CN102389407A - 虾青素在制备治疗和预防肺纤维化的药品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种虾青素的新用途，即在制备治疗和预防肺纤维化的药品中的新应用，通过有关虾青素肺纤维化细胞模型和动物模型实验研究证明，虾青素能够抑制肺纤维化细胞的增殖，诱导肺纤维化细胞凋亡，因此，虾青素可用于制备防治肺纤维化的药物。

Description

虾青素在制备治疗和预防肺纤维化的药品中的应用

技术领域

本发明涉及虾青素的新用途，具体地说涉及在制备治疗和预防肺纤维化的药品中的用途。

背景技术

肺纤维化是一种弥漫性肺间质疾病，以特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）为代表，病理改变以逐渐加重的肺部损伤导致肺泡结构紊乱和肺组织纤维化为特征，最终导致呼吸功能丧失，预后极差。IPF发病率较高，且近年来呈逐年增加的趋势，其病因不明，发病机制不清。以往认为肺间质纤维化的形成是由于炎症激活了肺间质内成纤维细胞使其过度增殖的结果，但临床抗炎治疗未取得满意的疗效。

海洋生物由于长期生活在高盐、高压、低温和无光照的封闭体系中，无论大小、软硬、抑或速度快慢，都能生存下来，必然产生一套不同于陆生生物的代谢和防御系统，从而产生一些结构新颖、活性优良的新化合物。因此，研究海洋生物极有可能筛选到具有新、奇、特、高活性的先导化合物，其开发价值不可估量。虾青素就是一种从海洋生物体中提取的天然类胡萝卜素，是唯一能通过血脑屏障的酮式类胡萝卜素，因最初从虾中提取而得名，其实在虾、蟹、鲑鱼、藻类等海洋生物中均可找到。虾青素作为一种潜在的药物，近年来受到了科研人员的高度关注，研究表明虾青素能通过增强机体免疫应答能力和其强大的抗氧化活性预防疾病的产生，大量的研究显示虾青素在促进抗体的产生、增强宿主的免疫功能方面有重要的生理功能。

因此通过研究抗肺纤维化作用及其机制，从海洋生物中寻找合适的药物防治肺纤维化具有深远的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虾青素的新用途，即在制备治疗和预防肺纤维化的药品中的新应用。

下面用虾青素对培养的A549细胞和人胚肺成纤维细胞的药理试验及结果来详细说明其在该制药领域中的新用途。A549细胞是一种肺癌细胞，所有研究肺纤维化的实验都把它当成一种上皮细胞作为对照；人胚肺成纤维细胞（HFL1）是正常的成纤维细胞。A549和HFL1经由TGF-β刺激后都可以转化成肌成纤维细胞，而导致肺纤维化。

一、虾青素对培养的正常A549细胞株、人胚肺成纤维细胞株（HFL1）的细胞增殖抑制率检测。

1、实验步骤：

（1）实验分组：空白对照组（无细胞组）、正常细胞对照组（包括A549细胞株和人胚肺成纤维细胞株，但不加虾青素）、虾青素用药实验组（包括A549细胞株和人胚肺成纤维细胞株）；每组设6 个平行孔。

（2）种植细胞：将处于对数生长期的A549和HFL1细胞分别按预先设计种植到两块96 孔板中。空白组各孔均不加细胞，仅分别加入100μL 细胞培养液；其它各组每孔分别加入100μL 培养液、约2×104 个细胞。

（3）加虾青素试剂：种板12h后,分别移弃两板各孔中的旧培养液。向虾青素用药实验组各孔中分别加入一定浓度（0μmol/l，10μmol/l，20μmol/l，40μmol/l， 80μmol/l，160μmol/l）虾青素培养液，每孔200μL，其中0μmol/l即为正常细胞对照组；向空白组及对照组各孔中均加入细胞培养液，每孔200μL。

（4）SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时。

（5）倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。

（6）每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。

（7）结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解。

（8）用自动化分光光度平板读数计在560nm波长处测定每个小孔的OD值。

2、实验结果

根据公式计算抑制率：抑制率=[1-（实验组吸光度/对照组吸光度）]×100%。

SRB法检测虾青素作用48h对HFL1和A549增殖的影响，结果显示见图1、图2。

图1：虾青素对培养的人肺成纤维细胞株（HFL1）细胞增殖抑制率检测，图2：虾青素对培养的正常A549细胞株的细胞增殖抑制率检测。从图中可以看出，虾青素对二株细胞均有一定抑制作用，并具有浓度依赖性，与0uM对照组比较有统计学意义（P<0.05）。图中显示，虾青素对HFL1的最大半数抑制率（IC₅₀）为83 uM，虾青素对A549的最大半数抑制率（IC₅₀）是132uM。

