CN102380024B - 一种抗老年性脑痴呆症的中药组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗老年性脑痴呆症的中药组合物及其用途。该中药组合物由以下原料药组成：化橘红、知母、杜仲叶和人参，所述的化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为(1～10)∶(1～10)∶(1～10)∶(0.4～8)，所述原料药的来源为中药材或相当于中药材生药量的中药提取物。本发明的中药组合物对抗老年性脑痴呆症具有显著的作用，可用于预防和治疗老年性脑痴呆症；且为纯中药制剂，安全低毒、廉价易得；经药理药效学实验证明，与现有技术中常用的西药和中药对照物相比，其治疗效果明显提高。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，涉及一种抗老年性脑痴呆症的中药组合物及其用途。
背景技术
老年性脑痴呆症(Senile dementia)，亦称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以临床和病理为特征的进行性退行性神经病，该病严重影响着患者的生活能力和生活质量，给家庭和社会带来沉重的监护负担和医疗费用负担。目前全世界约有1800万人患有老年性脑痴呆症。据推测，至2025年，全球老年性脑痴呆症患者将剧增至3400万人。在美国，65岁以上的人有10％患有老年性脑痴呆症，是老年人死亡的第四位原因；在英国，65岁以上人群的发病率也达10％，85岁以上人群的发病率高达47％；在我国超过60岁的人口占总人口的10.15％，约1.29亿人，其中老年性脑痴呆症患病率约为5％，患者约为700万人。这么庞大的发病群体势必会日益加重社会负担、家庭负担，带来一系列的家庭和社会问题。
目前临床上用于治疗老年性脑痴呆的药物集中在胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体阻滞剂、清除自由基的抗氧化剂、雌激素类药物四个方面，上述药物多是临床对症治疗药物，只能一定程度上缓解AD某些症状，而不能使这些症状得到根本的治疗和逆转，也不能有效的预防AD，更为严重的是上述药物均存在不同程度的毒副作用。因此研究治疗作用确切、安全低毒、廉价易得的中药复方创新药物具有较大的市场竞争优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗老年性脑痴呆症的中药组合物。
本发明的另一目的在于提供一种抗老年性脑痴呆症的药物。
本发明的又一目的在于提供上述抗老年性脑痴呆症药物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供上述中药组合物在制备抗老年性脑痴呆症药物中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种抗老年性脑痴呆症的中药组合物，其在于由以下原料药组成：化橘红、知母、杜仲叶和人参，所述的化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为(1～10)∶(1～10)∶(1～10)∶(0.4～8)，所述原料药的来源为中药材或相当于中药材生药量的中药提取物。优选为化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为(2～6)∶(1～5)∶(1～5)∶(0.6～4)。更进一步优选为化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为4∶2∶2∶1。
上述的抗老年性脑痴呆症的中药组合物，其在于所述的化橘红、知母、杜仲叶和人参为药材的水提取物、醇提取物或者中药材直接打粉。
一种抗老年性脑痴呆症的药物，其在于由上述的中药组合物和药学可接受的辅料制成。所述的药物为口服剂型。所述的口服剂型优选为胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、滴丸剂、软胶囊剂、蜜丸剂或水丸剂。
上述的抗老年性脑痴呆症药物的制备方法，包括以下步骤：制得化橘红、知母、杜仲叶和人参的醇提取物或水提取物，再向醇提取物或水提取物中加入药学可接受的辅料，得到所述的药物。
上述的中药组合物在制备抗老年性脑痴呆症药物中的应用。
化橘红：芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis(L.)Osbeek的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。前者习称“毛橘红”，后者习称“光七爪”、“光五爪”性味与归经：辛、苦，温。归肺、脾经。功能与主治：散寒，燥湿，利气，消痰。用于风寒咳嗽，喉痒痰多，食积伤酒，呕恶痞闷。
知母：为百合科知母属植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)的根状茎。性味功能：苦、寒、清热除烦，润肺滋肾。主治烦躁口渴、肺热燥咳、消渴、午后潮热等症。临床常用药，不仅清肺火，又能清胃火，特别是清虚热、胃阴热等虚热症。
杜仲叶：为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥叶。性状：杜仲叶面呈椭圆形或卵形，长7-15cm，宽3.5-7cm。表面黄绿色或黄褐色，微有光泽。先端渐尖，基部圆形成广楔形，边缘有锯齿，具短叶柄。质脆，搓之易碎，折断面有少量银白色橡胶丝相连。气味，味微苦。性味与归经：微辛，温。归肝、肾经。功能与主治：补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软。
