CN102391498A

CN102391498A - 一种聚乙二醇二脂肪酸甘油酯衍生物及其在药物传递中的应用

Info

Publication number: CN102391498A
Application number: CN 201110235954
Authority: CN
Inventors: 何仲贵; 孙进; 陈国良; 张文萍; 王永军
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-08-17
Filing date: 2011-08-17
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2031-08-17
Also published as: CN102391498B

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇与二脂肪酸甘油酯以碳酸酯键连接的聚乙二醇二脂肪酸甘油酯衍生物，如通式（

）或通式（

），其中PEG分子量范围在2000-5000，R₁和R₂分别为10到20碳原子的饱和或不饱和链，以及该类衍生物形成自组装胶束，作为药物的载体，发挥药物传递中的作用。

Description

一种聚乙二醇二脂肪酸甘油酯衍生物及其在药物传递中的应用

技术领域

本发明涉及一种纳米制剂中使用的长循环辅料聚乙二醇二脂肪酸甘油酯衍生物及其在药物传递中的应用。

背景技术

聚合物胶束（Polymeric Micelle）是两亲性聚合物在溶剂中，由分子间的氢键、静电相互作用和范德华力推动下自发地形成的一种自组装结构，具有疏水性内核与亲水外壳，大小可以控制在纳米尺寸范围内。聚合物胶束具有多种形态，以球形最为常见，此外还有棒状、囊状、片状、管状、盘状、角柱形及其他更复杂的结构等。聚合物胶束有许多优点，其中通过EPR（Enhanced Permeability and Retention）效应聚集在肿瘤部位，是其作为抗肿瘤药物载体的基础。其亲水性的外壳可以避免网状内皮细胞系统的吞噬，增加血液滞留时间。在其应用中，亲水链段一般要具有生物相容性并能对胶束粒子在水中的分散起到稳定作用。

聚乙二醇(PEG)是一种中性、无毒、具有生物相容性的亲水性聚合物，是经美国FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。当疏水性药物包封于PEG类胶束后，PEG在药物周围产生空间屏障，可减少药物的酶解。而且包封可改变药物在体内的分配行为，避免药物在肾代谢中被很快消除。

PEG化磷脂在国内尚无产品，国外主要是聚乙二醇磷脂酰乙醇胺（PEG-PE）应用较多，但价格昂贵，这成为制约我国纳米制剂发展的一个瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚乙二醇二脂肪酸甘油酯衍生物及其在药物传递中的应用。本发明制备的聚乙二醇二脂肪酸甘油酯与PEG衍生化磷脂的结构类似，以聚乙二醇作为亲水端，二脂肪酸甘油酯作为疏水端，在水中自组装形成胶束，作为药物的传递系统。

本发明所述的衍生物具有式(I)和（II）的结构：

（

）

（

）。

所述的聚乙二醇分子量范围在2000-5000。

R为11到19个碳原子的饱和或不饱和链。

本发明所述的衍生物通过如下方法合成：

（1）聚乙二醇二脂肪酸甘油酯（I）的合成方案

a) 1,2-甘油缩丙酮（

）的合成

Figure 2011102359547100002DEST_PATH_IMAGE006

将200 mL无水丙酮加入三颈瓶中，三颈瓶上接球形冷凝管，然后缓慢加入甘油25g（0.27 mol），再加入新制的无水ZnCl₂20 g（0.18 mol），磁子搅拌，60℃回流12 h。停止反应后，将反应液减压浓缩，除去过量的丙酮。再将剩余物减压蒸馏，收集102-104℃/水泵（0.085MPa）时的馏分，得20 g无色油状1,2-甘油缩丙酮，产率为70%。

b) 3-苄基-1,2-甘油缩丙酮的合成

将甘油缩丙酮32.48 g（0.246 mol）置于三颈瓶中，加入350 mL N,N-二甲基甲酰胺，再加入氯化苄34.3 g（0.27 mol），冰浴下缓慢加入NaH 7.09 g（0.295 mol），边加边搅拌，加完后将反应瓶移至室温下反应24 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（5/1）。待反应进行基本完全，停止反应，得到乳黄色混浊液，旋蒸除去N,N-二甲基甲酰胺（110-115℃/水泵，0.085MPa），加入200 mL水，搅拌2 h，放置一段时间后分层，界面层有少量黑色的物质，过滤除掉黑色物质，用乙酸乙酯萃取，少量多次（50 mLx5），合并乙酸乙酯层，用饱和的氯化钠水溶液洗3次（100 mL×3），把乙酸乙酯蒸出，得到深黄色油状液体40.5 g，为3-苄基-1,2-甘油缩丙酮粗品，未进一步纯化，直接进入下一步反应。