二、虾青素对A549、HFL1转分化时细胞增殖抑制率检测和对激活的A549、HFL1细胞增殖抑制率检测。

（一）筛选TGFβ1诱导转分化的浓度和时间，成功构建细胞转分化模型。

1、实验步骤

（1）常规细胞消化，离心，洗涤一次，重悬。

（2）将细胞接种于24孔培养板，让其贴壁生长，分为对照组（正常培养的HFL1细胞）和实验组（为TGF-β1刺激的HFL1细胞）。

（3）37℃二氧化碳培养箱过夜，使其贴壁。

（4）贴壁后，实验组加入5uM TGF-β1的无血清培养基分别刺激0h，24h，48h，72h。

（5）37℃二氧化碳培养箱孵育。

（6）PBS冲洗两次。

（7）加入4%多聚甲醛固定30min。

（8）PBS冲洗3次。

（9）加入0.5%TritonX-100作用20min。

（10）PBS冲洗两次。

（11）10%小牛血清蛋白封闭，4℃过夜。

（12）PBS冲洗两次。

（13）滴加兔源性抗α- SMA多克隆抗体（1：100），4℃过夜。

（14）PBS冲洗两次。

（15）滴加FITC标记的羊抗兔IgG二抗（1：150），培养箱，锡纸包裹避光孵育1h。

（16）PBS冲洗两次。

（17）荧光显微镜观察。

2、实验结果

参看图3、图4所示，图3为TGF-β1刺激HFL1细胞0h、24h、48h、72h后，光镜下形态变化，图4为荧光显微镜下α- SMA的表达：

α- SMA的注释：肺纤维化的病理特征是肺泡上皮损伤，成纤维细胞灶的形成以及细胞外基质的过度沉积最终导致了肺组织结构的异常重塑，近来的研究发现成纤维细胞灶主要由表达α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin, α-SMA）的肌成纤维细胞构成，是造成细胞外基质异常沉积的主要细胞，大量成纤维细胞灶的出现可提示纤维化处于进行性活动期，可作为肺纤维化进入不可逆纤维化过程的一个组织病理上的指标。

图中，A、B、C、D为光镜下TGF-β1刺激0h、24h、48h、72h后的细胞形态的变化，可见细胞伸长，出现丝状和片状伪足；A’、B’、C’、D’为TGF-β1刺激0h、24h、48h、72h后免疫荧光检测α- SMA的表达，可见随着TGF-β1作用时间的延长，α- SMA的表达增多。

（二）虾青素对A549转分化时的细胞增殖抑制率检测。

1、实验步骤

（1）实验分组：空白对照组（无细胞组）、正常细胞对照组（包括A549细胞株和人胚肺成纤维细胞株，但不加虾青素）、虾青素用药实验组（包括A549细胞株和人胚肺成纤维细胞株）；每组设6 个平行孔。

（2）种植细胞：将处于对数生长期的A549细胞分别按预先设计种植到96 孔板中。空白组各孔均不加细胞，仅分别加入100μL 细胞培养液；其它各组每孔分别加入100μL 培养液、约2×104 个细胞。

（3）加虾青素试剂：种板12h后,分别移弃两板各孔中的旧培养液。实验组各孔中分别加入一定浓度（0μmol/l，10μmol/l，20μmol/l，40μmol/l， 80μmol/l，160μmol/l）虾青素培养液，每孔200μL，其中0μmol/l即为正常细胞对照组；向空白组及对照组各孔中均加入细胞培养液，每孔200μL，其中正常细胞对照组可为0μmol/l组，可以此作分析，培养2h后，实验组加入5nM的TGF-β1无血清培养基，刺激72h。