人参：为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey的干燥根。优选为生晒参。
本发明的有益效果：
本发明的中药组合物对抗老年性脑痴呆症具有显著的作用，可用于预防和治疗老年性脑痴呆症；且为纯中药制剂，安全低毒、廉价易得；经药理药效学实验证明，与现有技术中常用的西药和重要对照物相比，其治疗效果明显提高。
具体实施方式
实施例1中药组合物治疗老年性脑痴呆症的体外药效学试验
中药组合物由化橘红、知母、杜仲叶和人参组成，组方I药味质量配比为4∶2∶2∶1；组方II药味质量配比为10∶10∶10∶1；组方III药味质量配比为1∶1∶2∶4。通过测定“叠氮钠诱导的PC12细胞”的增殖率、LDH释放量、细胞内钙离子浓度进行体外药效学实验。
1、中药组合物醇提取液和水提取液的制备
组方I醇提取液：称取化橘红22.24g、知母11.12g、杜仲叶11.12g和人参5.56g，加600ml 60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h；将3次滤液合并，旋蒸回收乙醇至无醇味，250ml容量瓶加蒸馏水定容，按照生药材计算，得到浓度为200mg/ml药液；取1ml浓度为200mg/ml的药液，置于10ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，得到浓度为20mg/ml药液；将药液在超净台内过滤除菌，4℃冰箱保存，备用。加药前，将药液用RPMI1640培养液稀释到浓度为2mg/ml。
组方II醇提取液：分别称取化橘红16.14g、知母16.14g、杜仲叶16.14g和人参1.61g，制备浓度为20mg/ml的药液；制备方法同组方I制备醇提取液方法。加药前，将药液用RPMI1640培养液稀释到浓度为2mg/ml。
组方III醇提取液：分别称取化橘红6.25g、知母6.25g、杜仲叶12.50g和人参25.00g，制备浓度为20mg/ml的药液；制备方法同组方I制备醇提取液方法。加药前，将药液用RPMI1640培养液稀释到浓度为2mg/ml。
组方I水提取液：称取化橘红22.24g、知母11.12g、杜仲叶11.12g和人参5.56g，用10倍量的水浸泡组方药材1h，直火加热提取3次，每次提取时间为1h，抽滤，将3次滤液合并浓缩后，置于250ml容量瓶加蒸馏水定容，按照生药材计算，得到浓度为200mg/ml药液；取1ml浓度为200mg/ml的药液，置于10ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，得到浓度为20mg/ml药液；将药液在超净台内过滤除菌，4℃冰箱保存，备用。加药前，将药液用RPMI1640培养液稀释到浓度为2mg/ml。
组方II水提取液：分别称取化橘红16.14g、知母16.14g、杜仲叶16.14g和人参1.61g，制备浓度为20mg/ml的药液；制备方法同组方I制备水提取液方法。加药前，将药液用RPMI1640培养液稀释到浓度为2mg/ml。
组方III水提取液：分别称取化橘红6.25g、知母6.25g、杜仲叶12.50g和人参25.00g，制备浓度为20mg/ml的药液；制备方法同组方I制备水提取液方法。加药前，将药液用RPMI1640培养液稀释到浓度为2mg/ml。
2.细胞接板培养、分组造模与给药
实验细胞：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)，购于中国医学科学院基础医学研究所。
实验药品：叠氮钠(Amersco)，胰蛋白酶(AMRESCO，USA)；新生牛血清(NewbornCalf Serum，GIBCO Invitrogen Corporation，New Zealand)；RPMI Medium 1640干粉培养基(GIBCO Invitrogen)；二甲基亚砜(dimethyl-sulfoxide，DMSO，江苏永华精细化学品有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物制品有限公司，20101123)
D-Hank′s平衡盐溶液配制：NaCl 4.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4·12H2O 0.067g，KH2PO40.03g，NaHCO3 0.175g，酚红0.01g，三蒸水500mL，调节pH至7.0～7.4；
PBS平衡盐溶液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4·12H2O 3.49g，KH2PO4 0.20g，三蒸水1000mL，调节pH至7.2～7.4；
RPMI1640培养液配制：RPMI Medium 1640干粉培养基(GIBCO Invitrogen)10.4g，NaHCO3 2.0g，青霉素(400万U单位市售)0.06g，链霉素(100万U单位市售)0.1006g，三蒸水900mL配制，抽滤除菌；
细胞营养液配制：含10％新生牛血清的RPMI 1640培养基溶液；
0.25％胰蛋白酶消化液配制：将胰蛋白酶(Trypsin(1∶250)AMRESCO，USA)溶解于PBS平衡盐溶液中，0.22μm滤器过滤除菌；
