具体实施方式
本发明采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(MoleculA.r beacon)技术对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA,简称金葡)基因中高保守特异性核酸序列(nuc基因)进行扩增检测,从而判断金黄色葡萄球菌的存在。
从而指导临床医生对金黄色葡萄球菌感染的病人用药,帮助预后判断。
目的基因nuc的检测:因为nuc基因是金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶基因,所以对nuc基因的检测可以区分金黄色葡萄球菌(SA)和凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的。
所述nuc基因序列如SEQ ID NO.7所示。
内参照原理:试剂盒设置了内参照neo基因,即大肠杆菌新霉素基因。它在金葡基因组和人类基因组中均无同源基因,因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在,从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时,表示PCR反应体系以及操作正常;因此当目的基因nuc结果为阴时,内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因nuc结果为阳时,内参照的扩增曲线较目的基因阴性时内参照的扩增曲线要推迟,或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因nuc和内参照基因neo结果都为阴时,该试验视为无效,需再重复。
阳性对照原理:每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳,表明对靶基因的检测系统是正常的;而当结果为阴时,表明该次实验无效,需重复。
阴性对照原理:为证明有否污染存在,每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴,表明本次试验无污染;如结果为阳,则表明该次实验无效,需重复。
实施例1本发明试剂盒的组成
主要原材料来源及制备方法:
Tris:分析纯,有合格资质的供应厂商的产品,含量99.7%,红外合格,pH(5%水)10.3-10.9,水份0.3%,熔点167-171℃,吸收系统合格,杂质最高含量合格。
MgCl2:分析纯,有合格资质的供应厂商的产品,含量不少于99%,水溶液反应合格,杂质最高含量合格。(MgCl2极易吸潮,启用新瓶后放于干燥器下保存)。
EDTA:分析纯,有合格资质的供应厂商的产品,为白色结晶状粉末,溶于水,溶液呈酸性,难溶于醇,含量不少于99.5%,水溶液反应合格,络合力试验合格,杂质最高含量合格。
HCl:分析纯,北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。
纯化水:购买乐百氏桶装纯净水,然后经Millipore公司的Milli-QBiocel型纯水机处理,电阻率16-18MΩ。
引物和探针:本发明所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成,并经Sigma质检合格(含质谱鉴定);
其中nuc基因最优引物、探针序列组合如下:
上游引物A(SEQ ID NO.1):5’-AAAACACCCCTATCAAATGATAATC-3’;
下游引物A(SEQ ID NO.2):5’-GAAGAACTCCGCGACGCA-3’;
荧光探针A(SEQ ID NO.3):
5’-FAM-CATTATCAATGGATAGGGGCTATTTTAATAAAATTCG-BHQ-3’。
其中neo内参照系统的引物、探针序列组合如下:
上游引物(SEQ ID NO.4):5’-GACTAAACTGGCTGACGG-3’;
下游引物B(SEQ ID NO.5):5’-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3’;
荧光探针B(SEQ ID NO.6):
5’-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-3’。
用于PCR反应的引物,紫外检测结果A260nm:A280nm≥1.5可视为合格引物。-20℃保存。
nuc探针:在寡核苷酸5’端标记FAM,3’端标记BHQ,紫外检测结果A260nm:A280nm≥1.5,在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰,-20℃保存。
neo探针:在寡核苷酸5’端标记TEXrd,3’端标记BHQ,紫外检测结果A260nm:A280nm≥1.5,在TEXrd荧光素的激发波长610nm处有吸收峰。-20℃保存。
dNTPs:dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司,或其他有合格资质的供应商,并经出厂检测合格;按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。根据供应商质量标准为HPLC纯,无DNase和RNase污染。-20℃保存。
Taq酶:本产品在研制开发及生产过程中,所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司,或其他有合格资质的供应商。浓度5U/μl,含10×PCRBuffer、25mmol/LMgCl2,根据供应商质量标准:本品具有DNA聚合酶活性,无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性;具热稳定性,94℃保温1小时后仍保持50%活性。-20℃保存。
