CN103298949A - 生物素衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物素衍生物、使用所述生物素衍生物的方法和包含所述生物素衍生物的试剂盒。在某些实施方案中，所述生物素衍生物可以在低于生物素所要求的苛刻条件下与抗生蛋白链菌素分离。因此，在某些实施方案中，所述生物素衍生物更好地适合用于这样的应用：其中希望在不太苛刻的条件下使生物素衍生物与抗生蛋白链菌素离解，诸如以维持与所述生物素衍生物连接的部分的结构完整性和/或生存力。

Description

生物素衍生物

背景技术

生物素和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素之间的相互作用被认为是实际上不可逆的。生物素对抗生物素蛋白具有约10^-15M的亲和常数或K_D。尽管所述相互作用会提供用于捕获含有生物素的实体的优良方式，在捕获以后释放那些实体需要非常苛刻的条件，诸如强酸、去污剂和/或高温。这样的条件包括，例如，在高盐中煮沸；甲酰胺和EDTA加热至94℃；6M胍，pH1.5；和在有盐、SDS和EDTA存在下加热到至少65℃。这样的条件通常不适合用于纯化蛋白或活细胞或病毒。

发明内容

发明人已经开发了对抗生蛋白链菌素具有降低的亲和力的生物素衍生物。因而，在某些实施方案中，所述生物素衍生物可以在低于生物素所要求的苛刻条件下与抗生蛋白链菌素分离。因此，在某些实施方案中，所述生物素衍生物更好地适合用于这样的应用：其中希望在不太苛刻的条件下使生物素衍生物与抗生蛋白链菌素离解，诸如以维持与所述生物素衍生物连接的部分的结构完整性和/或生存力。

在某些实施方案中，提供了生物素衍生物。在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

Y是O，或者不存在；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板(microplate)和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H；

其中如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H，或者Y是O。

在某些实施方案中，如果R₁是H，那么R₂是衍生基团，且如果R₂是H，那么R₁是衍生基团。在某些实施方案中，R₁是衍生基团。在某些实施方案中，R₁包含1-8个碳原子、1-6个碳原子或1-3个碳原子。在某些实施方案中，R₂是衍生基团。在某些实施方案中，R₂包含1-8个碳原子、1-6个碳原子或1-3个碳原子。在某些实施方案中，X是O。在某些实施方案中，X是S。在某些实施方案中，Y不存在。在某些实施方案中，Y是O。

在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄或-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H。

在某些实施方案中，如果R₁是H，那么R₂是衍生基团，且如果R₂是H，那么R₁是衍生基团。在某些实施方案中，R₁是衍生基团。在某些实施方案中，R₁包含1-8个碳原子、1-6个碳原子或1-3个碳原子。在某些实施方案中，R₂是衍生基团。在某些实施方案中，R₂包含1-8个碳原子、1-6个碳原子或1-3个碳原子。在某些实施方案中，X是O。在某些实施方案中，X是S。在某些实施方案中，R₁和R₂各自是H。

在式I和II的生物素衍生物的某些实施方案中，L不存在。在某些实施方案中，L是接头。在某些实施方案中，L选自聚乙二醇接头和寡肽接头。在某些实施方案中，所述接头包含可检测的部分。在某些实施方案中，所述可检测的部分选自含有生色团的部分、荧光部分、亲和标签、化学发光部分、酶和抗体。在某些实施方案中，所述可检测的部分选自生色团、荧光染料、荧光蛋白、磷光染料、串联染料、颗粒、纳米晶体、半抗原、酶和包含作为放射性同位素的原子的分子。在某些实施方案中，所述可检测的部分选自荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶、和包含作为放射性同位素的原子的分子。在某些实施方案中，L-R₃具有结构：

在某些实施方案中，R₅是H或衍生基团。在某些实施方案中，n是0-20的整数。

在式I和II的某些实施方案中，R₃是-OR₄。在某些实施方案中，R₃是-COOR₄。在某些实施方案中，R₄是H。在某些实施方案中，R₄包含1-8个碳原子、1-6个碳原子或1-3个碳原子。在某些实施方案中，R₄是CH₃。在某些实施方案中，R₃是反应基团。在某些实施方案中，当L是接头时，所述反应基团选自异硫氰酸酯、磺酰氯、4，6-二氯三嗪基、羧酸酯、卤代乙酰基、酰肼、琥珀酰亚胺酯、4-磺酰基-3，5-二氯苯酚酯、马来酰亚胺、碘代乙酰胺、叠氮化物(azide)和炔烃；或者当L不存在时，其选自羟基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基和4-磺酰基-3，5-二氯苯酚。在某些实施方案中，

(a)当L是接头时，R₃是

或者

(b)当L不存在时，R₃是

在某些实施方案中，R₃选自多肽、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

在某些实施方案中，a生物素衍生物对抗生蛋白链菌素具有在1x10^-13M至1x10^-8M之间的亲和力。

在某些实施方案中，提供了包含生物素衍生物和溶剂的组合物。在某些实施方案中，所述溶剂是水性溶剂。

在某些实施方案中，提供了将生物素衍生物固定至固体支持物上的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：使固体支持物与生物素衍生物接触，其中所述固体支持物包含生物素结合部分。在某些实施方案中，所述生物素衍生物对所述生物素结合部分的亲和力小于生物素对所述生物素结合部分的亲和力。在某些实施方案中，所述方法另外包括：使固定化的生物素衍生物与分子接触，所述分子对所述生物素结合部分的亲和力大于所述生物素衍生物对所述生物素结合部分的亲和力。在某些实施方案中，所述分子是生物素。在某些实施方案中，所述分子是生物素多聚体。在某些实施方案中，所述分子是生物素二聚体或生物素三聚体。在某些实施方案中，所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素。在某些实施方案中，所述固体支持物选自聚合物、玻璃、陶瓷、有机硅、金属、纤维素和凝胶的表面。在某些实施方案中，所述固体支持物选自微量培养板、微阵列芯片和微粒。在某些实施方案中，所述生物素衍生物包含选自下述的基团：蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子和细胞。

在某些实施方案中，提供了试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含生物素衍生物和/或含有生物素衍生物的组合物。

在某些实施方案中，提供了制备生物素衍生物的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下述结构的生物素衍生物：

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：使生物素甲酯与劳森试剂反应。

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下述结构的生物素衍生物：

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：(a)使生物素甲酯与劳森试剂反应；和(b)用过氧化氢氧化环硫原子。

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下述结构的生物素衍生物：

其中R₁是衍生基团。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：使生物素甲酯与仲胺反应性的衍生基团反应。在某些实施方案中，所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下述结构的生物素衍生物：

其中R₂是衍生基团。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：(a)使生物素甲酯与仲胺反应性的保护基反应，以制备包含在环氮上的保护基的生物素甲酯；(b)使(a)的产物与仲胺反应性的衍生基团反应；和(c)除去所述保护基。在某些实施方案中，所述仲胺反应性的保护基选自二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)、三苯甲基氯(Trt-Cl)、氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)和氯甲酸烯丙酯(Aloc-Cl)。在某些实施方案中，所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下式的生物素衍生物：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

Y是O，或者不存在；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H；

其中如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H，或者Y是O。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：合成选自下述的生物素衍生物：

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下述结构的生物素衍生物：

其中R₁是衍生基团。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：使脱硫生物素甲酯与仲胺反应性的衍生基团反应。在某些实施方案中，所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下述结构的生物素衍生物：

其中R₂是衍生基团。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：(a)使脱硫生物素甲酯与仲胺反应性的保护基反应；和(b)使(a)的产物与仲胺反应性的衍生基团反应。在某些实施方案中，所述仲胺反应性的保护基选自二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)、三苯甲基氯(Trt-Cl)、氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)、氯甲酸烯丙酯(Aloc-Cl)。在某些实施方案中，所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下述结构的生物素衍生物：

在某些实施方案中，所述方法包括：使脱硫生物素甲酯与劳森试剂反应。

在某些实施方案中，所述方法包括：合成具有下式的生物素衍生物：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：合成选自下述的生物素衍生物：

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：转化选自下述的化合物，以形成生物素衍生物

在某些实施方案中，通过该方法制备的生物素衍生物具有下式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

Y是O，或者不存在；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H；

其中如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H，或者Y是O。

在某些实施方案中，通过该方法制备的生物素衍生物具有下式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H。

附图说明

图1显示了从细胞裂解物混合物中纯化用生物素衍生物21标记的蛋白。图1A显示了下述情况下的荧光标记的蛋白分布：在抗生蛋白链菌素包被的琼脂糖捕获之前和之后(分别是左侧试管和中央试管)，和在从抗生蛋白链菌素包被的琼脂糖释放之后(右侧试管)。图1B显示了下述物质中的蛋白的分离：细胞裂解物混合物(泳道1)，在捕获生物素衍生物标记的蛋白以后的上清液(泳道2)，洗液(泳道3)，和纯化的从抗生蛋白链菌素包被的琼脂糖释放的蛋白(泳道3)。

图2显示了使用与生物素衍生物17连接的抗-CD3抗体从单核细胞集合分离CD3+T细胞。图2A显示了来自单核细胞集合的CD3+T细胞与用生物素衍生物17标记的抗-CD3抗体的结合，其复合物与M280抗生蛋白链菌素Dynabeads结合。图2B显示了分离的CD3+T细胞，其已经从M280抗生蛋白链菌素Dynabeads分离。图2C显示了在CD3+T细胞/抗-CD3抗体复合物解离以后的M280抗生蛋白链菌素Dynabeads(分离的CD3+T细胞复合物的大小显示在图2B中，在图2C中显示的分离的M280抗生蛋白链菌素Dynabeads不是按照与图1A相同的比例尺)。

图3显示了N3′-乙基生物素和在ForteBio系统上的抗生蛋白链菌素之间的结合和解离曲线。

图4显示了用N3’-乙基生物素炔烃118标记的HeLa细胞的荧光显微术。在有作为催化剂的Cu(I)/THPTA存在下，用N3’-乙基生物素炔烃118标记与Ac₄MaNAz补加培养基(上)或未补加培养基(下)一起温育的细胞。显示了得自AF488(左)、核染剂Hoechst33342(中)和归并图像(右)的荧光信号。

图5显示了用N3’-乙基生物素炔烃118标记的HeLa细胞的荧光显微术。在有作为催化剂的Cu(I)/THPTA存在下(第1-3行)或在没有Cu(I)存在下(第4-6行)，用N3’-乙基生物素炔烃118标记与Ac4GlcNAz、Ac4GalNAz或Ac₄MaNAz补加培养基(上)一起温育的细胞。在有作为催化剂的Cu(I)/THPTA存在下，用N3’-乙基生物素炔烃118处理未与Ac4GlcNAz、Ac4GalNAz或Ac₄MaNAz一起温育的细胞，作为对照(第7行)。显示了得自AF488(左)、核染剂Hoechst33342(中)和归并图像(右)的荧光信号。

图6显示了使用点击化学分离糖蛋白。在有Cu(I)/THPTA存在下，与N3′-乙基生物素炔烃118或生物素炔烃一起温育细胞裂解物，用抗生蛋白链菌素琼脂糖捕获，洗涤，并分别用10mM HCl或1％SDS在H₂O中的溶液在95℃洗脱。通过还原4-12％SDS-PAGE凝胶，分析纯化的级分，并用SYPRO-Ruby染色。

图7a)显示了细胞分离工作流程的图解；b)在不同分离阶段的细胞成像。比例条，10μm；和c)分别在分离前、捕获后和释放后，基于3种不同的细胞表面标志物(CD3、CD4和CD8)的细胞的流动直方图。

图8显示了在分离前、捕获后和释放后，基于2种细胞表面标志物(CD3和CD4)的细胞的流动直方图。淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体显示在上面。基于CD3和CD4细胞表面标志物的淋巴细胞亚群显示在下面。

具体实施方式

在本文中使用的部分标题仅仅是为了组织目的，不应解释为限制所述的主题。

除非另有定义，关于本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，单数术语应当包括复数，且复数术语应当包括单数。

