CN112175103A - 一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(PSA‑PG)及其合成方法和其在药物制剂中的应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。所述的PSA‑PG结构式为：
Figure DDA0002748683830000011
其中，PSA表示聚唾液酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在PSA分子中PG片段的数目，(X+Y)为PSA分子中唾液酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤80，2≤(X+Y)≤200，X/(X+Y)为0.5％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。PSA‑PG修饰或制备的微粒制剂具有高理化稳定性，低免疫原性，体内长循环性，以及高度肿瘤靶向性。

Description

一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方 法和其在药物制剂中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。
背景技术
所有的疾病都是一个过程，而非一个状态，免疫系统一直参与其中。免疫学与药剂学有机结合之后，我们可以将躲避免疫识别的策略转化为利用免疫系统进行药物递送系统(Drug delivery system，DDS)设计达到高效靶向目的。因此，纳米技术在未来的药物递送系统(DDS)中，所涉及的关键环节主动“找”到免疫细胞，改善免疫环境，依靠强大的免疫系统治愈疾病。
经典免疫学理论指出，各种白细胞的百分比为：中性粒细胞50～70％；嗜酸性粒细胞1～4％；嗜碱性粒细胞0～1％；淋巴细胞20～40％；单核细胞为1～7％(3～8％)，其中具有吞噬能力的细胞为中性粒细胞与单核细胞。占比最多的中性粒细胞来源于骨髓的造血干细胞，在骨髓中分化发育后，进入血液或组织，其在骨髓、血液与结缔组织的分布数量比是28:1:25(大约52％、2％、46％，也有文献指出，骨髓里的中性粒细胞是血液里的中性粒细胞100倍)。中性粒细胞的血液循环时间(血液中存在时间)约为6-8小时，然后离开血液，穿过血管壁进入组织，进入组织后不再返回血液中来。最为重要的是，中性粒细胞是血液中的第一道防线，是冲锋陷阵的先头部队士兵，而单核吞噬细胞(巨噬细胞)处理伤亡士兵。当纳米载体进入体内时，最早响应的是中性粒细胞。因此，可以利用中性粒细胞靶向肿瘤与炎症部位，类似于“搭顺风车”。简而言之，可以设计一种主动去“找”中性粒细胞的策略，而不是“躲”，达到高效靶向治疗的目的。
那么，如何去“找”？相关研究成果证明，所有血液循环中的中性粒细胞表面上均表达L-Selectin，即使是衰老的中性粒细胞，也表达L-Selectin，只是数量有所下降(Zhang,D.,et al.,Neutrophil ageing is regulated by the microbiome.Nature,2015,525:528-532.)，其配体便是唾液酸类物质(Zarbock,A.and K.Ley,Mechanisms andconsequences of neutrophil interaction with the endothelium.The Americanjournal of pathology,2008,172(1):1-7.)。有研究证明，肿瘤微环境中存在大量中性粒细胞，成为肿瘤相关中性粒细胞(Tumor associated neutrophil，TAN)，通过杀伤TAN可以重塑肿瘤微环境，有效抑制肿瘤生长(Zvi,G,Fridlender,et al.Polarization of Tumor-Associated Neutrophil Phenotype by TGF-β:"N1"versus"N2"TAN[J].Cancer Cell,2009.)。
聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是多个唾液酸(Sialic acid，SA)单体以α-2,8与/或α-2,9连接的同聚物，其中以α-2,8连接的PSA无免疫原性且可生物降解。实验证明，PSA能够赋予所修饰分子较长的血液循环时间，目前的研究发现其在蛋白分子的修饰方面表现出较好的效果。有研究指出，PSA化门冬酰氨酶无免疫原性，且门冬酰氨酶的活性几乎不受影响，但使用PEG修饰后活性严重下降。另外，PSA在消除所修饰蛋白/多肽的免疫原性与抗原性的同时似乎并不影响它们与相应受体的结合。同时，我们意识到PSA既可以发挥免疫伪装作用，又可以“搭顺风车”，与中性粒细胞等细胞表面上的Selectin、Siglec结合，利用中性粒细胞独特的变形穿过血管壁功能，在组织中释放药物，实现靶向递送药物目的，提高疗效(Luo X,Hu L,Zheng H,et al.Neutrophil-mediated delivery of pixantrone-loaded liposomes decorated with poly(sialic acid)–octadecylamine conjugatefor lung cancer treatment[J].Drug Delivery,2018,25(1):1200-1212.)。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，基于免疫学与药剂学的理论，利用PSA作为配体，主动靶向免疫细胞，对疾病进行免疫治疗。提出一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用，应用PSA-PG修饰的纳米制剂能够与中性粒细胞表面上的唾液酸受体(Selectin、Siglec)结合，“找”到中性粒细胞，以中性粒细胞作为药物载体，同时充分考虑免疫细胞的功能性特征，从而产生更优秀的药理活性。
