CN102391180A - 含巯基他克林衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐，该化合物或其互变异构体或其药用盐，同时具有乙酰胆碱酯酶抑制作用、增强海马LTP的作用改善学习记忆的作用，可以用来治疗、改善或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病，如阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知损伤、及其他氧化应激参与的痴呆症。

Description

含巯基他克林衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及含巯基他克林衍生物及其合成方法，本发明含巯基他克林衍生物主要用于阿尔茨海默病以及类似疾病的治疗。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又名老年性痴呆，是一种以进行性认知障碍和学习记忆力损伤为主的中枢神经系统退行性疾病。主要病理特征是大脑萎缩、Aβ聚集形成老年斑、tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结。临床表现为进行痴呆，目前其病因尚未明确。近年来医学界提出了多种病因假说，主要包括胆碱能功能衰退假说、淀粉样蛋白沉积假说、自由基超载引起氧化损伤假说、神经炎症假说等。其中“胆碱能假说”认为，阿尔茨海默病患者脑内胆碱能神经功能衰退直接导致患者认知和记忆能力损伤，外源性药物提高脑内胆碱能水平可缓解阿尔茨海默认知功能障碍症状。基于“胆碱能假说”一些改善AD症状的药物相继开发上市，主要最常见的药物是乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEI)。AchEI通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，延缓乙酰胆碱(Ach)水解的速度，提高突触间隙ACh的水平发挥对AD的治疗作用。美国食品和药物管理局(FDA)批准上市的乙酰胆碱酯酶抑制剂包括：他克林(Tacrine)、安理申(Donpezil)、艾斯能(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)等。

其中，他克林于上世纪80年代开发上市，并于1993年被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗老年性痴呆。该药口服能很好的通过血脑屏障，他克林作为经典的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其对轻、中度老年性痴呆有良好的治疗效果。但他克林在临床应用中有其不足之处，其肝毒性副作用较大，约有25％患者服用后出现转氨酶升高，患者服用该药同时必须进行转氨酶监控。另外改善认知功能效果不足导致患者服用剂量往往偏高，后期一般要达到80mg/d以上。他克林的这些不足严重限制了其临床应用。

一些重大的神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和血管性痴呆等病理过程都伴随有学习记忆能力不能程度的损伤，正常衰老也会伴随有学习记忆能力的下降。研究表明，学习记忆能力与海马突触可塑性密切相关。突触可塑性作为学习记忆的分子生物学基础，其主要表现形式包括长时程增强(long-term potentiation，LTP)和长时程抑制(long-term depression，LTD)。增强或者易化海马LTP的产生可增强实验动物的学习记忆能力，阻断海马LTP的产生会严重影响学习记忆能力。最新研究发现，含巯基的化合物具有明显增强衰老的实验动物海马脑区LTP的药理作用（Aging Cell.2010 Oct；9(5)：709-21)，其机制主要是通过调节衰老后NMDA受体的氧化还原状态来恢复海马脑区LTP功能。

含巯基药物，如乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽(GSH)、二氢硫辛酸、硫普罗宁具有高效的肝脏保护作用，广泛应用于临床治疗各种原因引起的肝功能损伤。它们通过降低转氨酶、上调总蛋白含量、降低肝细胞线粒体中ATP酶的活性保护肝线粒体结构，从而改善肝功能。含巯基化合物的这一特性正好能被用于克服他克林使用过程中的肝脏毒性。

自由基超载引起神经损伤也是AD发病的主要机制之一，自由基(reactive oxygen species，ROS)产生过多可导致神经元的损伤乃至死亡。含巯基的化合物具有明显的抗氧化清除自由基功效，已有报道将将抗氧化剂和AChEIs挛合使得单个药物同时具有AChE抑制和抗氧化作用的药物设计策略，如Rosini等通过不同长度的亚甲基链将他克林与硫辛酸连接，设计并合成出了一系列同时具有AChE抑制和抗氧化作用的化合物(J.Med.Chem.2005，48，360-363)。

发明内容

本发明的任务是提供一种含巯基他克林衍生物化合物，以及这种含巯基他克林衍生物化合物的互变异构体和这种含巯基他克林衍生物化合物的药用盐。

本发明的另一个任务是提供这种含巯基他克林衍生物化合物的制备方法。

本发明的又一个任务是提供这种含巯基他克林衍生物化合物的医药应用。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种含巯基他克林衍生物化合物具有以下式I所示的结构，包括这种含巯基他克林衍生物化合物的互变异构体，还包括这种含巯基他克林衍生物化合物的药用盐，