（4）SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时。

（5）倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。

（6）每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。

（7）结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解。

（8）用自动化分光光度平板读数计在560nm波长处测定每个小孔的OD值。

2、实验结果

虾青素对A549转分化时细胞增殖抑制率检测参见图5，IC50值为98uM。

从上述实验例可以确定虾青素对A549细胞的转分化有影响，下面再用免疫荧光检测法进一步说明。

（三）免疫荧光检测波形蛋白, E-cadherin的表达。

实验中所取的分组：对照组为正常的A549细胞，模型组为TGF-β1刺激后转分化的A549细胞，实验组为虾青素作用后的转分化的A549细胞。

1、实验步骤

（1）培养皿中各滴一滴培养液，将盖玻片置于其上，压紧。

（2）常规细胞消化，离心，洗涤一次，重悬，用移液枪将吹打的细胞悬液各加50μl到每个盖玻片上，让其贴壁生长。

（3）37℃二氧化碳培养箱过夜，使其贴壁。

（4）贴壁后，取上清。分组，一组为对照组，一组为模型组，一组为实验组，实验组加入虾青素，使终浓度为80uM。

（5）2h后，模型组和实验组加入TGF-β1。

（6）37℃二氧化碳培养箱孵育72h后。

（7）小心取出爬片，PBS冲洗两次。

（8）加入4%多聚甲醛固定30min。

（9）PBS冲洗3次。

（10）加入0.5%TritonX-100作用20min。

（11）PBS冲洗两次。

（12）10%小牛血清蛋白封闭，4℃过夜。

（13）PBS冲洗两次。

（14）滴加一抗（1：100），4℃过夜。

（15）PBS冲洗两次。

（16）滴加二抗（1：150），培养箱，锡纸包裹避光孵育1h。

（17）PBS冲洗。

（18）甘油封片，激发波长488nm，发射波长515-535nm，共聚焦观察。

3、实验结果

参见图7、图8，其中，

图7为波形蛋白的表达：A为对照组，B为模型组，C为实验组（虾青素用药组），模型组较对照组表达升高，用药组较模型组表达降低。

图8为E-cadherin的表达：A为对照组组，B为模型组，C为实验组（虾青素用药组），模型组较对照组表达降低，用药组较模型组表达升高。

由于肺泡上皮向间质细胞转型是纤维化局部成纤维细胞的重要来源，在转型过程中，E-cadherin丢失，波形蛋白等表达增高，但是由图7、图8可以看出虾青素具有抑制上皮细胞转型的功能。

（四）虾青素对激活A549细胞增殖抑制率检测。

1、实验步骤

（1）实验分组：空白对照组（无细胞组）、正常细胞对照组（A549细胞株，但不加虾青素）、虾青素用药实验组（A549细胞株）；每组设6 个平行孔。

（2）种植细胞：将处于对数生长期的A549细胞分别按预先设计种植到96 孔板中。空白组各孔均不加细胞，仅分别加入100μL 细胞培养液；其它各组每孔分别加入100μL 培养液、约2×104 个细胞。

（3）加虾青素试剂：种板12h后,分别移弃两板各孔中的旧培养液。加入5nM的TGF-β1无血清培养基，刺激72h后，各孔中分别加入一定浓度（0μmol/l，10μmol/l，20μmol/l，40μmol/l， 80μmol/l，160μmol/l）虾青素培养液，每孔200μL，其中0μmol/l即为正常细胞对照组；向空白组及对照组各孔中均加入细胞培养液，每孔200μL，培养48h。

（4）SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时。

（5）倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。

（6）每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。

（7）结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解。

（8）用自动化分光光度平板读数计在560nm波长处测定每个小孔的OD值。

2、实验结果

虾青素对激活的A549细胞增殖抑制率检测参见图6，IC50值为80uM。

从上述实验例可以确定虾青素能够促进激活的A549细胞凋亡，下面再用线粒体荧光探针检测法进行进一步说明。

（五）线粒体荧光探针检测细胞凋亡。

实验中所取的分组：对照组为正常的A549细胞，模型组为TGF-β1刺激后转分化的A549细胞，实验组为虾青素作用的激活后的A549细胞。

1、实验步骤

（1）培养皿中各滴一滴培养液，将盖玻片置于其上，压紧。

（2）常规细胞消化，离心，洗涤一次，重悬，用移液枪将吹打的细胞悬液各加50μl到每个盖玻片上，让其贴壁生长。

（3）37℃二氧化碳培养箱过夜，使其贴壁。

（4）贴壁后，取上清。分组，一组为对照组，一组为模型组，一组为虾青素用药组,模型组和实验组加入5nM的TGF-β1无血清培养基，刺激72h。

（5）实验组加入AX使终浓度为80uM，培养48h。

（6）Mito-Tracker Green储存液的配制：

用无水DMSO（anhydrous dimethylsulfoxide）配制Mito-Tracker red至终浓度为1mM。配制后可以-20℃或更低温度避光保存。

