CN102399291B - 一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的亲和层析复性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，具体涉及到一种抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的亲和层析复性方法。该亲和层析复性方法的具体步骤为：将还原变性的融合蛋白溶液载入肝素亲和层析柱中，让融合蛋白与肝素亲和介质进行可逆的亲和吸附，在运行一定梯度的条件下将层析柱中的变性缓冲液逐渐置换为复性缓冲液，使融合蛋白在层析柱上停留一定时间，最后用洗脱缓冲液将复性好的融合蛋白洗脱下来。该方法的优点在于：复性所得融合蛋白的蛋白浓度及活性均较高且同时具有纯化作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的亲和层析复性方法。
背景技术
本发明中的复性对象为水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，该融合蛋白是通过一个(Gly)3柔性肽基团将重组水蛭素III的C末端12肽与rPA基因融合而成的一种同时具有抗凝溶栓双功能的全新蛋白(吴梧桐，余蓉，等溶栓和抗凝双功能融合蛋白、制备方法及其应，中国专利公开号CN1970574)。该蛋白通过目前最常用的表达系统-大肠杆菌进行表达(余蓉等抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达，药物生物技术2007，14(3)：168-172)。虽然大肠杆菌表达蛋白具有快速、高效、价廉等优点。但外源蛋白在大肠杆菌中的大量表达，往往形成致密的包涵体。包涵体是无规则伸展肽链的聚集体，没有生物活性，需要通过一定的方法对包涵体进行溶解后复性使其恢复生物活性，并进一步纯化得到纯品后才能进一步使用。
蛋白质的复性及纯化技术是生物制药下游技术中的一个重点和难点，其成本大约占整个生物制药开发成本的50～70％，是一个生物药品能否顺利上市的关键。理想的蛋白复性技术应具备以下几个特点：①活性蛋白质的回收率高；②正确复性的产物易与错误折叠的产物分离；③复性后蛋白终浓度较高；④复性方法适合工业化生产；⑤复性过程耗时少，成本低。目前，国内外生物制药工业上普遍使用的复性手段还是稀释、透析复性等常规复性方法。稀释复性法是将包涵体蛋白变性液用复性缓冲液直接或者分步稀释，从而达到复性的目的。该方法存在复性时间长，缓冲液用量大，复性率及复性蛋白终浓度低等缺点。这无疑增加了复性的成本。而透析法复性蛋白是将包涵体蛋白溶液盛入透析袋中，用不断更换复性透析缓冲液将透析袋中的变性液逐渐置换出来，从而达到复性的目的(梁兰，余蓉，邓璇，等透析法体外复性抗凝溶栓双功能HV12p-rPA融合蛋白，药物生物技术，2009，16(02)：140-143)。该法仍然存在操作繁琐，复性时间长，复性率及复性蛋白终浓度较低的缺点。自从1990年Creighton等人(US Pat：4977248)首次采用离子交换层析复性蛋白以来，层析复性蛋白技术在蛋白质复性过程中的应用已取得了令人瞩目的成果。这种方法通过层析介质的介入，阻隔了蛋白质分子之间的相互作用，降低了聚集体的形成。蛋白质层析复性可在高蛋白质浓度下操作，适用于大规模生产，同时还能够纯化目标蛋白，具有双重作用。目前主要的层析复性技术有凝胶过滤层析法，离子交换层析法，疏水层析法，亲和层析法以及固定化分子伴侣、脂质体层析法等。不同层析复性方法有各自的优缺点及适用范围。当然对于某种蛋白往往需要通过实验条件优化(比如引入脲梯度，pH梯度及添加一些蛋白折叠辅助剂等)确定最适合该蛋白层析复性的方法。
水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白含有九对二硫键，复性过程中由于二硫键容易错配形成共价聚集体从而难以复性。目前，这种含有多对二硫键蛋白的复性率普遍不高。例如：同样含有九对二硫键的瑞替普酶(r-PA)，Kohnert(Kohnert U，et a1，Biochemical properties of thekringle 2 and protease domains are maintained in the refolding t-PA deletion variant BM 06.022，Protein Engineering)等用稀释复性法复性，其复性率不超过5％。孙石静(孙石静等，瑞替普酶融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及其复性，中国药科大学学报)等用金属螯合柱一步复性，融合蛋白复性率也仅达到10％。赵友春(赵友春等，提高溶栓新药瑞替普酶生产得率的中试研究，化工科技)等改进了Kohnert的方法，在谷胱甘肽还原体系中，用重组人二硫键异构酶(PDI)辅助瑞替普酶复性，其复性率达到14％以上。但是PDI价格昂贵，用于工业化生产无疑大大提高了生产成本。2006年刘海峰等(Haifeng Liu，et al，A comparativeinvestigation on different refolding strategies of recombinant human tissue-type plasminogenactivator derivative，Biotechnology Letters)采用Sephacryl-200凝胶介质层析复性和两步温控的方法复性Trx-rPA融合蛋白，复性率为13.8％。