CN102382856A - 含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物 - Google Patents

含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物，所述聚阳离子基因载体结构式为：
Figure 842556DEST_PATH_IMAGE001
，其中，n为1～20，m为1～20，x为1～20，y为1～20。所述制备方法包括如下步骤：将小分子量PEI及对苯二醛按摩尔比1:1的比例加入反应溶剂甲醇中；搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述聚阳离子基因载体。与现有技术相比，本发明的聚阳离子基因载体是具有高效、低毒、可降解回到多氨分子的起始状态的聚阳离子基因物质载体，可以用于基因物质(DNA与RNA)的输送。

Description

含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物
技术领域
本发明涉及一种聚阳离子基因载体、制备方法和复合物，具体涉及一种含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物。
背景技术
DNA和siRNA药物从概念走向临床应用的关键性瓶颈是其体内输送系统的研发。各类基因载体中，聚阳离子载体和病毒及脂质体载体相比具有基因担载密度和担载量均大、制备简单，便于化学修饰等优势，也存在着化学毒性大、体内循环周期短（不利于靶向）的缺点。高分子量的聚乙烯亚胺（PEI，25kDa）由于其氨基密度大，易于包裹带负电荷的基因物质而成为最早在体外和体内被广泛研究的转染活性较高的基因物质（DNA、siRNA）输送载体，但无法避免其高分量烷基骨架无法降解所带来的细胞毒性。设计和构建可降解的聚阳离子是提高基因物质转染活性、降低其细胞毒性的一个关键策略。比如，利用小分子量的聚乙烯亚胺通过在生理条件下可断裂的连接键构建可降解的聚乙烯亚胺类聚阳离子基因载体是本领域科学家所熟知的一个例子。
犹他大学的Sung Wan Kim等人在缓控释杂志（Journal of Controlled Release 2005，103：209–219）发表“Polyethylenimine with acid-labile linkages as a biodegradable gene carrier”的文章，该文章采用戊二醛作为连接剂与小分子量PEI(1800 Da)交联，生成特征性的含有亚胺键连接的可降解聚乙烯亚胺类聚阳离子，该类聚阳离子的结构特点是：细胞摄取后，凝聚基因的聚阳离子在内吞体和溶酶体的酸性条件下，与小分子量PEI直接相连的亚胺键断开，生成无细胞毒性的小分量PEI，但是亚胺键的聚合结构不能保证这一聚阳离子携带核酸进入细胞之前足够稳定，其转染活性较也不理想。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物。该聚阳离子基因载体是具有高效、低毒、可降解回到多氨分子的起始状态的聚阳离子基因物质载体，可以用于基因物质(DNA与RNA)的输送。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体，其结构式为：
，
其中，n为1～20，m为 1～20，x为1～20，y为 1～20。
优选的，所述聚阳离子基因载体的基本构建单元为小分子量PEI，所述PEI的分子量为800Da。
本发明还涉及一种制备上述的聚阳离子基因载体的方法，包括如下步骤：
（a）将小分子量PEI及对苯二醛按摩尔比1:1的比例加入反应溶剂甲醇中； 
（b）搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述聚阳离子基因载体。
优选的，所述小分子量PEI的分子量为800Da。
优选的，还包括分离纯化的步骤：将所述聚阳离子基因载体用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析，微孔滤膜过滤，冻干。
优选的，所述透析的时间为3天。
优选的，所述微孔滤膜的孔径为0.22微米。
优选的，所述微孔滤膜的截留分子量为3500Da。
本发明还涉及一种复合物，该复合物由包括如下步骤的方法制备而得：
（a）将权利要求1所述的聚阳离子基因载体的溶液快速加入到质粒溶液中，混合；
（b）将混合溶液于室温下孵育，即得所述复合物。
优选的，所述质粒为DNA质粒。
优选的，所述孵育的时间为0.5小时。
    与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明制备的可降解亚胺键的聚阳离子基因载体结构简单、容易合成；且其具有较高的转染活性和较低的毒性，是一种优良的基因物质输送载体。
附图说明
图1为本发明聚阳离子基因载体的合成线路示意图；
图2为高分子PEI-Tp与质粒合成的复合物的凝胶电泳图；
图3为高分子PEI-Tp与质粒的质量比不同时合成的复合物的粒径图；
图4为高分子PEI-Tp与质粒的质量比不同时合成的复合物的电势图；
图5为高分子PEI-Tp与质粒的质量比不同时合成的复合物的COS-7细胞转染活性示意图；
图6为高分子PEI-Tp与质粒的质量比不同时合成的复合物的COS-7细胞毒性对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版（科学出版社，2002）中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。
实施例1、含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体（高分子PEI-Tp）的制备
图1为含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体的制备方法的合成线路示意图；如图1所示。本实施例聚阳离子基因载体的制备方法包括如下步骤：
(a)、取相同摩尔的PEI800与对苯二醛，用甲醇分别溶解PEI800和对苯二醛，在无水无氧条件下将二者分别配成3mL和20mL的溶液；
(b)、冰浴条件下，首先在反应体系中加入PEI 800的甲醇溶液，然后将对苯二醛的甲醇溶液在无水无氧条件下逐滴加入到PEI 800的甲醇溶液中，搅拌反应24小时；反应停止后，用旋转蒸发仪在减压和降温的条件下把除去大部分甲醇，然后将粗产物于真空干燥箱内干燥过夜；
(c)、分离纯化，粗产物用少量超纯水溶解后，置于截留分子量为3500Da活化后的透析袋中透析3天，透析结束后用0.22
Figure 2011103271092100002DEST_PATH_IMAGE002
m的微孔滤膜过滤，分别转移到预先准备好的西林瓶中，产品在-20℃冰箱预冻过夜后，用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，即得到含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体（高分子PEI-Tp）。
取实施例制备的高分子PEI-Tp，进行分子量的测定
测定方法为凝胶渗透色谱（GPC）法，包括如下步骤：以PEG标准品及高分子PEI-Tp为样品，分别用纯水溶解得到10mg/ml的溶液，摇匀静置，用0.45
Figure 61047DEST_PATH_IMAGE002
m 的微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20
Figure 40504DEST_PATH_IMAGE002
l，记录色谱图。
将PEI标准品的重均分子量的对数值lgMw与相应的保留时间（tR）进行线性回归, 得回归方程。高分子PEI-Tp样品通过该回归方程的公式计算分子量和分布： 
 
