图中同样的字符代表附图各处同样的元件，其中：
图1是显示比较2-螺旋结合剂与不同类型细胞结合的实例的图。
图2是显示在与CS1、CS4和不可切换的Ab对照温育后结合和释放的SKOV3细胞百分数的实例的图。
图3是显示从包含9∶1比率CHO和SKOV-3细胞的混合细胞群中选择性捕获和释放SKOV-3细胞的实例的图。
图4是显示当CS3-PEG12-生物素/SKOV3复合物固定于Dynal链霉抗生物素珠时细胞的捕获和释放的实例的图。
图5显示当暴露于不同波长的光并让其弛豫不同时间段时SP的光切换异构化实例。
图6是αCD34-SP轭合的UV-Vis分析实例的图。
图7是对固定的抗-CD34MAb细胞捕获的UV-Vis效果实例的图。
图8是与αCD34结合的CTGR-标记KG1a的UV-Vis效果实例的图。
详述
为了更清楚和简明地描述要求保护的本发明主题，为用于下列说明和本文权利要求的具体术语提供下列定义。
如用于本文，术语“分子开关”指可在两种或多种状态之间切换的化学部分。切换可以是可逆或不可逆的。这种状态之间的转换可因对个别或组合给予的包括各种环境因素或配体在内的一种或多种外刺激的反应引起。分子开关的实例包括但不限于pH开关、光致变色、手性光学、宿主-客体开关、热开关、磁开关或电开关。
如用于本文，术语“抗体”指与另一种分子特异性结合从而限定为与另一种分子的特定空间和极性组织互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆或多克隆，可通过本领域熟知的技术比如宿主免疫和收集血清(多克隆)制备，或通过制备连续杂交细胞系和收集分泌的蛋白质(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变体，至少为天然抗体的特异性结合需要的氨基酸序列编码。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各种类别和同型，比如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM。功能性抗体片段可包括能够保持以类似全长抗体的亲和力结合的抗体部分(例如Fab、Fv和F(ab′)2或Fab′)。此外，在适当情况下可使用免疫球蛋白或其片段的凝聚物、聚合物和轭合物，只要基本维持对特定分子的结合亲和力。
如用于本文，术语“结合剂”指可与生物学样品中的一种或多种靶结合的分子。结合剂可与靶特异性结合。合适的结合剂可包括天然或修饰肽、蛋白质(如抗体、亲和体)、多糖(如凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原或半抗原中的一种或多种。合适的结合剂可根据待分析样品和检测可用的靶选择。例如，样品中的靶可包括配体和结合剂可包括受体，或者靶可包括受体和结合剂可包括配体。类似地，靶可包括抗原和结合剂可包括抗体或抗体片段或者反之亦然。在一些实施方案中，靶可包括核酸和结合剂可包括互补核酸。在一些实施方案中，靶和结合剂都可包括能够互相结合的蛋白质。
如用于本文，术语“生物学样品”指从生物学主体获得的样品，包括在体内或体外获得的生物学组织或流体起源的样品。此类样品可以是，但不限于，从包括人在内的哺乳动物离析的体液(如血液、血浆、血清或尿液)、器官、组织、碎片和细胞。生物学样品还可包括包括组织在内的生物学样品切片(如器官或组织的横切面部分)。生物学样品还可包括来自生物学样品的提取物，例如来自生物学流体(如血液或尿液)的抗原。
生物学样品可以是原核起源或真核起源(如昆虫、原虫、鸟、鱼、爬行动物)。在一些实施方案中，生物学样品是哺乳动物(如大鼠、小鼠、牛、狗、猴、豚鼠或家兔)的。在某些实施方案中，生物学样品是灵长类起源(例如黑猩猩或人)。
如用于本文，术语“探针”指具有结合剂和信号发生器的试剂(agent)。在一些实施方案中，探针的结合剂和信号发生器包埋在单个实体(如能够结合靶的放射性或荧光分子)中。在替代实施方案中，结合剂和信号发生器包埋在离散实体(如能够结合靶的初级抗体和能够结合初级抗体的标记次级抗体)中。当结合剂和信号发生器是单独的实体时，可以在单一步骤或多个步骤中将它们应用于生物学样品。
结合剂与结合剂的信号发生器可以直接(如经过掺入结合剂内的放射性标记原子)或间接(如通过连接体，它可包括裂解位点)附着，在单一步骤中应用于生物学样品。在一些实施方案中，结合剂和信号发生器是在应用于生物学样品之前预附着的单独实体，在单一步骤中应用于生物学样品。在其他实施方案中，结合剂和信号发生器是独立应用于生物学样品并合并下列应用的单独实体。
如用于本文，术语“信号发生器”指能够用一种或多种检测技术(如光谱法、量热法、波谱法或目测)提供可检测的信号的分子。可检测的信号的合适实例可包括光学信号和电信号，或放射性信号。信号发生器的实例包括发色团、荧光团、Raman-活性尾或放射性标记中的一种或多种。如上所述，关于探针，在一些实施方案中信号发生器和结合剂可存在于单个实体(如具有荧光标记或放射性标记的靶结合蛋白)中。在其它实施方案中，结合剂和信号发生器是在引入样品之前或之后互相关联的离散实体(如受体蛋白和抗特定受体蛋白的标记抗体)。