对于水蛭素12肽-瑞替普酶抗凝溶栓双功能融合蛋白采用脉冲稀释复性法复性，溶栓活性复性率仅有1.4％，抗凝比活只有615ATU/mg，蛋白终浓度60.0μg/ml。梁兰等(中国专利公开号CN 101245111A)采用透析法复性该融合蛋白，在蛋白终浓度225.6μg/ml情况下，复性蛋白溶栓比活为：6209IU/mg，抗凝比活为：709ATU/mg。余蓉，高玲，苏志国等(中国专利公开号CN 101386639A)采用Superdex G75凝胶过滤层析复性该融合蛋白，溶栓活性为：83242IU/mg，抗凝活性为：251ATU/mg，蛋白终浓度88.0μg/ml。本发明中的亲和层析复性方法，与以上方法比较，其优势在于：复性蛋白终浓度较高166.1μg/ml，溶栓比活为：32557IU/mg，抗凝比活较高为：9637ATU/mg，其最主要的优点是在复性的同时能纯化蛋白，得到的融合蛋白的纯度达到电泳纯。其成功复性HV12p-rPA，对其它与肝素亲和介质存在亲和作用的蛋白复性(如抗凝血酶III等)具有广泛的借鉴意义。
发明内容
本发明提出了一种全新的抗凝溶栓双功能融合蛋白的亲和层析复性方法。
该亲和层析复性技术方案如下：
1)将一定量的还原变性融合蛋白溶液载入经缓冲液I(0.05-0.2mol/L Tris-HCl，6-8mol/L Urea，1mmol/L EDTA，pH8.5)平衡好的肝素亲和层析柱(Heparin Sepharose 6 FastFlow)，融合蛋白可逆地被吸附在肝素亲和介质上；
2)在运行一定的梯度的条件下将层析柱中的缓冲液I(0.05-0.2mol/L Tris-HCl，6-8mol/L Urea，1mmol/L EDTA，pH8.5)逐渐置换为缓冲液II(0.05-0.2mol/L Tris-HCl，0.3-1mmol/L GSH，1-3mmol/L GSSG，0-3mol/L Urea，1mmol/LEDTA，pH8.5-10.5)并让融合蛋白在层析柱上停留0-1小时；
3)用缓冲液III(0.05-0.2mol/LTris-HCl，0.3-1mmol/L GSH，1-3mmol/L GSSG，0.5-1mol/LNaCl，1-3mol/LUrea，1mmol/LEDTA，pH8.5-10.5)将复性好的融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来；
4)对洗脱下来的融合蛋白进行活性测定及纯度鉴定。
附图说明
附图1为融合蛋白的肝素亲和层析复性图(实施例一)；
附图2为复性后洗脱下来的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图(实施例一)，M为分子量marker(2-6分别表示97.4kD，66.2kD，43.0kD，31.0kD，20.1kD)，1为洗脱液，7为融合蛋白。
附图3为融合蛋白的肝素亲和层析复性图(实施例二)；
附图4为复性后洗脱下来的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图(实施例二)，M为分子量marker(2-7分别表示97.4kD，66.2kD，43.0kD，31.0kD，20.1kD，14.4kD)，1为洗脱液，8为融合蛋白。
具体实施方式
实施例一
1.复性：用缓冲液I(0.05mol/L Tris-HCl，8mol/L Urea，1mmol/L EDTA，pH8.5)平衡肝素亲和层析柱(Heparin Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare，柱体积为5ml)，层析柱平衡好后将约含1.25mg蛋白的变性融合蛋白溶液载入已经平衡好的肝素亲和层析柱，用缓冲液I继续冲洗约3个柱体积，运行1个柱体积的梯度将缓冲液I逐渐置换为缓冲液II(0.05mol/LTris-HCl，1mmol/L GSH，1mmol/L GSSG，2mol/L Urea，1mmol/L EDTA，pH8.5)，用缓冲液II继续冲洗3个柱体积，停止冲洗，立即用缓冲液III(0.05mol/L Tris-HCl，1mmol/L GSH，1mmol/L GSSG，2mol/L Urea，1mmol/L EDTA，1mol/L NaCl，pH8.5)洗脱，收集洗脱峰(附图1为该条件下的层析复性图)，缓冲液流速0.8ml/min。
2.蛋白浓度测定
用考马斯亮蓝法测定洗脱峰的蛋白浓度为：166.1μg/ml。
3.活性测定
①抗凝活性的测定：
在400μl 4mg/ml的重组人纤维蛋白原溶液(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，pH7.4配制)中加入50μl复性好的融合蛋白溶液，充分混匀。用微量进样器向混合溶液中加标准凝血酶(100NIH单位)，时间间隔1min，若在1min内溶液中出现凝集，即说明滴定已达终点。由于水蛭素与凝血酶是1∶1结合，即每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝单位(ATU)，故可以由凝血酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。
②纤溶活性的测定：