本发明是通过如下技术方案实现的：
提供一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(PSA-PG)，所述聚唾液酸基团中各个唾液酸单元间通过α-2,8-糖苷键连接，α-2,8-聚唾液酸分子上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：
Figure BDA0002748683810000031
其中，PSA表示聚唾液酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在PSA分子中PG片段的数目，(X+Y)为PSA片段中唾液酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤80，2≤(X+Y)≤200，X/(X+Y)为0.5％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。
优选地，5≤X≤20，10≤(X+Y)≤100，X/(X+Y)为5％～30％，1≤n≤12，8≤m≤20。
在一些实施例中，所述PSA的聚合度是2-200，平均分子量为600-60000道尔顿；优选地，所述PSA的聚合度为10-100；平均分子量为3000-30000道尔顿。
在一些实施例中，所述PG的聚甘油部分具有1-100甘油重复单元，平均分子量为92-7400道尔顿；优选地，所述PG的聚甘油部分具有1-40甘油重复单元，平均分子量为92-3000道尔顿；更优选地，所述PG的聚甘油部分具有1-12甘油重复单元，平均分子量为92-1500道尔顿。
在一些实施例中，所述PG的非极性碳氢链数量为1～3，分别为1条碳氢链(聚甘油单脂肪酸酯)，2条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)，3条碳氢链(聚甘油三脂肪酸酯)，优选一条碳氢链(聚甘油单脂肪酸酯)和两条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)。
在一些实施例中，所述PG的碳氢链长度包含4～32个碳原子的烷基和烯基；优选地，所述PG的碳氢链选自辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生四烯酸，油酸中的一种或多种；更优选地，所述PG的碳氢链选自棕榈酸和硬脂酸中的至少其中之一。
本发明还提供一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物的合成方法，所述合成方法包括：反应投料比例为，PSA/PG/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；首先，将PSA溶在5mL的甲酰胺(FA)中，加入EDC/NHS，活化1.5h，此时体系澄清，PSA浓度为1～500mg/mL，EDC浓度为1～400mg/mL，NHS浓度为1～200mg/mL；再将溶解在2mL的FA中的PG加入反应体系中，PG浓度为1～500mg/mL；然后，加入TEA浓度为0.1～200mg/mL，氮气保护下，室温搅拌反应48h。将反应液转移至透析袋(MWCO 8～14kDa，美国光谱)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1/100)体系，透析介质体积为1000mL，每隔4h换透析介质，累计透析24h；随后，采用旋转蒸发除去80％水，冷冻干燥剩余溶液，得到白色絮状物质，即为合成物质PSA-PG。
本发明还提供一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物在药物制剂中的应用，尤其是所述PSA-PG在微粒给药制剂的制备和修饰中的应用，所述的微粒给药制剂可以为胶束、脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。PSA-PG与药物可以直接组装制备成纳米胶束，也可以选择磷脂、泊洛沙姆、吐温、司盘等表面活性剂混合组装制备成脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。药物与PSA-PG的质量比为1:3～1:80；优选地，药物与PSA-PG的质量比为1:5～1:20。
综上所述，本发明提供了一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用，该衍生物制备的纳米制剂能够主动靶向中性粒细胞，进行免疫治疗；同时，PSA-PG具有极好的保湿和防腐功能，可应用于皮肤保护功能的化妆品等。本发明的PSA-PG采用无免疫原性的PSA和PG通过共价偶联获得，其生物相容性和生物可降解性较好，并且PSA-PG具有两亲性，能够稳定修饰在纳米制剂表面，具备良好的临床转化和产业化开发前景。
附图说明
图1为聚唾液酸-十聚甘油二硬脂酸酯的1H-NMR；
图2为聚唾液酸-十二聚甘油二棕榈酸酯的1H-NMR；
图3为聚唾液酸-六聚甘油月桂酸酯的1H-NMR；
图4为聚唾液酸-三聚甘油辛酸酯的1H-NMR；
图5为重复注射PSA-PG10-2C18修饰脂质体的药动学(A)和组织分布(B)；
图6为DOX-PSAL的荷瘤小鼠体内药动学行为；
图7为S180荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；
图8为S180荷瘤小鼠肿瘤生存曲线；
图9为流式细胞仪分析中性粒细胞纯度；