如用于本文，术语“荧光团”指化学化合物，当它暴露于特定波长的光而被激发时发射不同波长的光。荧光团可根据它们的发射谱或“颜色”描述。绿色荧光团(例如Cy3、FITC和Oregon绿)的特征可在于它们的发射波长一般在515-540纳米范围。红色荧光团(例如Texas红、Cy5和四甲基罗丹明)的特征可在于它们的发射波长一般在590-690纳米范围。荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸基(isothiocyanato)均二苯乙烯-2，2′二磺酸、吖啶、吖啶和异硫氰酸吖啶的衍生物、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3，5二磺酸酯(Lucifer黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、Brilliant黄、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7-氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)、焰红染料；4′，6-二胺化酰亚氨基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)、5′，5”-二溴焦棓酚-磺酞(溴代焦棓酚红)、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸基苯基)4-甲基香豆素、-、4，4′-二异硫氰酸基二氢-均二苯乙烯-2，2′-二磺酸、4，4′-二异硫氰酸基均二苯乙烯-2，2′-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)、伊红、伊红衍生物比如异硫氰酸伊红、藻红、藻红衍生物比如藻红B和异硫氰酸藻红；乙啡啶；荧光素和衍生物比如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、QFITC(XRITC)；荧光胺衍生物(荧光与胺反应)；IR144；IR1446；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮；邻位甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红、B-藻红蛋白；邻苯二醛衍生物(荧光与胺反应)；芘和衍生物比如芘、丁酸芘和琥珀酰基1-芘丁酸酯；活性红4(Cibacron.RTM.亮红3B-A)、罗丹明和衍生物比如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas红)；N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)；核黄素；玫红酸和镧系元素(lathanide)螯合物衍生物、量子点、菁蓝、pyrelium染料和方酸菁(squaraines)。
如用于本文，术语“固体载体”指可将分析物或结合剂固定其上的物品。结合剂或分析物可以通过物理吸附、通过共价键形成或通过其组合固定在固体载体上。固体载体可包括聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的实例包括膜、微量滴定板、珠、微流芯片、滤器、测试带、载玻片、盖玻片和试管。
如用于本文，术语“特异性结合”指与基本较少识别其他分子相比，两种不同分子其中一种对另一种的特异性识别。分子在其表面上或在空腔内可具有因一种或多种静电相互作用、氢键或疏水相互作用而在两个分子之间产生特异性识别的区域。特异性结合实例包括但不限于抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸相互作用等。在一些实施方案中，在环境条件(即pH为约6-约8和温度为约0℃-约37℃)下结合剂分子对靶可具有不低于约105M-1的内在平衡缔合常数(KA)。
如用于本文，术语“靶或分析物”指当存在于样品中时可被检测或离析的生物学样品或其它感兴趣的样品的组分。靶可以是其中存在天然存在的特异性结合剂(如抗体)或者可制备特异性结合剂(如小分子结合剂或适体)的任何物质。一般来讲，结合剂可通过靶的一个或多个离散化学部分或者靶的三维结构组分(如肽折叠产生的3D结构)与靶结合。靶可包括天然或修饰肽、蛋白质(如抗体、亲和体或适体)、核酸(如多核苷酸、DNA、RNA或适体)；多糖(如凝集素或糖)和脂质中的一种或多种。靶还可包括化学或生物学试剂以及全细胞。
如用于本文，术语“肽”指通过α氨基与相邻氨基酸的羧基之间的肽键互相连接的氨基酸序列。氨基酸可以是标准氨基酸或一些其它非标准氨基酸。一些标准非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和蛋氨酸(Met)。极性中性的氨基酸包括甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asn)和谷氨酰胺(Gln)。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)。带负电荷(酸性)的氨基酸包括门冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。非标准氨基酸可以在体内例如通过翻译后修饰形成，此类氨基酸的一些实例是硒代半胱氨酸和焦赖氨酸(pyrolysine)。肽可以是多种长度，采用它们的中性(不带电荷)形式或比如其盐的形式。肽可以没有修饰比如糖基化、侧链氧化或磷酸化或者包含此类修饰。序列内氨基酸的取代基还可选自氨基酸所属类别的其它成员。合适的肽还可包括由连接于氨基侧链的其它取代基修饰的肽，比如糖基单元、脂质或无机离子比如磷酸根以及链的化学修饰。因此，术语“肽”或其等同物可打算包括经过上述修饰后不破坏其功能性的参考的适当氨基酸序列。
