CN102391225A - 霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其在制备免疫抑制药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其在制备免疫抑制药物中的应用。Penicacids A、B,其具体结构如(I)所示,其中,Penicacids A:Ri=CH3,R2=OH;PenicacidsB:Ri=H,R2=OGlu;Penicacids C,具体结构如式(II)所示。通过对Penicacids A、B、C进行免疫抑制活性评估,发现Penicacids A、B、C对次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)有明显抑制作用,尤其是化合物Penicacids B具有良好的抑制活性。因此Penicacids A、B、C可以用于制备免疫抑制药物,用于肾脏、肝脏等器官移植中。
Description
技术领域:
本发明属于医药技术领域,具体涉及一类霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其在制备免疫抑制药物中的应用。
背景技术:
目前临床上,如果疾病无法用化学疗法治愈,则采用移植他人健康脏器来代替病体脏器或部分病体脏器的办法。对于肝脏、肾脏、心脏、角膜等移植的研究正在进行,器官移植的病例也在增加。然而,移植他人器官时最大的问题是自体的免疫排斥反应。因此,从20世纪70年代开始,科学家们进行了免疫抑制剂的研究,以防止被移植者的排斥反应。
霉酚酸(MPA)是在短密青霉(Penicillium brevicompactum)的发酵液中发现的活性物质,具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等多种活性。在1968年,霉酚酸被首次发现具有IMPDH抑制活性,在20世纪80年代,科学家们发现霉酚酸对小鼠具有免疫抑制活性。1998年,其衍生物2-吗啉基乙酯由FDA批准作为临床药物,商品名骁悉(CellCept),主要用于肾脏及心脏移植术后器官排斥的预防,并能与环孢霉素合用,降低后者的剂量和毒性。
发明内容:
本发明的第一个目的是提供具有免疫抑制活性的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其药用盐。
本发明的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其药用盐,其结构如式(I)和(II)所示:
式(I)
其中,Penicacids A:R1=CH3,R2=OH;Penicacids B:R1=H,R2=OGlu;
Penicacids C如式(II)所示:
式(II)。
本发明人在海洋真菌活性次级代谢产物筛选的基础上,发现真菌(Penicillium sp.)SOF07的发酵提取物采用HPLC-UV指导分离,分离纯化到3个活性化合物,经结构分析,3个活性化合物为霉酚酸的衍生物-Penicacids A、B、C,具体结构如式(I)和(II)所示。通过对Penicacids A、B、C进行免疫抑制活性评估,发现Penicacids A、B、C对次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)有明显抑制作用,尤其是化合物Penicacids B具有良好的抑制活性。由此可见,本发明的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C具有免疫抑制活性。
因此本发明的第二个目的是提供霉酚酸衍生物Penicacids A、Penicacids B或Penicacids C,或其药用盐在制备免疫抑制药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种免疫抑制药物,其特征在于,包括有效量的作为活性成分的Penicacids A、Penicacids B或Penicacids C,或其药用盐,和药学上可以接受的载体。
本发明的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C是新的化合物,具有免疫抑制活性,可以用 于制备免疫抑制药物,用于肾脏、肝脏等器官移植中作为抑制药物。因此本发明为开发新的免疫抑制药物提供了备选化合物,为用于肾脏、肝脏等器官移植提供了更多的免疫抑制药物选择。
本发明使用到的海洋真菌(Penicillium sp.)SOF07,该菌株保存中国科学院应用微生物研究网络海洋微生物研究中心,地址:中国广东省广州市海珠区新港西路164号,邮编:510301,该菌株是对外销售的,公众可以从该保藏中心购买到该菌株。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
Penicacids A、B、C的制备和结构鉴定
一、Penicacids A、B、C的制备
1.种子培养:
(1)配制种子培养基:土豆(去皮)200g,葡萄糖20g,海盐30g,加水定容到1L,平均分装于10个500mL的锥形瓶中,121℃灭菌25分钟,获得灭菌的种子培养基。
(2)种子的培养:将海洋真菌(Penicillium sp.)SOF07的菌株接入到上述种子培养基中,在28℃的温度下,置摇床上以150rpm的转速,培养48小时得种子培养液。
2.固体发酵培养:
(1)配制发酵培养基:大米2000g,海盐60g,水2000mL,平均分装于20个500mL的锥形瓶,121℃灭菌25分钟,获得灭菌的发酵培养基。
(2)发酵培养:
在超净工作台中,将10mL种子培养液接入装有发酵培养基的500mL锥形瓶中,置于25℃培养箱,静置培养21天,获得海洋真菌(Penicillium sp.)SOF07的发酵培养物。
3.提取分离:
待发酵完毕,在每个装有100ml的发酵培养物的500ml锥形瓶中加入200mL丁酮到发酵培养物中,室温提取3次,丁酮层减压旋转蒸干有机溶剂,得粗提物40.45g。
将粗提物经硅胶(100-200目)柱层析分离,采用氯仿-甲醇(体积比为100∶0,95∶5,9∶1,8∶2,0∶100)梯度淋洗,经减压浓缩后,顺序得到馏分Fr.1~Fr.5。馏分Fr.2(体积比为95∶5的氯仿-甲醇洗脱的馏分),再经硅胶(100-200目)柱层析分离,采用乙酸乙酯-石油醚(体积比10∶90→90∶10)梯度淋洗,获得馏分Fr.2-1~Fr.2-7。馏分Fr.2-4(体积比为1∶1的乙酸乙酯-石油醚洗脱的馏分),再经反相中压柱层析,用ODS色谱柱(20×90mm,40-63μm,YMC),以甲醇-水作为洗脱剂,流速15mL/min,0-60min,体积比20∶70→80∶20梯度洗脱,得到化合物1(tR=33min,11.0mg)和化合物3(tR=24min,42mg)。馏分Fr.3(体积比为9∶1的氯仿-甲醇洗脱的馏分),再经反相制备液相,用ODS色谱柱(YMC-Pack ODS-A,250×10mm,5μ),以CH3CN-H2O作为洗脱剂,流速2.5mL/min,0-30min,体积比55∶45恒梯度洗脱,得化合物2(tR=15.9,5.8mg)。
二、化合物1、2和3的结构鉴定
对上一步骤中分离得到的化合物1、2和3进行结构分析测试,得到以下理化性质数据:
化合物1.无定形固体; 紫外:215,250,304nm;1H-和 13C-NMR,见表1;(-)ESI-MS(m/z)349.2([M-H]-),(+)ESI-MS(m/z)370.8([M+Na]+);(-)HR-ESI-MS C18H22O7,理论值349.1521.
化合物2.无色油状物; 紫外:216,250,304nm;1H-和 13C-NMR,见表1;(-)ESI-MS(m/z)497.6([M-H]-),(+)ESI-MS(m/z)517.6([M+Na]+);(-)HR-ESI-MS C23H30O12,理论值497.1624.
化合物3.无色油状物; 紫外:219,249,303nm.1H-和 13C-NMR,见表1;(-)ESI-MS(m/z)369.3([M-H]-),ESI-MS(pos.):(m/z)375.2,([(M-H2O)+Na]+),([M+Na]+);(-)HR-ESI-MS(m/z)351.1018,[(M-H2O)-H]-,理论值C17H22O9.
根据以上理化数据分析可知,化合物1、化合物2和化合物3的具体结构如式(I)和(II)所示,将化合物1命名为Penicacids A,将化合物2命名为Penicacids B,将化合物3命名为Penicacids C。
式(I)
其中,Penicacids A:Ri=CH3,R2=OH;Penicacids B:R1=H,R2=OGlu;
Penicacids C如式(II)所示:
式(II)。
表1:PenicacidsA-C的NMR数据(500/125MHz,TMS为内标,ppm)
aRecorded in CDC13.bRecorded in MeOH-d4.cRecorded in DMSO-d6
实施例2
对实施例1分离纯化得到的化合物Penicacids A、B、C进行IMPDH抑制活性和小鼠脾细胞增殖抑制活性的实验。
具体步骤为:IMPDH(II型)酶抑制活性测试,采用Magasanik等报道的方法(Magasanik,B.;Moyed,H.;Gehring,L.J.Biol.Chem.1957,226,339-350.),采用96孔板,在340nm下检测NADH的形成对IMPDH(II型)酶活性进行评估。Penicacids A、B、C溶解于DMSO中,再倍比稀释3次,然后添加到待测定混合物中预培养,酶的终浓度不超过2%(V/V)。以霉酚酸作为对照。
小鼠脾细胞增殖抑制活性测试,具体操作为:取C57BL/6小鼠的脾脏,通过尼龙膜过滤获取无菌的单细胞悬液,然后将细胞1000rpm离心5分钟,再用0.83%氯化铵的Tris缓冲液悬浮颗粒细胞。用RPMI1640洗涤细胞二次,然后计算细胞总数,再将细胞悬浮于RPMI11640的完全培养基中(含HEPES 30nm,青霉素100U/毫升,链霉素100微克/毫升,谷氨酰胺2nm,和10%的FCS)。5×105个细胞/孔接种于96孔平底板,再用2微克/毫升的刀豆素刺激细胞。化合物Penicacids A、B、C或0.5%DMSO孵育细胞72小时,然后用MTT法评估细胞增殖。以霉酚酸作为对照。
实验结果见表2:
表2:Penicacids A、B、C的免疫抑制活性
上述实验结果表明Penicacids A、B、C对次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)有明显抑制作用,尤其是化合物Penicacids B有良好的抑制活性。
因此本发明为研制新的免疫抑制药物提供了新的先导化合物。
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