c) 苄基甘油醇（

Figure 2011102359547100002DEST_PATH_IMAGE008

）的合成

将3-苄基-1,2-甘油缩丙酮粗产物40.5 g加入三颈瓶中，加入甲醇200 mL，1 mol盐酸130 mL，加热回流，反应17 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（1/1）。待反应进行基本完全，停止反应，加入NaHCO₃，调pH为中性，将反应液中的甲醇蒸出，用乙酸乙酯萃取，少量多次（50 mL×5），合并乙酸乙酯层，用饱和的氯化钠水溶液洗3次（100 mL×3），加入无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，把滤液中的乙酸乙酯蒸出，剩余物减压蒸馏，收集（180-190℃/油泵，0.1MPa）时的馏分，得到20 g淡黄色油状液体，薄层点板为单点，分子量为181，产率为65%。

d) 苄基二脂肪酸甘油酯（

）的合成

将硬脂酸9.38 g（0.033 mol）置于三颈瓶中，加入250 mL二氯甲烷，加热使其全部溶解，再加入DCC6.8g （0.033 mol），冰浴搅拌1 h，然后加入苄基甘油醇2 g（0.011 mol），DMAP 1 g（0.0082 mol），25℃下反应72 h，薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（5/1）。待反应进行基本完全，停止反应，反应液静置12 h，抽滤，滤液分别用2 M盐酸、水和饱和NaCl萃取3次（150 mL×3），加入无水硫酸镁干燥，过夜，抽滤，滤液浓缩得二硬脂酸甘油酯的粗产物，干燥后为淡黄白色固体。

将棕榈酸8.46 g（0.033 mol）置于三颈瓶中，加入250 mL二氯甲烷，加热使其全部溶解，再加入DCC 6.8g （0.033 mol），冰浴搅拌1 h，然后加入苄基甘油醇2 g（0.011 mol），DMAP 1 g（0.0082 mol），25℃下反应72 h，薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（5/1）。待反应进行基本完全，停止反应，反应液静置12 h，抽滤，滤液分别用2 M盐酸、水和饱和NaCl萃取3次（150 mL×3），加入无水硫酸镁干燥，过夜，抽滤，滤液浓缩得二棕榈酸甘油酯粗产物，干燥后为淡黄白色固体。

将肉豆蔻酸7.54 g（0.033 mol）置于三颈瓶中，加入250 mL二氯甲烷，加热使其全部溶解，再加入DCC 6.8g （0.033 mol），冰浴搅拌1 h，然后加入苄基甘油醇2 g（0.011 mol），DMAP 1 g（0.0082 mol），25℃下反应72 h，薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（5/1）。待反应进行基本完全，停止反应，反应液静置12 h，抽滤，滤液分别用2 M盐酸、水和饱和NaCl萃取3次（150 mL×3），加入无水硫酸镁干燥，过夜，抽滤，滤液浓缩得二肉豆蔻酸甘油酯粗产物，干燥后为淡黄白色固体。

将月桂酸6.61 g（0.033 mol）置于三颈瓶中，加入250 mL二氯甲烷，加热使其全部溶解，再加入DCC 6.8g （0.033 mol），冰浴搅拌1 h，然后加入苄基甘油醇2 g（0.011 mol），DMAP 1 g（0.0082 mol），25℃下反应72 h，薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（5/1）。待反应进行基本完全，停止反应，反应液静置12 h，抽滤，滤液分别用2 M盐酸、水和饱和NaCl萃取3次（150 mL×3），加入无水硫酸镁干燥，过夜，抽滤，滤液浓缩得二月桂酸甘油酯粗产物，干燥后为淡黄白色固体。

苄基二脂肪酸甘油酯的纯化：将粗产物用适量二氯甲烷溶解，加入等量柱层析硅胶（1:1），旋蒸除去溶剂，待全部产生白色粉末状固体时，用硅胶柱洗脱，展开剂为石油醚/乙酸乙酯（50/1），薄层板检测，收集馏分蒸干，得苄基二脂肪酸甘油酯的白色固体。

e) 二脂肪酸甘油酯（

Figure 2011102359547100002DEST_PATH_IMAGE012

）的合成

将苄基二脂肪酸甘油酯2 g加入单口瓶中，再加入40 mL四氢呋喃，搅拌使溶解，然后加入0.4 g钯碳，25℃。单口瓶上接球形冷凝管，密封，先用氩气排去体系中的空气，反复3次，然后再用氢气排去体系中的氩气，使整个反应在氢气流下反应10 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（5/1），碘熏显色。待反应进行基本完全，停止反应，反应液抽滤，滤液蒸干，得到白色固体。