其中：

m＝2、3、4、5、6、7或8；

R₀为H或Cl；

R₁为H或C₁-C₅的烷基；

n＝0、1或2；

R₂为H或C₂-C₅的烷酰基。

以上所述的药用盐，是指任何药用盐。本发明所提供化合物含有碱部分，药用盐可以通过常规方法由式I的母体化合物合成。通常，该盐通过将游离碱形式的式I化合物与化学计算量的适当酸在水中或者有机溶剂中制备。通常非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇为优选溶剂。其中药用盐可以是：无机酸成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐；或有机酸成盐，例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐和对甲苯磺酸盐。

本发明提供的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐，可用于制备治疗、改善、预防认知功能衰退相关的神经系统疾病的药物，所述的认知功能衰退相关的神经系统疾病包括阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知损伤及其他氧化应激参与的痴呆症等。

本发明将他克林与含巯基基团采用合理药物的设计方法进行融合，一方面保持他克林的乙酰胆碱酯酶抑制活性，同时克服其肝脏毒性；另一方面通过巯基基团的增强海马LTP的作用进一步提高其改善学习记忆能力的作用，另外巯基的抗氧化作用也有助于对抗氧化应激对大脑组织的损伤。该类含巯基他克林衍生物为新一代多功能高效低毒的抗痴呆增强学习记忆的药物。

本发明提供的含巯基他克林衍生物化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)令硫代乙酸与含溴羧酸在有机碱或无机碱的催化下发生亲核取代反应，得到式(1)化合物；

2)令邻氨基苯甲酸或4-氯邻氨基苯甲酸与环己酮在三氯氧磷的催化下发生成环反应，得到式(2)化合物，邻氨基苯甲酸或4-氯邻氨基苯甲酸与环己酮在三氯氧磷的催化下发生成环反应的具体步骤可以按照已经报道的方法合成[参见：J.Med.Chem.1999，42，4225-4231]；

3)令式(2)化合物与烷基二胺在正戊醇做溶剂的条件下发生亲核取代反应，得到式(3)化合物，式(2)化合物与烷基二胺在正戊醇做溶剂的条件下发生亲核取代反应的具体步骤可以按照已经报道的方法合成[参见：J.Med.Chem.2008，51，713-716]；

4)令式(1)化合物与式(3)化合物在酸胺缩合剂催化下常温过夜反应，得到式(4)化合物；

5)式(4)化合物经还原剂、碱解液水解或酸解液水解得到式(5)化合物；

上述步骤1)至5)的反应路线及式(1)、(2)、(3)、(4)和(5)化合物的结构为：

其中m＝2、3、4、5、6、7或8；

R₀为H或Cl；

R₁为H或C₁-C₅的烷基；

n＝0、1或2；

R₃为C₂-C₅的烷酰基。

上述步骤1)所述的有机碱是三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、2，6二甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶；所述的无机碱是碳酸钾或碳酸钠；

上述步骤4)所述的酸胺缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)；

上述步骤5)所述的还原剂为氢化铝锂，所述的碱解液为碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、或氨水的甲醇液，所述的酸解液为氯化氢饱和的甲醇。

本发明化合物的具体制备方法是：

上述步骤1)所述的令硫代乙酸与含溴羧酸在有机碱或无机碱的催化下发生亲核取代反应得到式(1)化合物的具体方法可以是：令硫代乙酸在四氢呋喃做溶剂的条件下，缓慢滴加到含有3-溴丙酸的四氢呋喃溶液中，并加入1倍当量的碱作为催化剂，控温50℃反应20小时制得式(1)化合物，其中作为催化剂的碱可以是有机碱或无机碱，所述的有机碱可以是三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、2，6二甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶，所述的无机碱可以是碳酸钾或碳酸钠；

上述步骤2)所述的令邻氨基苯甲酸或4-氯邻氨基苯甲酸与环己酮在三氯氧磷的催化下发生成环反应得到式(2)化合物的具体方法可以是：邻氨基苯甲酸或4-氯邻氨基苯甲酸与环己酮在三氯氧磷的催化下，控温100℃回流2小时，发生成环反应得到式(2)化合物。具体步骤可以按照已经报道的方法合成(参见：J.Med.Chem.1999，42，4225-4231)。

上述步骤3)所述的令式(2)化合物与烷基二胺在正戊醇做溶剂的条件下发生亲核取代反应得到式(3)化合物的具体方法可以是：式(2)化合物与烷基二胺在正戊醇做溶剂的条件下，控温180℃回流18小时，发生亲核取代反应得到式(3)化合物；具体步骤可以按照已经报道的方法合成(参见：J.Med.Chem.2008，51，713716)。