如用于本文，术语“核苷酸”指天然和修饰的磷酸核苷。术语“核苷”指在1′位或在与糖或糖取代基(如碳环或非环部分)的等同位置连接有嘌呤、脱氮嘌呤(deazapurine)、嘧啶或修饰碱基的化合物。核苷可含有糖或糖取代基的2′-脱氧基、2′-羟基或2′，3′-二脱氧基形式以及其它取代形式。磷酸核苷中的糖部分可以是戊糖，比如核糖，磷酸酯化位点可对应于连接于核苷戊糖C-5位的羟基。核苷酸可以是，但不限于，三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)。三磷酸脱氧核糖核苷可以是，但不限于，三磷酸脱氧核糖腺苷(2′-脱氧腺苷5′-三磷酸酯或dATP)、三磷酸脱氧核糖胞苷(2′-脱氧胞嘧啶5′-三磷酸酯或dCTP)、三磷酸脱氧核糖鸟苷(2′-脱氧鸟苷5′-三磷酸酯或dGTP)或三磷酸脱氧核糖胸苷(2′-脱氧胸腺嘧啶5′-三磷酸酯或dTTP)。
术语“寡核苷酸”用于本文指核苷酸或其衍生物的寡聚物。通用于说明书中，每当用字母序列代表寡核苷酸时，核苷酸从左至右是5′→3′顺序。在字母序列中，字母A表示腺苷，C表示胞苷，G表示鸟苷，T表示胸苷，W表示A或T，S表示G或C。N代表随机的核酸碱基(如N可以是A、C、G、U或T中任何一种)。合成的、闭锁的、随机的核苷酸用+N代表，硫代磷酸酯修饰的随机核苷酸用*N代表。
“核酸”或“寡核苷酸”用于本文可以是DNA或RNA，或其类似物(如硫代磷酸酯类似物)。核酸或寡核苷酸还可包括修饰的碱基、主链和/或末端。合成主链的非限制性实例包括硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、磷酸硼烷、氨基磷酸盐、肽核酸、吗啉代、闭锁核酸、木糖核酸或其参看核酸的稳定性和/或其它优点的类似物。
如用于本文，术语细胞指真核和原核细胞，包括各种组织或器官、成熟、不成熟、原始或干细胞衍生的细胞。术语还包括在实验室操作以通过标记、遗传工程或本领域已知的任何其它手段掺入一种或多种理想特性的细胞。
术语“干细胞”包括但不限于胚胎干细胞、成人干细胞、诱导的多能干细胞、癌干细胞、通过体细胞核转移产生的干细胞。干细胞可从血液、骨髓、脂肪或其它组织和器官离析。
术语“感兴趣的分子”或“分析物”可互换使用。在一些实施方案中，感兴趣的分子可通过样品需要的分析或分离的类型和性质确定。在一些实施方案中，分析可提供关于样品中感兴趣分子的存在或不存在的信息。在另一个实施方案中，分析可提供关于样品状态的信息。例如，如果样品包括饮用水样品，则分析可提供关于样品中细菌浓度的信息从而提供样品的可饮用性。类似地，如果样品包括组织样品，则本文公开的方法可用于检测感兴趣的分子，可帮助比较不同类型的细胞或组织，比较不同的发展阶段，检测疾病或异常的存在，确定疾病异常的类型或者研究感兴趣的多种分子之间的相互作用。
在一个实施方案中，可通过分子设计并将环境敏感元件直接掺入结合剂的分子主链内发展可切换的亲和力结合剂。这使结合剂平台成为可能，其中对一组环境改变反应性呈现一致性分子改变(立体重排、电荷等)的特异性元件是保守的，而形成结合/靶识别袋的其它分子元件可改变。这样可将可切换的结合剂支架修饰以识别不同靶，同时保持对特异性环境改变的敏感性。这种路径因为可切换主链元件的保守而呈现改善的释放机制和大小一致性，但通过限制允许改变的亲和力序列的数目和位置增加发展抗理想靶的高亲和力结合剂的难度。
在另一个实施方案中，可通过用本领域技术人员通常已知的任何技术选择或设计抗感兴趣的特异性靶的不可切换的结合剂，然后经过附着环境敏感性部分将所得结合剂在化学上修饰以产生环境应答性可切换的结合剂，制备可切换的亲和力结合剂。本实施方案允许在设计和选择亲和力结合剂时增加柔性，因为一个靶与下一个之间支架部分不必保守，只要存在足够的化学操控性以允许后续修饰。但是，这种在支架主链中的相同柔性规定抗不同靶的结合剂(或甚至抗相同靶的不同结合剂)将对修饰呈现不同的敏感性，因此基于分子开关修饰的效率、位置等对理想环境线索将经常证明不同的敏感性水平。
虽然制备方法可根据所用结合剂支架和发展方法而变化，但可通过选择适当的环境开关将本发明应用于多种亲和力结合剂。可能的亲和力结合剂的非穷尽名单包括抗体、抗体片段、亲和体和肽基结合剂。这些亲和力支架各自呈现不同的优点和缺点，根据预期应用而变化，在文献中已详尽综述。用于一个或多个实施方案的目的时，只要所选亲和力结合剂能够直接或间接加入环境敏感性分子开关，则让使用者判定确切的选择。
用于一个或多个实施方案的目的时，分子或环境开关定义为整合或附属于结合剂的化学部分，对外刺激的反应是经历不同的物理改变(如构象位移、电改变、pI改变等)。通过修饰选择的分子开关可以发展对多种环境线索和多种刺激强度敏感的可切换的结合剂。这些环境刺激可包括但不限于温度、pH、盐/离子浓度、暴露于特定波长的光、引入化学化合物等。除了掺入单一类型开关和使用单一刺激以外，对相同结合剂使用多种类型开关和/或应用多种刺激是可行的。
通过小心地选择，可以进一步鉴定对适度刺激改变和强度反应以便切换前和切换后环境条件都适应于生物学样品比如核酸、蛋白质、细胞、组织和动物的这些开关的亚类。这使它们能够用于原位、计算机生物模拟(in silico)、体外和体内应用，没有使靶损伤或修饰的危险，允许它们用于此类任务比如生物学分离、靶标记和造影、多路分析和传感器。可能的分子开关及其关联优点和缺点已在文献中广泛讨论。用于一个或多个实施方案的目的时，可利用这些中的任何一种，只要可以设计将它们直接整合入所选亲和力结合剂的主链内或间接使其附属于结合剂的手段，而不明显破坏亲和力结合剂识别理想靶的能力。
当构建时，无论利用何种制备方法，所得可切换的亲和力结合剂在一种环境条件下对其靶呈现能够高选择性、高特异性结合的初始亲和力，但在第二种环境条件下证明结合亲和力大幅下降。这种结合亲和力的下降足够充分，以便可通过温和的洗涤步骤将结合剂从其靶除去，让样品处于未修饰、分析前状态。