UNG酶:本产品在研制开发及生产过程中,所应用的UNG酶购自Promega公司或其他有合格资质的供应商,按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。浓度>1U/μl,根据供应商质量标准:本品具有尿嘧啶糖基化酶活性,无核酸外切酶及核酸内切酶活性,1UUNG在50℃2min能降解至少103copies含dU的模板,使其不能产生扩增产物。-20℃保存。
基础试剂配制:
10×浓缩清洗液A:配制0.2N NaOH,5mL/管分装;
10×浓缩清洗液B:配制10×TE缓冲液(pH8.0),10mL/管分装;
提取固形物:取直径为0.5mm和1.0mm两种玻璃珠,按质量配比约为:0.5mm∶1.0mm=9∶1比例配制出提取固形物,每管约0.15g分装。
10mmol/L Tris-HCl溶液的配制:称取0.12114g的Tris,加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中,振摇使之充分溶解,移入100mL的容量瓶中,用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中,用HCl调pH值为8.0,最后用蒸馏水定容到100mL,翻转容量瓶使之充分混匀。移入试剂瓶并标记名称、浓度、配置时间。
dNTPs的配制如表1:
表1
名称 |
dATP |
dCTP |
dGTP |
dUTP |
体积 |
300μL |
300μL |
300μL |
450μL |
从冰柜中取出所需试剂,平衡至室温。按上述比例加入所有试剂后用磁力搅拌器混匀。
引物和探针的稀释:
取出合成的引物和探针,在高速台式冷冻离心机上离心8000r/min,3min。取出待测引物和探针,计算并加超纯水稀释引物和探针到100μM,在涡旋混匀器上混合均匀,取出后在手掌型离心机离心。
内参照:组成为103copies/mL含内参照基因质粒;领用经分光光度计精确定量的含内参照基因的高浓度质粒,用1×TE作10倍梯度稀释至103copies/mL作为内参照,1mL/管分装。
阳性对照:组成为106copies/mL-107copies/mL含目的片段质粒;领用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒,用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至106copies/mL-107copies/mL作为阳性对照,1mL/管分装。阳性对照品为含目的基因的质粒,目的基因来自美国菌种保藏中心(ATCC)的原始菌株。
阴性对照:组成为1×清洗液B,将配制好的10×清洗液B用纯化水作10倍稀释,制得1×清洗液B作为阴性对照,1mL/管分装。
SA-PCR反应液配方如表2(44.3μl):
表2
本试剂盒组成部分如表3:
表3
组成 |
规格和数量 |
10×浓缩清洗液A |
5ml×1瓶 |
10×浓缩清洗液B |
20ml×1瓶 |
提取固形物 |
48管 |
nuc-PCR反应液 |
1.1ml×2管 |
Taq DNA Polymerase(5U/μl) |
50μl×1管 |
Uracil N-Glycosylase(UNG)(1U/μl) |
20μl×1管 |
内参照 |
1ml×1管 |
阴性对照 |
1ml×1管 |
阳性对照(MRSA) |
1ml×1管 |
实施例2本发明试剂盒的使用
一、试剂准备:
1.取出10×浓缩清洗液A和10×浓缩清洗液B,用无菌纯水按1∶9(体积比)进行稀释,放于4℃冰箱中备用。
2.将Taq DNA Polymerase和Uracil N-Glycosylase(UNG)瞬时离心后,放于-20℃冰箱中备用。
3.确定需要进行的反应管数n(标本数+阴性、阳性对照)后,取出SA-PCR反应液,将n×44.3μl SA-PCR反应液/nuc-PCR反应液,n×0.5μlTaq DNA Polymerase和n×0.2μl Uracil N-Glycosylase(UNG)加入一个离心管中并振荡混匀,瞬时离心后,向每一个PCR反应管中分装45μl,盖上管盖后转移到加样区,避光放于4℃冰箱备用。
4.将提取固形物及阳性对照、阴性对照、内参照转移到样品处理区,放于4℃冰箱中备用。
二、样本处理:
1.适用标本类型:痰液、尿液、胸腹水、脑脊液、血液、分泌物等。
2.若样本初始浓度较低,建议可以先对初始样本进行增菌后检测。
3.标本采集:
3.1痰液:清晨从肺深部咳出的痰液,用无菌玻璃管收集1-3ml,密闭送检。取200μL至1.5mL离心管加入4倍体积的1×清洗液A,摇匀,室温放置15-30min待液化;将液化后的标本,13000r/min离心5min;去上清,沉淀加清洗液B 1ml混匀,13000r/min离心5min;重复1.3一次;去上清,沉淀中加入100μl清洗液B备用。
3.2尿液:用无菌玻璃管收集中段尿1-3ml,密闭送检。
2.1摇匀尿液,取1.0ml至1.5ml离心管,13000r/min离心5min;去上清,沉淀(沉淀如不明显,可再加入尿液样本重复前步骤)加清洗液B1ml混匀,13000r/min离心5min;去上清,沉淀中加入100μl清洗液B备用。
3.3血液:发热初期1~2天内或高峰期采血。血量1~3ml注入血培养瓶中增菌后送检(血标本必须在24小时内进行标本制备);从血培养瓶中取100μl至1.5ml离心管中加入1ml清洗液A,颠倒管子混匀后室温静置5min,13000r/min离心5min;去上清,沉淀加1ml清洗液B混匀,13000r/min离心5min;重复3.2两遍;去上清,沉淀中加入100μl清洗液B备用。