上述步骤4)所述的令式(1)化合物与式(3)化合物在酸胺缩合剂催化下常温过夜反应得到式(4)化合物的具体方法可以是：1.3倍当量的式(1)化合物与1倍当量的式(3)化合物在1.5倍当量的酸胺缩合剂催化下常温反应12小时，再经柱层析纯化得到式(4)化合物，其中反应溶剂可以是二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺，所述的酸胺缩合剂可以是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)，柱层析的条件是二氯甲烷∶甲醇＝100∶1(0.3％三乙胺)；

上述步骤5)所述的式(4)化合物经还原剂、碱解液水解或酸解液水解得到式(5)化合物的具体方法可以是：将式(4)化合物与1.5倍当量的氢化铝锂置于四氢呋喃中反应制得式(5)化合物；也可以将式(4)化合物溶于氯化氢饱和的甲醇，控温50℃反应12小时得到式(5)化合物。还可以将式(4)化合物溶于碱液，常温搅拌2小时制得式(5)化合物，其中碱液可以是碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水的甲醇液。

本发明提供的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐，同时具有乙酰胆碱酯酶抑制作用、增强海马LTP的作用改善学习记忆的作用，可以用来治疗、改善或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病，如阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知损伤、及其他氧化应激参与的痴呆症。

以本发明提供的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐为活性成分，可以制成药物组合物。以本发明提供的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐为活性成分，加上药学上可接受的添加剂或/和载体，可以制备成各种药物制剂，如固体口服制剂，包括片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊或颗粒剂等；液体口服制剂，包括口服溶液剂；注射剂，包括注射用水针、注射用冻干粉针、大输液、小输液等。

附图说明

图1：含巯基他克林衍生物结构式。

图2：含巯基他克林衍生物1、2、6及他克林对大鼠海马长时程增强作用的电生理图(n＝6-9，^#P＜0.01vs Control，^##P＜0.01vs Control)。

具体实施方式

以上已经描述了用于制备本发明化合物的通用方法。提供下列实施例进一步举例说明本发明，而不是对本发明范围的限定。

实施例1  3-(硫代乙酰基)丙酸的制备

将20.8ml(0.29mol)的硫代乙酸溶于20ml四氢呋喃中，缓慢滴加到含有16ml(0.224mol)3-溴丙酸的四氢呋喃溶液中，并加入29.0g的三乙胺做催化剂。控温50℃搅拌反应20小时。旋转蒸除去大部分的四氢呋喃，将所得的无色粘状液体静置析晶24小时，得无色针状晶体。抽滤并用少量的四氢呋喃洗滤饼，减压干燥得13.0克无色块状晶体，产率为39.2％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：11.0(s，1H)，3.08(t，J＝7.2Hz，2H)，2.66(t，J＝7.2Hz，3H)，2.32(s，3H).

实施例1-1：用与实施例1类似的方法可以制备2-(硫代乙酰基)丙酸：

将2.28g(0.03mol)的硫代乙酸溶于10ml四氢呋喃中，缓慢滴加到含有4.56g(0.03mol)2-溴丙酸的四氢呋喃的溶液中，并加入3.0g的三乙胺做催化剂。控温50℃搅拌反应20小时。抽滤除反应液中析出的晶体，将滤液旋转蒸除去绝大部分的四氢呋喃，得黄色液体2.4g，产率为54％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：12.99(s，1H)，4.02(q，J＝7.2Hz，1H)，2.32(s，3H)，1.37(d，J＝7.2Hz，3H).ESI-MS：[M-1]^-＝146.8.