此类可切换的亲和力结合剂可用于不抑制修饰的亲和力结合剂的初始靶结合或后续靶释放的任何格式。例如，溶液基或固体-固定状态。这包括但不限于使溶液中利用的染料-亲和力结合剂配体直接轭合，比如用于荧光活化细胞分选、活或固定细胞染色，和组织样品染色，以及在固体表面上固定，比如显微镜载玻片、磁或层析珠、流室表面、传感器阵列等。这种柔性允许可切换的亲和力结合剂用于各种应用，包括但不限于细胞和组织分析、细胞和蛋白质分离、可更新的传感器等。
在一些实施方案中，靶包含但不限于一种或多种生物学细胞。例如，细胞可包括原核和真核起源。真核细胞可以是任何分类，包括但不限于昆虫、两栖动物、禽类、哺乳动物和人。合适的人细胞包括临床上有关如来自内胚层、外胚层和中胚层的细胞，比如干细胞、癌细胞和血细胞。
在一些实施方案中，靶包含但不限于一种或多种生物学试剂。例如，生物学试剂可包含病原体、毒素或其组合。生物学试剂可包括阮病毒、微生物(病毒、细菌和真菌)和一些单细胞和多细胞真核生物(例如寄生虫)及其关联毒素。病原体是可引起其宿主(动物或植物)疾病或生病的感染物。病原体可包括细菌、病毒、原虫、真菌、寄生虫或阮病毒中的一种或多种。
在一些实施方案中，分离包含但不限于从天然来源或实验室制备的生物学样品离析蛋白质、抗体或其它生物学试剂。实例包括但不限于治疗蛋白比如胰岛素、治疗或诊断抗体、疫苗、酶或激素。
实施例
用于实施例部分的缩写扩展如下：“min”：分钟；“h”：小时；“s”：秒；“rt”：室温；“mg”：毫克；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克每毫升；“mmol”；毫摩尔；“μL”：微升；“KDa”：千道尔顿；“MALDI-TOF-MS”：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；“HPLC”：高效液相色谱；“(LC-MS)”：液相色谱质谱；“ESI-MS”：电喷射电离质谱；“TFA”：三氟乙酸；“HOAc”：乙酸；“DMSO”：二甲基亚砜；“DMF”：二甲基甲酰胺；“DVB”：二乙烯基苯；“DTT”：二硫苏糖醇；“NMM”：N-甲基吗啉；“HCl”：盐酸；“MeCN”：乙腈；“NHS”：N-羟基琥珀酰亚氨基；“PBS”：磷酸盐缓冲盐水；“SP”：1-(-羧基乙基)-3，3-二甲基-6’-硝基螺(二氢吲哚-2，2’-2H-苯并吡喃)；“MWCO：分子量筛截；“Fmoc”：9-芴基甲基氨基甲酸酯；“HBTU”：邻-苯并三唑-N，N，N’N’-四甲基脲
Figure BPA00001448005100131
六氟磷酸盐；“TIPS”：三异丙基硅烷；“EDT”：乙二硫醇；“Rink酰胺树脂LS”：4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基树脂，100-200目。除非另外提出，否则使用的所有试剂级化学品都是原样使用，Millipore水用于制备所有水溶液。
实施例1生物素-CS1的制备
Figure BPA00001448005100132
用0.2mmol/g取代Rink Amide Resin LS以40-100μmol规模与N-α-Fmoc-保护的氨基酸，用标准固相技术合成线性肽(生物素-GSGSCNKEMRNRYWEAALDPNLNNQQKRAKIRSIYDDPC)。用Symphony肽合成仪(Protein Technologies Inc.)合成肽。使树脂在二氯甲烷中膨胀1小时，接着用DMF洗涤30分钟，此时交换二氯甲烷。每次偶联反应都在室温下进行，用HBTU作为偶联剂和NMM作为碱。对于每一步，以相对于估计的树脂容量为5当量的规模各自递送偶联剂和氨基酸。除了残基2-5以外大多数残基都进行双偶联。单偶联的偶联时间是30分钟(首次偶联为40分钟)，双偶联为2×20分钟。反应不扰乱氨基酸的侧链，将侧链用对酸敏感的基团保护，或者在半胱氨酸的情况下，使用酸和碱稳定的乙酰氨基甲基(Acm)保护。在每次偶联反应后，将N-端Fmoc-保护的胺通过在室温下用20％哌啶在DMF中15分钟脱保护。在最终的氨基酸偶联和N-端Fmoc保护基团脱保护后，用与其它氨基酸残基所用相同程序使生物素轭合。然后将固体载体用DMF洗涤6次，用DCM洗涤6次，通过使氮气穿过反应器干燥50分钟。
裂解和脱保护：通过将载体用每100mg原料树脂(在肽合成开始时)1.2mL比率为94∶2.5∶2.5∶1的TFA∶EDT∶水∶TIPS混合物搅动约2-2.5小时，使肽从载体裂解和侧链脱保护(除了半胱氨酸以外)。通过玻璃绒过滤混合物，用2×0.5mL TFA洗涤树脂。将滤液和洗涤液在固体干冰中冷却，用冷的乙醚(～10-15ml/ml滤液)稀释。将悬浮液在4℃以3000rcf离心10分钟。倾析上清液，使残留物再悬浮于冷的乙醚(～20ml)中，将离心和倾析的过程重复3次。使最后的残留物溶于水中并冻干。以上过程关于每种肽的偏差，和进一步的细节，在下文描述。
氧化(环化：使粗线性肽(6mg)溶于2mL 50％HOAc中。将溶液用18mL 1N HCl稀释。向该溶液内加入244.4μL碘溶液(0.1M，通过使1体积1N(0.5M)I2溶液与4体积50％HOAc混合制备)，将混合物搅拌90分钟。通过滴加1M硫代硫酸钠溶液猝灭反应物，直至没有颜色残留。将所得混合物通过反相HPLC在AKTA净化器上纯化，使用以下方法：0-25％B 6.875CV(柱体积)，25-35％B 41.25CV和35-100％B1.875CV，柱：Xterra MS C18 19×100mm，5μm粒度，流速：10ml/min，缓冲液：A，0.1％TFA在水中，B，0.1％TFA在乙腈(ACN)中。当主峰开始洗脱时，手工收集流分。通过分析HPLC发现单一流分是纯的，将其冻干。MS(单同位素质量)：计算值：4763.2，实测值：4763.8。