3.4胸腹水、脑脊液:用无菌管采集。摇匀,取1.0ml至1.5ml离心管,13000r/min离心5min;去上清,沉淀加清洗液B1ml混匀,13000r/min离心5min;去上清,沉淀中加入100μl清洗液B备用。
3.5分泌物:无菌涤纶拭子采集后放回管中送检(标本在室温下保存不应超过1天,在4~8℃保存不超过6天)。向拭子管中加入1.0ml清洗液B,将标本管用震荡器高速震荡2min制成标本悬浮液;取出全部标本悬浮液放入1.5ml离心管中,13000r/min离心5min;去上清,沉淀加1ml清洗液B混匀,13000r/min离心5min;去上清,沉淀中加入100μl清洗液B备用。
三、样本DNA提取:
1、向上述样本处理中处理好的各样本管中分别加入1管提取固形物(轻弹管底尽量将固形物倒净),用强力震荡器(如美国Vortex-Genie)高速涡旋震荡5min,瞬时离心,加入20μl内参照。
2、阴性对照样本制备:取出阴性对照,8000r/min离心数秒,吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中,加入20μl内参照。
阳性对照样本制备:(同阴性对照)
3、将待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后95℃干浴2min,即刻冰浴2-5min后13000r/min离心1min;上清液用于PCR扩增。
四、PCR反应
1、加样(样品处理区或者加样区)
向准备好的PCR反应液管中分别加入5μl上清液(注意避免吸入固形提取物)待测样品,阴性对照样品,阳性对照样品,盖紧管盖后瞬时低速离心。(注意PCR反应管管壁上不可沾有反应液,不可有气泡)
2、PCR扩增(检测区)
将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上,编辑样本信息并按表4循环参数进行扩增反应。
表4
SA-PCR反应体系中包括:SA检测和内参照;利用仪器配套软件进行自动分析,得到各样品Ct值如表5。
表6
五、检验结果的分析
1.结果分析条件设定
1.1ABI 7500基线(baseline放定:取2个到样品阈值(threshold)前3个循环值作为基线。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,即Ct阴性对照=30或者“Undet.”为准。
1.2STRATAGENE Mx3000P基线设定:选择“适合基线(Adaptivebaseline)”设定时的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,即Ct阴性对照=30或者“No Ct”为准。
2.质控标准
本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件:
2.1阴性质控:SA-PCR体系中:金葡(SA-FAM)Ct值=30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500),内参照(Texas Red)Ct值<30,且有较好的对数增长曲线。
2.2阳性质控:SA-PCR体系中:金葡(SA-FAM)Ct值≤23,且有较好的对数增长曲线;内参照(Texas Red)Ct值≤30。
3、结果
1.金黄色葡萄球菌结果(SA-PCR体系)判读:
1.1金黄色葡萄球菌阴性:金葡(SA-FAM)Ct值=30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500);且内参照(Texas Red)通道Ct值<30,且有较好的对数增长曲线。
1.2金黄色葡萄球菌阳性:金葡(SA-FAM)Ct值≤23,且有较好的对数增长曲线;内参照(Texas Red)Ct值≤30。
1.3反应无效:金葡(SA-FAM)Ct值=30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500);且内参照(Texas Red)Ct值=30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。
请参阅图1、图2、通过对本发明试剂盒灵敏度和精密度进行研究,显示其具备以下性能:
图1为nuc基因灵敏度参比品检测结果图,所测浓度依次为1.0×106copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml、最低检出限为1.0×103copies/mL。
图2:nuc基因特异性结果图;如图所测为表皮葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、藤黄微球菌、微球菌、蜡样芽胞杆菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、牛链球菌、绿脓杆菌、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、弱阳性对照、阳性对照,除弱阳性对照、阳性对照外结果全为阴性。
本试剂盒具有的特点:
1、具有很高的准确性、灵敏度和特异性;
2、无须PCR后处理,完全闭管扩增和检测,采用了dUTP-UNG系统,有助于避免扩增产物的污染;
3、操作简单、耗时短(2~3小时);
4、结果客观可靠,仪器自动收集和分析数据。
综上,与实验室普通PCR定量检测相比,本产品准确性高、特异性强,而且在灵敏度和精密度都有了很大的改进,提高。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。