图10为激光共聚焦显微镜成像中性粒细胞摄取DOX溶液和DOX-PSAL。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明提供一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(PSA-PG)，所述聚唾液酸基团中各个唾液酸单元间通过α-2,8-糖苷键连接，α-2,8-聚唾液酸分子上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：
Figure BDA0002748683810000051
其中，PSA表示聚唾液酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在PSA分子中PG片段的数目，(X+Y)为PSA片段中唾液酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤80，2≤(X+Y)≤200，X/(X+Y)为0.5％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。
材料来源：
本发明中，所用PSA的聚合度分别为2、3、4、5、6、10、16、32、100、130～170、200～270，对应分子量分别为644.50，957.73，1270.97，1584.21，1897.45以及平均分子量为3000，5000，16000，30000，4～5万与6～8万道尔顿。聚合度2～10的PSA购买自美国Nacalai公司；PSA(平均分子量11.0kDa；平均分子量22.7kDa；平均分子量39.0kDa)，来自Camida，爱尔兰；PSA平均分子量30kDa购自英国carbosynth公司(卡博森斯化学科技(苏州)有限公司)；其余分子量的PSA自制。
实施例1聚唾液酸-十聚甘油二硬脂酸酯的合成
本发明所述的PSA-PG制备过程：首先，投料比例为聚唾液酸(PSA)/十聚甘油二硬脂酸酯(PG10-2C18)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量PSA溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG10-2C18加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10kDa)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质聚唾液酸-十聚甘油二硬脂酸酯(PSA-PG10-2C18)。
在IR光谱中，PSA-PG10-2C18在1730.9cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于PSA，其在2920.3，2848.7cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在720cm-1处有直链碳数大于7的峰。
请参考图1，PSA的特征峰(–COCH3)在δ2.00ppm可以检测到。δ1.26ppm和δ0.88ppm处的两个峰分别对应于PG10-2C18中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与PSA相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/(X+Y)
DS可通过1H-NMR谱图中PG10-2C18上的1.26ppm的特征-CH2-质子峰(60H，不包括酯键相邻的-CH2-)与PSA单元上的2.00ppm的特征–COCH3质子峰(3H)的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：
δ1.26ppm＝4.00δ2.00ppm＝1.00
DS＝4.00×3/(1.00×60)×100％＝20.0％(此公式中，X为20，X+Y为100。)
实施例2聚唾液酸-十二聚甘油二棕榈酸酯的合成
本发明所述的PSA-PG制备过程：首先，投料比例为聚唾液酸(PSA)/十二聚甘油二棕榈酸酯(PG12-2C16)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量PSA溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG12-2C16加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10kDa)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质聚唾液酸-十二聚甘油二棕榈酸酯(PSA-PG12-2C16)。
在IR光谱中，PSA-PG12-2C16在1735.4cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于PSA，其在2921.5，2850.2cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在719cm-1处有直链碳数大于7的峰。
如图2所示，PSA的特征峰(–COCH3)在δ2.01ppm可以检测到。δ1.26ppm和δ0.90ppm处的两个峰分别对应于PG12-2C16中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与PSA相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/(X+Y)
DS可通过1H-NMR谱图中PG12-2C16上的1.26ppm的特征-CH2-质子峰(52H，不包括酯键相邻的-CH2-)与PSA单元上的2.00ppm的特征–COCH3质子峰(3H)的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：