实施例2生物素-CS2的制备
Figure BPA00001448005100151
按照关于生物素-CS1描述的同样方式制备线性肽(生物素-VENKCNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPC)。
生物素-CS2的氧化(环化)：生物素-CS2的氧化(环化)按照关于生物素-CS1描述的同样方式进行。将粗混合物最初在SepPak C18 plus柱上纯化，使用阶式梯度，开始用100％0.1％TFA在水中，结束用100％0.1％TFA在乙腈中，每步改变10％至多为50％，然后跳至100％。大多数产物用40％B洗脱。在冻干后，使残留物溶于300uL水中，在分析HPLC上进一步纯化(柱：Xterra C18 4.6×50mm，5μm粒度，流速1ml/min，梯度方法与上文关于生物素CS1纯化运行3次所列相同。将主峰收集、合并和冻干。在冻干后，分析HPLC显示位移返回20.8分钟的单峰。质量(单同位素)：计算值：4919.3，实测值：4920.3。
实施例3 Cy5-CS3的制备
Figure BPA00001448005100152
按照上文关于生物素-CS1的描述制备和纯化线性肽(Cy5-VENKhCNKEMRNRYWEAALDPNLNNQQKRAKIRSIYDDPhC(其中hC代表同型半胱氨酸)染料-标记的线性肽，对染料附着稍加修改。此外对酸敏感的基团(三苯甲基)用于半胱氨酸侧链保护。
染料附着：在最终的氨基酸添加和N-端氨基脱保护后，按照上文关于生物素-CS1的描述洗涤和干燥树脂。将一部分固体载体(10μmol规模)放回肽合成仪上，在二氯甲烷(DCM)中膨胀30分钟，用DCM和DMF各洗涤3次，接着使处理的固体载体悬浮于2mL无水DMF中。向悬浮液内加入约10μL NMM，接着加入Cy5-NHS酯在0.5ml无水DMF中的溶液。将染料容器用0.5ml DMF漂洗，将该溶液也加入反应混合物中。让反应混合物静置过夜，通过使氮气鼓泡穿过悬浮液约每30秒搅动1次。然后让染料溶液排出，在干燥前将载体先后用DMF(9次)和DCM(6次)洗涤。然后将载体用氮气通过30分钟干燥。裂解和脱保护按照上文关于线性生物素-CS1的描述进行。将粗物质用环化生物素-CS1所用方法纯化。
氧化(环化)：尝试用两种方法氧化。在第一种，将一部分来自线性肽纯化的材料溶于4mL 0.01M磷酸钠(pH 7.8)中。在使空气鼓泡穿过溶液2分钟后，将容器用铝箔包裹，顶端用Chemwipe覆盖(让空气循环)。在室温下搅拌混合物，反应用HPLC跟踪。1天后，观察到大约相等比例的两个重叠峰。4天后，反应完成。对样品进行LCMS，显示形成氧化产物(线性肽的观察质量5386.1对5388.7)。
在第二种方法，将来自线性肽纯化的其余材料吸收在9mL 0.01M磷酸钠(pH 7.8)中。向其内加入1mL DMSO，在黑暗中在室温下搅拌混合物。搅拌过夜后，在原料和产物区只观察到单峰。将两批反应混合物合并，用上文描述的相同方法在AKTA净化器上纯化。将流分14和15洗脱的产物合并和冻干以得到蓝色固体。HPLC显示单峰。质量(单同位素)：计算值：5386.5，实测值：5386.1。
实施例4 Cy5-CS4的制备
Figure BPA00001448005100171
按照上文关于Cy5-CS3的描述制备和纯化Cy5-CS4(其中hC代表同型半胱氨酸和iBu代表异丁酸)。所用氧化方法是DMSO促进的氧化。分析HPLC显示97％纯度。质量(单同位素)：计算值：5414.3，实测值：5414.5。
实施例5 Cy5-CS1的制备
按照上文关于Cy5-CS4的描述合成和纯化Cy5-CS1。分析HPLC显示保留时间为8.3分钟的单一物质。质量(单同位素)：计算值：5358.3，实测值5358.6。
实施例6 Cy5-CS5的制备
Figure BPA00001448005100173
按照上文关于Cy5-CS3线性肽中间体的描述合成和纯化Cy5-CS5(Cy5-VENKFNKEMRNRYWEAALDPNLNNQQKRAKIRSIYDDPS)线性肽。将3组流分收集和冻干：流分14-15(纯度96.5％，保留时间为8.9分钟的稍宽的峰)，流分16-19(纯度97.5％，尖峰，保留时间9.4分钟)和流分20-22(纯度98％，保留时间为9.4分钟的尖峰)。质量(单同位素)：计算值：5388.4，实测值：5389.4。这种肽没有半胱氨酸，其合成不涉及环化步骤。
实施例7生物素-LC-LC-CS4的制备
Figure BPA00001448005100181
按照上文关于Cy5标记肽的描述合成生物素-LC-LC-CS4线性肽。使用市售获得的生物素-LC-LC-NHS酯(14mg)和两倍量的树脂(20μmol当量)。用反相HPLC在AKTA净化器上在下列条件下进行纯化：20％B用于6.25CV，20-30％B在35.5CV中，30-100％B在2.5CV中。质量(单同位素)：计算值：5229.3，实测值：5230.6。
生物素-LC-LC-CS4的氧化：将两次柱纯化的合并材料吸收在4.5mL 0.01M磷酸钠(pH 7.8)中。向其内加入450μL DMSO，在室温下将混合物搅拌过夜。过滤反应混合物以除去不溶物，用梯度法(20％B用于25CV，20-30％B在37.5CV中，30-100％B在2.5CV中，柱：Xterra MSC18 19×100mm，流速10ml/min，溶剂A：0.1％TFA/水和溶剂B：0.1％TFA/ACN)在AKTA净化器上纯化。将主要流分用MALDI分析，发现是需要的产物。质量(单同位素)：计算值：5229.3，实测值5227.0。