Triton X-100(10％)配制：精密移取Triton X-100 1.0mL用PBS平衡盐溶液稀释定容至10mL即得。
EGTA(1mol/L)配制：精密称取EGTA 3.8006mg用4mL PBS平衡盐溶液溶解，再用4M氢氧化钠调节PH为8.4，最后用PBS平衡盐溶液定容至10mL即得。
Fura 2-AM(1mmol/L)配制：精密称取0.5mg Fura 2-AM，用499μL DMSO溶解即得，-20℃冰箱冻存。
细胞培养：取生长良好的PC12细胞经0.25％胰蛋白酶消化，离心后用细胞营养液重悬制成细胞悬液，计数后调节细胞浓度为1×105个/mL。将此细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，除细胞板四周各孔外，每孔接种100μL。96孔细胞培养板各孔各加入100μL D-Hank’s平衡盐溶液。将接种细胞后的培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养24h。
细胞分组、造模与给药：将96孔细胞培养板除掉四周的孔外，其余各孔按列分组。从细胞板的第二列开始，依次设为空白组；模型组；给药组，每组设置6个复孔。按照下述方法对各组细胞进行造模和给药，并放入5％CO2、37℃恒温培养箱中培养24h，备用。
给药组：接种的PC12细胞培养24h后，弃去原培养液，分别加入含NaN3(浓度为50mmol/l)的培养液100μl，再加入分别含有组方I、II、III的水提取物和乙醇提取物的RPMI1640培养液20μl。其中各组方的药物在RPMI1640培养液中的含量为2mg/ml。培养12h，测定OD值。
模型组：接种的PC12细胞培养24h后，弃去原培养液，加入含NaN3(浓度为50mmol/l)培养液100μl，再加入新鲜培养液20μl。培养12h，测定OD值。
空白组：接种的PC12细胞培养24h后，弃去原培养液，加入培养液120μl。培养12h，测定OD值。
3.组方药物对叠氮钠诱导的PC12细胞损伤修复作用-对受损细胞增殖活性的影响，检测结果见表1。
表1：各组方水提取物和醇提取物(2mg/ml)对NaN3诱导的PC12细胞增殖活性的影响
| 实验序号 | 细胞OD值 | 细胞增殖率％ |
| 正常组 | 1.2270±0.164 | / |
| 模型组 | 0.9610±0.159# | / |
| 组方I水提取液 | 1.2977±0.181 | 35.04％** |
| 组方II水提取液 | 1.2892±0.178 | 34.15％** |
| 组方III水提取液 | 1.2708±0.146 | 32.24％** |
| 组方I醇提取液 | 1.3384±0.168 | 39.27％** |
| 组方II醇提取液 | 1.3100±0.157 | 36.32％** |
| 组方III醇提取液 | 1.2916±0.189 | 34.40％** |
注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。
结论：抗AD组方I、II、III的水提取物和乙醇提取物，在修复NaN3诱导的PC12细胞活力方面，与模型组相比，均具有极显著性作用(p＜0.01)，即具有修复NaN3诱导细胞损伤作用。
4.组方药物对“叠氮钠诱导的PC-12细胞”LDH释放量影响的测定
4.1细胞接板培养、细胞分组、造模和给药的方法同上。
4.2比色法测定细胞LDH释放
测定原理：乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶，存在于细胞的胞质内。当细胞受到损伤后，细胞膜完整性降低，LDH会泄漏到细胞外液中。通过测定细胞培养液中的LDH含量，可以间接反映细胞膜的完整性。本实验采用LDH测试盒测定细胞泄漏的LDH。由于LDH能够催化乳酸形成丙酮酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，因此可以通过比色法可以测出LDH的活力。
测定步骤：采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒进行测定。
4.3结果统计方法
所有数据结果用均数±标准差
表示，并用SPSS 11.0统计学软件进行方差分析和组间t检验。
4.4实验结果，见表2。
表2：各组方醇提取物(2mg/ml)对NaN3诱导的PC12细胞LDH释放量的影响
| 组别 | OD450±SS | 抑制率(％) |
| 空白组 | 0.1007±0.0217 | / |
| 模型组 | 0.1373±0.0358## | / |
| 组方I | 0.0931±0.0283* | 32.20* |
| 组方II | 0.0936±0.0312* | 31.80* |
| 组方III | 0.0952±0.0273* | 30.66* |
空白组与模型组相比，##P＜0.01；给药组与模型组比较*p＜0.05。
4.5结论
实验考察了抗AD组方I、II、III的乙醇提取物，对NaN3诱导的PC12细胞乳酸脱氢酶释放的影响。结果表明，与模型组比较，在给药2.0mg/mL浓度条件下，各组方药物的提取物，显著地抑制PC12细胞的乳酸脱氢酶释放，即具有修复NaN3诱导细胞损伤作用，均具有显著性(p＜0.05)修复NaN3诱导细胞损伤作用。
5.组方药物对“叠氮钠诱导的PC-12细胞”的细胞内钙离子浓度影响的测定
5.1细胞接板培养