实施例2  3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺的制备

称取3-(硫代乙酰基)丙酸0.444g(0.003mol)溶于10ml的二氯甲烷中，加入0.7g的HOBt，控温20℃搅拌10min，随后加入1.0g的EDC·HCl，再控温25℃搅拌30min，随后加入9-(3-氨基丙基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶0.84g(0.0033mol)。控温25℃搅拌18h后停止反应，向反应体系中加入饱和食盐水，随后用0.5M的稀酸水洗反应液，分液后再用饱和的NaHCO₃溶液洗二氯甲烷层，分液再次用饱和食盐水洗二氯甲烷层。分液将所得的二氯甲烷层用无水硫酸镁，直接柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝100∶1，0.3％三乙胺)，得茶色液体状产物0.6g，产率为54％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：7.97(d，J＝8.4Hz，1H)，7.84(d，J＝8.0Hz，1H)，7.50(t，J＝7.2Hz，1H)，7.30(t，J＝7.2Hz，1H)，6.49(t，J＝5.4Hz，1H)，4.75(m，1H)，3.45(dd，J＝5.6Hzand J＝6.0Hz，2H)，3.37(ddd，J＝6.4Hz，2H)，3.13(t，J＝7.2Hz，2H)，3.01(m，2H)，2.72(m，2H)，2.48(m，2H)，2.26(s，3H)，1.87(m，4H)，1.75(m，2H).¹³C-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：206.97，196.14，170.72，158.23，150.71，147.23，128.46，123.81，122.73，120.13，116.11，46.10，39.15，36.31，33.76，30.90(2C)，28.92，27.13，24.90，22.75.ESI-MS：[M+1]⁺＝386.2.

实施例2-1：用与实施例2相同的方法制备3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丁基氨基)丙酰胺：

制备方法同实施例2，只是用9-(3-氨基丁基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶代替9-(3-氨基丙基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶，产率为64％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：7.94(d，J＝8.4Hz，1H)，7.89(d，J＝8.4Hz，1H)，7.54(t，J＝7.6Hz，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，3.95(s，1H)，3.47(m，2H)，3.05(m，2H)，2.67(m，4H)，1.91(m，4H)，1.75(m，2H)，1.65(m，2H)，1.39(m，6H).¹³C-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：195.87，172.08，158.61，151.97，145.10，129.21，126.38，124.10，123.04，119.29，115.24，44.84，36.37，36.06，34.13，32.55，31.23，30.55，25.01，24.16，22.81，22.25.ESI-MS：[M+1]⁺＝400.2.

实施例2-2：用与实施例2相同的方法制备3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺：

制备方法同实施例2，只是用9-(3-氨基己基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶代替9-(3-氨基丙基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶，产率为75％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：7.95(d，J＝8.4Hz，1H)，7.91(d，J＝8.4Hz，1H)，7.56(t，J＝7.6Hz，1H)，7.35(t，J＝7.6Hz，1H)，5.64(s，1H)，4.01(s，1H)，3.49(t，J＝7.2Hz，2H)，3.24(m，2H)，3.13(t，J＝7.2Hz，2H)，3.07(m，2H)，2.71(m，2H)，2.46(t，J＝7.2Hz，2H)，2.32(s，3H)，1.93(m，4H)，1.66(m，2H)，1.50(m，2H)，1.39(m，4H).¹³C-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：196.20，170.52，158.34，150.79，147.28，128.59，128.36，123.66，122.81，120.16，115.88，49.30，39.37，36.42，33.92，31.63，30.58，29.53，26.55，26.52，25.05，24.80，23.04，22.75.ESI-MS：[M+1]⁺＝428.2.

实施例2-3：用与实施例2相同的方法制备2-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺：

制备方法同实施例2，只是用2-(硫代乙酰基)丙酸代替3-(硫代乙酰基)丙酸，产率为53.3％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：7.95(d，J＝8.4Hz，1H)，7.93(d，J＝8.4Hz，1H)，7.56(ddd，J＝7.2Hz and J＝8.0Hz and J＝0.8Hz，1H)，7.37(ddd，J＝7.2Hz and J＝8.0Hz and J＝0.8Hz，1H)，6.49(s，1H)，4.73(s，1H)，4.04(q，J＝7.2Hz，1H)，3.46(m，2H)，3.37(m，2H)，3.08(m，2H)，2.76(m，2H)，2.29(s，3H)，1.92(m，4H)，1.79(m，2H)，1.48(d，J＝7.2Hz，3H).¹³C-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：196.85，172.31，158.09，150.92，146.64，128.57，128.08，123.98，122.63，120.15，116.40，45.31，40.91，36.79，33.54，31.30，30.22，25.00，23.00，22.64，15.90.ESI-MS：[M+1]⁺＝386.2.