（7）Mito-Tracker red工作液的配制：

a、取少量1mM Mito-Tracker red储存液按照1:5000-1:50000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液中，使最终浓度为20-200nM；

b、Mito-Tracker red工作液使用前需37℃预温育。

（8）线粒体的荧光标记：

a、去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并37℃预温育的Mito-Tracker red染色工作液，与细胞37℃共孵育15-45分钟；

b、去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入37℃预温育的新鲜细胞培养液；

c、随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker red染色工作液中Mito-Tracker Green的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

（9）α- SMA表达检测

a、加入4%多聚甲醛固定30min；

b、 PBS冲洗3次；

c、 加入0.5%TritonX-100作用20min；

d、 PBS冲洗两次；

e、 10%小牛血清蛋白封闭，4℃过夜；

f、 PBS冲洗两次；

g、滴加一抗（1：100），4℃过夜；

h、PBS冲洗两次；

i、 滴加二抗（1：150），培养箱，锡纸包裹避光孵育1h；

j、 PBS冲洗；

k、甘油封片，激发波长488nm，发射波长515-535nm，共聚焦观察。

2、实验结果

参见图9，图9为线粒体荧光探针检测细胞凋亡示图：A为模型组线粒体结构，D为虾青素作用的激活的A549细胞线粒体结构，B模型标志蛋白α- SMA的表达,E为虾青素作用的激活的A549细胞α- SMA的表达，C为AB合成图,F为DE的合成图；由图中可看出，模型组线粒体结构正常，分布均匀，药物干预组线粒体结构紊乱、发生凝聚。说明虾青素能够促进转化后的肌成纤维细胞凋亡。

注释：线粒体凋亡通路是细胞凋亡的“中心执行者”，凋亡过程中线粒体内发生的最重要事件即其结构和功能的改变。近几年的大量研究显示，线粒体的融合分裂（mitochondrial fusion and fission）与细胞凋亡密切相关，线粒体融合能够抑制凋亡而分裂则启动凋亡。

以上实验例为体外试验，下面再用体内实验例加以说明。

1、试验动物分组：

大鼠雌雄各半共50只，应用随机区组设计原则给大鼠分组，利用随机数字把大鼠随机分入设计的对照组（NM组）、1个模型组（FM组）及4个干预组（AM）每组8只。NM组经气管内注入生理盐水，模型组经气管内注入博莱霉素（5mg／kg）。干预组经气管注入博莱霉素（5mg／kg）3天后，其中3组经由口腔灌胃虾青素，虾青素药物浓度分别为0.5mg/kg，1 mg/kg，2mg/kg，另外一组腹腔注射地塞米松，药物浓度为1mg/kg。（地塞米松是一种激素类药物，是目前应用较普遍的治疗肺纤维化的药物）

2、动物处理：（大鼠肺纤维化模型的制备）

①以4%水合氯醛（1ml/100g体重）腹腔麻醉大鼠，约3～5min后，大鼠进入麻醉迟缓状态。（如麻醉不深，须用乙醚加强 ）。

②麻醉后将其仰卧固定于鼠板，将四肢和头部固定，剪去颈毛。用碘氟消毒皮肤，在无菌操作下切开长约1cm的颈中切口，逐层分离暴露气管。（如室温低，须用保温措施）。

③用弯尖眼科钳经气管下方穿过，轻微抬起气管，尽量接过气管分叉处，抬高鼠板头端，使与桌面成30°～35°角。

④选择1个7号的注射用针头，将其针头用砂片磨成弧形，使其变得圆钝。在进针前用注射器试通注射针头，避免堵塞。进针时与水平面成15˚ 的角度、在两个环状软骨之间刺入、针孔方向面向术者，有落空感证明以刺进1～1.5cm，约到气管分叉处停止停针后注入博莱霉素。注入博莱霉素0.2ml（约BLM溶液5mg/kg），在向气管内注入0.2ml的空气2～3次，以使药物在肺部分布均匀。

⑤以大鼠身体长轴为中心，正反快速旋转鼠板1～2min。

⑥缝合皮肤，局部碘氟消毒（或用青霉素消毒）防止感染，室温保持在24˚C～25˚C待苏醒，动物自然清醒后置笼内常规饲养。

3、实验结果：

（1）取材前后各组平均体重比较

空白对照

模型组

地塞米松组

虾青素(0.5mg)