关于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养、酶反应和纯化使用的示例性技术是本领域已知的。许多这样的技术和操作描述在，例如，Sambrook等人.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))以及其它地方。另外，化学合成的示例性技术也是本领域已知的。

在本申请中，除非另外说明，“或”的使用是指“和/或”。在多项从属权利要求的背景下，“或”的使用以仅择一方式回引超过一项前述独立权利要求或从属权利要求。并且，术语诸如“元件”或“组分”包括：含有一个单元的元件和组分，以及含有超过一个单元的元件和组分，除非另外特别说明。

生物素衍生物

本发明提供了生物素衍生物，其可用于这样的应用：其中希望在不太苛刻的条件下使生物素衍生物与例如抗生蛋白链菌素离解，或者其中希望不发生这样的解离。本文使用的术语“生物素衍生物”包括、但不限于生物素或脱硫生物素的衍生物，其解离常数小于或大于生物素或脱硫生物素对抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的解离常数。

在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

在某些实施方案中，X是S或O。在某些实施方案中，R₁选自H和衍生基团。在某些实施方案中，R₂选自H和衍生基团。在某些实施方案中，Y是O，或者不存在。在某些实施方案中，L不存在，或者是接头。在某些实施方案中，R₁和R₂中的至少一个是H。在某些实施方案中，如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H。在某些实施方案中，如果X是O，那么Y是O。在某些实施方案中，如果R₁是H，那么R₂是衍生基团。在某些实施方案中，如果R₂是H，那么R₁是衍生基团。在某些实施方案中，R₃选自-RO₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

在某些实施方案中，X是S或O。在某些实施方案中，R₁选自H和衍生基团。在某些实施方案中，R₂选自H和衍生基团。在某些实施方案中，L不存在，或者是接头。在某些实施方案中，如果X是S，那么R₁和R₂中的至少一个是H。在某些实施方案中，如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H。在某些实施方案中，如果R₁是H，那么R₂是衍生基团。在某些实施方案中，如果R₂是H，那么R₁是衍生基团。在某些实施方案中，R₃选自-RO₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

本文使用的术语“衍生基团”表示被取代的或未被取代的直链、支链、环状或它们的组合形式的碳残基，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，且其包含1-12个碳原子(即，C₁-C₁₂)。示例性的饱和基团包括，但不限于：烷基诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基和它们的同系物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。不饱和基团是具有一个或多个双键(诸如烯基)或三键(诸如炔基)的基团。不饱和衍生基团的例子包括，但不限于：乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高级(即，具有更多个碳原子)同系物和异构体。

术语衍生基团包括含有一个或多个选自O、N、Si、P和S的杂原子取代基的基团。示例性的这样的衍生基团包括直链、支链、环状或它们的组合形式的含碳残基，其包含所述数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si、P和S的杂原子，且其中所述氮、磷和/或硫原子可以任选地被氧化，且氮杂原子可以任选地季铵化。在某些实施方案中，一个或多个杂原子可以位于衍生基团的内部位置处，或位于所述衍生基团与分子的其它部分相连的位置处。因而，衍生基团包括，但不限于：烷氧基、烷基氨基和烷硫基。

术语衍生基团也包括这样的基团：其包含被一个或多个卤素取代的碳原子，所述卤素替代一个或多个氢。可以存在于这样的衍生基团中的示例性卤素包括F、Br、Cl和I。

在某些实施方案中，衍生基团包含1-11个碳原子(即，C₁-C₁₁)、1-10个碳原子(即，C₁-C₁₀)、1-9个碳原子(即，C₁-C₉)、1-8个碳原子(即，C₁-C₈)、1-7个碳原子(即，C₁-C₇)、1-6个碳原子(即，C₁-C₆)、1-5个碳原子(即，C₁-C₅)、1-4个碳原子(C₁-C₄)、1-3个碳原子(C₁-C₃)或1-2个碳原子(C₁-C₂)。在某些实施方案中，衍生基团是饱和的或不饱和的直链或支链碳残基。

本文使用的术语“接头”表示，将式I至VI中任一个的生物素衍生物与其它分子相连的化学部分，所述其它分子诸如反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、在细胞表面上的分子、核苷酸、寡核苷酸、小分子、在微量培养板表面上的分子和在微粒表面上的分子。在某些实施方案中，接头是聚合物或生物聚合物。非限制性的示例接头包括聚乙二醇接头和寡肽接头(也简称为肽接头)。许多接头是本领域已知的。本领域技术人员可以根据预期的用途选择合适的接头。

在某些实施方案中，接头包含可检测的部分。

本文使用的术语“可检测的部分”表示便利分子的检测的部分，且其包括通过本领域已知的任何方式可检测的任何部分。非限制性的示例性的可检测的部分包括含生色团的部分、荧光部分、亲和标签、化学发光部分、酶s、抗体和包含作为放射性同位素的原子的分子。许多可检测的部分是本领域已知的，其包括，但不限于：生色团、荧光染料、荧光蛋白、磷光染料、串联染料、颗粒、纳米晶体、半抗原、酶、包含作为放射性同位素的原子的分子或作为放射性同位素的原子。众多荧光染料是本领域技术人员已知的，包括，但不限于：香豆素、菁染料、苯并呋喃、喹啉、喹唑酮、吲哚、氮茚(benzazole)、borapolyazaindacene和呫吨(包括fluoroscein、罗丹明和rhodol)。可检测的部分的存在是可直接地或间接地检测的。例如，可以用辐射计数装置测量的放射性标记；可以用肉眼观察或用分光光度计测量的色素、染料或其它色原体；可以用自旋标记分析仪测量的自旋标记；和荧光部分(荧光团)，其中输出信号通过合适的分子加合物的激发而产生，且其可以通过用被染料吸收的光激发来观察，或者可以用标准的荧光计或成像系统来测量。本领域技术人员可以根据预期的用途选择合适的可检测的部分。

本文使用的术语“反应基团”表示，作为第一分子的一部分的化学部分，所述化学部分能够与作为第二分子的一部分的“互补基团”反应，以在所述第一分子和所述第二分子之间形成共价键。互补基团也可以称作“互补的反应基团”。在某些实施方案中，反应基团是亲电子基团，且互补基团是亲核基团。在某些实施方案中，反应基团是亲核基团，且互补基团是亲电子基团。在某些实施方案中，反应基团是叠氮化物，且互补基团是炔烃。在某些实施方案中，反应基团是炔烃，且互补基团是叠氮化物。术语“炔烃”包括、但不限于：含有末端碳-碳三键的部分，例如，乙炔。该术语也包括、但不限于：含有活化的碳-碳三键的部分，例如，环辛炔和二氟环辛炔、二苯并环辛炔和氮杂-二苯并环辛炔。在某些实施方案中，反应基团是选自式I至VI的分子的一部分。在某些实施方案中，互补基团是第二分子的一部分，所述第二分子选自蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、在细胞表面上的分子、核苷酸、寡核苷酸、小分子、在微量培养板表面上的分子和在微粒表面上的分子。在某些实施方案中，互补基团是胺。

非限制性的示例性的反应基团包括：当L是接头时，异硫氰酸酯、磺酰氯、4，6-二氯三嗪基、羧酸酯、卤代乙酰基(诸如酰基氯)、酰肼、琥珀酰亚胺酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯)、苯酚酯(诸如4-磺酰基-3，5-二氯苯酚酯)、马来酰亚胺、叠氮化物、炔烃和碘代乙酰胺；或当L不存在时，羟基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基和4-磺酰基-3，5-二氯苯酚。非限制性的示例性的反应基团还包括，但不限于：烯烃类、乙炔类、醇类、苯酚类、醚类、氧化物类、卤化物类、醛类、酮类、酯类、胺类、酰胺类、氰酸酯类、异氰酸酯类、硫氰酸酯类、异硫氰酸酯类、肼类、腙类、重氮基、重氮鎓基、硝基、腈类、硫醇类、硫化物类、二硫化物类、亚砜类、砜类、磺酸基、亚磺酸基、缩醛类、缩酮类、酸酐类、硫酸酯类、次磺酸基、异腈类、脒类、酰亚胺类、亚氨酸酯类、硝酮类、羟胺类、肟类、氧肟酸基、硫代氧肟酸基、丙二烯类、原酸酯类、亚硫酸酯类、烯胺类、炔胺类、脲类、假脲类、氨基脲类、碳二亚胺类、氨基甲酸酯类、亚胺类、叠氮化物类、炔烃、偶氮基、氮化偶氮基和亚硝基。

在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

在某些实施方案中，R₁是衍生基团。在某些实施方案中，L不存在，或者是接头。在某些实施方案中，R₃选自-RO₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

在某些实施方案中，R₂是衍生基团。在某些实施方案中，L不存在，或者是接头。在某些实施方案中，R₃选自-RO₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

在某些实施方案中，R₁是衍生基团。在某些实施方案中，L不存在，或者是接头。在某些实施方案中，R₃选自-RO₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

在某些实施方案中，提供了一种生物素衍生物，其具有式：

在某些实施方案中，R₂是衍生基团。在某些实施方案中，L不存在，或者是接头。在某些实施方案中，R₃选自-RO₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

某些非限制性的示例性的生物素衍生物显示在表1、2、3和4中。表1显示了某些非限制性的示例性的生物素衍生物结构，其中L和R₃没有指定。如上面所指出的，L可以不存在，或者可以是接头。许多不同的接头和/或R₃基团可以用于表1的结构中。本领域技术人员可以根据预期的用途选择合适的接头(或选择接头的不存在)和合适的R₃基团。

表2显示了某些非限制性的示例性的生物素衍生物结构，其中R₃基团没有指定。本领域技术人员可以根据预期的用途选择合适的R₃基团。某些接头显示在表2的结构中。那些接头绝不是在例如表1的结构中或在式I至VI中可以使用的可能接头的穷尽。

表3显示了某些非限制性的示例性的生物素衍生物。那些生物素衍生物中的每一种包含反应基团N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯作为R₃。尽管那些结构用NHS来显示，该表示绝不是在例如表1的结构中或在式I至VI中可以使用的可能反应基团或R₃基团的穷尽。

表4显示了某些非限制性的示例性的生物素衍生物。那些结构中的每一种包含酯基团(-COOR₄)，当R₄是H时，其可以是羧酸。

表1：非限制性的示例性的生物素衍生物结构

表2：非限制性的示例性的生物素衍生物结构

表3：非限制性的示例性的生物素衍生物结构

表4：非限制性的示例性的生物素衍生物结构

在某些实施方案中，R₃选自蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。在某些实施方案中，蛋白R₃基团是抗体。这样的抗体可以属于任何种、类或亚型，且包括嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段，诸如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、单结构域抗体(sdAb)等。

在某些实施方案中，R₃是-OR₄，其中R₄选自H和衍生基团。在某些实施方案中，R₄包含1-8个碳原子、1-6个碳原子或1-3个碳原子。在某些实施方案中，R₄是甲基(CH₃)。在某些实施方案中，L不存在，且R₃是-OR₄，其中R₄如上面所定义。参见表4中的非限制性的示例性结构。

合成生物素衍生物的示例性方法

在某些实施方案中，提供了合成式I至VI的生物素衍生物的方法。在本文中(例如，在实施例1-11转杆)描述了非限制性的示例性的合成式I至VI的生物素衍生物的方法。

在某些实施方案中，提供了一种合成生物素衍生物67的方法。

在某些实施方案中，所述方法包括下述步骤：使生物素甲酯与劳森试剂反应，所述劳森试剂具有结构：

在某些实施方案中，所述反应在有机溶剂诸如二甲苯中进行。

在某些实施方案中，使用例如过氧化氢或间氯过氧苯甲酸(mCPBA)，将生物素衍生物67中的环硫原子氧化成砜，以制备生物素衍生物68。

在某些实施方案中，提供了合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₁是衍生基团。在某些实施方案中，所述方法包括：使生物素甲酯与仲胺反应性的衍生基团反应。