f) 二脂肪酸甘油酯（）的活化

将二脂肪酸甘油酯4 g（8.75 mmol）置于三颈瓶中，加入200 mL干燥四氢呋喃，再加入羰基二咪唑（CDI）7.1 g（35 mmol），45℃下反应24 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（1/3）。待反应进行基本完全，停止反应，将反应液蒸干，除去四氢呋喃，向得到的固体中加入100 mL无水乙醇，冰浴下搅拌2 h，抽滤，滤饼干燥，得白色固体。

g) 聚乙二醇二脂肪酸甘油酯（I）的合成

Figure 2011102359547100002DEST_PATH_IMAGE016

将二脂肪酸甘油酯活化产物2 g（3.2 mmol）置于三颈瓶中，加入100 mL干燥四氢呋喃，搅拌使溶解，然后加入不同链长的mPEG，再加入50 mL三乙胺，45℃下反应72 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：二氯甲烷/甲醇（10/1），碘熏显色。待反应进行基本完全，停止反应，反应液蒸干，除去四氢呋喃和三乙胺，剩余物加入100 mL无水乙醚，冰浴搅拌2 h，抽滤，滤饼干燥得白色固体。

将该白色固体用适量二氯甲烷溶解，加入等量柱层析硅胶（1:1），旋蒸除去溶剂，待全部变成白色粉末状固体时，用硅胶柱洗脱，展开剂：乙酸乙酯/石油醚（50/1），洗脱12 h，再用二氯甲烷/甲醇（30/1）洗脱6 h，最后用二氯甲烷/甲醇（20/1）洗脱，薄层板检测，收集馏分蒸干，得聚乙二醇二脂肪酸甘油酯。¹H-NMR谱图见附图1和2。

（2）双链聚乙二醇二脂肪酸甘油酯（II）的合成方案

a) 苄基甘油醇（）的活化

将苄基甘油醇1.0 g（mmol）置于三颈瓶中，加入50 mL干燥四氢呋喃，再加入羰基二咪唑（CDI）7.1 g（35 mmol），45℃下反应10 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：石油醚/乙酸乙酯（1/1）。待反应进行基本完全，停止反应，将反应液蒸干，除去四氢呋喃，向得到的固体中加入20 mL水，用乙酸乙酯快速萃取3次（20 mL×3），合并乙酸乙酯层，加入无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，滤液蒸干，得白色固体，熔点为50-52。

b)苄基二聚乙二醇甘油酯（

）的合成

Figure 2011102359547100002DEST_PATH_IMAGE020

将苄基甘油醇活化产物置于三颈瓶中，加入干燥四氢呋喃100 mL，再加入不同链长的mPEG，45℃下反应48 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：二氯甲烷/甲醇（10/1）。待反应进行基本完全，停止反应，反应液蒸干，向剩余物中加入100 mL无水乙醚，冰浴搅拌2 h，抽滤，滤饼干燥，所得白色固体为苄基二聚乙二醇甘油酯粗产物，不做处理，直接进入下一步反应。

c) 二聚乙二醇甘油酯（

）的合成

将苄基二聚乙二醇甘油酯2 g加入单口瓶中，再加入40 mL四氢呋喃，搅拌使其溶解，然后加入0.4 g钯碳，25℃。单口瓶上接球形冷凝管，密封，先用氩气排去体系中的空气，反复3次，然后再用氢气排去体系中的氩气，使整个反应在氢气流下持续进行10 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：二氯甲烷/甲醇（10/1），碘熏显色。待反应进行基本完全，停止反应，反应液抽滤，滤液蒸干，得到二聚乙二醇甘油酯1.8 g，产率为90%。熔点：57-58℃，直接进入下一步反应。

d) 双链聚乙二醇二脂肪酸甘油酯（II）的合成

将二脂肪酸甘油酯活化产物2 g（3.2 mmol）置于三颈瓶中，加入100 mL干燥四氢呋喃，搅拌使其溶解，然后加入4g 二聚乙二醇甘油酯（1.0 mmol），再加入50 mL干燥三乙胺，45℃下反应72 h。薄层层析（TCL）检测反应，展开剂：二氯甲烷/甲醇（8/1），碘熏显色。待反应进行基本完全，停止反应，反应液蒸干，除去四氢呋喃和三乙胺，向剩余物中加入100 mL无水乙醚，冰浴搅拌2 h，抽滤，滤饼干燥得白色固体。