取生长良好的PC12细胞经0.25％胰蛋白酶消化，离心后用细胞营养液重悬制成细胞悬液，计数后调节细胞浓度为1×105个/mL。将此细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1000μL。24孔细胞培养板最后一列和最后一行各孔中各加入1000μL D-Hank’s平衡盐溶液。将接种细胞后的24孔细胞培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养24h，备用。
5.2细胞分组、造模和给药的方法同上
细胞分组：将24孔细胞培养板共有4行6列，除掉最后一列和最后一行的孔外，其余各孔按照列的顺序进行分组。从细胞板的第一列开始，依次设为空白组；模型组；给药组。每组设置3个复孔。
造模和给药：细胞接板培养了24h后，依据24孔细胞培养板分组情况，按照下述方法对各组细胞进行造模和给药，并放入5％CO2、37℃恒温培养箱中培养12h，备用。
给药组：接种的PC12细胞培养后，弃去原培养液，分别加入含NaN3(浓度为50mmol/l)的培养液1000μl，再加入含有各组方醇提物的RPMI1640培养液200μl。各组方药物在RPMI1640培养液中的含量为2mg/ml。
模型组：接种的PC12细胞培养24h后，弃去原培养液，加入含NaN3(浓度为50mmol/l)培养液1000μl，再加入新鲜培养液200μl。
正常组：接种的PC12细胞培养24h后，弃去原培养液，加入含PBS(浓度为50mmol/l)培养液1000μl，再加入含水的培养液200μl。
培养12h，测定OD值。
5.3Fura 2-AM双波长荧光扫描法测定细胞内钙离子浓度
测定步骤：
在各组细胞造模和给药培养了12h之后，将24孔细胞培养板的各孔中的细胞营养液吸掉。贴壁细胞用0.25％胰蛋白酶消化1min，将消化后的细胞液吸出，重悬于2mL HBSS平衡盐溶液(市售)中(在10mL离心管中操作)。精密加入1mmol/L的Fura 2-AM 20μL，使其在细胞悬液中的最终浓度为10μmol/L。将此细胞悬液置于37℃水浴中振荡孵育50min，负载完成后以2000rpm速度离心4min，去掉上清液后，将离心沉淀所得的细胞团用HBSS平衡盐溶液轻轻洗涤两次，每次用量2mL。然后再用含0.2％牛血清白蛋白的HBSS平衡盐溶液制成细胞悬液，于双波长荧光分光光度计上37℃条件下测定R值。然后加入10％Triton X-100溶液20μL，使其在细胞悬液中的终浓度为0.1％，2分钟后测定Rmax值。再加入1mol/L的EGTA溶液20μL，使其在细胞悬液中的终浓度为10mmol/L，2分钟后测定Rmin值。细胞内钙离子浓度按照下面公式计算。
[Ca2+]i＝Kd×(R-Rmin)(Sfb/Sfa)/(Rmax-R)
其中Kd为钙离子结合Fura2的解离常数，在37℃条件下为224nmol/L。R为各测定点340nm和380nm荧光强度的比值，F340nm/F380nm。Rmax和Rmin分别代表最大荧光强度比值和最小荧光强度比值。Sfb和Sfa分别为零钙时和钙离子浓度饱和时在380nm处的荧光强度值。
双波长激发光交替扫描条件如下：
激发波长A：340nm；激发波长B：380nm。发射波长A：500nm；发射波长B：500nm。激发光光栅：3nm；发射光光栅：3nm。时间间隔：2.0秒。反应时间：0.02秒。灵敏度：高。测定温度：恒温37℃。
5.4实验结果
表3：各组方醇提物(2mg/ml)对NaN3诱导的PC12细胞细胞内钙离子浓度的影响
| 组别 | [Ca2+]i(nM) |
| 正常组 | 194.74±12.985 |
| 模型组 | 260.79±6.709## |
| 组方I | 199.129±4.871** |
| 组方II | 202.221±5.028** |
| 组方III | 204.099±6.482** |
空白组与模型组相比，##P＜0.01；给药组与模型组比较**p＜0.01。
5.5结论
实验考察了抗AD组方对NaN3诱导的PC12细胞内钙离子内流的影响。实验结果表明，与模型组比较，在给药2.0mg/mL浓度条件下，组方能够极显著性降低NaN3诱导的PC12细胞钙离子内流。
体外药效学实验结论：抗老年性脑痴呆症组方能够显著地抵抗NaN3诱导的细胞活力下降；抗老年性脑痴呆症组方具有抑制NaN3诱导损伤的细胞钙离子内流的作用；抗老年性脑痴呆症组方具有减少细胞乳酸脱氢酶释放的作用。抗AD组方均具有极显著性(p＜0.01)，修复NaN3诱导细胞损伤作用。
实施例2中药组合物治疗老年性脑痴呆症的体内药效学试验
本实验采用三氯化铝和D-半乳糖的联合诱导使小鼠产生老年性痴呆症状作为动物载体模型，考察组方口服灌胃给药是否具有对抗老年性脑痴呆症的作用。同时，实验中采用氢溴酸加兰他敏(乙酰胆碱酯酶抑制剂)和银杏叶提取物(抗氧化剂)分别作为西药和中药阳性对照药。
1仪器、材料与试药
1.1药物
三氯化铝(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；D-半乳糖(分析纯，纯度≥99％，Sigma公司，批号：G0625)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(中国医药集团上海化学试剂公司，实验级，分子量300-800)；氢溴酸加兰他敏(陕西康盛生物技术有限公司，批号：Ga100803)；银杏叶提取物(徐州恒凯银杏制品有限公司，批号：N0100828)。
1.2试剂盒