本文使用的术语“仲胺反应性的衍生基团”表示这样的衍生基团：其包含促进衍生基团与仲胺的连接的化学部分。在某些实施方案中，所述促进衍生基团与仲胺的连接的化学部分是离去基团。非限制性的示例性的仲胺反应性的衍生基团包括碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。本领域技术人员可以根据要连接的衍生基团和特定用途来选择合适的仲胺反应性的衍生基团。

在某些实施方案中，提供了合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₂是衍生基团。在某些实施方案中，所述方法包括：使生物素甲酯与仲胺反应性的保护基反应。在某些实施方案中，所述方法另外包括：使产物(即，包含在5位氮上的保护基的生物素甲酯)与仲胺反应性的衍生基团反应。在某些实施方案中，所述方法另外包括：除去所述保护基。

本文使用的术语“仲胺反应性的保护基”表示这样的保护基：其包含促进保护基与仲胺的连接的化学部分。在某些实施方案中，所述促进保护基与仲胺的连接的化学部分是离去基团。本文使用的术语“保护基”表示这样的化学部分：其防止反应基团(诸如仲胺)与混合物中的反应性物质反应，其中所述保护基可以在特定条件下除去，所述条件不会在其它方面改变所述保护基连接的生物素衍生物。非限制性的示例性的仲胺反应性的保护基包括：二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)、三苯甲基氯(Trt-Cl)、氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)和氯甲酸烯丙酯(Aloc-Cl)。本领域技术人员可以为特定用途选择合适的仲胺反应性的保护基。

在某些实施方案中，提供了合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₁是衍生基团。在某些实施方案中，所述方法包括：使脱硫生物素甲酯与仲胺反应性的衍生基团反应。

在某些实施方案中，提供了合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₂是衍生基团。在某些实施方案中，所述方法包括：使脱硫生物素甲酯与仲胺反应性的保护基反应。在某些实施方案中，所述方法另外包括：使产物(即，包含在5位氮上的保护基的脱硫生物素甲酯)与仲胺反应性的衍生基团反应。在某些实施方案中，所述方法另外包括：除去所述保护基。

在某些实施方案中，提供了一种合成生物素衍生物79的方法。

在某些实施方案中，所述方法包括：使脱硫生物素甲酯与劳森试剂反应。

在某些实施方案中，用碱(诸如NaOH)处理生物素衍生物的甲酯，以生成生物素衍生物的羧酸。在某些实施方案中，通过使所述羧酸与修饰羧酸的反应基团反应，用反应基团(诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)修饰所述生物素衍生物的羧酸。

本文使用的“修饰羧酸的反应基团”表示这样的反应基团：其包含促进所述反应基团与羧酸的连接的化学部分。非限制性的示例性的修饰羧酸的反应基团包括：

2，2，2-三氟乙酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯；

2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)-1，1，3，3-四甲基异脲鎓四氟硼酸盐；

2，2，2-三氟乙酸全氟苯酯；和

2，2，2-三氟乙酸-2，3，5，6-四氟苯酯。

在某些实施方案中，通过使包含NHS酯的生物素衍生物与包含伯胺的接头基团反应，可以将合适的接头掺入生物素衍生物中。例如，在某些实施方案中，通过使生物素衍生物的NHS酯与下式反应，可以将聚乙二醇接头添加至生物素衍生物上：

其中n是0-20的整数。在某些实施方案中，可以用如上所述的反应基团修饰得到的生物素衍生物的羧酸。可替换地，可以使包含在一个位置处的伯胺和在另一个位置处的反应基团的接头与包含NHS酯的生物素衍生物反应，以便制备包含接头和反应基团的生物素衍生物。

在某些实施方案中，使用在生物素衍生物上的反应基团将所述生物素衍生物与选自下述的部分连接：蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒(连接后，所述分子仍然称作“生物素衍生物”)。使用反应基团将化合物与这种部分连接的许多方法是本领域已知的。此外，本领域技术人员可以根据要与生物素衍生物连接的部分来选择合适的反应基团。例如，在某些实施方案中，可以使用NHS酯反应基团将生物素衍生物与包含伯胺的部分(诸如肽、蛋白、抗体等)连接。在某些实施方案中，可以使用叠氮化物反应基团通过点击化学将生物素衍生物与包含炔烃的部分连接。在某些实施方案中，可以使用炔烃反应基团通过点击化学将生物素衍生物与包含叠氮化物的部分连接。

在某些实施方案中，生物素衍生物的接头包含可检测的部分。在实施例9中显示了非限制性的示例性的将可检测的部分与生物素衍生物的接头基团连接的方法。

使用本文讨论的方法和试剂和/或本领域已知的方法和试剂，本领域技术人员可以合成式I至VI的生物素衍生物。为了制备式I至VI中的任一个的特定生物素衍生物而选择合适的试剂、反应条件、溶剂等，是在本领域的技能内。

示例性的包含生物素衍生物的组合物

在某些实施方案中，提供了包含一种或多种生物素衍生物的组合物。在某些实施方案中，组合物包含在合适的溶剂中的一种或多种生物素衍生物。溶剂包括，但不限于：水性的溶剂、非水性的溶剂和水性的/非水性的溶剂系统。非限制性的示例性的溶剂包括水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种盐和/或一种或多种缓冲剂。许多盐和缓冲剂是本领域已知的。本领域技术人员可以根据预期的用途选择合适的溶剂、一种或多种合适的盐和/或一种或多种合适的缓冲剂。

在某些实施方案中，包含一种或多种生物素衍生物的组合物是干燥的。也就是说，在某些实施方案中，所述组合物不包含溶剂，但是包含除了一种或多种生物素衍生物以外的一种或多种额外组分。在某些实施方案中，包含一种或多种生物素衍生物的干燥的组合物包含一种或多种盐和/或一种或多种缓冲剂。在某些实施方案中，所述干燥的组合物适合用于例如在使用前在溶剂中重构。

示例性的包含生物素衍生物的试剂盒

在某些实施方案中，提供了包含一种或多种生物素衍生物的试剂盒。在某些实施方案中，这样的试剂盒可以包含至少一种组合物，所述组合物包含一种或多种生物素衍生物。在某些实施方案中，在试剂盒中的组合物是上面讨论的干燥的组合物。在某些实施方案中，在试剂盒中的组合物包含上面讨论的溶剂。

在某些实施方案中，试剂盒包含一种或多种额外组分。非限制性的示例性的额外组分包括：样品处理装置(诸如移液器、滴管等)、适合用于不同仪器(诸如比色皿、微孔滴定板等)中的容器、用于特定用途的缓冲液(诸如反应缓冲液、洗脱缓冲液、结合缓冲液等)、其它试剂(诸如用于洗脱生物素衍生物的生物素、抗生蛋白链菌素包被的固体支持物和便利检测的试剂)、以及生物素衍生物的使用说明书。

示例性的使用生物素衍生物的方法

在某些实施方案中，提供了固定化式I至VI中的任一个的生物素衍生物的方法。在某些实施方案中，这样的方法包括：使所述生物素衍生物与包含生物素结合部分的固体支持物接触。在某些实施方案中，所述方法另外包括：从所述生物素结合部分洗脱式I至VI中的任一个的生物素衍生物。

本文使用的“生物素结合部分”表示，特异性地结合生物素的部分。非限制性的示例性的生物素结合部分包括，但不限于：抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、和特异性地结合生物素的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素的衍生物。非限制性的示例性的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素的衍生物包括：含有一个或多个氨基酸置换、缺失和/或修饰的抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素。非限制性的示例性的这样的衍生物参见，例如，美国公开号2008/0255004；PCT公开号WO01/05977；美国专利号6,022,951、6,391,571、6,312,916、6,417,331、6,165,750、6,156,493、5,973,124和5,168,049。

在某些实施方案中，在可能希望以后解离的情况下，选自式I至VI的生物素衍生物的生物素衍生物对生物素结合部分的亲和力小于生物素对所述生物素结合部分的亲和力。因而，在某些实施方案中，选自式I至VI的生物素衍生物的生物素衍生物以大于1x10^-13M的K_D结合生物素结合部分。在某些实施方案中，选自式I至VI的生物素衍生物的生物素衍生物以大于1x10^-13M的K_D结合生物素结合部分。在某些实施方案中，选自式I至VI的生物素衍生物的生物素衍生物以下述K_D结合生物素结合部分：在1x10^-13M至1x10^-8M之间、在1x10^-12M至1x10^-9M之间、或在1x10^-11M至1x10^-9M之间、在10^-13M至10^-4M之间、在10^-12M至10^-4M之间、在10^-11M至10^-4M之间、在10^-10M至10^-4M之间、在10^-9M至10^-4M之间、在10^-8M至10^-4M之间、在10^-7M至10^-4M之间或在10^-6M至10^-4M之间。

在某些实施方案中，在不希望以后解离的情况下，选自式I至VI的生物素衍生物的生物素衍生物对生物素结合部分的亲和力小于或等于1x10^-13M。因而，在某些实施方案中，选自式I至VI的生物素衍生物的生物素衍生物以在约1x10^-13M至约1x10^-15M之间的K_D结合生物素结合部分。

非限制性的示例性的固体支持物包括：聚合物(诸如琼脂糖、琼脂糖、纤维素、硝酸纤维素、海藻酸盐、特氟隆、胶乳、丙烯酰胺、尼龙、塑料、聚苯乙烯、有机硅等)、玻璃、硅石、陶瓷制品和金属。这样的固体支持物可以呈任意形式，诸如颗粒(包括微粒)、薄板、标尺、凝胶、过滤器、膜、微纤维条带、试管、孔、平板(诸如微量培养板，包括6-孔平板、24-孔平板、96-孔平板、384-孔平板等)、纤维、毛细管、梳、移液器尖、微阵列芯片等。在某些实施方案中，所述生物素结合部分与固体支持物的表面结合。在某些实施方案中，所述固体支持物的表面包含不规则的表面，诸如多孔的、微粒的、纤维的、网状的或烧结的表面。

在某些实施方案中，固体支持物选自微量培养板、微阵列芯片和微粒。在某些实施方案中，固体支持物至少部分地由聚合物组成。在某些实施方案中，微粒固体支持物包含单分散或多分散球形珠子。单分散微粒具有基本上均匀的大小(即，它们具有小于5％的直径标准差)，而多分散微粒具有不同的大小。在某些实施方案中，微粒各处由相同的聚合物组成，或者是芯-壳聚合物，其中微粒的芯由一种聚合物组成，外层(或“壳”)由另一种聚合物组成。在某些实施方案中，微粒是磁性的。

在某些实施方案中，生物素结合部分通过所述生物素结合部分的氨基或硫氢基与固体支持物连接。在有些这样的实施方案中，固体支持物的表面包含能够与游离胺或硫氢基反应的基团。非限制性的示例性的这类基团包括：羧基、活化的卤素、活化的2-取代的乙基磺酰基、活化的2-取代的乙基羰基、活化的酯、乙烯基磺酰基、乙烯基羰基、醛、环氧等。有些这样的基团可能需要使用额外反应物来提供能够与游离胺或硫氢基反应的基团。非限制性的示例性的额外反应物包括：溴化氰、羰二咪唑、戊二醛、羟基琥珀酰亚胺、甲苯磺酰氯等。

许多固体支持物是本领域已知的，且本领域技术人员可以根据预期的用途选择合适的固体支持物。类似地，如果不可商购得到含有与其表面连接的生物素结合部分的固体支持物，本领域技术人员可以选择适合用于将生物素结合部分与固体表面连接的方法。示例性的这类方法参见，例如，美国公开号US2008/022004A1。

在某些实施方案中，洗脱包括：使固定化的生物素衍生物与置换分子接触。本文使用的“置换分子”是这样的分子：其对所述生物素结合部分的亲和力大于所述生物素衍生物对所述生物素结合部分的亲和力。这样的分子的非限制性实例是生物素。本文使用的术语“生物素”包括天然生物素和非天然生物素，诸如生物素甲酯和生物素多聚体，包括、但不限于，生物素二聚体和生物素三聚体。非限制性的示例性的生物素包括在下述文献中描述的非天然的生物素：例如，Wilbur等人，Bioconjugate Chem.8：819-32(1997)。在某些实施方案中，生物素以小于1x10^-14M的K_D结合所述生物素结合部分。在某些实施方案中，非天然的生物素比天然生物素更易溶于水性溶剂中。本文使用的术语“天然生物素”表示具有下述结构的生物素：