纤维蛋白-琼脂糖平板测定法：配制平板用溶液均为50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/LNaCl，pH7.4。将20μl 400NIH单位的凝血酶加到10ml重组纤维蛋白原溶液(4mg/ml)中，迅速混匀，倾入完全融化且已降温至50℃左右的10ml琼脂糖溶液(1％)中，混匀，倒入直径为9cm的平皿中，室温放置0.5h以上，凝固后打孔使用。孔中滴加不同比活性的r-PA标准品及复性好的融合蛋白溶液各20μl。平皿加盖，37℃温育18h。测量溶栓圈相互垂直的两直径，以两直径乘积的对数为纵坐标，以r-PA标准品的单位活性的对数1g IU/ml为横坐标作标准曲线，将测得数据代入标准曲线方程，求出相应的单位比活。
通过以上方法测得洗脱峰的溶栓比活为：32557IU/mg，抗凝比活为：9637ATU/mg。
4.SDS-PAGE电泳鉴定纯度(银染法)
由附图2可知洗脱峰在相应位置只有一条带，纯度达到电泳纯。
实施例二
1.复性：用缓冲液I(0.05mol/L Tris-HCl，8mol/L Urea，1mmol/L EDTA，pH8.5)平衡肝素亲和层析柱(Heparin Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare，柱体积为5ml)，层析柱平衡好后将约含0.625mg蛋白的变性融合蛋白溶液载入已经平衡好的肝素亲和层析柱，用缓冲液I继续冲洗约4个柱体积，运行3个柱体积的梯度将缓冲液I逐渐置换为缓冲液II(0.05mol/L Tris-HCl，1mmol/L GSH，1mmol/L GSSG，2mol/L Urea，1mmol/LEDTA，pH9.5)，用缓冲液II继续冲洗4个柱体积，停止冲洗，让融合蛋白在层析柱上停留1小时，用缓冲液III(0.05mol/L Tris-HCl，1mmol/L GSH，1mmol/L GSSG，2mol/L Urea，1mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl pH9.5)洗脱，收集洗脱峰(附图3为该条件下的层析复性图)，缓冲液的运行流速为0.4ml/min。
2.蛋白浓度测定
用考马斯亮蓝法测定洗脱峰的蛋白浓度为：46.8μg/ml。
3.活性测定
①抗凝活性的测定：
在400μl 4mg/ml的重组人纤维蛋白原溶液(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/LNaCl，pH7.4配制)中加入50μl复性好的融合蛋白溶液，充分混匀。用微量进样器向混合溶液中加标准凝血酶(100NIH单位)，时间间隔1min，若在1min内溶液中出现凝集，即说明滴定已达终点。由于水蛭素与凝血酶是1∶1结合，即每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝单位(ATU)，故可以由凝血酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。
②纤溶活性的测定：
纤维蛋白-琼脂糖平板测定法：配制平板用溶液均为50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/LNaCl，pH7.4。将20μl 400NIH单位的凝血酶加到10ml重组纤维蛋白原溶液(4mg/ml)中，迅速混匀，倾入完全融化且已降温至50℃左右的10ml琼脂糖溶液(1％)中，混匀，倒入直径为9em的平皿中，室温放置0.5h以上，凝固后打孔使用。孔中滴加不同比活性的r-PA标准品及复性好的融合蛋白溶液各20μl。平皿加盖，37℃温育18h。测量溶栓圈相互垂直的两直径，以两直径乘积的对数为纵坐标，以r-PA标准品的单位活性的对数1g IU/ml为横坐标作标准曲线，将测得数据代入标准曲线方程，求出相应的单位比活。
通过以上方法测得洗脱峰的溶栓比活为：35278IU/mg，抗凝比活为：5210ATU/mg。
4.SDS-PAGE电泳鉴定纯度(银染法)
由附图4可知洗脱峰在相应位置只有一条带，纯度达到电泳纯。
Claims (2)
1.一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的亲和层析复性方法，其特征在于：将水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白还原变性液载入用缓冲液I平衡好的肝素亲和层析柱，使该融合蛋白在变性状态下与肝素亲和介质结合，然后用缓冲液I继续冲洗3-4个柱体积，运行1-3个柱体积的梯度下将缓冲液I逐渐置换为缓冲液II，用缓冲液II继续冲洗3-4个柱体积，停止冲洗并让融合蛋白在层析柱上停留1个小时，最后用缓冲液III将复性好的融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，其中，缓冲液I的组成为：0.05-0.2mol/L Tris-HCl，6-8mol/LUrea，1mmol/L EDTA，pH8.5；缓冲液II的组成为：0.05-0.2mol/L Tris-HCl，0.3-1mmol/L GSH，1-3mmol/L GSSG，0-3mol/L Urea，1mmol/LEDTA，pH8.5-10.5；缓冲液III的组成为：0.05-0.2mol/L Tris-HCl，0.3-1mmol/L GSH，1-3mmol/L GSSG，0.5-1mol/LNaCl，1-3mol/L Urea，1mmol/L EDTA，pH8.5-10.5。
2.按照权利要求1所述抗凝溶栓双功能融合蛋白亲和层析复性方法，其特征在于：所用肝素亲和层析介质为Heparin Sepharose 6 Fast Flow。
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