δ1.31ppm＝3.02δ2.01ppm＝1.00
DS＝3.02×3/(1.00×52)×100％＝17.3％(此公式中，X为17.3，X+Y为100。)
实施例3聚唾液酸-六聚甘油月桂酸酯的合成
本发明所述的PSA-PG制备过程：首先，投料比例为聚唾液酸(PSA)/六聚甘油月桂酸酯(PG6-C12)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量PSA溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG6-C12加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10kDa)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质聚唾液酸-六聚甘油月桂酸酯(PSA-PG6-C12)。
在IR光谱中，PSA-PG6-C12在1729.6cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于PSA，其在2923.2，2852.5cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在721cm-1处有直链碳数大于7的峰。
如图3所示，PSA的特征峰(–COCH3)在δ1.98ppm可以检测到。δ1.25ppm和δ0.89ppm处的两个峰分别对应于PG6-C12中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与PSA相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/(X+Y)
DS可通过1H-NMR谱图中PG6-C12上的1.25ppm的特征-CH2-质子峰(18H，不包括酯键相邻的-CH2-)与PSA单元上的1.98ppm的特征–COCH3质子峰(3H)的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：
δ1.25ppm＝0.73δ1.98ppm＝1.00
DS＝0.73×3/(1.00×18)×100％＝12.1％(此公式中，X为12.1，X+Y为100。)
实施例4聚唾液酸-三聚甘油辛酸酯的合成
本发明所述的PSA-PG制备过程：首先，投料比例为聚唾液酸(PSA)/三聚甘油辛酸酯(PG3-C8)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；将适量PSA溶在5mL的甲酰胺(FA)，按比例加入EDC/NHS，4℃下活化90min，此时体系澄清；再将溶解在2mL的FA中的PG3-C8加入反应体系中，加入TEA，室温搅拌反应48h，反应溶液澄清；然后将反应液转移至透析袋(截留分子量10kDa)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1:100)体系，透析体积为1000mL透析，每隔4小时更换透析介质，累计透析24h；最后，旋转蒸发除去部分水，将剩余物质冷冻干燥，得到白色絮状物质，即为合成物质聚唾液酸-三聚甘油辛酸酯(PSA-PG3-C8)。
在IR光谱中，PSA-PG3-C8在1732.7cm-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于PSA，其在2915.3，2843.8cm-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在720cm-1处有直链碳数大于7的峰。
如图4所示，PSA的特征峰(–COCH3)在δ2.00ppm可以检测到。δ1.31ppm和δ0.92ppm处的两个峰分别对应于PG3-C8中的-CH2-和-CH3上的H，其余各峰与PSA相似。
接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/(X+Y)
DS可通过1H-NMR谱图中PG3-C8上的1.31ppm的特征-CH2-质子峰(10H，不包括酯键相邻的-CH2-)与PSA单元上的2.00ppm的特征–COCH3质子峰(3H)的相对强度之比获得：
通过1H-NMR上积分换算可得：
δ1.31ppm＝0.22δ2.00ppm＝1.00
DS＝0.22×3/(1.00×10)×100％＝9.5％(此公式中，X为9.5，X+Y为100)
实施例5PSA-PG衍生物临界胶束浓度(CMC)的测定
根据实施例1～4中合成的PSA-PG10-2C18、PSA-PG12-2C16、PSA-PG6-C12、PSA-PG3-C8分子结构分析，其中均存在亲水端(PSA基团)和亲脂端(PG中的碳氢链)，作为高分子嵌段物能够在水中自发形成胶束，可以利用荧光探针法测定其临界胶束浓度。
精密移取0.1mL浓度为1×10-5M芘工作液若干份于西林瓶中，氮气吹干，精密称取每种PSA-PG衍生物若干份，置于上述西林瓶中，分别加10mL纯水，得到芘工作液的浓度为10-7M(芘在水中的饱和溶解度为7×10-7M)，水浴超声30min，放置过夜，即得到浓度分别为5×10-4，1×10-3，3×10-3，5×10-3，1×10-2，3×10-2，5×10-2，1×10-1，5×10-1，1，5g/L的PSA-PG衍生物溶液。将上述芘的水溶液以393nm作为发射波长在300nm-350nm波长范围内扫描，叠加各激发波长图谱并记录数据。以340nm和335nm的荧光强度(I340/I335)之比为纵坐标，对数浓度值为横坐标作图，曲线的拐点即为PSA-PG衍生物的CMC值。如表1所示，PSA-PG10-2C18、PSA-PG12-2C16、PSA-PG6-C12、PSA-PG3-C8的CMC值分别为1.3±0.2、3.5±1.1、25.6±2.5、47.3±4.1μg/mL。由于PSA-PG10-2C18衍生物具有较低的CMC，更容易自组装形成胶束等纳米制剂，因此，后面实施例中未注明处均采用PSA-PG10-2C18。