在某些实施方案中，洗脱包括：在混合下，将固定化的生物素衍生物在室温或在37℃暴露于足以造成释放的浓度(例如，毫摩尔(mM)浓度)的天然生物素或非天然生物素(诸如生物素多聚体)。

在某些实施方案中，本文所述的方法用于检测、鉴定、测定、纯化、分选和/或分离来自样品的实体。在某些实施方案中，将所述实体与生物素衍生物连接，使得它变成式I至VI中的任一个的R₃基团。在某些实施方案中，所述实体选自蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞或微粒。在某些实施方案中，R₃是这样的部分：其可以结合要从样品中分离的实体。

在某些实施方案中，R₃是基于活性的探针，其与特定实体或实体类特异性地相互作用，且在某些实施方案中，其在结合以后变得与实体共价连接。非限制性的示例性的基于活性的探针参见，例如，Bachovchin等人，Nat.Biotech.27：387-394(2009)；Cravatt等人，Ann.Rev.Biochem.77：383-414(2008)；等人，Curr.Pharmac.Des.13：253-261(2007)；Kato等人，Nat.Chem.Biol.1：33-38(2005)；Patricelli等人，Biochem.46：350-358(2007)；Paulick等人，Curr.Opin.Genet.Dev.18：97-106(2008)；Saghatelian等人，PNAS101：10000-10005(2004)；Salisbury等人，J.Am.Chem.Soc.130：2184-2194(2008)；Salisbury等人.PNAS104：1171-1176(2007)；Wright等人，Chem.& Biol.14：1043-1051(2007)；Wright等人，JACS131：10692-10700(2009)；美国专利号6,872,574B2；和美国公开号US2009/0252677A1和US2008/0176841A1。

在有些这样的实施方案中，R₃是结合样品中的实体的抗体。因而，在某些实施方案中，在所述的方法中使用式I至VI中的任一个的生物素衍生物(其中R₃是，例如，抗体或其它实体结合部分)来结合样品中的实体。然后可以根据需要检测、鉴定、测定、纯化、分选和/或分离所述实体。

在某些实施方案中，所述样品是生物样品。这样的生物样品包括，但不限于：血液和血液级分和产品、唾液、淋巴液、胆汁、尿、乳汁、粪便、脊髓液、精液、细胞、蛋白、在其内部或其表面上包含靶蛋白的细胞、细胞提取物、组织样品的流体制品、器官活组织检查样品等。其它示例性的样品包括，但不限于：水样品、土壤样品的流体制品、食物样品等。

在某些实施方案中，本文所述的方法被用于从样品中检测、鉴定、测定、纯化、分选和/或分离细胞和/或病毒。非限制性的示例性的细胞包括：原核和真核细胞，包括哺乳动物细胞、非哺乳动物动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、酵母细胞、原生动物、细菌等。非限制性的示例性的病毒包括：DNA和RNA病毒和逆转录病毒等。在某些实施方案中，所述细胞和/或病毒在所述方法中始终存活。在某些实施方案中，在使用所述方法分选、纯化和/或分离以后，繁殖所述细胞或病毒。在某些实施方案中，如果在应用所述方法以后有至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的细胞和/或病毒存活(即，能够繁殖和/或实现细胞或病毒过程)，则认为所述细胞和/或病毒“保持存活”。

在某些实施方案中，式I至VI中的任一个的生物素衍生物与实体的结合被用于标记实体，例如，用于检测。在某些实施方案中，式I至VI中的任一个的生物素衍生物通过R₃基团与实体结合，所述R₃基团包含实体结合部分。在某些实施方案中，式I至VI中的任一个的生物素衍生物包含可检测的部分作为接头(或L基团)的一部分。因而，在有些这样的实施方案中，在结合以后，通过可检测的部分的结合可以检测所述实体。可以在有或没有通过本文所述方法(诸如生物素衍生物与生物素结合部分的结合)对实体纯化、分选和/或分离存在下(或之前或之后)进行这样的检测。

作为一个非限制性例子，式I至VI中的任一个的生物素衍生物(其包含具有可检测部分的接头和与细胞表面上的因子结合的R₃基团)可以与混合物中的细胞结合。在结合以后，可以在显微镜下检查混合物，以检测可检测的部分与混合物中的细胞的结合。然后可以使所述细胞与微粒接触，所述微粒包含在表面上的生物素结合部分。所述生物素结合部分可以结合式I至VI中的任一个的生物素衍生物，从而导致微粒与混合物中的细胞的结合。然后可以通过所述微粒的某种性质(例如，通过磁性分离或轻轻离心)，可以从所述混合物中分离出细胞。然后可以中断生物素衍生物/生物素结合部分相互作用(即，使用洗脱步骤)。所述细胞将保持与可检测的部分结合，但是不与微粒结合。然后可以根据需要操作细胞，在某些实施方案中，所述可检测的部分仍然结合。

要求保护的发明绝不限于本文例证的实施方案。本领域技术人员可以预见到所述生物素衍生物和方法的许多额外应用。

实施例

下面讨论的实施例意图仅仅是本发明的示例，不应以任何方式认为限制本发明。所述实施例无意表示下面的实验是进行的所有或唯一实验。已经努力确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但是应当考虑有些实验误差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度以摄氏度为单位，压力是在大气压或附近。

实施例1：6-(5-((3aS，4S，6aR)-5，5-二氧代-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊烷酰氨基)己酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物1)的制备

使用过氧化氢将生物素甲酯62氧化成砜63，然后将甲酯水解成游离酸64，将后者转化成NHS酯65。使所述NHS酯65与6-氨基己酸反应，得到66，将后者转化成NHS酯1。

实施例2：5-((3aS，4S，6aR)-5，5-二氧代-2-硫代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物2)的制备

使用劳森试剂(2，4-双(4-甲氧基苯基)-1，3，2，4-二硫杂二磷杂环丁烷2，4-二硫化物)，将生物素甲酯62转化成67。使用过氧化氢将甲酯67氧化成砜68。将甲酯68水解成游离酸69，然后将其转化成NHS酯2。

实施例3：5-((3aS，4S，6aR)-2-硫代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物3)的制备

使用劳森试剂，将生物素甲酯62转化成67。将甲酯67水解成游离酸70，然后将其转化成NHS酯3。

实施例4：5-((3aS，4S，6aR)-1-甲基-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物4)的制备

用碘甲烷将生物素甲酯62选择性地烷基化，得到71。将甲酯71水解成游离酸70，然后将其转化成NHS酯4。

实施例5：5-((3aS，4S，6aR)-3-乙基-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物6)的制备

用二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)选择性地保护生物素甲酯62，得到73，随后用碘乙烷烷基化，得到74。用80％醋酸切割DMTr保护基，得到75。将甲酯75水解成游离酸76，然后将其转化成NHS酯6。

实施例6：21-((3aS，4S，6aR)-3-乙基-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂二十一烷-1-酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物17)的制备

使如上制备的生物素衍生物6与氨基-(PEG)₄-酸反应，得到77，然后将其转化成NHS酯17。

实施例7：6-((4R，5S)-5-甲基-2-硫代咪唑烷-4-基)己酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物18)的制备

用劳森试剂将DSB甲酯78转化成79。将甲酯79水解成游离酸80，然后将其转化成NHS酯18。

实施例8：22-((4R，5S)-5-甲基-2-硫代咪唑烷-4-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂二十二烷-1-酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(生物素衍生物20)的制备

使DSB NHS酯81与氨基-(PEG)₄-酸叔丁酯反应，得到82，用劳森试剂将后者转化成83。用TFA将叔丁酯去保护，得到游离酸84，然后将其转化成NHS酯20。

实施例9：2-(6-氨基-3-iminio-4，5-二磺酸酯基-3H-呫吨-9-基)-5-(((S)-23-(((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-1-((3aS，4S，6aR)-3-乙基-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-5，21-二氧代-9，12，15，18-四氧杂-6，22-二氮杂二十七烷-27-基)氨甲酰基)苯甲酸酯(生物素衍生物21)的制备

使如上制备的生物素衍生物17与L-Lys(Boc)-O^tBu反应，随后用TFA去保护，得到生物素衍生物85。然后使生物素衍生物85与AF488、5-NHS酯反应，随后转化成NHS酯21。

实施例10：N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((3aS，4S，6aR)-3-乙基-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(生物素衍生物23)的制备

使如上制备的生物素衍生物6与化合物86反应，得到生物素衍生物23。

实施例11：5-((3aS，4S，6aR)-3-乙基-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-N-(3，6，9，12-四氧杂十五-14-炔基)戊酰胺(生物素衍生物24)的制备

使如上制备的生物素衍生物6与化合物87反应，得到生物素衍生物24。

实施例12：抗体-连接的生物素衍生物的制备

通过标准方法，制备山羊抗-小鼠IgG(GAM)的一系列生物素衍生物缀合物。参见，例如，Haugland等人，Meth.Mol.Biol.45：205(1995)。在与生物素衍生物缀合之前，用Alexa

染料(Invitrogen)标记山羊抗-小鼠抗体，以便利以后的检测。用本发明的琥珀酰亚胺酯缀合蛋白的一种示例方法如下。在制备需要的缀合物时，本领域技术人员可以改变生物素衍生物与蛋白的比例、蛋白浓度、时间、温度、缓冲液组成等。在0.1M碳酸氢钠中制备～10mg/mL的蛋白溶液。以～10mg/mL，将生物素衍生物溶解在合适的溶剂(诸如DMF或DMSO)中。在搅拌下，将预定量的生物素衍生物加入所述蛋白溶液中。20当量的生物素衍生物与1当量的蛋白的摩尔比是常见的，但是最佳量随具体生物素衍生物而变化，且可以由本领域技术人员确定。将所述反应混合物在室温温育1小时或在冰上温育数小时。通常通过尺寸排阻色谱法，诸如在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Bio-Rad P-30树脂上，使生物素衍生物-蛋白缀合物与游离的未反应的试剂分离开。

抗体-连接的生物素衍生物被称作“1-Ab”、“2-Ab”、“3-Ab等。抗体-连接的生物素衍生物的结构显示在下面的表5中。

实施例13：抗体-连接的生物素衍生物的捕获和分离效率分析

将0.5ml抗体-连接的生物素衍生物(0.1mg/ml，在PBS缓冲液中)与100μl M280抗生蛋白链菌素Dynabeads(10mg/ml)一起温育，并在室温混合10分钟。将试管在磁体上放置1分钟。小心地取出上清液。然后从磁体取下试管，并加入0.5ml PBS缓冲液，通过轻轻抽吸5次，将珠子重新悬浮。将试管在磁体上放置1分钟。小心地取出上清液。将PBS缓冲液洗涤重复2次。从磁体取下试管，并将珠子小心地再悬浮于0.5ml新鲜洗脱缓冲液中，所述洗脱缓冲液含有在PBS中的5mM生物素或5mM二生物素，并在室温混合5分钟。将试管在磁体上放置1分钟。小心地取出上清液。通过上清液的荧光强度，测量捕获和分离效率。

该实验的结果显示在表5中。

表5：抗体-连接的生物素衍生物的捕获和分离效率

实施例14：标记的摩尔比对捕获和分离效率的影响

使用在实施例12中描述的方法，用生物素衍生物14、17和20标记抗体。在生物素衍生物与抗体的不同初始摩尔比，进行标记。然后使用在实施例13中描述的方法来确定标记的初始摩尔比对捕获和分离效率的影响。