上式中Mn、Mw分别为数均分子量和重均分子量；D指分布系数；RIi为供试品在保留时间i时的峰高；Mi为供试品在保留时间i时的分子量。
计算得：PEI-Tp的分子量Mn=2282，Mw=4958。
实施例2、高分子PEI-Tp与质粒合成复合物（Polyplex）的制备
称取定量的高分子PEI-Tp聚合物，加超纯水配置成2mg/mL的溶液，然后用0.22m的无菌滤头过滤；质粒的浓度稀释成1mg/mL；配置不同质量比的复合物溶液，需要保持质粒溶液的浓度不变，然后按照高分子PEI-Tp与质粒的不同质量比稀释高分子溶液的浓度，注意保持稀释后的高分子溶液和质粒溶液的体积相等，最后将高分子溶液快速加入到质粒溶液中混合，室温下孵育30min，得到一系列质量比的复合物。 
高分子PEI-Tp与质粒合成的复合物的凝胶电泳表征
配置质量比1.0％琼脂糖溶液，在微波炉中加热溶解，取40mL溶液，倒入专用的EB（溴化乙锭）污染的烧杯中，加入约40
Figure 90817DEST_PATH_IMAGE002
L的EB溶液，搅匀后倒入模具中，插上梳子，约30min之后，胶就凝固了，电泳槽中加入适量TAE(三（羟）氨基甲烷醋酸盐）缓冲液，将琼脂糖凝胶放入电泳槽等待上样。
配置不同质量比的复合物溶液，室温孵育30min。上样的Marker 选用1000-10000kb的质粒maker，上样时先取1L的上样缓冲液，加入5
Figure 555349DEST_PATH_IMAGE002
L的样品样品，混合均匀后，加入到凝胶孔中。加上电压160伏的电压，蓝色的溴酚蓝会快速的移动到胶的底端之后，约20min，用紫外凝胶成像系统拍照；如图2所示，Polyplex可以完全包裹DNA用于基因输送。
高分子PEI-Tp与质粒合成的复合物（Polyplex）粒径测定
复合物粒径的测定的样品量为1.6mL，Luciferase（荧光素酶）质粒和高分子溶液的体积各位800
Figure 822383DEST_PATH_IMAGE002
L，质粒的浓度均为20g/mL，依据质量比对高分子溶液（原始浓度为2mg/mL）进行稀释，所需测定的复合物中高分子（PEI-Tp）与质粒的质量比分别为1，3，5，10，20。
混合时，将高分子溶液加入质粒溶液中，吹打均匀，室温孵育30min。检测采用Brookhaven Instruments公司的粒径仪，每个样品测定3次，取平均值作图，如图3所示，Polyplex可形成纳米颗粒。
高分子PEI-Tp与质粒合成的复合物（Polyplex）Zeta电位测定
复合物ζ点位的测定的样品量为1.6mL，Luciferase质粒和高分子溶液的体积各位800
Figure 752478DEST_PATH_IMAGE002
L，质粒的浓度均为20
Figure 745842DEST_PATH_IMAGE002
g/mL，依据质量比对高分子溶液（原始浓度为2mg/mL）进行稀释，所需测定的复合物中高分子（PEI-Tp）与质粒的质量比分别为1，3，5，10，20。
混合时，将高分子溶液加入质粒溶液中，吹打均匀，室温孵育30min，然后检测。检测采用Brookhaven Instruments公司的粒径仪，每个样品测定3次，取平均值作图。如图4所示，Polyplex的Zeta电势为正，可包裹带负电荷的DNA。
高分子PEI-Tp与质粒合成的复合物（Polyplex）的细胞转染实验
在48孔细胞培养板中，加入0.5mL的细胞悬液，密度是5.0～10×104/mL，培养过夜。48孔板转染时，每孔加入质粒的量是500ng，体积25
Figure 313221DEST_PATH_IMAGE002
L，将聚合物配置成2mg/mL的溶液，并用0.22
Figure 50233DEST_PATH_IMAGE002
m的滤膜无菌过滤，按照设置的待测样品与质粒的质量比，稀释成所需的比例，聚合物溶液的总体积为25
Figure 635935DEST_PATH_IMAGE002
L，然后把聚合物溶液加入到质粒的溶液当中去，快速混匀，孵育20min。加入每孔的复合物的体积为50L，为总体积（500
Figure 120454DEST_PATH_IMAGE002
L）的十分之一，符合规定。每个质量比做三个复孔。
阳性对照组PEI 25kDa和Lipofectamine 2000（脂质体2000），以其最佳质粒比2时的结果各做三个对照孔，在孵育的这段时间里，从培养箱中拿出细胞，除去有血清的培养基，再用200
Figure 395577DEST_PATH_IMAGE002
L 的PBS溶液洗一遍，培养基换成250
Figure 101365DEST_PATH_IMAGE002
L的无血清的培养基，然后将孵育好的复合物按顺序加入到细胞中去。4小时后，除去无血清的培养基，每孔加入含10%胎牛血清和1%双抗的新鲜培养基，再培养48小时，检测转染结果。如图5所示，结果显示，在w/w比例为70：1时，PEI-Tp的转染活性超过了阳性对照Lipofectamine 2000和PEI 25kDa。
高分子PEI-Tp的细胞毒性实验
接种非洲绿猴肾细胞细胞（Cos-7），将细胞消化，稀释成密度为5～10×104/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100
Figure 436532DEST_PATH_IMAGE002
L，培养过夜；
将2mg/mL的高分子DMEM溶液稀释成不同的浓度梯度，终体积为100
Figure 978503DEST_PATH_IMAGE002
L，阳性对照组PEI 25kDa和PEI 800也稀释为与待测样品组一致的浓度梯度。
取出细胞后，移除有血清的培养基，用100μL的PBS（磷酸盐）缓冲溶液洗一遍，直接把配制好的高分子DMEM溶液加到各个细胞孔中，阴性对照组中加入100
Figure 57317DEST_PATH_IMAGE002
L无血清无酚红DMEM。4小时后，除去培养液和高分子溶液，每孔加入100
Figure 617611DEST_PATH_IMAGE002
L的无血清无酚红培养基，避光条件下再加入25
Figure 389258DEST_PATH_IMAGE002
L的MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液，该溶液用PBS缓冲溶液配制成5mg/mL），置于细胞培养箱中培养6小时。
显微镜下观察活细胞的结晶情况，如没有完全结晶，可适当延长放置时间。如果完全结晶，倒出96孔板中的液体，然后在每孔中各加入150
Figure 150016DEST_PATH_IMAGE002
L的DMSO（二甲亚砜），轻微摇晃96孔板使甲臢晶体充分溶解。由于加入DMSO后溶液颜色会随时间变化，酶标仪的检测在20min内进行，检测波长为490nm，通过样品组的在此波长的吸收值和空白对照组做比值，从而得到细胞的成活率。
图6为高分子PEI-Tp与质粒的质量比不同时合成的复合物的COS-7细胞毒性对比图，如图6所示，细胞活性测试表明：PEI-Tp的细胞毒性远小于阳性对照PEI 25KDa。
综上所述，本发明制备的可降解亚胺键的聚阳离子基因载体结构简单、容易合成；且其具有较高的转染活性和较低的毒性，是优良的基因物质输送载体。