实施例2-4：用与实施例2相同的方法制备2-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丁基氨基)丙酰胺：

制备方法同实施例2，只是用9-(3-氨基丁基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶代替9-(3-氨基丙基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶，2-(硫代乙酰基)丙酸代替3-(硫代乙酰基)丙酸，产率为40.3％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：7.91(t，J＝9.2Hz，2H)，7.54(ddd，J＝7.2Hz and J＝8.0Hz and J＝1.2Hz，1H)，7.34(ddd，J＝7.2Hz and J＝8.0Hz and J＝1.2Hz，1H)，6.39(s，1H)，3.99(q，J＝7.2Hz，1H)，3.77(s，1H)，3.46(t，J＝7.2Hz，2H)，3.26(m，2H)，3.05(m，2H)，2.70(m，2H)，2.29(s，3H)，1.91(m，4H)，1.61(m，4H)，1.43(d，J＝7.2Hz，3H).¹³C-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：196.87，171.47，158.39，150.60，147.21，128.54，128.37，123.78，122.69，120.24，116.24，48.68，40.90，39.22，33.87，30.22，28.84，26.97，24.84，23.00，22.72，15.89.ESI-MS：[M+1]⁺＝400.2.

实施例2-5：用与实施例2相同的方法制备2-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺：

制备方法同实施例2，只是用9-(3-氨基己基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶代替9-(3-氨基丙基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶，2-(硫代乙酰基)丙酸代替3-(硫代乙酰基)丙酸，产率为43％。¹H-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：7.96(d，J＝8.4Hz，1H)，7.92(d，J＝8.4Hz，1H)，7.55(t，J＝7.2Hz，1H)，7.35(t，J＝7.2Hz，1H)，6.25(s，1H)，4.01(q，J＝7.2Hz，1H)，3.49(t，J＝7.2Hz，2H)，3.21(m，2H)，3.07(m，2H)，2.71(m，2H)，2.33(s，3H)，1.92(m，4H)，1.66(m，2H)，1.49(m，2H)，1.44(d，J＝7.2Hz，3H)，1.39(m，2H)，1.33(m，2H).¹³C-NMR(DCCl₃，400MHz，δ/ppm)：196.88，171.32，158.16，150.91，147.07，128.45，128.39，123.69，122.85，120.05，115.73，49.28，40.85，39.43，33.77，31.61，30.25，29.31，26.48，26.44，24.77，23.01，22.70，15.88.ESI-MS：[M+1]⁺＝428.2.

实施例2-6：用与实施例2相同的方法制备3-硫代乙酰基-N-((3-氯-5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺

制备方法同实施例2，只是用N-(6-氨基正己基)-3-氯-5，6，7，8-四氢吖啶-9-胺代替9-(3-氨基丙基氨基)-5，6，7，8-四氢吖啶，产率为67.3％。H¹-NMR(CDCl₃，400MHz，δppm)：7.89(d，J＝8.8Hz，1H)，7.88(s，1H)，7.26(dd，J＝8.8Hz and J＝2.4Hz，1H)，5.69(brs，1H)，4.01(brs，1H)，3.47(m，2H)，3.24(q，J＝6.8Hz，2H)，3.13(t，J＝6.8Hz，2H)，3.03(m，2H)，2.67(m，2H)，2.46(t，J＝7.2Hz，2H)，2.31(s，3H)，1.91(m，4H)，1.65(m，J＝7.2Hz，2H)，1.50(m，J＝7.2Hz，2H)，1.45-1.31(m，4H).C¹³-NMR(CDCl₃，400MHz，δppm)：196.2，171.1，159.5，150.8，148.0，134.0，127.5，124.6，124.3，118.4，115.8，49.4，39.3，36.4，34.0，31.6，30.9，29.5，26.5，26.4，25.0，24.6，22.9，22.6.ESI-MS：[M+H]⁺＝462.4

实施例3  3-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺的制备

将0.2g(0.0005mol)的3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺溶于10ml的氯化氢饱和的甲醇，控温50℃反应12小时，加入二氯甲烷稀释，饱和碳酸氢钠调反应液pH至中性，分液将二氯甲烷层旋蒸得0.17g，产率99％。ESI-MS：[M+1]⁺＝344.2.

实施例3-1：用与实施例3相同的方法制备3-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丁基氨基)丙酰胺：

制备方法同实施例3，只是用3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丁基氨基)丙酰胺代替3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺，产率99％。H¹-NMR(d⁶-DMSO，400MHz，δppm)：8.16(d，J＝8.4Hz，1H)，7.89(m，1H)，7.74(d，J＝8.4Hz，1H)，7.58(t，J＝7.6Hz，1H)，7.37(t，J＝7.6Hz，1H)，5.96(brs，1H)，3.51-3.46(m，2H)，3.05-3.00(m，2H)，2.91(t，J＝5.6Hz，2H)，2.68(t，J＝5.6Hz，2H)，2.61(t，J＝7.6Hz，2H)，2.32(t，J＝7.2Hz，2H)，2.21(brs，1H)，1.82-1.79(m，4H)，1.61-1.54(m，J＝7.2Hz，2H)，1.50-1.37(m，J＝7.2Hz，2H).C¹³-NMR(d⁶-DMSO，400MHz，δppm)：170.5，156.6，152.0，145.2，129.4，126.5，124.1，124.0，119.6，115.2，47.9，38.6，32.6，28.4，27.0，25.3，22.9，22.4，20.5.ESI-MS：[M+1]⁺＝358.2.