冰乙酸(分析纯，南京宁试化学试剂有限公司)；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20101120)；乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20101123)；超氧化物歧化酶测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20101123)；小鼠β淀粉样蛋白1-40酶联免疫检测试剂盒(R&D Expirtion，批号：201009)。
1.3动物
ICR种小鼠，雌雄各半，体重18～20g(南通大学实验动物中心提供)。
2实验溶液配制
2.1AlCl3溶液(0.50mg/mL)
称取适量三氯化铝粉末用蒸馏水配制成浓度为0.50mg/mL的溶液。
2.2D-半乳糖溶液(6.0mg/mL)
称取适量D-半乳糖溶液粉末用生理盐水配制成浓度为6.0mg/mL的溶液，临用前用0.2μm的无菌微孔滤膜法过滤除菌。
2.3组方溶液(990.0mg/mL，330.0mg/mL，110.0mg/mL)
中药组合物由化橘红、知母、杜仲叶、人参组成，组方I药味质量配比为4∶2∶2∶1；组方II药味质量配比为10∶10∶10∶1；组方III药味质量配比为1∶1∶2∶4。将组方I、II、III分别用60％乙醇回流提取，回收乙醇至无醇味，用质量百分含量为0.5％的CMC-Na水溶液将分别组方I稀释配制成为990.0mg/mL，330.0mg/mL，110.0mg/mL的溶液，灌胃体积为0.1ml/10g，给药剂量9900mg·Kg-1·Day-1、3300mg·Kg-1·Day-1、1100mg·Kg- 1·Day-1。用0.5％CMC-Na水溶液将组方II稀释配制成330.0mg/mL，灌胃体积为0.1ml/10g，给药剂量3300mg·Kg-1·Day-1。用0.5％CMC-Na水溶液将组方III稀释配制成330.0mg/mL，灌胃体积为0.1ml/10g，给药剂量3300mg·Kg-1·Day-1。
2.4银杏叶提取物溶液(6.0mg/mL)
称取适量银杏叶提取物粉末用0.5％的CMC-Na水溶液配制成浓度为6.0mg/mL的溶液。
2.5氢溴酸加兰他敏溶液(0.6mg/mL)
称取适量氢溴酸加兰他敏粉末用0.5％的CMC-Na水溶液配制成浓度为0.6mg/mL的溶液。
3小鼠给药剂量的确定
3.1实验药物的剂量确定
考察组方I低、中、高三个剂量组及组方II和组方III中剂量的药效，则三个剂量组的小鼠给药剂量应该分别为1.1、3.3、9.9g生药·Kg-1·Day-1。
3.2中药阳性对照组剂量的确定
本实验采用的小鼠剂量为60mg·Kg-1·Day-1。
3.3化药阳性对照组剂量的确定
本实验采用的小鼠剂量为6.0mg·Kg-1·Day-1。
4实验方法
4.1实验分组
小鼠适应性饲养1周后，随机分成7组，每组14只，雌雄各半。组别分别为正常对照组(正常组)；模型对照组(模型组)；中药阳性对照组(中阳组)；西药阳性对照组(西阳组)；组方I高剂量组；组方I中剂量组；组方I低剂量组；组方II中剂量组；组方III中剂量组。
4.2造模和给药
4.2.1正常对照组
A、采取每天给予正常自来水作为饮用水。
B、上午九点腹腔注射空白生理盐水溶液(给药体积，0.1mL/10g)。
C、下午1点灌胃0.5％CMC-Na水溶液(给药体积，0.1mL/10g)。
4.2.2模型对照组
A、采取每天给予0.50mg/mL的AlCl3溶液作为饮用水，由于25g小鼠每天饮水量为5mL，因此AlCl3的给药剂量相当于100mg·Kg-1·Day-1。
B、上午九点腹腔注射6.0mg/mL的D-半乳糖生理盐水溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，60mg·Kg-1·Day-1)。
C、下午1点灌胃0.5％CMC-Na水溶液(给药体积，0.1mL/10g)。
4.2.3中药阳性对照组
A、采取每天给予0.50mg/mL的AlCl3溶液作为饮用水，由于25g小鼠每天饮水量为5mL，因此AlCl3的给药剂量相当于100mg·Kg-1·Day-1。
B、上午九点腹腔注射6.0mg/mL的D-半乳糖生理盐水溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，60mg·Kg-1·Day-1)。
C、下午1点灌胃6.0mg/mL银杏叶提取物0.5％CMC-Na溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，60mg·Kg-1·Day-1)。
4.2.4西药阳性对照组
A、采取每天给予0.50mg/mL的AlCl3溶液作为饮用水，由于25g小鼠每天饮水量为5mL，因此AlCl3的给药剂量相当于100mg·Kg-1·Day-1。
B、上午九点腹腔注射6.0mg/mL的D-半乳糖生理盐水溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，60mg·Kg-1·Day-1)。
C、下午1点灌胃0.6mg/mL氢溴酸加兰他敏0.5％CMC-Na溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，6.0mg·Kg-1·Day-1)。
4.2.5组方I高剂量组
A、采取每天给予0.50mg/mL的AlCl3溶液作为饮用水，由于25g小鼠每天饮水量为5mL，因此AlCl3的给药剂量相当于100mg·Kg-1·Day-1。