该实验的结果显示在表6中。

表6：生物素衍生物与抗体的不同标记摩尔比的捕获和分离效率

结果表明，约10至约30的标记初始摩尔比对生物素衍生物14和17的捕获和分离效率几乎没有影响。对于生物素衍生物20而言，增加标记的摩尔比可以增加捕获和释放效率。

实施例15：使用BioLayer干扰量度法确定速率常数和结合亲和力

在BioLayer干扰量度法(BLI)中，结合在光纤尖部的一层分子会在从该分子层反射的白光中产生干涉图样。结合在光纤尖部的分子的数目的变化，会造成可以测量的该干涉图样的迁移。波长迁移是分子层厚度的直接量度。此外，因为可以实时测量所述迁移，所以可以测定结合和解离速率。参见，例如，Concepcion等人，Combinatorial Chemistry and High ThroughputScreening，12，791-800(2009)；Lotze，等人，美国专利申请20090147264；Abdiche等人，Anal.Biochem.，377(2)，209-217(2008)。

如下使用BLI来测定某些生物素衍生物对抗生蛋白链菌素的速率常数和结合亲和力。在使用之前，将得自ForteBio的抗生蛋白链菌素生物传感器尖部在水中预润湿30min。在动力学缓冲液中在25℃进行所有相互作用分析。给在Octet中使用的96-孔微量培养板的每孔填充200μl样品或缓冲液，并在1000rpm搅拌。将3种不同浓度的抗体-连接的生物素衍生物样品一式两份地加入96-孔微量培养板中，并还将缓冲溶液加入96-孔微量培养板中作为参比对照。如下制备结合曲线：将抗生蛋白链菌素生物传感器尖部浸入样品孔中，并在1000rpm在25℃温育500秒。如下制备解离曲线：将抗生蛋白链菌素生物传感器尖部浸入动力学缓冲液孔中，并在1000rpm在25℃温育500秒。使用Data Analysis Octet软件得到动力学数据。

该实验的结果显示在表7中。

表7：抗体-连接的生物素衍生物的结合常数

生物素衍生物	捕获	分离	KD(M)	Kon(1/Ms)	Kd(1/秒)
						生物素-Ab	100％	0％	5.95x10-15	2.41x107	1.43x10-7
DSB-Ab	98％	10％	3.54x10-13	1.30x106	4.58x10-7
						1-Ab	60％	35％	1.26x10-10	1.30x105	1.65x10-5
3-Ab	86％	75％	4.54x10-10	1.56x105	7.10x10-5
						4-Ab	55％	85％	3.92x10-9	1.03x104	4.04x10-5

10-Ab	76％	92％	1.52x10-9	1.73x105	2.63x10-4
						14-Ab	98％	60％	1.44x10-11	3.43x105	4.91x10-6
21-Ab	97％	99％	2.56x10-11	3.43x105	4.91x10-6
						22-Ab	94％	95％	3.34x10-9	7.85x104	2.62x10-4
11-Ab	90％	92％	5.65x10-10	1.14x105	6.42x10-5
						12-Ab	98％	95％	8.79x10-12	3.61x105	3.17x10-6

结果表明，已经形成了生物素衍生物的动态多样性，具有从1×10^-13M至1×10^-8M的结合亲和力范围。因此，通过选择适当的生物素衍生物，可以得到所需的捕获和分离效率。

实施例16：从细胞裂解物分离抗体-连接的生物素衍生物

为了确定可调的生物素衍生物是否将在细胞裂解物中起作用，选择山羊抗-小鼠IgG/生物素衍生物21缀合物来验证从细胞裂解物的蛋白纯化。如下制备细胞裂解物：将Jurkat细胞(～3×10⁷)悬浮在1ml含有0.5％SDS的Tris缓冲液中，并超声处理1分钟，以制备约2mg/ml总蛋白。将山羊抗-小鼠IgG缀合物21-Ab(100μg)与0.5ml细胞裂解物混合，并涡旋30秒。加入100μl抗生蛋白链菌素包被的琼脂糖，并在室温在翻滚和倾斜下温育5分钟，随后在10,000×g离心3分钟。取出上清液。将1ml PBS缓冲液加给抗生蛋白链菌素珠子，并在室温混合3分钟，随后在10,000×g离心3分钟。取出上清液。将PBS洗涤步骤重复2次。将500μl3mM生物素溶液加给抗生蛋白链菌素珠子，并在室温在翻滚和倾斜下温育5分钟，随后在10,000×g离心3分钟。回收上清液中的山羊抗-小鼠IgG缀合物21-Ab。通过荧光强度测量回收效率。通过蛋白凝胶染色，检查分离的蛋白的纯度。

结果显示在图1中。图1A显示了下述情况下试管中的荧光标记的蛋白分布：在捕获之前和捕获之后，以及在从抗生蛋白链菌素包被的琼脂糖释放之后。图1B显示了细胞裂解物混合物、上清液、洗液和纯化的蛋白的蛋白凝胶染色。

实施例17：从外周血单核细胞分离T细胞

为了确定抗体-连接的生物素衍生物是否可以用于分离CD3+T细胞，用生物素衍生物17标记抗-CD3抗体。使用标准操作，从抗凝固化的外周血或富含白细胞的血沉棕黄层分离出外周血单核细胞(PBMC)。制备分离缓冲液(不含Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其补充了0.1％BSA和2mM EDTA)。以1×10⁸细胞/ml，用分离缓冲液悬浮PBMC。将500μl(～5×10⁷细胞)的PBMC混悬液与25μl用生物素衍生物17标记的抗-CD3抗体在2-8℃混合10分钟。加入2ml分离缓冲液以洗涤细胞，随后在350×g离心8分钟。取出上清液，并抛弃。加入1ml分离缓冲液，并再悬浮细胞沉淀物。

加入75μl再悬浮的M280抗生蛋白链菌素Dynabeads(10mg/ml)，并在室温混合15分钟。将试管在磁体上放置1分钟。小心地取出上清液，并抛弃。从磁体取下试管，加入1ml分离缓冲液，并通过轻轻抽吸5次来悬浮珠子-结合的细胞。将试管在磁体上放置1分钟。小心地取出上清液，并抛弃。从磁体取下试管，并将珠子-结合的细胞再悬浮于1ml新鲜5mM生物素缓冲液在分离缓冲液中的溶液中，并在翻滚和倾斜下在室温温育10分钟。将试管在磁体上放置1分钟，并将含有无珠细胞的上清液转移至新试管，并再次在磁体上放置1分钟，以除去任何残余的珠子。将含有无珠细胞的上清液转移至新试管，并加入2ml分离缓冲液，随后在350×g离心8分钟。抛弃上清液，并将细胞沉淀物再悬浮于优选的培养基(诸如MEM、DMEM或RPMI)中。通过流式细胞计量术，检查分离的CD3+T细胞的生存力和纯度。

结果显示在图2中。图2A显示了与用生物素衍生物17标记的抗-CD3抗体一起温育的单核细胞集合，所述生物素衍生物17然后结合M280抗生蛋白链菌素Dynabeads。图2B显示了在生物素衍生物17从M280抗生蛋白链菌素Dynabeads解离以后，分离的CD3+T细胞。图2C显示了在用生物素溶液洗脱以后，游离的M280抗生蛋白链菌素Dynabeads。在该实验中，通过流式细胞计量术确定，100％的CD3+T细胞被从单核细胞集合除去。此外，80％的CD3+T细胞被回收，且回收的CD3+T细胞是99％纯的。

实施例18：化合物17的AlexaFluor488衍生物的制备

实施例19：化合物117与抗生蛋白链菌素的结合亲和力和结合可逆性

为了评价N3′-乙基生物素与抗生蛋白链菌素的结合亲和力和可逆性，设计了简单的荧光结合和释放测定。简而言之，在pH7.4PBS缓冲液中与M-280抗生蛋白链菌素Dynabeads一起温育N3′-乙基生物素-AF488缀合物117。在室温温育25min以后，从上清液中分离出磁珠，所述上清液用于测量捕获效率，其中测量上清液的荧光强度以确定未被捕获的量。然后，用PBS缓冲液洗涤N3′-乙基生物素117结合的磁珠，以除去弱的或非特异性的结合。如下试验可逆性：在室温在PBS缓冲液中与2mM生物素一起温育N3′-乙基生物素117结合的磁珠5min，然后用磁体浓缩磁珠，并测量溶液中的荧光强度，以确定释放的量。作为对照，还以相同的测定形式试验生物胞素-AF488缀合物。如下所示，N3′-乙基生物素表现出高结合效率，且所述结合在非变性条件下用生物素竞争试剂是完全可逆的。

荧光捕获和释放测定的细节如下。将100μLM280抗生蛋白链菌素Dynabeads(10mg/mL，Invitrogen)转移至1.5mL离心管，并用500μLPBS洗涤3次。加入500μL N3′-乙基生物素-AF488缀合物117(0.2μM在PBS缓冲液中，pH7.4)，并在翻滚和倾斜下在室温混合25分钟。将试管在磁体上放置1分钟，以在磁体上浓缩磁珠。小心地取出上清液，并保存用于通过测量上清液的荧光强度来测量捕获效率。从磁体取下试管，并加入500μLPBS，然后通过轻轻抽吸5次将珠子再悬浮。将试管在磁体上放置1分钟。小心地取出上清液。将PBS洗涤重复另外1次。从磁体取下试管，并将珠子小心地再悬浮于500μL2mM生物素在PBS(pH7.4)中的溶液中，在翻滚和倾斜下在室温混合5分钟。将试管在磁体上放置1分钟。小心地取出上清液，并保存用于通过测量上清液的荧光强度来测量释放效率。

实施例20：速率常数的动力学测量

使用无标记的ForteBio系统，试验N3′-乙基生物素与抗生蛋白链菌素的结合常数和结合与解离速率常数。将N3′-乙基生物素117共价地固定在胺反应性的传感器尖部(得自ForteBio的)上。为了制备结合曲线，将N3′-乙基生物素标记的生物传感器尖部与抗生蛋白链菌素一起在25℃温育。通过在上述的PBS缓冲液中以及在含有2mM生物素的PBS缓冲液中在25℃温育抗生蛋白链菌素结合的传感器尖部，确定解离曲线。如图3所示，N3′-乙基生物素在PBS缓冲液中显示出与抗生蛋白链菌素的快速结合速率(k_on～1.5×10⁵M^-1S^-1)和从抗生蛋白链菌素相对缓慢的解离速率(k_off～1.2×10^-4S^-1)。N3′-乙基生物素的解离常数k_D是约0.8nM。在有2mM生物素存在下，N3′-乙基生物素表现出快速的解离速率(k_off～5.8×10^-2S^-1)，因而导致从抗生蛋白链菌素完全解离。

荧光捕获和释放测定的细节如下。在动力学缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.05％吐温-20，pH7.2)中在25℃进行所有相互作用分析。在使用之前，将得自ForteBio的胺反应性的生物传感器尖部在水中预润湿20min。根据下述样品布局，以200μL/孔，将制备的样品和缓冲液加入96-孔微量培养板中，并将整个96-孔板在1000rpm搅动。用8个生物传感器尖部平行地进行动力学测定。将每个胺反应性的生物传感器尖部在MES缓冲液中平衡5min，然后用EDC/NHS活化5min。用2mM N3′-乙基生物素117将活化的生物传感器尖部标记10min，然后用1M乙醇胺淬灭5min。将N3′-乙基生物素117固定化的生物传感器尖部在动力学缓冲液中温育5min以制备基线，然后在含有2μg/mL抗生蛋白链菌素的动力学缓冲液或动力学缓冲液(对照)中在1000rpm温育10min以制备结合曲线，随后用动力学缓冲液或含有2mM生物素的动力学缓冲液在1000rpm温育10min以制备解离曲线。使用ForteBio Data Analysis Octet软件，通过从参照曲线减去样品曲线来处理所述曲线，并通过拟合曲线来计算动力学数据。