表1 PSA-PG衍生物的临界胶束浓度
Figure BDA0002748683810000101
实施例6多西他赛PSA-PG10-2C18胶束制备
称取一定量的多西他赛(DTX)、PSA-PG10-2C18共同溶解在乙醇中，药物与载体的质量比为1:10、1:20及1:40，在磁力搅拌下缓慢滴入去离子水，继续搅拌30min。将所得的溶液装入透析袋中，室温下，用去离子水透析48h，除去乙醇，过0.45和0.22μm的微孔滤膜除去未包封的多西他赛。采用ZS90激光测定仪测定各组制剂的平均粒径在30-60nm之间，均小于100nm。其中在比例为1:20中载药量为0.019g/g，包封率为37.4％，7天内未见结晶析出，稳定性良好。
实施例7 PSA-PG10-2C18修饰装载多柔比星(DOX)脂质体的制备
制备工艺如下：根据表2处方称取脂质体膜材置于西林瓶中，加入500μL无水乙醇并于65℃水浴中搅拌溶解。待膜材及药物溶解后，敞开体系，继续搅拌挥除80％无水乙醇。以1mL·S-1的速度将预热至相同温度的柠檬酸-柠檬酸钠溶液(200mM，pH 4.0)注入膜材中，注入5mL。65℃水浴搅拌20min，得到脂质体初品。将初品超声分散处理(功率和时间：200W×2min+400W×6min，工作1s间歇1s)，后依次通过0.80、0.45、0.22μm微孔滤膜，即得空白脂质体(磷脂浓度为50mg·mL-1)。取空白脂质体混悬液适量，加入磷酸钠溶液(500mM)调节外水相pH，再加入适量灭菌注射用水，混合均匀，即得pH梯度脂质体。按照药脂比1:10(wt/wt)将上述梯度脂质体与4.0mg·mL-1DOX药物溶液混合，60℃水浴搅拌孵育，20min后取出，置于冰水浴2min终止载药，即得多柔比星脂质体(DOX)。
表2 DOX脂质体处方
Figure BDA0002748683810000111
DiR脂质体制备处方如表3所示，制备工艺与DOX脂质体相同，只需将DiR替换DOX。
表3 DiR脂质体处方
Figure BDA0002748683810000112
实施例8 PSA-PG10-2C18修饰白藜芦醇乳剂的制备
制备工艺：根据表4处方参数，将处方量水相55℃预热备用。将处方量油相(RES、MCT、S90G、PSA-PG10-2C18)于55℃下搅拌至全部溶解。搅拌下将预热至相同温度的水相加入油相，高速分散，即得初乳。探头超声(200w×2min；400w×6min)处理后，过0.22μm微孔滤膜除菌即得(修饰密度约为总磷脂量的10％，mol/mol)。实验结果表明，所得RES乳剂的平均粒径为98.1±3.8nm，Zeta电位-42.5±3.3mV，4℃放置6个月后粒径与电位无显著性变化，RES含量仍高达为98.7±0.5％，也无分层和乳滴合并现象，制剂稳定性良好。
表4 PSA-PG10-2C18修饰乳剂处方
Figure BDA0002748683810000121
实施例9 PSA-PG10-2C18修饰姜黄素纳米粒的制备
制备方法：根据表5处方参数，适量乙醇溶解处方量的CUR、EPCs、GMS、PSA-PG10-2C18并于65℃搅拌下熔融；挥干乙醇，恒速注入预热至相同温度的5％葡萄糖溶液，孵育10min；之后探头超声8min，超声工艺为200w条件下2min，400w条件下6min，过0.22μm微孔滤膜。实验结果表明，固体纳米粒的粒径为167.6±5.4nm，Zeta电位为-48.4±4.2mV，包封率为95.2±3.7％，4℃放置6个月粒径、电位和包封率无明显变化，表明制剂稳定性良好。
表5 PSA-PG10-2C18修饰纳米粒处方
Figure BDA0002748683810000122
Figure BDA0002748683810000131
实施例10 PSA-PG10-2C18修饰多柔比星囊泡的制备
制备方法：根据表6所示处方参数，60℃下将处方量Tween80、S80、CH、PSA-PG10-2C18用适量乙醇溶解，挥干乙醇后，搅拌条件下加入溶解有DOX的灭菌注射用水溶液，使用葡聚糖凝胶(G50)柱层析除去外水相的DOX，即得到包封有DOX的由PSA-PG衍生物修饰的囊泡。实验结果表明，所得囊泡的平均粒径为120.3±4.8nm，Zeta电位-55.4±4.3mV，包封率为38.2％，4℃放置6个月粒径、电位和包封率无明显变化，表明制剂稳定性良好。
表6 PSA-PG10-2C18修饰多柔比星囊泡处方
Figure BDA0002748683810000132
实施例11 PSA-PG急性毒性初步实验
PSA-PG衍生物溶液的制备：取PSA-PG衍生物适量，加入50.0mg蛋黄卵磷脂E80，500μL无水乙醇溶解，加灭菌注射用水稀释至5mL，过0.22μm微孔滤膜即得。
PSA-PG衍生物急性毒性考察方案：81只小鼠随机分为27组，每组3只，即PSA-PG10-2C18、PSA-PG12-2C16、PSA-PG6-C12、PSA-PG3-C8(由实施例1～4所合成)四个制剂组，每个制剂组又分为高、中、低三个剂量组，分别为PSA-PG10-2C18药效学试验中给药制剂中材料的1000、100和10倍。各组小鼠以不同剂量给予相应的制剂，尾静脉给药后，1h内即时记录各组小鼠的死亡时间，随后每隔1h记录小鼠死亡时间，至24h结束试验。计算各组小鼠的平均存活时间，结果见表7。
表7 PSA-PG衍生物的药动学实验结果
Figure BDA0002748683810000141
*ND代表小鼠存活时间超过24h.