Claims (11)

1.一种含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体，其特征在于，其结构式为：
Figure 2011103271092100001DEST_PATH_IMAGE001
，
其中，n为1～20，m为 1～20，x为1～20，y为 1～20。
2.根据权利要求1所述的聚阳离子基因载体，其特征在于，所述聚阳离子基因载体的基本构建单元为小分子量PEI，所述PEI的分子量为800Da。
3.一种制备权利要求1所述的聚阳离子基因载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）将小分子量PEI及对苯二醛按摩尔比1:1的比例加入反应溶剂甲醇中； 
（b）搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述聚阳离子基因载体。
4.根据权利要求3所述的聚阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，所述小分子量PEI的分子量为800Da。
5.根据权利要求3或4所述的聚阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，还包括分离纯化的步骤：将所述聚阳离子基因载体用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析，微孔滤膜过滤，冻干。
6.如权利要求5所述的聚阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，所述透析的时间为3天。
7.如权利要求5所述的聚阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.22微米。
8.如权利要求5所述的聚阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜的截留分子量为3500Da。
9.一种复合物，其特征在于，该复合物由包括如下步骤的方法制备而得：
（a）将权利要求1所述的聚阳离子基因载体的溶液快速加入到质粒溶液中，混合；
（b）将混合溶液于室温下孵育，即得所述复合物。
10.根据权利要求9所述的复合物，其特征在于，所述质粒为DNA质粒。
11.根据权利要求9所述的复合物，其特征在于，所述孵育的时间为0.5小时。
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