实施例3-2：用与实施例3相同的方法制备3-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺：

制备方法同实施例3，只是用3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺代替3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺，产率99％。ESI-MS：[M+1]⁺＝386.2.

实施例3-3：：用与实施例3相同的方法制备2-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺

制备方法同实施例3，只是用2-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺代替代替3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺，产率97％。ESI-MS：[M+1]⁺＝344.2.

实施例3-4：用与实施例3相同的方法制备2-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丁基氨基)丙酰胺

制备方法同实施例3，只是用2-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丁基氨基)丙酰胺代替3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺，产率96.5％。ESI-MS：[M+1]⁺＝358.2.

实施例3-5：用与实施例3相同的方法制备2-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺

制备方法同实施例3，只是用2-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺代替3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺，产率98.3％。ESI-MS：[M+1]⁺＝386.2.

实施例3-6：用与实施例3相同的方法制备3-巯基-N-((3-氯-5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺

制备方法同实施例3，只是用3-硫代乙酰基-N-((3-氯-5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺代替3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺，产率99％。H¹-NMR(d⁶-DMSO，400MHz，δppm)：8.15(d，J＝9.2Hz，1H)，7.82(t，J＝4.2Hz，1H)，7.71(d，J＝2.0Hz，1H)，7.34(dd，J＝9.2Hz and 2.4Hz，1H)，5.78(brs，1H)，3.43(q，J＝6.4Hz，2H)，3.00(q，J＝6.8Hz，2H)，2.88(m，2H)，2.67-2.61(m，4H)，2.34(t，J＝7.2Hz，2H)，1.80-1.77(m，4H)，1.56-1.52(m，J＝6.8Hz，2H)，1.36-1.32(m，J＝6.8Hz，2H)，1.25-122(m，4H).C¹³核磁共振结果为：C¹³-NMR(d⁶-DMSO，400MHz，δppm)：170.4，158.9，151.5，147.1，133.4，126.2，126.1，124.0，118.6，115.9，48.3，38.8，33.4，31.1，30.9，29.5，26.5，26.4，25.3，22.9，22.5，20.5.ESI-MS：[M+1]⁺＝420.4.

实施例4  体外胆碱酯酶抑制活性研究：

Ellman(Ellman，G. L.；Courtney，K.D.；Andres，B.；Featherstone，R.M.Biochem.Pharmacol.1961，7，88-95)报道的比色法在30℃测定乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制活性，测试溶液由以下各项组成：50mM的磷酸盐缓冲液pH7.4，1.5mM的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellman’s试剂)，0.22U/ml的乙酰胆碱酯酶(来源于电鳗)，30mM的硫代碘化乙酰胆碱作为酶促反应的底物。将检测的化合物加入测定溶液中并与酶在室温下孵育5min，再加入1.5mM的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)孵育10min，随后加入底物硫代碘化乙酰胆碱室温下孵育5min。用Biotek的酶标仪测定在415nm处的吸光度(OD值)，计算由于测试化合物的存在所导致的百分比抑制率。测定产生50％的乙酰胆碱酯酶抑制效果的化合物浓度(IC₅₀)，IC₅₀越小反映抑制乙酰胆碱酯酶的活性越强。

相同的方法测定丁酰胆碱酯酶(BuchE)活性，只是用0.12U/ml的丁酰胆碱酯酶(来源于牛血清)代替0.22U/ml的乙酰胆碱酯酶(来源于电鳗)，30mM的硫代碘化丁酰胆碱代替30mM的硫代碘化乙酰胆碱作为酶促反应的底物。实验结果见表1。