由上表可知，材料PSA-PG6-C12在10mmol·kg-1的给药剂量下，小鼠平均存活时间仅为5min，提示了PSA-PG6-C12潜在的毒性；材料PSA-PG10-2C18、PSA-PG12-2C16、PSA-PG3-C8在药效学给药剂量1000倍时(10mmol·kg-1)，仍未出现小鼠死亡现象，其致死剂量可能远远高于10mmol·kg-1。此外，分别对上述材料以10mmol·kg-1的剂量腹腔注射，均未观察到小鼠死亡现象，充分体现了上述实施例中合成材料低毒性的优势。
实施例12 PSA-PG10-2C18体内重复注射ABC现象的实验
为了考察重复注射在大鼠体内的药动学及组织分布，给药方案如表8。根据实施例7中的处方工艺制备脂质体。首次注射，DiR-PSAL和DiR-PEGL以磷脂剂量为0.01μmol/kg尾静脉注射，间隔7天以5μmol磷脂/kg的剂量二次注射DiR-PEGL脂质体。对照组首次注射5％的葡萄糖注射液。二次给药后分别于0.083、0.25、0.5、1、2、4h经眼眶静脉丛取血，4500rpm离心10min获取血浆。4h后处死动物，取出肝脾，生理盐水洗净，滤纸吸干，所得血浆及组织样品于-20℃冷冻保存待用。
结果：如图5所示，重复注射DiR-PEGL后其DiR的血浆浓度迅速降低(P<0.01)，肝脾聚集量显著增加，即DiR-PEGL会引起严重的ABC现象。然而，DiR-PSAL的药动曲线首次和二次基本相似。肝脾聚集量没有差异，结果表明，SL重复注射不会诱导ABC现象。
表8重复注射PSA-PG10-2C18修饰脂质体的药动学实验结果
Figure BDA0002748683810000151
注：ABC index用来评价ABC现象强弱。ABC index＝AUC二次注射/AUC首次注射。
ABC index越大，表明诱导ABC现象越弱，本研究中，PSA修饰脂质体的ABC index(0–30min)为0.95±0.03，而PEG修饰脂质体为0.12±0.05，两者具有显著性差异(P<0.01)。结果表明PSA修饰脂质体会避免ABC现象的发生。
实施例13 PSA-PG10-2C18修饰DOX脂质体的S180荷瘤小鼠体内药动学实验
药动学实验：取12只健康雄性S180荷瘤昆明小鼠，瘤体积为300～400mm3，随机分成4组，每组3只，分别通过尾静脉注射Free DOX、DOX-PSAL、DOX-PEGL，DOX给药剂量为5mg·kg-1，并于给药后0.083、0.25、0.5、1、4、8、12和24h眼眶取血于肝素抗凝管中，4500rpm离心10min分离血浆，取所得血浆样品100μL，加入900μL甲醇/水(1/1,v/v)，涡旋5min，10000rpm离心10min，取上清液600μL至另一EP管中，继续10000rpm离心10min。取上清液200μL上样于96孔板中，在激发波长λex＝450nm和发射波长λem＝490nm下测定荧光强度F，并计算血浆中DOX注射剂量百分比(Injected dose，％ID)，以％ID对时间作图，得药动学曲线图，荷瘤小鼠给予不同制剂后药时曲线见图6。
由图6的药动学行为可知，令人振奋的是，DOX-PSAL和DOX-PEGL具有相似的药动学行为，DOX-PSAL具有更优秀的长循环特性，能够有效利用实体瘤高渗透长滞留效应(EPR效应)，为DOX-PSAL的抗肿瘤药效学奠定了良好的基础。
实施例14 PSA-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的体内抗肿瘤药效学实验
如图7和图8所示，S180抗肿瘤实验：将24只荷瘤小鼠随机分为4组，即对照组(Control，0.9％NaCl注射液，10mL·kg-1)、药物溶液组(Free DOX)、PEG修饰DOX脂质体组(DOX-PEGL)和PSA修饰DOX脂质体组(DOX-PSAL)组，每组6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后第3天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后第3、6、9、12和15天)，各组多柔比星的单次给药剂量均为5mg·kg-1。治疗期间每天记录小鼠死亡事件，隔天称量小鼠体质量并测量肿瘤长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积V＝0.5*a*b2。
实施例15荷瘤小鼠中性粒细胞分离
中性粒细胞采用天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的小鼠中性粒细胞分离液试剂盒(LZS1100)进行分离纯化，全过程样本、试剂及实验环境均在20±2℃的条件下进行。
1.制备抗凝血液，肝素加入量为10IU·mL-1全血。
2.取一支离心管，先加入分离液1：3mL，后加入80％浓度分离液1溶液(分离液1：样本稀释液＝4：1的混合液)：1.5mL，形成梯度界面。
3.制备血液样本：抗凝血液与红细胞沉降液按1:1比例混匀后，小心加于分离液梯度界面之上，800g离心20min。
4.离心后，血浆层下出现两层白色环状细胞层，取下层白色环状中性粒细胞层(会有少量红细胞混杂)，加3-5倍体积清洗液混匀，400g离心10min。