实施例8生物素-PEG12-CS3的制备
Figure BPA00001448005100182
按照上文关于Cy5-标记肽的描述合成生物素-PEG12-CS3线性肽。使26μmol树脂负载的CS3如上膨胀，然后悬浮于含有15μL NMM的～3mL DMF中。使购自Quanta Biodesign的生物素-PEG12-NHS(80mg)溶于1mL无水DMF中。将其一部分(0.6mL)加入CS3树脂内。按照上文关于染料标记肽的描述进行混合和洗涤。裂解和进一步后处理也按照上文描述进行。
生物素-PEG12-CS3的氧化：使一部分粗生物素-PEG12-CS3(10mg)溶于10mL 0.01M磷酸钠(pH 7.8)缓冲液中。向其内加入1mLDMSO，将混合物在室温下搅拌过夜。反应后接着进行分析HPLC。LC方法：使用的柱，Xterra RP 4.6×50mm，溶剂A 0.1％TFA/水，溶剂B 0.1％TFA/ACN，流速：1mL/min，梯度：0-25％B 30分钟(37.5CV)，25-35％B 30分钟(37.5CV)。在转化至柱体积后将粗混合物在AKTA净化器上用Xterra MS C18 19×100mm柱，用相同的缓冲液和梯度法纯化。流速是10ml/min。将洗脱的产物冻干。HPLC显示单峰。质量：计算值：5572.3，实测值：5573.2。
实施例9生物素-PEG12-CS4的制备
Figure BPA00001448005100191
按照关于生物素-PEG12-CS3描述的同样方式制备生物素-PEG12-CS4线性肽。
生物素-PEG12-CS4的氧化：氧化在比先前大多数氧化反应高2×的稀释度进行，以减少不溶性产物形成(可能由于寡聚化)。使粗生物素-PEG12-CS4(10mg)溶于20mL 0.01M磷酸钠(pH 7.8)中。向其内加入2mL DMSO，在室温下搅拌混合物。2天后，将粗产物过滤，在AKTA上纯化，使用以下方法：0-25％B在37.5CV中，25-35％B在37.5CV中和35-100％B在1.875CV中，柱Xterra MS C18 19×100mm，流速10ml/min，溶剂A：0.1％TFA/水和溶剂B：0.1％TFA/CAN。将单一流分中洗脱的主峰的大部分冻干并用HPLC和MALDI-TOF-MS分析。HPLC显示只有85％的纯度。用分析HPLC进行进一步纯化。质量：计算值：5600.3，实测值5600.5。
实施例10在溶液中2-螺旋肽结合剂的细胞结合和释放的证明
SKOV-3人卵巢细胞(ATCC)用作Her-2表达的阳性对照。根据ATCC方案将SKOV-3细胞培养在具有10％FBS和1％青霉素-链霉素的McCoy5a培养基中。
根据ATCC推荐将中国仓鼠卵巢细胞(CHO，ATCC)培养在补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的F-12K培养基中，用作阴性对照。
为了显影，将细胞在PBS中以1μM终浓度用Cell Tracker绿(Invitrogen)标记。将具有染料的细胞在摇摆器上在37℃温育30分钟，以1000rpm离心，用PBS洗涤1次，以需要的浓度再悬浮于PBS中。
在溶液中的细胞结合：在摇摆的情况下在4℃将SKOV-3和CHO细胞用1％BSA封闭15分钟(200μL总体积/样品)。在摇摆器上在4℃将标记的结合剂或对照标记的抗-Her2 Ab以5μg/mL终浓度加入细胞(106个细胞/样品)内30分钟。通过使细胞以1000rpm自旋5分钟将PBS中未结合和非特异性结合的流分洗掉。然后将样品以200μL总体积保存在4℃1％多聚甲醛(PFA)中。在Beckman Coulter FC500流式细胞仪上分析细胞。
在溶液中的细胞释放：在如上所述结合之后但在贮存于多聚甲醛之前，将用于估计释放分数的样品在摇摆器上在37℃温育30分钟。在37℃温育15分钟后，使细胞自旋向下，除去上清液。然后使细胞小粒在37℃再悬浮于PBS中，进一步在37℃再温育15分钟。最终，使细胞自旋向下，再悬浮于200μL 1％PFA中，在4℃保存。在Beckman Coulter FC500流式细胞仪上分析细胞。
如图1显示，2-螺旋结合剂CS1、3-5的Cy5变体对Her2-表达SKOV-3细胞发生显著性和选择性结合，这些肽对阴性对照CHO细胞系最小结合。
图2比较Cy5-CS1和Cy5-CS4与对照抗-Her2 Ab对SKOV-3细胞的结合和释放。对照Ab保持与细胞完全结合，而肽结合剂在温度提高后表现显著性释放水平。
实施例11在溶液中Cy5-CS4 2-螺旋肽结合剂对混合细胞群中 SKOV-3细胞的结合和释放
SKOV-3按照上文在实施例10的描述制备和标记，然后与未标记的CHO细胞混合以得到10％SKOV-3细胞和90％CHO细胞。接着按照上文实施例10的描述用Cy5-CS4结合剂进行结合和释放研究。
图3证明在非靶向CHO细胞的存在下SKOV-3细胞的选择性捕获，SKOV-3细胞高效率捕获，而CHO细胞保持未结合。
实施例12在固体载体上生物素-PEG12-CS3 2-螺旋肽结合剂的 细胞结合和释放
细胞结合和珠捕获：在加入200μL 5μg/mL生物素-PEG12-CS3结合剂之前，将SKOV-3和CHO细胞(106个细胞每样品)在4℃用1％BSA在PBS中封闭15分钟。然后在轻轻振荡的情况下将该混合物在4℃温育30分钟。然后将样品离心，在PBS中洗涤2次以除去过量、未结合的生物素-PEG12-CS3。在将150μL这种珠浆料加入每种细胞-结合剂混合物内30-60分钟之前，在室温下将Dynal链霉抗生物素磁珠(Invitrogen)用PBS洗涤3次。在温育后，在成像以量化结合的细胞之前，用磁石捕获珠，在4℃洗掉未结合的细胞。