表1  含巯基他克林衍生物抑制乙酰胆碱酯酶活性数据

实施例5  增强大鼠海马长时程增强(LTP)作用研究

成年SD大鼠快速断头，取出脑组织，从大脑半球腹内侧分离出双侧海马，用振动切片机将其切成厚约400μm的脑片。将切好的脑片置于持续通含氧混合气的人工脑脊液(ACSF)中，室温22-25℃下孵育1h后，移至恒温记录浴槽中，持续灌流ACSF，并持续通入含氧混合气。在解剖显微镜直视下，将刺激电极置于CA1区的Schaffer侧支处，玻璃记录微电极置于CA1区锥体细胞层，记录细胞外诱发群峰电位(PS)，记录信号经微电极放大器放大，软件进行采样处理并保存。先用中等强度的单刺激(60秒间隔，200微秒的持续时间)诱发出特征性的基础群峰电位，持续记录10min使PS达到稳定，调节PS至最大幅度的50～60％，再稳定记录15min，然后给予Schaffer侧支纤维100Hz、100串的高频刺激(HFS)，此时可以记录到增大的PS，高频刺激后连续记录1小时。通过记录高频刺激后的群峰电位的增大幅度与持续时间，考察测试化合物对大鼠海马LTP的增强作用，见图1，A：3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺(1)；B：3-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺(2)；C：3-巯基-N-((3-氯-5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺(6)；D：对照他克林。实验结果表明：本发明所述的含巯基他克林衍生物具有显著增强大鼠海马长时程增强(LTP)作用，而他克林没有明显增强大鼠海马长时程增强(LTP)作用。说明本发明所述的含巯基他克林衍生物，在增强大鼠海马长时程增强(LTP)改善学习记忆方面，明显优于现有药物他克林。

实施例6  肝功能研究

取成年雌雄各半的SD大鼠，体重180-250g，按25℃，12h黑白夜饲养。对照他克林溶解于PBS中(pH7.4)，按高剂量6μmol/100g急性腹膜内给药。待测化合物3-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺(2)溶解在酸性的盐水中，按和他克林等摩尔量腹腔给药。在给药后12，20，36小时从眼后静脉丛收集肝素化血清用常规方法检测AST，ALT水平和ALB含量，数据如表2。实验结果表明：阳性对照他克林在6μmol/L剂量下给药24小时后，与给药前对比ALT、AST值明显增高(^*P＜0.01vs 0h)，36小时后ALT虽然有一定程度的恢复，但AST值依然偏高(^*P＜0.01vs 0h)。而3-巯基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺(2)在给药24小时、36小时后，与给药前对比ALT、AST、ALB值无明显变化。提示3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)丙酰胺(2)，在高剂量6μmol/L剂量下不影响SD大鼠的肝脏功能。由此说明本发明所述的含巯基他克林衍生物，在肝脏功能保护方面优于现有药物他克林。

表2：生理盐水、他克林、及3-硫代乙酰基-N-((5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)丙基氨基)

丙酰胺(2)的肝脏功能生化实验数据

实施例7  过氧化氢介导的SH-SY5Y细胞凋亡保护实验研究

SH-SY5Y细胞株种植于96孔培养板中，用RPMI1640培养基加10％的胎牛血清，置于5％CO₂、95％空气、饱和湿度、37℃培养箱内培养24小时。将培养板中的液体吸去，加入待测化合物与空白溶剂对照，继续培养12小时后，加入500μmol·L^-1的过氧化氢造模处理，再继续培养12小时，吸去每孔中的液体，然后在每孔中加5mg·ml^-1的MTT，放置培养箱4个小时后加DMSO振荡10分钟，使其充分溶解。选择490nm或者570nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(OD值)。SH-SY5Y细胞经化合物和过氧化氢共同处理后的OD值与单用过氧化氢处理的OD值的差值(即化合物存在导致细胞生存数的增加值)和细胞不用过氧化氢处理的OD值与单用过氧化氢处理的OD值的差值(即过氧化氢存在导致细胞死亡数)的比值(％)表示药物对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用。比值越大，化合物对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用越强。实验结果表明(如表3)，本发明所述的含巯基他克林衍生物在1μM-30μM浓度下，均具有抑制过氧化氢介导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用。

表3  含巯基他克林衍生物的神经保护数据

实施例8：

注射剂：活性成分1mg

氯化钠9mg

制备方法：将活性成分和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

上述活性成分为3-巯基-N-((3-氯-5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺。

实施例9

片剂：

将活性成分、预胶化淀粉和微晶纤维素过筛，充分混合，加入基乙烯吡咯烷酮溶液，混合，制软材，过筛，制湿颗粒，于50-60℃干燥，将羟甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。

上述活性成分为3-巯基-N-((3-氯-5，6，7，8-四氢吖啶基-9-氨基)己基氨基)丙酰胺。

本发明的其余制剂同样采用药学制剂领域的常规处方、按常规生产方法制备。

Claims (10)