5.离心后弃上清，即得中性粒细胞。
随后，我们采用Biolegend公司的FITC偶联单克隆抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)和CD62L抗体特异性标记中性粒细胞。将分离纯化的小鼠中性粒细胞，用PBS洗一遍，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻吹打细胞，使之成为细胞悬液(1×106个/mL)，转移至细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养0.5h。取出培养瓶后，按250ng·mL-1加入FITC偶联单克隆抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)抗体和1μg·mL-1加入PE偶联单克隆抗小鼠CLM-5抗体，于5％CO2、37℃的培养箱中培养0.5h，收集细胞，5000rpm离心3min，去除上清液。加入PBS重悬细胞清洗，5000rpm离心3min，弃去上清，加入200μL、PBS重新分散细胞，在流式细胞仪上检测样品的荧光强度，每个样品收集1×104个细胞，采用FITC通道检测细胞荧光强度，用FlowJo 7.6.1软件分析数据。如图9所示，FITC-Gr-1和PE-CLM-5双阳性的中性粒细胞为96.4％，纯度较高，符合实验要求。
实施例16 PSA-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的细胞靶向性实验
为了进一步研究载体在细胞内转运行为，取对数生长期的S180细胞，小心吸走培养皿中的培养基，PBS清洗一遍后加入新鲜的培养基，轻轻吹打细胞使其成为细胞悬液。取洁净细胞爬片在75％乙醇中浸泡5min，用无菌的PBS洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于十二孔板内，接种细胞并置于5％CO2，37℃的培养箱中培养过夜,使其约为50％～80％满。更换培养基为含PSA-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的培养基和含多柔比星游离溶液的培养液(多柔比星浓度均为5mg/mL)，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养4h后。取出爬片细胞板，除去上清液，加入4％多聚甲醛固定细胞20min。固定完成后，弃去废液，使用PBS清洗三遍。加50μL DAPI工作液(细胞核染料)，室温避光孵育15min，染色结束后用冷的PBS清洗三次。轻轻甩干爬片，将抗荧光淬灭封片剂滴于载玻片上，从培养板中取出盖玻片，附着有细胞的一面向下扣在载玻片上，排除气泡，吸干溢出的封片剂，封边，最后爬片置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
如图10所示，DOX-PEGL由于PEG层的阻隔作用，S180细胞对DOX-PEGL摄取受阻，细胞质中的DOX较少，进入与细胞核蓝色染料叠加后呈现出浅紫色细胞核；令人惊喜的是，DOX-PSAL被S180细胞摄取之后，进入细胞的内含体与溶酶体，随着pH的逐渐降低，DOX-PSAL中的多柔比星加速释放，快速扩散，均匀分布于整个细胞中，但是细胞核区域多柔比星的分布量较溶液组少，与细胞核蓝色染料叠加后呈现出明显的紫色细胞核。证明中性粒细胞能够高效靶向摄取DiR-PSAL。因此，这也可以充分解释实施例14中，DOX-PSAL能通过靶向肿瘤相关中性粒细胞高效蓄积与肿瘤部位，释放DOX，杀伤肿瘤。
实施例17 PSA-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的细胞毒性实验
为了考察多柔比星制剂对S180肿瘤细胞活力的影响，我们采用只需要4小时即可显色的CCK8法进行测定。
1.将S180肿瘤细胞悬液100μL(约104个细胞)加入到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)。设置空白孔(有培养基，无细胞)与对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定3复孔。
2.置37℃，5％CO2孵育0.5小时，倒置显微镜下观察。
3.每孔加入10μL待检测不同浓度多柔比星制剂，37℃孵育。
4.每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育4小时。
5.测定450nm各孔的吸光值。
6.结果分析：将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。细胞活力％＝(加药细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100％，在通过拟合计算细胞活力为50％时的DOX制剂浓度，即为IC50，半数抑制浓度，该数值越小，对应制剂的细胞抑制能力越强。