实施例21：化合物21的炔丙基衍生物的制备

实施例22：N3′-乙基生物素炔烃118在生物系统中用于标记、检测和分离的用途

使用叠氮基糖标记系统来证实N3′-乙基生物素炔烃118在生物系统中用于有效标记、检测和分离的能力。

细胞中的蛋白标记和检测

在4个100mm组织培养皿中，在玻璃盖玻片上，在补充了10mL10％胎牛血清(FBS)的最低基础培养基(MEM)中培养HeLa细胞。向每个组织培养皿中，分别加入10μLAc₄GlcNAz(100mM在DMSO中的溶液)、Ac₄GalNAz(100mM在DMSO中的溶液)、Ac₄ManNAz(100mM在DMSO中的溶液；Life Technologies，San Diego，CA，SKU编号分别为C33367、C33367和CC33366)和DMSO。将所述培养皿在37℃保湿培养箱中在5％CO₂下温育24h。温育以后，除去培养基，并用10mL含1％FBS的DPBS洗涤HeLa细胞2次。然后，用3.7％甲醛在PBS中的溶液在室温固定HeLa细胞15min，并用10mL含1％FBS的DPBS洗涤1次。用0.5％Triton X-100在PBS中的溶液将HeLa细胞在室温渗透化处理15min，然后用10mL含1％FBS的DPBS洗涤1次。在有100μM CuSO₄、500μM三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)和2.5mM抗坏血酸钠于DPBS(含有1％FBS)中的溶液存在下，用10μM N3′-乙基生物素炔烃118在室温标记HeLa细胞30min。对于对照实验，也用10μM N3′-乙基生物素炔烃118(不含CuSO₄)标记HeLa细胞。在标记以后，用含1％FBS的DPBS再洗涤HeLa细胞2次，并在含1％FBS的DPBS中与核染剂Hoechst33342(1∶5000稀释度)一起温育10min。用含1％FBS的DPBS洗涤细胞3次，并用eH₂O洗涤1次。将盖玻片风干以后，在Cytoseal中将盖玻片固定在显微载玻片上。在Zeiss Axioskop2荧光显微镜上捕获荧光图像，所述显微镜具有40×物镜，配有Hamamatsu ORCA-ER CCD照相机，其使用得自Omega Optical的激发和发射滤光片。使用365±5nm带通滤光片(对于激发)和400±5nm截止滤光片(对于发射)，将核染剂Hoechst33342成像。使用480±10nm带通滤光片(对于激发)和510±10nm带通滤光片(对于发射)，将Alexa Fluor488荧光团成像。对于核染剂和Alexa Fluor488(AF488)染料通道，分别使用20和50ms的曝光时间进行图像收集。使用Slidebook软件以相同的均化处理所有原始图像。

如图4所示，与未用叠氮基糖温育的对照细胞相比，用叠氮基糖温育的细胞表现出增加的荧光信号，并且指示，通过三唑键的形成而用N3′-乙基生物素炔烃118标记细胞。仅在有催化剂Cu(I)和叠氮基聚糖二者存在下观察到荧光信号的增强。Cu(I)螯合配体THPTA会促进反应和保护蛋白损伤，但是并非细胞标记所必需的。如图4所示，在有作为催化剂的Cu(I)/THPTA存在下，与Ac4MaNAz补加培养基(上)或未补加培养基(下)一起温育的细胞被N3’-乙基生物素炔烃118标记。显示了得自AF488(左)、核染剂Hoechst33342(中)和归并图像(右)的荧光信号。这些结果证实，N3′-乙基生物素炔烃118对于细胞中的标记和检测而言是有效的试剂。

蛋白分离

为了从细胞混合物中分离出含有糖蛋白的叠氮基糖，在Ac₄GlcNAz补加培养基中培养Jurkat细胞24h。在该培养过程中，在2个T175组织培养瓶中，在100mL补充了10％FBS的RPMI1640培养基中培养Jurkat细胞。当细胞密度达到～10×10⁶细胞/mL时，分别加入100μL Ac₄GlcNAz(100mM在DMSO中的溶液)和DMSO(对照)。将烧瓶在37℃保湿培养箱中在5％CO₂下温育24h。温育以后，通过在600×g离心5min，收集Jurkat细胞，并用PBS洗涤5次。将细胞沉淀物悬浮于PBS中，以调节细胞密度在50×10⁶细胞/mL，并将各1mL转移至1.5mL试管。通过再在600×g离心5min，收集细胞。然后，将1mL0.5％SDS/PBS加入每个试管中，并通过超声处理进行裂解。在0.5％SDS/PBS中制备～3mg/mL的细胞裂解物。

如下所述，在有CuSO₄、THPTA和抗坏血酸钠存在下，与N3’-乙基生物素炔烃118或生物素炔烃一起在室温温育细胞裂解物。使用N3′-乙基生物素炔烃118和生物素炔烃(Invitrogen)进行平行的蛋白富集实验。生物素炔烃具有结构：

在0.5％SDS/PBS中，在有0.5mM CuSO₄、2.5mM THPTA和5mM抗坏血酸钠存在下，分别与50μM N3′-乙基生物素炔烃118或生物素炔烃一起在室温温育细胞裂解物(500μL，Ac₄GlcNAz处理过或未处理过)1h。对于对照实验，还在没有CuSO₄存在下分别与50μM N3′-乙基生物素炔烃118或生物素炔烃一起温育细胞裂解物。

在点击标记(click labeling)以后，用抗生蛋白链菌素琼脂糖在室温富集蛋白。在温育以进行点击标记以后，将500μLMeOH和150μLCHCl₃加入每个试管中。涡旋试管，并在10,000rpm离心4min。除去溶液，并用MeOH洗涤沉淀物5次，然后重新溶解在500μL0.5％SDS/PBS中。将200μL抗生蛋白链菌素琼脂糖(Invitrogen)加入每个试管中，并在室温温育1h。将琼脂糖珠子转移至2mL旋转柱(Bio-Rad)，并用2mL TEST(10mMTris，1mM EDTA，1M NaCl，0.1％吐温-20，pH7.4)洗涤5次。在洗涤步骤以后，使用2mM生物素或10mM HCl在H₂O中的溶液(1mL×3)，从抗生蛋白链菌素琼脂糖洗脱被N3′-乙基生物素炔烃118标记的蛋白；通过在1％SDS于H₂O中的溶液中在95℃加热蛋白-结合的抗生蛋白链菌素琼脂糖5min，洗脱被生物素炔烃标记的蛋白。收集洗脱液，并在真空离心蒸发浓缩器(speed vac)中干燥。

作为对照，还在没有Cu(I)催化剂存在下与N3’-乙基生物素炔烃118或生物素炔烃一起温育细胞裂解物。另一种对照是，使用未处理的细胞裂解物进行相同的分离操作。

如图6所示，使用N3′-乙基生物素炔烃118，没有Cu(I)催化剂和没有Ac₄GlcNAz处理的对照实验表现出非常低的背景，这指示，通过三唑键的形成来用N3′-乙基生物素炔烃118进行标记，随后通过N3′-乙基生物素与抗生蛋白链菌素的相互作用来用抗生蛋白链菌素琼脂糖进行捕获，可以选择性地分离含有叠氮基的糖蛋白。使用生物素炔烃的一个重要问题是，分离的蛋白被抗生蛋白链菌素(SA)污染，所述抗生蛋白链菌素(SA)在苛刻的变性条件下从琼脂糖珠子浸出。这些结果证实，在缓慢释放以分离出清洁蛋白用于下游分析方面，使用N3′-乙基生物素具有巨大优点。

实施例23：使用抗生蛋白链菌素-N3’-乙基生物素系统进行细胞分离

申请人已经鉴别出某些生物素类似物，它们表现出与抗生蛋白链菌素的最佳可逆相互作用，所述相互作用在温和生理条件下允许(1)快速且完全的结合和(2)快速且完全的释放。鉴别的生物素类似物之一被命名为N3′-乙基生物素(k_D～0.8nM)，其在有1mM二生物素竞争试剂存在下具有快速的结合速率(k_on～1.5×10⁵M^-1S^-1)以及快速的解离速率(koff～5.8×10^-2S^-1)。相反，生物素在相同条件下是几乎不可逆的。N3′-乙基生物素和抗生蛋白链菌素之间的这些可逆相互作用会提供将N3′-乙基生物素化的抗体可逆地固定化在抗生蛋白链菌素磁珠上用于细胞分离用途的独特方法。

为了评价使用抗生蛋白链菌素-N3′-乙基生物素系统的细胞分离效率，首先用小鼠抗-人CDx单克隆抗体(mAb)缀合N3′-乙基生物素17(显示在下面)。还用AlexaFluor488(AF488)标记mAb，以允许流式细胞计量术分析。

用N3′-乙基生物素标记抗体的一般规程

在0.1M碳酸氢钠中制备～3mg/mL的抗体溶液(第一抗体和第二抗体)。以～20mg/mL，将N3′-乙基生物素琥珀酰亚胺酯17溶解在DMSO中。在(磁力)搅拌下在大气压下，分别将10、20和30当量摩尔比的N3′-乙基生物素琥珀酰亚胺酯17加入蛋白溶液中。将所述反应混合物在室温温育1小时。使用用磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡过的BIO-RAD P-30树脂，通过旋转柱纯化N3′-乙基生物素-抗体缀合物。

用AlexaFluor染料标记抗体的一般规程

在0.1M碳酸氢钠中制备～3mg/mL的抗体溶液(第一抗体和第二抗体)。以～10mg/mL，将染料琥珀酰亚胺酯溶解在DMSO中。使用20当量摩尔比的

琥珀酰亚胺酯(Life Technologies，San Diego，CA，SKU#A20000)，而对于

琥珀酰亚胺酯(LifeTechnologies，San Diego，CA，SKU#A20006)，使用8的摩尔比。在(磁力)搅拌下在大气压下，将琥珀酰亚胺酯加入蛋白溶液中。将所述反应混合物在室温温育1小时。使用用磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡过的树脂，通过旋转柱纯化

染料-抗体缀合物。

标记程度的测量

N3′-乙基生物素的标记程度(DOL)的确定

使用可商业得到的

生物素定量测定试剂盒(LifeTechnologies，San Diego，CA，SKU#F30755)，试验了在抗体缀合物中的可利用的生物素类似物的确定。简而言之，将2mL HABA/抗生物素蛋白复合物加入2个单独的试管中。向每个试管中，分别加入100μLPBS和N3′-乙基生物素-抗体缀合物，并在轻轻搅拌下温育10min。在500nm测量两个样品的吸光度，并计算2个样品之间的吸光度差异(ABS＝空白吸光度-样品吸光度)。使用下述方程式，计算生物素类似物的标记程度(DOL)：

DOL＝(ABS×BSF×蛋白分子量×1000)/(C×0.05)

BSF：换算因子(2.37×10^-8)；

C：蛋白浓度(mg/mL)。

AF488和AF647的标记程度(DOI)的确定

一种用于估测标记程度(DOL)的简单方法是，通过直接测量在280nm的蛋白吸光度和在吸收最大值的AF488染料(AF647染料)吸光度来确定。如下计算蛋白浓度：

其中典型IgG在280nm的摩尔消光系数(ε)是203,000cm^-1M^-1。AF488染料在494nm的摩尔消光系数(ε)是71,000cm^-1M^-1，AF488染料的校正因子(X)是0.11。AF647染料在649nm的摩尔消光系数(ε)是240,000cm^-1M^-1，AF647染料的校正因子(X)是0.03。

如下计算标记程度(DOL)：

细胞的制备

用人周围T淋巴细胞(CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺细胞)的细胞模型系统，评价细胞分离。

通过NH₄Cl裂解，从得自健康志愿者供体的人外周血制备人外周血单核细胞(PBMC)。在37℃水浴中预温热NH₄Cl裂解缓冲液(150mM NH₄Cl，10mM NaHCO₃和1mM EDTA)。将各自5mL全血与45mL NH₄Cl裂解缓冲液一起加入50mL离心管中，并在室温搅拌15min。将样品在350×g离心5min，并用移液器除去上清液。将细胞沉淀物再悬浮于15mL分离缓冲液(DPBS，0.1％BSA，2mM EDTA)中，并再在350×g离心5min。用移液器除去上清液，并将细胞沉淀物再悬浮于2mL分离缓冲液中。计数细胞，并调节细胞浓度至3×10⁷细胞/mL。

细胞分离的一般规程

简而言之，首先分别与小鼠抗-人CDx(CD3、CD4和CD8)mAb-N3′-乙基生物素17缀合物一起在冰上温育PBMC(3×10⁷细胞)10min。然后，加入抗生蛋白链菌素M280