B、上午九点腹腔注射6.0mg/mL的D-半乳糖生理盐水溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，60mg·Kg-1·Day-1)。
C、下午1点灌胃990mg/mL组方I药物的0.5％CMC-Na溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，9900mg·Kg-1·Day-1)。
4.2.6组方I、II、III中剂量组
A、采取每天给予0.50mg/mL的AlCl3溶液作为饮用水，由于25g小鼠每天饮水量为5mL，因此AlCl3的给药剂量相当于100mg·Kg-1·Day-1。
B、上午九点腹腔注射6.0mg/mL的D-半乳糖生理盐水溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，60mg·Kg-1·Day-1)。
C、下午1点灌胃330mg/mL各组方药物的0.5％CMC-Na溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，3300mg·Kg-1·Day-1)。
4.2.7组方I低剂量组
A、采取每天给予0.50mg/mL的AlCl3溶液作为饮用水，由于25g小鼠每天饮水量为5mL，因此AlCl3的给药剂量相当于100mg·Kg-1·Day-1。
B、上午九点腹腔注射6.0mg/mL的D-半乳糖生理盐水溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，60mg·Kg-1·Day-1)。
C、下午1点灌胃110mg/mL组方I药物的0.5％CMC-Na溶液(给药体积，0.1mL/10g；给药剂量，1100mg·Kg-1·Day-1)。
4.3造模和给药的期限和频率
给药期限为120天，给药频率为每周6次，共计给药108次。
5实验指标测定
5.1学习和记忆力指标的测定：采用水迷宫法进行测定。
5.2脑重系数指标测定
测定方法：小鼠取脑前，先用电子秤称量小鼠的体重。称过小鼠体重后，用手术剪剪刀将小鼠断头处死，在冰袋上用眼科剪剪开头盖骨后，用手术剪和小镊子迅速取出小鼠全脑，清理除掉残留物后，放入相应的标过号、在电子天平上调过零的10mL离心管中，用电子天平称量鼠脑的重量。脑重系数的计算方法：小鼠脑重系数＝小鼠脑湿重(g)/体重(g)×100％。
5.3脑组织中总蛋白用考马斯亮蛋白法测定：采用考马斯亮蛋白测定试剂盒进行测定。
5.4小鼠脑组织中SOD活力的测定：采用SOD试剂盒进行测定。
5.5小鼠脑组织中TChE活力测定：采用TChE试剂盒进行测定。
5.6双抗体夹心法测定小鼠脑组织中Aβ1-42淀粉样蛋白：采用Aβ1-42淀粉样蛋白试剂盒进行测定。
6.实验结果
6.1学习能力和记忆能力考察
本实验研究中采用Morris水迷宫法，通过小鼠寻找平台的潜伏时间考察了各组小鼠的学习和记忆能力。实验结果表明，小鼠通过三氯化铝和D-半乳糖联合造模诱导后，模型组小鼠在学习第三天时，与正常组相比，学习能力下降。而在阳性对照组和给药组的结果中，在小鼠既给予造模同时又采取给药的情况下，相比于模型组小鼠的学习能力得到了明显的改善，其中氢溴酸加兰他敏组、银杏叶提取物组和组方I、II、III各组的小鼠搜索平台潜伏期时间明显少于模型组(p＜0.05)；上述各组小鼠在第4象限的停留时间与模型组比较均具有显著的提高(p＜0.05)。小鼠的行为学实验结果证明，组方I、II、III各组均有显著性提高模型试验小鼠获得学习和记忆能力的作用，其中组方I高剂量组的作用最为明显(表4和表5)。
表4：小鼠学习能力结果
(与正常组比较#p＜0.05；##p＜0.01；与模型组比较*p＜0.05；**p＜0.01)
表5：小鼠记忆能力结果
| 组别 | 第4象限停留时间 |
| 正常组 | 32.83±6.71 |
| 模型组 | 21.26±7.2# |
| 中阳组 | 29.52±6.55* |
| 西阳组 | 29.53±6.85* |
| 组方I高剂量 | 32.01±8.55* |
| 组方I中剂量 | 31.45±9.13* |
| 组方I低剂量 | 30.25±8.17* |
| 组方II中剂量 | 30.94±6.11* |
| 组方III中剂量 | 30.82±7.15* |
(与正常组比较#p＜0.05；##p＜0.01；与模型组比较*p＜0.05；**p＜0.01)
6.2脑重系数考察
脑重系数是反映脑体积和脑重变化最直观的指标，老年性痴呆患者临床表现常有脑体积变小、脑萎缩等情况发生。然而在本实验中，采用三氯化铝和D-半乳糖联合造模诱导后，模型组小鼠与正常组比较脑重系数无明显的变化。同时各阳性对照组以及组方高剂量组，低剂量组与模型组比较，脑重系数也无显著性的改变(表6)。因此从结果中可以推断，在该复合型造模条件下，小鼠不会产生全脑重量明显的改变。
表6：小鼠脑重系数结果
| 脑重系数(％) | SD | |
| 正常组 | 1.434 | 0.313 |
| 模型组 | 1.497 | 0.124 |
| 中阳组 | 1.491 | 0.191 |
| 西阳组 | 1.571 | 0.279 |
| 组方I高剂量 | 1.634 | 0.299 |
| 组方I中剂量 | 1.526 | 0.168 |
| 组方I低剂量 | 1.489 | 0.159 |
| 组方II中剂量 | 1.498 | 0.201 |
| 组方III中剂量 | 1.516 | 0.179 |