如表9所示，CCK8实验结果显示，细胞抑制能力强弱顺序为：Free DOX>DOX-PSAL>DOX-PEGL，并且DOX-PSAL显著强于DOX-PEGL。虽然DOX游离药物溶液体外对S180细胞具有较强的抑制能力，但结合实施例13中的药动学行为，由于DOX游离药物溶液体内循环时间极短，肿瘤部位不能有效累积。因此，可以解释实施例14中DOX游离药物溶液体内抗肿瘤效果较差。结合实施例13中的药动学行为，虽然DOX-PSAL和DOX-PEGL均具有较好的体内长循环能力，但DOX-PEGL细胞摄取受阻，导致其对S180细胞抑制能力较差，而DOX-PSAL通过靶向肿瘤相关中性粒细胞，重塑肿瘤微环境，抑制肿瘤生长。
表9 DOX-PSAL对S180肿瘤细胞体外抑制效果
Figure BDA0002748683810000181
注：***表示p<0.001，**表示p<0.01，*表示p<0.05。
本文所描述的概念在不偏离其精神和特性的情况下可以实施成其它形式。所公开的具体实施例应被视为例示性而不是限制性的。因此，本发明的范围是由所附的权利要求，而不是根据之前的这些描述进行确定。在权利要求的字面意义及等同范围内的任何改变都应属于这些权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(PSA-PG)，其特征在于，所述聚唾液酸基团中各个唾液酸单元间通过α-2,8-糖苷键连接，α-2,8-聚唾液酸分子上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：
Figure FDA0002748683800000011
其中，PSA表示聚唾液酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在PSA分子中PG片段的数目，(X+Y)为PSA片段中唾液酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤80，2≤(X+Y)≤200，X/(X+Y)为0.5％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。
2.如权利要求1所述的含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物，其特征在于，5≤X≤20，10≤(X+Y)≤100，X/(X+Y)为5％～30％，1≤n≤12，8≤m≤20。
3.如权利要求1或2所述的含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物，其特征在于，所述PG的非极性碳氢链数量为1～3，分别为1条碳氢链(聚甘油单脂肪酸酯)，2条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)，3条碳氢链(聚甘油三脂肪酸酯)。
4.如权利要求3所述的含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物，其特征在于，所述PG的碳氢链选自辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生四烯酸，油酸中的一种或多种。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述的含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
投料比例为，PSA/PG/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；
PSA浓度为1～500mg/mL，PG浓度为1～500mg/mL，EDC浓度为1～400mg/mL，NHS浓度为1～200mg/mL，TEA浓度为0.1～200mg/mL；
氮气保护下，室温搅拌反应48h，将反应液转移至透析袋中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1/100)体系，透析介质体积为1000mL，每隔4h换透析介质，累计透析24h，采用旋转蒸发除去80％水，冷冻干燥剩余溶液，得到白色絮状物质，即为合成物质PSA-PG。
6.一种如权利要求1-4任意一项所述的含有聚唾液酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物在药物制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物制剂为微粒给药制剂，所述PSA-PG可应用于微粒给药制剂的制备和修饰。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微粒给药制剂为胶束、脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述微粒给药制剂中，药物与PSA-PG的质量比为1:3～1:80。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述微粒给药制剂中，药物与PSA-PG的质量比为1:5～1:20。
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