磁珠(Life Technologies，San Diego，CA，SKU#112-05D)，并在翻滚和倾斜下在室温温育10min。将细胞混合物在磁体上放置1min，并取出上清液。洗涤磁性标记的细胞，然后通过与1mM二生物素一起温育5min，从磁珠释放细胞。通过自动化细胞计数器(Life Technologies，San Diego，CA，SKU#C10227)，测量分离的细胞的量和生存力。通过流式细胞计量术，分析细胞的分离效率和纯度。结果总结在图7和下表中。通过证实基于3种不同的细胞表面标志物进行细胞分离的可行性，已经开发了简单的工作流程(2步温育、1步洗涤和1步分离，图7a)。全细胞分离过

以在小于30min内实现，以达到高回收率(＞80％)、高纯度(＞92％)和高生存力(＞92％)。通过使用抗生蛋白链菌素M280Dynalbeads，用多个磁珠通过N3′-乙基生物素和抗生蛋白链菌素之间的相互作用而捕获每个靶细胞(图7b)，且可以通过简单的磁体而容易地分离(图7b)，以实现高分离效率(98-100％，图7c)。使用1mM二生物素在生理条件下从抗生蛋白链菌素磁珠快速且完全地释放N3′-乙基生物素化的mAb，以实现细胞的高回收率、高纯度和高生存力(图7c)。

分离的细胞的回收率、纯度和生存力

[a]将每个回收率和生存力报告为独立的一式三份实验的平均值，所述实验基于

测量。

[b]将每个纯度报告为基于流式细胞计量术测量的独立的一式三份实验的平均值。误差棒代表独立的一式三份实验的标准差。

方法1：

向在15mL离心管中的1mL PBMC(～3×10⁷细胞)中，加入2μL小鼠抗-人CDx mAb-N3′-乙基生物素17缀合物(1mg/mL，在PBS中)，并在冰上温育10min。然后，加入10mL分离缓冲液，并在350×g离心5min。用移液器小心地取出8mL上清液，并抛弃，并加入70μL抗生蛋白链菌素

磁珠(15mg/mL)，并在翻滚和倾斜下在室温温育10min。将试管在磁体上放置1min，并取出上清液。然后，从磁体取下试管，并加入5mL分离缓冲液，并通过轻轻抽吸5次再悬浮珠子-结合的细胞。将试管在磁体上放置1min，并取出上清液。重复洗涤步骤2次。3次洗涤以后，加入1mL释放缓冲液(1mM二生物素在分离缓冲液中)，并在翻滚和倾斜下在室温温育5min。通过抽吸10次，混合所述悬浮液，并将试管在磁体上放置1min。将含有无珠细胞的上清液转移至新试管，并在350×g离心5min。取出上清液，并抛弃，将细胞沉淀物悬浮于1mL分离缓冲液中。

方法2：

向在15mL离心管中的1mL PBMC(～3×10⁷细胞)中，加入2μL小鼠抗-人CDx mAb(1mg/mL，在PBS中)，并在冰上温育10min。然后，加入10mL分离缓冲液，并在350×g离心5min。用移液器小心地取出8mL上清液，并抛弃，并加入70μL山羊抗-小鼠(GAM)IgG-N3′-乙基生物素17缀合物包被的抗生蛋白链菌素

磁珠(通过温育10μgGAM IgG-N3′-乙基生物素缀合物17/mg抗生蛋白链菌素磁珠来制备，15mg/mL)，并在翻滚和倾斜下在室温温育10min。将试管在磁体上放置1min，并取出上清液。然后，从磁体取下试管，并加入5mL分离缓冲液，并通过轻轻抽吸5次再悬浮珠子-结合的细胞。将试管在磁体上放置1min，并取出上清液。重复洗涤步骤2次。3次洗涤以后，加入1mL释放缓冲液(1mM二生物素在分离缓冲液中)，并在翻滚和倾斜下在室温温育5min。通过抽吸10次，混合所述悬浮液，并将试管在磁体上放置1min。将含有无珠细胞的上清液转移至新试管，并在350×g离心5min。取出上清液，并抛弃，将细胞沉淀物悬浮于1mL分离缓冲液中。

通过

自动化细胞计数器进行细胞计数和生存力试验的一般 规程

用移液器混合10μL细胞样品和10μL锥虫蓝染色剂溶液。将10μL样品混合物加入在

细胞计数室载玻片的一侧上的室孔中。然后，将细胞计数室载玻片插入仪器上的载玻片入口中。用仪器同时记录细胞浓度和生存力。

通过流式细胞计量术进行细胞分析的一般规程

使用

II流式细胞计量术(Becton Dickinson，Franklin Lakers，NJ)，进行细胞分析。将空白PBMC用作对照样品，以建立前向角光散射(FSC)、侧向角光散射(SSC)和光电倍增管(PMT)电压，从而获得淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的微小群体。使用相同的一起设置来运行抗体标记的PBMC，为每个样品收集20,000个事件。使用在488nm的激发激光和在515-545nm的发射滤光片，收集AF488信号。使用在633nm的激发激光和在650-670nm的发射滤光片，收集AF647信号。

实施例24：使用具有不同结合亲和力的生物素和生物素类似物，基于双重细胞表面标志物进行细胞分离

基于双重细胞表面标志物(CD3⁺和CD4⁺)来选择人周围T淋巴细胞，以证实细胞分离。用生物素分子和AlexaFluor647(AF647)(用于流式细胞计量术分析目的)标记抗-CD4mAb；并用N3′-乙基生物素17和AlexaFluor488(AF488)标记抗-CD3 mAb。同时用抗-CD4 mAb-生物素缀合物和抗-CD3mAb-N3′-乙基生物素17缀合物在冰上温育PBMC(3×10⁷细胞)10min。然后，加入抗生蛋白链菌素

磁珠，并在室温温育10min。在除去未结合的试剂的洗涤步骤以后，通过用1mM二生物素温育5min，选择性地释放磁性标记的细胞，得到无珠子的CD3⁺CD4^-细胞。

如图8所示，在用生物素化的抗-CD4 mAb和N3′-乙基生物素化的抗-CD3 mAb温育以后，CD3⁺或CD4⁺细胞已经被抗生蛋白链菌素M280

磁珠捕获，分离效率为～100％。在用1mM二生物素温育以后，选择性地使CD3⁺CD4^-细胞脱离磁珠，具有80±5％回收率、92±3％纯度和95±2％生存力，且CD4⁺细胞保持与磁珠结合。结果证实，通过控制释放条件，可以选择性地使N3′-乙基生物素脱离抗生蛋白链菌素，而不干扰生物素-抗生蛋白链菌素相互作用。这会提供基于双重细胞表面标志物的简单的一步细胞选择方法。

尽管已经参考不同的应用、方法和组合物描述了公开的教导，应当理解，可以做出不同的变化和修改，而不脱离本文的教导。提供前述实施例来更好地例证本教导，且无意限制本文的教导的范围。考虑下述权利要求，可以进一步理解本教导的某些方面。

Claims (153)

1.一种生物素衍生物，其具有式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

Y是O，或者不存在；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H；

其中如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H，或者Y是O。

2.根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中如果R₁是H，那么R₂是衍生基团，且如果R₂是H，那么R₁是衍生基团。

3.根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₁是衍生基团

4.根据权利要求3所述的生物素衍生物，其中R₁包含1-8个碳原子。

5.根据权利要求3所述的生物素衍生物，其中R₁包含1-6个碳原子。

6.根据权利要求3所述的生物素衍生物，其中R₁包含1-3个碳原子。

7.根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₂是衍生基团。

8.根据权利要求7所述的生物素衍生物，其中R₂包含1-8个碳原子。

9.根据权利要求7所述的生物素衍生物，其中R₂包含1-6个碳原子。

10.根据权利要求7所述的生物素衍生物，其中R₂包含1-3个碳原子。

11.根据前述权利要求中任一项所述的生物素衍生物，其中X是O。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的生物素衍生物，其中X是S。

13.根据前述权利要求中任一项所述的生物素衍生物，其中Y不存在。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的生物素衍生物，其中Y是O。

15.根据前述权利要求中任一项所述的生物素衍生物，其中L不存在。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的生物素衍生物，其中L是接头。

17.根据权利要求16所述的生物素衍生物，其中L选自聚乙二醇接头和寡肽接头。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的生物素衍生物，其中所述接头包含可检测的部分。

19.根据权利要求18所述的生物素衍生物，其中所述可检测的部分包含：生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶或放射性同位素。

20.根据权利要求19所述的生物素衍生物，其中所述可检测的部分是荧光染料。

21.根据权利要求16所述的生物素衍生物，其中L-R₃具有结构：

其中R₅是H或衍生基团，且n是0-20的整数。

22.根据前述权利要求中任一项所述的生物素衍生物，其中R₃是-OR₄或-COOR₄。

23.根据权利要求22所述的生物素衍生物，其中R₄是H。

24.根据权利要求22所述的生物素衍生物，其中R₄包含1-8个碳原子。

25.根据权利要求22所述的生物素衍生物，其中R₄包含1-6个碳原子。

26.根据权利要求22所述的生物素衍生物，其中R₄包含1-3个碳原子。

27.根据权利要求22所述的生物素衍生物，其中R₄是CH₃。

28.根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团。

29.根据权利要求28所述的生物素衍生物，其中：

(a)当L是接头时，所述反应基团选自异硫氰酸酯、磺酰氯、4，6-二氯三嗪基、羧酸酯、卤代乙酰基、酰肼、琥珀酰亚胺酯、4-磺酰基-3，5-二氯苯酚酯、马来酰亚胺、碘代乙酰胺；叠氮化物，和炔烃；或者

(b)当L不存在时，所述反应基团选自羟基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基和4-磺酰基-3，5-二氯苯酚。

30.根据权利要求28所述的生物素衍生物，其中

(a)当L是接头时，R₃是或者

(b)当L不存在时，R₃是

31.根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃选自多肽、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

32.根据权利要求31所述的生物素衍生物，其中R₃是多肽。

33.根据权利要求32所述的生物素衍生物，其中R₃是抗体。

34.根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

35.根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

36.根据权利要求35所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

37.根据权利要求35所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

38.根据权利要求37所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

39.一种生物素衍生物，其具有式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-0R₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H。

40.根据权利要求39所述的生物素衍生物，其中如果R₁是H，那么R₂是衍生基团，且如果R₂是H，那么R₁是衍生基团。

41.根据权利要求40所述的生物素衍生物，其中R₁是衍生基团。

42.根据权利要求41所述的生物素衍生物，其中R₁包含1-8个碳原子。

43.根据权利要求41所述的生物素衍生物，其中R₁包含1-6个碳原子。

44.根据权利要求41所述的生物素衍生物，其中R₁包含1-3个碳原子。

45.根据权利要求40所述的生物素衍生物，其中R₂是衍生基团。

46.根据权利要求45所述的生物素衍生物，其中R₂包含1-8个碳原子。

47.根据权利要求45所述的生物素衍生物，其中R₂包含1-6个碳原子。

48.根据权利要求45所述的生物素衍生物，其中R₂包含1-3个碳原子。

49.根据权利要求39-48中任一项所述的生物素衍生物，其中X是O。

50.根据权利要求39-48中任一项所述的生物素衍生物，其中X是S。

51.根据权利要求50所述的生物素衍生物，其中R₁和R₂各自是H。

52.根据权利要求39-51中任一项所述的生物素衍生物，其中L不存在。

53.根据权利要求39-51中任一项所述的生物素衍生物，其中L是接头。

54.根据权利要求53所述的生物素衍生物，其中L选自聚乙二醇接头和寡肽接头。

55.根据权利要求54所述的生物素衍生物，其中所述接头包含可检测的部分。

56.根据权利要求55所述的生物素衍生物，其中所述可检测的部分包含生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶或放射性同位素。