从珠释放细胞：将上述细胞-结合剂-珠混合物从4℃条件移至37℃温育。在37℃温育15分钟后，用磁石将珠拉下，洗掉释放的细胞。在成像以量化任何未释放的细胞之前，再重复1次温育和洗涤。用Typhoon 9410荧光成像系统(GE Healthcare)完成显影。用ImageQuant软件(5.2版本，GE Healthcare)完成荧光的量化。
图4详述细胞的生物素-PEG12-CS3珠-固定的捕获和释放。按照溶液结合和释放数据的趋势，看到该结合剂对SKOV-3细胞的选择性捕获，在37℃温育之后显著比例的结合SKOV-3细胞从珠释放。
实施例13用于细胞结合和释放的αCD34-SP抗体轭合物的制备
SP-NHS合成：用最初由Aizawa，et al.公开的方案的改进版本合成螺吡喃前体分子SP。向配备磁搅拌棒的烧瓶内加入2，3，3-三甲基假吲哚(3.2mL，20mmol)和β-碘代丙酸(4.0g，20mmol)。将所得混合物在80℃加热3小时，然后冷却至室温(rt)，用甲醇(30-50mL)稀释。加入乙酸乙酯(150mL)诱发需要的1-羧基乙基-2，3，3-三甲基假吲哚
Figure BPA00001448005100221
碘化物产物(TMII)沉淀。将这种粉红色固体进一步用过量乙酸乙酯洗涤几次，减压干燥，不进一步纯化即使用。产物鉴定和相对纯度用TLC(5％MeOH/95％CH2Cl2)证实。
然后向干净的反应管内加入悬浮于1.25mL甲基乙基酮(MEK)中的TMII(0.5mg，1.39mmol)，接着加入哌啶(125μL，1.27mmol)。在110℃加热该混合物直至实现TMII完全溶出。然后加入溶于500μLMEK中的5-硝基水杨醛(250mg，1.91mmol)，将所得反应溶液在110℃加热5分钟。让粗产物混合物在室温下过夜，然后在甲醇(10mL)中稀释。加入过量乙酸乙酯(60mL)诱发SP产物沉淀。然后将这种褐色固体过滤，洗涤3次，减压干燥几小时，接着不进一步纯化即使用。
将SP(10mg，26.3μmol在263μL中)的DMF溶液加入干燥的反应瓶内，接着加入二环己基碳二亚胺(DCC)(16mg，79μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(9mg，79μmol)。将反应混合物用石蜡膜密封，避光保护，在室温下搅拌4小时。将所得琥珀色溶液过滤以除去白色固体尿素沉淀物，然后将滤液最终真空浓缩以得到呈油性残留物的SP-NHS。
在HPLC和ESI-MS证实产物鉴定和纯度后，将SP-NHS在无水DMF中稀释至67μM，密封防潮，在-20℃贮存。分析HPLC条件：用10分钟从H2O/0.1％TFA至MeCN/0.1％TFA线性梯度，在具有254和345nm UV监测的Xbridge C18柱，2.5μm，1.0×50mm(Waters)上。SP洗脱在8.0分钟，SP-NHS洗脱在8.4分钟。C25H23N3O7的ESI-MS(计算m/z＝477.15，实测m/z＝477.15)。
用SP修饰αCD34：将购自Lifespan的IgG3，k同型抗-CD34抗-人小鼠单克隆抗体(αCD34，100μg)在4℃在3.5L PBS缓冲液中透析过夜，然后在室温下在3.5L 0.1M NaHCO3，pH 8.3中透析2小时。将所得样品经过离心超滤浓缩至1-3mg/mL(5-17nmol)。用UV-Vis分光光度法和抗已知量抗体的LDS-PAGE蛋白质凝胶电泳确定蛋白质浓度。向20μL该溶液内加入稀释在无水DMF中的1μL等分试样SP-NHS以得到5-5000nM浓度(1-1000摩尔当量SP-NHS相对于1当量全抗体)。将反应混合物在室温下温育2小时，或在4℃温育15小时。随后，将样品用于用PBS/0.05％吐温-20(PBST)平衡的Zeba脱盐自旋柱(Thermo Scientific)，经过上述UV-Vis测量和蛋白质凝胶电泳量化蛋白质回收和修饰程度。将样品在4℃贮存几周，必要时用于后续细胞结合和释放测定。
图5描述由吸光度改变指示SP在丙酮中的光可切换行为。图6显示αCD34、SP-NHS和αCD34-SP的UV-Vis光谱比较。
实施例14 CD34+KG1a细胞的固定αCD34捕获
细胞系和培养条件：根据制造商的方案各自培养人急性骨髓性白血病细胞系KG-1的变体亚系KG-1a(ATCC)以及前髓细胞的细胞系HL-60(ATCC，目录号CCL-240)，维持2×105和1×106个细胞/mL的浓度。简言之，在37℃在5％CO2气氛下将细胞维持在具有20％胎牛血清的Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)(ATCC)中。每周2次或必要时进行传代培养。
微量板细胞结合测定：将天然、修饰或对照的Abs以～1μg/mL稀释在PBS/0.05％吐温-20/0.2％BSA(PBSTB)中，加入(100μL/孔)Reacti-结合蛋白G涂覆的96-孔板(Thermo Scientific)，该板在添加Ab之前刚用PBST洗涤3次。在37℃温育1小时后，除去Ab溶液，将板用PBS/0.1％BSA/2mM EDTA(PBSBE)洗涤3次。
将已知浓度的KG1a或HL-60细胞从培养中取出，离心(1000RPM，5分钟)，用Dulbeco氏PBS(DPBS)洗涤1次，第二次离心。除去洗涤缓冲液后，使细胞再悬浮于10mL DPBS中，然后加入1μL 10mMCellTrackerGreen CFMDA、CellTracker Red CMTPX或CellTrace FarRed DDAO-SE(Invitrogen)的DMSO溶液。将标记反应物在37℃温育30分钟，并在培养管旋转装置(rotisserie)上轻轻地搅动。在离心后，将所得标记细胞用PBSBE洗涤1次，再离心，再悬浮于PBSBE中以得到500个细胞/μL终浓度。标记的细胞立即用于微量板结合测定或避光保护置于冰上，在几小时内使用。