1.具有式I结构的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐，

其中：

m＝2、3、4、5、6、7或8；

R₀为H或Cl；

R₁为H或C₁-C₅的烷基；

n＝0、1或2；

R₂为H或C₂-C₅的烷酰基。

2.根据权利要求1所述的具有式I结构的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐，其特征在于，所述的药用盐，是指任何药用盐。

3.权利要求1所述的含巯基他克林衍生物化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)令硫代乙酸与含溴羧酸在有机碱或无机碱的催化下发生亲核取代反应得到式(1)化合物；

2)令邻氨基苯甲酸或4-氯邻氨基苯甲酸与环己酮在三氯氧磷的催化下发生成环反应得到式(2)化合物；

3)令式(2)化合物与烷基二胺在正戊醇做溶剂的条件下发生亲核取代反应得到式(3)化合物；

4)令式(1)化合物与式(3)化合物在酸胺缩合剂催化下常温过夜反应得到式(4)化合物；

5)式(4)化合物经还原剂、碱解液水解或酸解液水解得到式(5)化合物；

上述步骤1)至5)的反应路线及式(1)、(2)、(3)、(4)和(5)化合物的结构为：

其中m＝2、3、4、5、6、7或8；

R₀为H或Cl；

R₁为H或C₁-C₅的烷基；

n＝0、1或2；

R₃为C₂-C₅的烷酰基。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的有机碱是三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、2，6二甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶；所述的无机碱是碳酸钾或碳酸钠；步骤4)所述的酸胺缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)；步骤5)所述的还原剂为氢化铝锂，所述的碱解液为碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、或氨水的甲醇液，所述的酸解液为氯化氢饱和的甲醇。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

步骤1)所述的令硫代乙酸与含溴羧酸在有机碱或无机碱的催化下发生亲核取代反应得到式(1)化合物的具体方法是：令硫代乙酸在四氢呋喃做溶剂的条件下，缓慢滴加到含有3-溴丙酸的四氢呋喃溶液中，并加入1倍当量的碱作为催化剂，控温50℃反应20小时制得式(1)化合物，其中作为催化剂的碱可以是有机碱或无机碱，所述的有机碱可以是三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、2，6二甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶，所述的无机碱可以是碳酸钾或碳酸钠；

步骤2)所述的令邻氨基苯甲酸或4-氯邻氨基苯甲酸与环己酮在三氯氧磷的催化下发生成环反应得到式(2)化合物的具体方法是：邻氨基苯甲酸或4-氯邻氨基苯甲酸与环己酮在三氯氧磷的催化下，控温100℃回流2小时，发生成环反应得到式(2)化合物；

步骤3)所述的令式(2)化合物与烷基二胺在正戊醇做溶剂的条件下发生亲核取代反应得到式(3)化合物的具体方法是：式(2)化合物与烷基二胺在正戊醇做溶剂的条件下，控温180℃回流18小时，发生亲核取代反应得到式(3)化合物；

步骤4)所述的令式(1)化合物与式(3)化合物在酸胺缩合剂催化下常温过夜反应得到式(4)化合物的具体方法是：1.3倍当量的式(1)化合物与1倍当量的式(3)化合物在1.5倍当量的酸胺缩合剂催化下常温反应12小时，再经柱层析纯化得到式(4)化合物，其中反应溶剂可以是二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺，所述的酸胺缩合剂可以是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)，柱层析的条件是二氯甲烷∶甲醇＝100∶1(0.3％三乙胺)；

步骤5)所述的的式(4)化合物经还原剂、碱解液水解或酸解液水解得到式(5)化合物的具体方法是：将式(4)化合物与1.5倍当量的氢化铝锂置于四氢呋喃中反应制得式(5)化合物，或将式(4)化合物溶于氯化氢饱和的甲醇，控温50℃反应12小时得到式(5)化合物，或将式(4)化合物溶于碱液，常温搅拌2小时制得式(5)化合物，其中碱液可以是碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水的甲醇液。

6.一种药物组合物，含有权利要求1所述的具有式I结构的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐。

7.一种药物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的具有式I结构的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐，以及药学上可接受的添加剂或/和载体。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，其剂型为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂，所述的固体口服制剂可以是片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊或颗粒剂；所述的液体口服制剂可以是口服溶液剂；所述的注射剂可以是注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

9.权利要求1或2所述的具有式I结构的含巯基他克林衍生物化合物或其互变异构体或其药用盐，在制备用于治疗、改善或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的认知功能衰退相关的神经系统疾病是阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知损伤或其他氧化应激参与的痴呆症。

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