57.根据权利要求56所述的生物素衍生物，其中所述可检测的部分是荧光染料。

58.根据权利要求53所述的生物素衍生物，其中L-R₃具有结构：

其中R₅是H或烷基，且n是0-20的整数。

59.根据权利要求39-58中任一项所述的生物素衍生物，其中R₃是-OR₄或-COOR₄。

60.根据权利要求59所述的生物素衍生物，其中R₄是H。

61.根据权利要求59所述的生物素衍生物，其中R₄包含1-8个碳原子。

62.根据权利要求59所述的生物素衍生物，其中R₄包含1-6个碳原子。

63.根据权利要求59所述的生物素衍生物，其中R₄包含1-3个碳原子。

64.根据权利要求58所述的生物素衍生物，其中R₄是CH₃。

65.根据权利要求39所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团。

66.根据权利要求65所述的生物素衍生物，其中：

(a)当L是接头时，所述反应基团选自异硫氰酸酯、磺酰氯、4，6-二氯三嗪基、羧酸酯、卤代乙酰基、酰肼、琥珀酰亚胺酯、4-磺酰基-3，5-二氯苯酚酯、马来酰亚胺、碘代乙酰胺、叠氮化物和炔烃；或者

(b)当L不存在时，所述反应基团选自羟基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基和4-磺酰基-3，5-二氯苯酚。

67.根据权利要求65所述的生物素衍生物，其中：

(a)当L是接头时，R₃是或者

(b)当L不存在时，R₃是

68.根据权利要求39所述的生物素衍生物，其中R₃选自多肽、氨基酸、葡聚糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒。

69.根据权利要求68所述的生物素衍生物，其中R₃是多肽。

70.根据权利要求69所述的生物素衍生物，其中R₃是抗体。

71.根据权利要求39所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

72.根据权利要求39所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

73.根据权利要求72所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

74.根据权利要求39所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

75.根据权利要求74所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物选自：

76.根据前述权利要求中任一项所述的生物素衍生物，其中所述生物素衍生物对抗生蛋白链菌素具有在1x10^-13M至1x10^-8M之间的亲和力。

77.一种组合物，其含有根据前述权利要求中任一项所述的生物素衍生物和溶剂。

78.根据权利要求77所述的组合物，其中所述溶剂是水性的溶剂。

79.一种将生物素衍生物固定至固体支持物上的方法，所述方法包括：使固体支持物与根据权利要求1-76中任一项所述的生物素衍生物接触，其中所述固体支持物包含生物素结合部分。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述生物素衍生物对所述生物素结合部分的亲和力小于生物素对所述生物素结合部分的亲和力。

81.根据权利要求79或权利要求80所述的方法，其中所述方法另外包括：使固定化的生物素衍生物与分子接触，所述分子对所述生物素结合部分的亲和力大于所述生物素衍生物对所述生物素结合部分的亲和力。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述分子是生物素。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述生物素是生物素多聚体。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述生物素是生物素二聚体或生物素三聚体。

85.根据权利要求79-84中任一项所述的方法，其中所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素。

86.根据权利要求79-85中任一项所述的方法，其中所述固体支持物选自聚合物、玻璃、陶瓷、有机硅、金属、纤维素和凝胶的表面。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述固体支持物选自微量培养板、微阵列芯片和微粒。

88.根据权利要求79-87中任一项所述的方法，其中所述生物素衍生物包含选自下述的基团：蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子和细胞。

89.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-76中任一项所述的生物素衍生物或者根据权利要求77或权利要求78所述的组合物。

90.一种合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

所述方法包括下述步骤：使生物素甲酯与劳森试剂反应。

91.一种合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

所述方法包括下述步骤：(a)使生物素甲酯与劳森试剂反应；和(b)用过氧化氢氧化环硫原子。

92.一种合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₁是衍生基团；

所述方法包括下述步骤：使生物素甲酯与仲胺反应性的衍生基团反应。

93.根据权利要求93所述的方法，其中所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

94.一种合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₂是衍生基团；

所述方法包括下述步骤：(a)使生物素甲酯与仲胺反应性的保护基反应，以制备包含在环氮上的保护基的生物素甲酯；(b)使(a)的产物与仲胺反应性的衍生基团反应；和(c)除去所述保护基。

95.根据权利要求94所述的方法，其中所述仲胺反应性的保护基选自二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)、三苯甲基氯(Trt-Cl)、氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)和氯甲酸烯丙酯(Aloc-Cl)。

96.根据权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

97.一种制备具有下式的生物素衍生物的方法：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

Y是O，或者不存在；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H；

其中如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H，或者Y是O；

所述方法包括下述步骤：合成选自下述的生物素衍生物：

98.一种合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₁是衍生基团；

所述方法包括下述步骤：使脱硫生物素甲酯与仲胺反应性的衍生基团反应。

99.根据权利要求97所述的方法，其中所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

100.一种合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

其中R₂是衍生基团；

所述方法包括下述步骤：(a)使脱硫生物素甲酯与仲胺反应性的保护基反应；和(b)使(a)的产物与仲胺反应性的衍生基团反应。

101.根据权利要求99所述的方法，其中所述仲胺反应性的保护基选自二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)、三苯甲基氯(Trt-Cl)、氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)、氯甲酸烯丙酯(Aloc-Cl)。

102.根据权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述仲胺反应性的衍生基团选自碘代烷基、溴代烷基、氯代烷基和氯甲酸烷酯。

103.一种合成具有下述结构的生物素衍生物的方法：

所述方法包括：使脱硫生物素甲酯与劳森试剂反应。

104.一种制备具有下式的生物素衍生物的方法：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H；

所述方法包括下述步骤：合成选自下述的生物素衍生物：

105.一种制备生物素衍生物的方法，所述方法包括下述步骤：转化选自下述的化合物，以形成所述生物素衍生物化合物：

106.根据权利要求105所述的方法，其中所述生物素衍生物具有式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

Y是O，或者不存在；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H；

其中如果X是O，那么R₁和R₂中的至少一个不是H，或者Y是O。

107.根据权利要求105所述的方法，其中所述生物素衍生物具有式：

其中：

X是S或O；

R₁选自H和衍生基团；

R₂选自H和衍生基团；

L不存在，或者是接头；

R₃选自-OR₄、-COOR₄、反应基团、蛋白、肽、氨基酸、葡聚糖、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、激素、脂多糖、核苷酸、寡核苷酸、小分子、细胞、微量培养板和微粒；

R₄选自H和衍生基团；

其中R₁和R₂中的至少一个是H。

108.一种检测样品中的蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

a.提供根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团；

b.提供包含蛋白的样品，所述蛋白包含能够与所述反应基团反应的互补基团；

c.提供生物素结合部分，所述生物素结合部分包含可检测的部分；

d.使所述生物素衍生物与所述样品接触，以提供标记混合物；

e.使所述标记混合物与所述生物素结合部分接触；和

f.检测所述蛋白。

109.根据权利要求108所述的方法，其中所述反应基团是炔烃，且互补基团是叠氮化物。

110.根据权利要求109所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

111.根据权利要求108所述的方法，其中所述反应基团是叠氮化物，且所述互补基团是炔烃。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

113.根据权利要求108所述的方法，其中所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。

114.根据权利要求108所述的方法，其中所述可检测的部分是生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶、包含作为放射性同位素的原子的分子或作为放射性同位素的原子。

115.一种检测样品中的蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

a.提供根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团；且其中所述接头存在，并包含可检测的部分。

b.提供包含蛋白的样品，所述蛋白包含能够与所述反应基团反应的互补基团；

c.使所述生物素衍生物与所述样品接触；和

d.检测所述蛋白。

116.根据权利要求115所述的方法，其中所述反应基团是炔烃，且所述互补基团是叠氮化物。

117.根据权利要求116所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

118.根据权利要求115所述的方法，其中所述反应基团是叠氮化物，且所述互补基团是炔烃。

119.根据权利要求118所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

120.根据权利要求118所述的方法，其中所述可检测的部分是生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶、包含作为放射性同位素的原子的分子或作为放射性同位素的原子。

121.一种分离样品中的蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

a.提供根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团；

b.提供包含蛋白的样品，所述蛋白包含能够与所述反应基团反应的互补基团；

c.提供固体支持物，所述固体支持物包含生物素结合部分；

d.使所述生物素衍生物与所述样品接触，以提供标记混合物；

e.使所述标记混合物与所述固体支持物接触；和

f.使所述蛋白结合所述固体支持物，以提供分离的蛋白。

122.根据权利要求121所述的方法，其中所述反应基团是炔烃，且所述互补基团是叠氮化物。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

124.根据权利要求121所述的方法，其中所述反应基团是叠氮化物，且所述互补基团是炔烃。

125.根据权利要求124所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

126.根据权利要求121所述的方法，其中所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。

127.一种分离样品中的细胞的方法，所述方法包括下述步骤：

a.提供样品，所述样品包含至少一个细胞；

b.提供根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团；

c.提供抗体，所述抗体包含能够与所述反应基团反应且能够结合在所述细胞上的蛋白的互补基团；

d.提供固体支持物，所述固体支持物包含生物素结合部分；

e.使所述生物素衍生物与所述抗体接触，以提供生物素标记的抗体；

f.使所述生物素标记的抗体与所述样品接触，以提供标记混合物；

g.使所述标记混合物与所述固体支持物接触；和

h.使所述细胞结合所述固体支持物，以提供分离的细胞。

128.根据权利要求127所述的方法，其中所述反应基团是炔烃，且所述互补基团是叠氮化物。

129.根据权利要求128所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

130.根据权利要求127所述的方法，其中所述反应基团是叠氮化物，且所述互补基团是炔烃。

131.根据权利要求130所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

132.根据权利要求127所述的方法，其中所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。

133.一种标记蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

a.提供根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团；

b.提供包含蛋白的样品，所述蛋白包含能够与所述反应基团反应的互补基团；和

c.使所述生物素衍生物与所述样品接触，以提供生物素衍生物标记的蛋白。

134.根据权利要求133所述的方法，其中所述反应基团是炔烃，且所述互补基团是叠氮化物。

135.根据权利要求134所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

136.根据权利要求133所述的方法，其中所述反应基团是叠氮化物，且所述互补基团是炔烃。

137.根据权利要求136所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

138.根据权利要求133所述的方法，所述方法另外包括下述步骤：

a.提供生物素结合部分，所述生物素结合部分包含可检测的部分；和

b.使所述生物素结合部分与所述生物素衍生物标记的蛋白接触。

139.根据权利要求138所述的方法，其中所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。

140.根据权利要求138所述的方法，其中所述可检测的部分是生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶、包含作为放射性同位素的原子的分子或作为放射性同位素的原子。

141.一种标记样品中的蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

a.提供根据权利要求1所述的生物素衍生物，其中R₃是反应基团；且其中所述接头存在，并包含可检测的部分；

b.提供包含蛋白的样品，所述蛋白包含能够与所述反应基团反应的互补基团；和

c.使所述生物素衍生物与所述样品接触，以提供标记的蛋白。

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述反应基团是炔烃，且所述互补基团是叠氮化物。

143.根据权利要求142所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

144.根据权利要求141所述的方法，其中所述反应基团是叠氮化物，且所述互补基团是炔烃。

145.根据权利要求144所述的方法，其中所述炔烃是乙炔。

146.根据权利要求141所述的方法，其中所述可检测的部分是生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶、包含作为放射性同位素的原子的分子或作为放射性同位素的原子。

147.一种标记生物素衍生物的方法，所述方法包括下述步骤：

a.提供根据权利要求1所述的生物素衍生物；

b.提供生物素结合部分；和

c.使所述生物素衍生物与所述生物素结合部分接触，以提供标记的生物素衍生物。

148.根据权利要求147所述的方法，其中所述生物素结合部分包含可检测的部分。

149.根据权利要求148所述的方法，其中所述可检测的部分是生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶或放射性同位素。

150.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的生物素衍生物和生物素结合部分。

151.根据权利要求150所述的试剂盒，其中所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。

152.根据权利要求150所述的试剂盒，其中所述生物素结合部分包含可检测的部分。

153.根据权利要求149所述的试剂盒，其中所述可检测的部分是生色团、荧光染料、荧光蛋白、纳米晶体、酶或放射性同位素。

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