向Ab-涂覆或对照的微量板孔内加入100μL等分试样的标记细胞悬浮液混合物。在温育后，通过用200μL PBSBE轻轻地移液管抽吸将各孔洗涤3次。将最终100μL部分PBSBE加入各孔内用于在Typhoon 9410荧光成像系统(GE Healthcare)上进行荧光读板。用ImageQuant软件(5.2版本，GE Healthcare)完成荧光的量化。
实施例15用CellTracker Green标记的CD34+KG1a细胞的固定 αCD34-SP捕获和UVA-诱导的释放
以实施例14的同样方式进行2块单独微量板的CellTracker Green(CTG)细胞标记和抗体固定。加入细胞后，将一块板在室温下暴露于明视野照明30分钟，而第二块板在室温下暴露于UVA辐射(用台式透照仪365nm)10分钟以及黑暗温育20分钟(也就是说2×5分钟UVA暴露被20分钟黑暗温育分隔)。然后进行3次PBSBE洗涤，然后将所得细胞保留如上显影和量化。
图7清楚地指示相对于未修饰αCD34的类似暴露，在αCD34-SP轭合物对UVA暴露后，靶KG-1a细胞群的释放增强。
实施例16用CellTrace Far Red标记的CD34+KG1a细胞的固定 αCD34-SP捕获和UVA-诱导的释放
按照实施例15的同样方式进行CellTrace Far Red(CTFR)细胞标记、抗体固定和微量板温育和光暴露条件。
图8证明相对于CTG-标记细胞所见，在固定的αCD34-SP暴露于UVA后CTFR-标记KG-1a的释放增强。CTFR共价修饰细胞的外部，推定其扰乱了CD34生物标记与抗体的固有识别。
虽然本文只说明和描述了本发明的某些特征，但本领域技术人员将想到许多修饰和改变。因此，应理解所附权利要求打算涵盖落在本发明真正精神范围内的所有此类修饰和改变。

Claims (15)

1.一种用于结合和释放细胞的试剂盒，所述试剂盒包含，
结合剂，所述结合剂包含可在结合细胞的高亲和力状态与释放细胞的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；其中所述结合剂包含亲和体、抗体、肽、其片段，或其组合中的一种或多种。
2.一种用于结合和释放靶的试剂盒，所述试剂盒包含，
结合剂，所述结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；其中所述结合剂包含2-螺旋结合剂。
3.权利要求2的试剂盒，其中所述靶是细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质、核酸、肽、脂质、多糖，或其组合。
4.一种用于结合和释放靶的试剂盒，所述试剂盒包含，
结合剂，所述结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；其中所述结合剂包含化学修饰的抗体或其片段。
5.权利要求4的试剂盒，其中所述靶选自细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质、核酸、肽、脂质、多糖，或其组合。
6.一种用于结合和释放细胞的方法，所述方法包括，
使一种或多种结合剂接触细胞，其中所述结合剂包含可在结合细胞的高亲和力状态与释放细胞的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；和
为所述开关引入触发器，以引起细胞与结合剂结合或从结合剂释放。
7.权利要求6的方法，其中所述触发器包含酸、碱、热、光、磁场、电场、还原剂、盐或其组合中的一种或多种。
8.权利要求6的方法，其中所述结合剂包含亲和体、抗体、肽、其片段，或其组合中的一种或多种。
9.一种用于结合和释放靶的方法，所述方法包括，
使一种或多种结合剂接触靶，其中所述结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关，其中所述结合剂包含2-螺旋结合剂；和
为所述开关引入触发器，以引起靶与结合剂结合或从结合剂释放。
10.权利要求9的方法，其中所述靶选自细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质、核酸、肽、脂质、多糖，或其组合。
11.权利要求9的方法，其中所述触发器包含酸、碱、热、光、磁场、电场、还原剂、盐或其组合中的一种或多种。
12.一种用于结合和释放靶的方法，所述方法包括，
使一种或多种结合剂接触靶，其中所述结合剂包含可在结合靶的高亲和力状态与释放靶的低亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关，其中所述结合剂包含化学修饰抗体或其片段；
为所述开关引入触发器，以引起靶与结合剂结合或从结合剂释放。
13.权利要求12的方法，其中所述靶选自细胞、病原体、病毒、抗体或抗体片段、蛋白质和核酸。
14.权利要求12的方法，其中所述触发器包含酸、碱、热、光、还原剂、盐或其组合中的一种或多种。
15.一种检测样品中多个靶的方法，所述方法包括以下步骤：
将探针应用于样品以结合感兴趣的靶，所述探针包含结合剂，所述结合剂包含可在不同亲和力状态之间切换的环境反应性分子开关；
检测探针；
应用外刺激使探针从感兴趣的靶释放；
应用第二探针以结合感兴趣的第二靶；
检测第二探针；和
根据需要多次重复步骤c和d。
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