将该白色固体用适量二氯甲烷溶解，加入等量柱层析硅胶（1:1），旋蒸除去溶剂，待全部产生白色粉末状固体时，用硅胶柱洗脱，展开剂为乙酸乙酯/石油醚（50/1），洗脱12 h，再用二氯甲烷/甲醇（30/1）洗脱6 h，最后用二氯甲烷/甲醇（20/1）洗脱，薄层板检测，收集馏分蒸干，得到双链聚乙二醇二脂肪酸甘油酯。¹H-NMR谱图见附图3。

本发明制备的聚乙二醇二脂肪酸甘油酯可作为两类药物传递的载体，第一类是高效、高毒、难溶的药物，包括阿霉素、紫杉醇等、维甲酸、羟基喜树碱、亮菌甲素、尼莫地平等，第二类是生理环境下不稳定且细胞摄取率低的药物，主要为基因类药物，如DNA等。

附图说明

图1为实施例1制备的聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯的核磁谱图；

图2为实施例1制备的聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯的核磁谱图；

图3为实施例1制备的双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯的核磁谱图；

图4为实施例1制备的聚乙二醇2000、聚乙二醇5000和双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯阿霉素自组装胶束的结构示意图（a：聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束；b：聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯胶束；c：双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束）；

图5为实施例1制备的聚乙二醇2000、聚乙二醇5000和双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯阿霉素自组装胶束的粒径图（a：聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束，平均粒径16.86 nm；b：聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯胶束，平均粒径22.45 nm；c：双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束，平均粒径20.14 nm；）；

图6为实施例1制备的聚乙二醇棕榈酸酸甘油酯阿霉素自组装胶束的粒径图（平均粒径14.26 nm）；

图7为实施例1制备的聚乙二醇二肉豆蔻酸甘油酯阿霉素自组装胶束的粒径图（平均粒径：11.3 nm）；

图8为实施例1制备的聚乙二醇二月桂酸甘油酯阿霉素自组装胶束的粒径图（平均粒径9.8 nm）；

图9为实施例1制备的聚乙二醇2000、聚乙二醇5000和双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯阿霉素自组装胶束的电镜图（a：聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束；b：聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯胶束；c：双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束）；

图10为阿霉素溶液的释放；

图11为实施例1制备的聚乙二醇2000、聚乙二醇5000和双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯阿霉素自组装胶束的（a：聚释放曲线乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束；b：聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯胶束；c：双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯胶束）；

图12为实施例1聚乙二醇2000二棕榈酸甘油酯制备的阿霉素胶束的释放曲线；

图13为实施例1聚乙二醇2000二肉豆蔻酸甘油酯制备的阿霉素胶束的释放曲线；

图14为实施例1聚乙二醇2000二月桂酸甘油酯制备的阿霉素胶束的释放曲线；

图15为实施例1制备的聚乙二醇2000、聚乙二醇5000和双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯阿霉素自组装胶束与阿霉素溶液的药时曲线；

图16为实施例1制备的聚乙二醇2000、聚乙二醇5000和双链聚乙二醇2000二硬脂酸甘油酯阿霉素自组装胶束的组织分布结果。

具体实施方式：

本发明制备的聚乙二醇二脂肪酸甘油酯作为载体，阿霉素为模型药物，制备的自组装胶束如下：

实施例1阿霉素自组装胶束的制备

分别称取聚乙二醇2000二硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸和月桂酸甘油酯，聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯、双链聚乙二醇二硬脂酸甘油酯200 mg，置于100 mL茄形瓶中，加入3 mL三氯甲烷，加入盐酸阿霉素甲醇溶液（1mg/ mL）8 mL，再加入2 mL三乙胺，混合1 h，蒸干溶剂，形成含药脂膜，再干燥2小时，使有机溶剂完全除尽，得到红色含药脂膜，然后加入HBS缓冲液（pH7.4）5 mL，在37℃下磁力搅拌4 h，用0.22 μm 滤膜过滤，测定粒径。聚乙二醇2000二硬脂酸、聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯、双链聚乙二醇二硬脂酸甘油酯结构示意图、电镜照片及各胶束粒径图及见附图2至图7所示。

由图2至图7可知，实施例1制备的阿霉素自组装胶束的平均粒径分别为16.86nm、22.45nm、20.14nm、14.26nm、11.3和9.8 nm，形状为球形。