(与正常组比较#p＜0.05；##p＜0.01；与模型组比较*p＜0.05；**p＜0.01)
6.3脑组织中SOD活力考察
本实验通过测定脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)的活性，来反映小鼠脑内的抗氧化水平。从表7的结果，我们可以发现通过三氯化铝和D-半乳糖联合造模损伤后，模型组小鼠1％脑组织匀浆液中总SOD活力与正常组小鼠比较显著地降低(p＜0.05)，说明造模成功。阳性对照药氢溴酸加兰他敏组与模型组比较，有提高SOD活力的趋势，但不具有显著性差异(p＞0.05)；阳性对照药银杏叶提取物组与模型组比较，有提高SOD活力的显著性作用(p＜0.05)；组方I、II、III各组与模型组比较，有提高SOD活力的极显著性作用(p＜0.01)，详见(表7)。
表7：小鼠1％脑组织匀浆液中总SOD活力
| 总SOD活力(U/mgprot) | SD | |
| 正常组 | 89.9699 | 12.566 |
| 模型组 | 74.8674# | 16.837 |
| 中阳组 | 92.1976* | 10.254 |
| 西阳组 | 80.6365 | 11.611 |
| 组方I高剂量 | 99.7748** | 13.758 |
| 组方I中剂量 | 97.3729** | 11.445 |
| 组方I低剂量 | 93.3671** | 12.031 |
| 组方II中剂量 | 96.1046** | 13.224 |
| 组方III中剂量 | 95.3158** | 11.328 |
(与正常组比较#p＜0.05；##p＜0.01；与模型组比较*p＜0.05；**p＜0.01)
6.4脑组织中TChE活力考察
在本实验的结果中，与正常组小鼠相比较，三氯化铝和D-半乳糖的联合损伤造成小鼠脑组织中TChE活力的显著升高(p＜0.05)，表明造模成功。氢溴酸加兰他敏组、银杏叶提取物组和组方I、II、III各组与模型组比较，均能使小鼠脑组织中的TChE活力有显著性的下降(p＜0.05)。详见(表8)。
表8：小鼠10％脑组织匀浆液中TChE活力
| TChE活力(U/mgprot) | SD | |
| 正常组 | 0.319 | 0.106 |
| 模型组 | 0.527# | 0.151 |
| 中阳组 | 0.349* | 0.128 |
| 西阳组 | 0.340* | 0.238 |
| 组方I高剂量 | 0.301* | 0.129 |
| 组方I中剂量 | 0.312* | 0.115 |
| 组方I低剂量 | 0.320* | 0.135 |
| 组方II中剂量 | 0.317* | 0.109 |
| 组方III中剂量 | 0.321* | 0.113 |
(与正常组比较#p＜0.05；##p＜0.01；与模型组比较*p＜0.05；**p＜0.01)
6.5脑组织中β淀粉样蛋白1-42含量考察
本实验研究中测定了造模给药后各组小鼠10％脑组织匀浆液中β淀粉样蛋白1-42的含量。实验结果表明，通过三氯化铝和D-半乳糖的联合损伤后，模型组小鼠脑组织中的Aβ1-42的含量明显增高(p＜0.01)，表明实验动物造模成功。实验结果显示，阳性对照药氢溴酸加兰他敏组和银杏叶提取物组与模型组比较，能显著性地降低小鼠脑组织中Aβ1-42的含量(p＜0.05)，而组方I、II、III各组与模型组比较，能极显著性地减低小鼠脑组织中Aβ1-42的含量(p＜0.01)。结果显示抗AD组方药物在降低小鼠脑组织中Aβ1-42的含量的活性方面具有优效性。详见(表9)。
表9：小鼠10％脑组织匀浆液中β1-42淀粉样蛋白含量(μg/L)
(与正常组比较#p＜0.05；##p＜0.01；与模型组比较*p＜0.05；**p＜0.01)
7.结论
抗AD组方I、II、III对D-半乳糖和三氯化铝联合损伤的AD模型小鼠具有显著性的治疗作用，其作用优于两种阳性对照药。与模型组相比较，组方药物能够显著地提高小鼠的学习能力，显著地提高小鼠的记忆能力，显著地提高小鼠的增加脑组织内的SOD活力，显著地提高小鼠的降低脑内TChE水平，显著地提高小鼠的减少Aβ1-42在小鼠脑组织内的生成和沉积。
实施例3制备胶囊剂
称取化橘红22.80g、知母11.40g、杜仲叶11.40g和人参5.70g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为4∶2∶2∶1)，加60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h，乙醇倍量为12倍；将3次滤液合并，减压浓缩至密度为1.1～1.2，在65℃条件下真空干燥，得粉末。
加入粉末量适量的辅料淀粉，湿法制粒，灌注胶囊，即得胶囊剂。
实施例4制备颗粒剂
称取化橘红16.55g、知母16.55g、杜仲叶16.55g和人参1.65g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为10∶10∶10∶1)，用10倍量的水浸泡组方药材1h，直火加热提取3次，每次提取时间为1h，抽滤，将3次滤液合并，减压浓缩至密度为1.1～1.2，在65℃条件下真空干燥，得粉末。加入粉末2倍质量的辅料糊精，混合均匀，过65目筛，用95％乙醇为粘合剂适量，制成湿材，经20目筛挤压制粒，经65℃干燥后，得棕黄色颗粒剂。
实施例5制备片剂