虾青素(1mg)

虾青素(2mg)

生理盐水组

实验前

229g

232g

225g

225g

235g

230g

242g

实验后

423.4g

327g

178.5g

318g

304g

326g

389g

饲养过程中随着虾青素喂食时间的延长，各组的呼吸音较模型组和地塞米松组都有所减弱，并且呼吸频率较两组正常。肺纤维化形态学观察空白对照和生理盐水组双肺呈粉红色，表面光滑弹性良好，结构清晰；模型组双肺苍白，体积缩小，硬度增加，表面结节样改变及出现条索状凹沟。地塞米松组和虾青素组较模型组肺组织结构有所改善，但虾青素组治疗效果更为明显。

（2）羟脯氨酸测试

注释：羟脯氨酸在胶原蛋白中占 13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、腱、软骨、血管等处，因此羟脯氨酸的量能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。测定羟脯氨酸的含量，可换算成肺胶原蛋白的含量，以反映肺纤维化程度。

实验步骤：

1、 组织样本水解：准确称取组织80～100mg，剪碎，加6mol/l HCL 1ml,放磨口试管中加盖，95℃；

或者沸水浴水解5小时，也可放100℃烤箱中水解5小时；

6mol/l HCL的配制：浓HCl为12mol/L,与水1∶1稀释为6mol/L；

2、水解液调 PH 值至 6.0～6.8；

①、流水冷却后各管加指示剂1滴，摇匀；

②、各管加入调PH甲液1.5ml，混匀；

③、各管加入调PH乙液0.2ml，混匀，并用PH试纸测PH，（大约在 5～6 之间）；

④、各管逐滴小心加入乙液，每滴加入后均要混匀，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色。此时，PH值在6.0～6.8左右；

⑤、然后加蒸馏水至10ml，混匀；

⑥、取3～4ml稀释的检测液加适量活性炭（约 20～30mg 左右，以上清液离心后澄清无色为准），混匀，3500转/分离心10分钟，小心取上清1ml作检测。

检测结果显示：模型组的羟脯氨酸含量明显高于其余各组，实验组有所降低，虾青素组治疗效果较地塞米松组明显，并且有浓度依赖性，用药浓度越大治疗效果越好。

本发明的优点是：从以上有关虾青素肺纤维化细胞模型和动物模型实验研究证明，虾青素能够抑制肺纤维化细胞的增殖，诱导肺纤维化细胞凋亡，因此，虾青素可用于制备防治肺纤维化的药物。

附图说明

图1：虾青素对培养的人胚肺成纤维细胞株（HFL1）的细胞增殖抑制率检测；

图2：虾青素对培养的正常A549细胞株的细胞增殖抑制率检测；

图3：TGF-β1刺激HFL1细胞0h、24h、48h、72h后，光镜下形态变化；

图4：TGF-β1刺激HFL1细胞0h、24h、48h、72h后，荧光显微镜下α- SMA的表达：

图5：虾青素对A549转分化时的细胞增殖抑制率检测；

图6：虾青素对激活的A549细胞增殖抑制率检测；

图7：免疫荧光检测波形蛋白的表达；

图8：免疫荧光检测E-cadherin的表达；

图9：线粒体荧光探针检测细胞凋亡示图。

具体实施方式

实施例1

虾青素的化学名称为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，是一种类胡萝卜素，但是其极易被氧化且水溶性差，因此为了提高虾青素的水溶性和稳定性，提高它的临床应用，将其制成虾青素-β-环糊精包合物并制成片剂应用于临床。

包合物的制备方法：采用羟丙基β环糊精（hydroxypropyl β

Cyclodextrin，HP β CD）做包合材料，用研磨法，将虾青素和HP β CD以适当摩尔比投料，常温下加少量水研磨4h，然后真空干燥12h，干燥物用少量乙醇快速洗涤1次，挥干乙醇后得淡紫色粉末，按此法制备虾青素包合物。进一步地，按常规制药工艺将虾青素包合物制成片剂产品。

实施例2

虾青素溶剂产品的制备方法：

取53.08mg虾青素溶于9mL生理盐水和1mL乙醇中，配置成10mM虾青素，经0.22um滤膜过滤，置于4℃冰箱中待用。

Claims (1)

1.虾青素在制备治疗和预防肺纤维化的药品中的应用。

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