实施例2 聚乙二醇二脂肪酸甘油酯制备的释放特征考察

采用动态透析法分别考察阿霉素溶液、聚乙二醇2000二硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸和月桂酸甘油酯胶束、聚乙二醇5000二硬脂酸甘油酯、双链聚乙二醇二硬脂酸甘油酯胶束的体外释药特征。移取1 mL胶束溶液于透析袋中，透析袋两端夹紧，置于含有150 mL释放介质的锥形瓶中，释放介质分别为为pH7.4、6.5、5.5、4.5 PBS缓冲液，在恒温（37℃）振荡器中以100 r/min进行体外释放度考察。分别在0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h取样5 mL，同时补充相应体积的释放介质，稀释后经0.45 μm微孔滤膜过滤，取20 μL进行HPLC测定。结果见附图8、图9、图10和图11。

由图8、图9、图10和图11可知，各聚乙二醇二脂肪酸甘油酯所制备的PEG化胶束均能延长阿霉素的释放时间，并具有pH敏感特征，在低pH环境下，可以较快地释放胶束中包封的药物，而在生理pH下释放较为缓慢。

实施例2 聚乙二醇二硬脂酸甘油酯制备的阿霉素载药胶束的药代动力学研究

取30只健康、雄性大鼠，体重250 g左右，随机分为4组，给药前禁食12 h，自由饮水。一组静脉注射阿霉素溶液(DOX-sol)作为对照，其他三组分别静脉注射聚乙二醇二脂肪酸甘油酯阿霉素自组装胶束(DOX2000-M, DOX 5000-M和DOX- Gemini M)，剂量为5 mg/kg，给药后采血时间点：0.08、0.17、0.33、0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216、240h，在各采血时间点通过眼眶取血0.5 mL，取血后立即移入经肝素处理的试管中，离心10 min（13000×g），分离血浆，于–80℃冰箱中冷冻，依法测定，药时曲线见附图12。

由图12可知，给予阿霉素载药胶束后，与溶液组相比，阿霉素胶束消除半衰期显著延长，具有显著地长循环作用 (P<0.01)。

实施例3 聚乙二醇二硬脂酸甘油酯制备的阿霉素载药胶束的荷瘤小鼠组织分布研究

将荷瘤小鼠45只随机分为3组，每组5只，组内编号。一组静脉注射阿霉素溶液(DOX-sol)作为对照，其他两组分别静脉注射聚乙二醇二脂肪酸甘油酯阿霉素自组装胶束(DOX2000-M和DOX- Gemini M)，剂量为5 mg/kg，在给药后2 h、10 h、48 h，分别从每组中各取出5只小鼠，摘眼球取血，离心分离血浆（13000×g）；立即解剖分离心、肝、脾、肺、肾和脑，用生理盐水洗净表面血液后用滤纸吸干表面水分，装入自封袋，血浆和组织样品于–80℃冰冻保存。

取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤的组织样品约0.2 g（对于质量不足0.2 g的组织全取），精密称定，加入1 mL PBS缓冲液（pH 7.4）进行匀浆，取50 μL匀浆液，依法测定。结果见附图13。

由图13可知，在心脏中，给药后2 h，12 h和48 h，载药胶束的药物浓度显著低于溶液组。结果表明载药胶束可以降低阿霉素对正常组织的毒性。

在肝中，给药后2 h时，载药胶束在肝中的浓度显著高于溶液组，在12 h和48 h后，与药物溶液没有显著性差异，但载药胶束的药物浓度都呈下降趋势，溶液组没有下降趋势。结果表明，载药胶束在给药后，迅速聚集于肝脏，但是能够避免肝的巨噬细胞吞噬，使进入血液循环的药量增加。

在脾中，给药后2 h和12h，载药胶束的的药物浓度与药物溶液相比，无显著性差异，在48 h时，载药胶束的浓度显著低于药物溶液。结果表明载药胶束能避免脾的巨噬细胞吞噬，进入血液循环，将更多的药物输送到肿瘤组织。

在肺和肾中中，给药后2 h和12 h和48 h，载药胶束的药物浓度与溶液组没有显著性差异

在脑中，给药后2 h，12 h和48 h，阿霉素溶液和载药胶束均没有分布。

在血浆中，在给药后2 h，阿霉素溶液和载药胶束的药物浓度没有显著性差异，但12 h和48 h，载药胶束的药物浓度显著高于溶液组。

在肿瘤中，给药后2 h，12 h和48 h，载药胶束的药物浓度显著高于溶液组，同时载药胶束在肿瘤组织中的药物浓度有逐渐升高的趋势，在肿瘤部位维持一定的浓度。结果表明载药胶束能够通过EPR效应不断地蓄积于肿瘤组织，慢慢地释放药物，从而产生抗肿瘤效果。