称取化橘红6.41g、知母6.41g、杜仲叶12.82g和人参25.64g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为1∶1∶2∶4)，加60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h，乙醇倍量为12倍，将3次滤液合并；减压浓缩至密度为1.1～1.2，在65℃条件下真空干燥，得粉末。加入粉末量适量的辅料淀粉和硬脂酸镁，混匀，打片，即得片剂。
实施例6制备口服液
称取化橘红12.82g、知母6.41g、杜仲叶6.41g和人参25.64g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为2∶1∶1∶4)，加60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h，乙醇倍量为12倍，将3次滤液合并，减压浓缩至小体积，加入适量的苯甲酸钠，用纯水定容至0.5g生药/mL，分装于10mL的口服液瓶中，即得口服液。
实施例7制备滴丸剂
称取化橘红35.76g、知母5.96g、杜仲叶5.96g和人参3.58g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为6∶1∶1∶0.6)，加600ml 60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h，乙醇倍量为12倍，将3次滤液合并；减压浓缩至密度为1.1～1.2，在65℃条件下真空干燥，得粉末。
PEG4000∶PEG6000＝2∶1，置于70℃水浴中加热熔融，将中药组合物粉末加入到上述熔融基质中，搅拌使药粉均匀分散并溶解于基质中，药物与基质比例为1∶5。采用液体石蜡作为冷却剂，上端温度设置为10℃，滴距为5cm，滴制滴丸。
实施例8制备软胶囊剂
称取化橘红7.90g、知母19.75g、杜仲叶19.75g和人参3.95g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为2∶5∶5∶1)，加60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h，乙醇倍量为12倍，将3次滤液合并；减压浓缩至密度为1.1～1.2，在65℃条件下真空干燥，得粉末。
软胶囊囊材由胶料明胶、增塑剂甘油、附加剂尼泊金、遮光剂二氧化钛、矫味剂乙基香草醛组成。取组方药物干粉，加入含适量蜂蜡和大豆油，压制成软胶囊。
实施例9制备蜜丸剂
称取化橘红22.30g、知母11.15g、杜仲叶11.15g和人参6.69g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为2∶1∶1∶0.6)，加60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h，乙醇倍量为12倍，将3次滤液合并；减压浓缩至密度为1.1～1.2，在65℃条件下真空干燥，得粉末。
取组方干粉适量，加入炼蜜，药粉∶炼蜜＝1∶1，制丸块，制丸条，制分粒，搓圆药粒，即得蜜丸剂。
实施例10制备水丸剂
称取化橘红21.38g、知母8.55g、杜仲叶12.83g和人参8.55g(化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为5∶2∶3∶2)，加60％乙醇浸泡1h，然后回流提取，提取3次，每次提取时间为2h，乙醇倍量为12倍，将3次滤液合并；减压浓缩至密度为1.1～1.2，在65℃条件下真空干燥，得粉末。采用水泛丸法起模、成型、盖面和干燥，制成水丸。
Claims (9)
1.一种抗老年性脑痴呆症的中药组合物，其特征在于由以下原料药组成：化橘红、知母、杜仲叶和人参，所述的化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为(1～10)∶(1～10)∶(1～10)∶(0.4～8)，所述原料药的来源为中药材或相当于中药材生药量的中药提取物。
2.根据权利要求1所述的抗老年性脑痴呆症的中药组合物，其特征在于所述的化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为(2～6)∶(1～5)∶(1～5)∶(0.6～4)。
3.根据权利要求2所述的抗老年性脑痴呆症的中药组合物，其特征在于所述的化橘红、知母、杜仲叶和人参的质量比为4∶2∶2∶1。
4.根据权利要求1所述的抗老年性脑痴呆症的中药组合物，其特征在于所述的化橘红、知母、杜仲叶和人参为药材的水提取物、醇提取物或者中药材直接打粉。
5.一种抗老年性脑痴呆症的药物，其特征在于由权利要求1-4中任意一项所述的中药组合物和药学可接受的辅料制成。
6.根据权利要求5所述的抗老年性脑痴呆症的药物，其特征在于为口服剂型。
7.根据权利要求6所述的抗老年性脑痴呆症的药物，其特征在于为胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、滴丸剂、软胶囊剂、蜜丸剂或水丸剂。
8.权利要求5所述的抗老年性脑痴呆症药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：制得化橘红、知母、杜仲叶和人参的醇提取物或水提取物，再向醇提取物或水提取物中加入药学可接受的辅料，得到所述的药物。
9.权利要求1所述的中药组合物在制备抗老年性脑痴呆症药物中的应用。
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