CN102378634A - 用于胰组织再生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供使用治疗有效量的TWEAK受体激动剂在受试者中或在培养物中扩增胰细胞群或诱导胰组细胞生成的方法。这些方法可用于治疗需要增强胰组细胞来进行细胞替补疗法的疾病或状况，包括例如糖尿病和导致整个或部分胰丧失的状况。

Description

用于胰组织再生的方法

本发明涉及用于扩增胰细胞群和诱导胰组织再生的方法。

由于具有糖尿病的患者中生成胰岛素的β细胞的数目不足和由于胰癌可源自失控的胰祖细胞生长的可能性，对胰细胞的再生过程特别感兴趣。对生成新β细胞已提出的机制包括已有β细胞的复制和β细胞的新生，其中自祖细胞分化胰岛素阳性细胞。在新生机制中，已提出分化的管上皮细胞作为胰祖细胞起作用(Bonner-Weir et al.，Pediatric Diabetes 5：15-22(2005)；Sharma et al.，Diabetes 48：507-513(1999))。小鼠中的最新证据强力支持此假说：用管特异性碳酸酐酶报告基因遗传标记的分化的管细胞在出生后和在损伤后二者作为产生新岛和胰腺泡(分泌消化酶的组织)二者的胰祖细胞起作用(Inada et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 105(50)：19915-9(2008))。新生机制也可涉及能表达谱系规范标志物(包括例如Ngn3和Pdx-1，它们指导细胞分化成胰岛素阳性细胞)的驻留祖细胞。最近报告了胰管结扎损伤模型中支持Ngn3阳性祖细胞产生胰岛素阳性细胞的能力的证据(Xu，et al.Cell 132：197(2008))。如此，有可能Ngn3和/或Pdx1阳性祖细胞衍生自分化的管上皮细胞，它们是胰岛素阳性细胞新生过程中的中间体。或者，能够表达Ngn3和/或Pdx1的祖细胞可驻留在成体胰中。

糖尿病是一种在美国影响大约750万人的疾病。这种疾病的根本原因是胰中朗格汉斯岛中β细胞的胰岛素生成减少或缺失。糖尿病疗法的一项主要目标是重获再生或替补生成胰岛素的β细胞的能力。虽然移植朗格汉斯岛细胞会是有效治疗，但是这种疗法的应用受限于经由器官捐献能获得的岛供应短缺。获得替补β细胞来治疗1型或2型糖尿病的两种替代手段是在体内自内源前体再生β细胞和在体外扩增和分化β细胞前体供移植疗法用。尽管潜力较大，但是这两种办法受限于能有效扩增和分化β细胞前体的因子缺乏。基于细胞移植物的疗法面对离体扩增未分化状态的罕见祖细胞及其在体内投递时朝向经历细胞死亡的趋势中特别重大的困难。

发明概述

本发明至少部分涉及如下发现，TNF家族成员TWEAK能够扩增人和啮齿动物胰细胞群和诱导胰中出现内分泌谱系定向祖细胞。因而，本发明提供在体内和在体外使用TWEAK受体(TWEAK-R)的激动剂再生胰组织和扩增胰细胞群的方法。这些方法可用于治疗需要增强胰祖细胞来进行细胞替补疗法的疾病或状况，包括例如糖尿病和导致整个或部分胰丧失的状况。

本发明的各方面涵盖TWEAK-R激动剂用于在患者中诱导胰组织再生的用途。在例示性实施方案中，所述胰组织是胰岛组织。在一些实施方案中，所述胰岛组织包含岛β细胞。

在例示性实施方案中，所述患者已丧失胰组织。在一些实施方案中，所述患者具有糖尿病，而且所述方法包括对所述患者使用有效诱导分泌胰岛素的胰组织再生的的量的TWEAK-R激动剂。所述糖尿病可以是1型糖尿病或2型糖尿病。

在一些实施方案中，所述患者已经历胰组织切除。在例示性实施方案中，所述患者已经历癌性胰组织切除。

在一些实施方案中，所述患者已接受胰中的细胞或组织移植物，其中所述移植物包含能够分化成胰细胞的祖细胞。在例示性实施方案中，所述移植物包含胰祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞。所述胰祖细胞可以是CK、Ki 67、Pdx1和/或Ngn3阳性细胞。所述胰祖细胞可以是胰管上皮细胞或管附近细胞。在例示性实施方案中，所述移植物基本上由胰管上皮细胞组成。

在一些实施方案中，所述胰祖细胞是能够分化成胰细胞的胚胎干细胞、成体干细胞、全能干细胞或多能干细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在施用TWEAK-R激动剂之前施用所述移植物。在一些实施方案中，同时施用所述移植物和所述TWEAK-R激动剂。

本发明的各方面涵盖用于在患者中治疗糖尿病的方法，包括对具有糖尿病的患者施用i)包含能够分化成胰细胞的祖细胞的细胞或组织移植物，和ii)足以诱导胰组织再生的治疗有效量的TWEAK-R激动剂。

本发明的各方面进一步涵盖在已经历部分胰脏切除术的患者中再生胰组织的方法，包括对所述患者施用在所述患者中有效诱导胰祖细胞再生的量的TWEAK-R激动剂，其中所述祖细胞驻留在所述患者中或移植入所述患者中。

在某些实施方案中，本发明的方法包括对所述患者共施用TWEAK-R激动剂和抗炎剂或其它免疫调控剂，例如用于在具有1型糖尿病的患者中抑制根本的自身免疫性应答。例示性免疫调控剂包括但不限于抗CD3单克隆抗体和Rituxan。可以在施用所述TWEAK-R激动剂的同时或之后施用所述免疫调控剂。

在一些实施方案中，在胰或胰区中或附近施用所述TWEAK-R激动剂。在例示性实施方案中，所述患者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述患者是人。

本发明的各方面涵盖用于扩增胰细胞群的方法，包括使包含至少一个胰祖细胞或至少一个能够去分化成胰祖细胞的细胞的胰细胞群与TWEAK-R激动剂接触以获得胰细胞扩增群。在例示性实施方案中，所述胰细胞群基本上由胰祖细胞组成。在一些实施方案中，所述胰祖细胞是胰管上皮细胞和/或管附近细胞。在一些实施方案中，所述胰祖细胞是CK、Ki 67、Pdx1、和/或Ngn3阳性细胞。在一些实施方案中，所述胰细胞群基本上只由胰管上皮细胞组成。在一些实施方案中，所述胰细胞扩增群包含胰岛素阳性细胞扩增群。在一些实施方案中，所述胰细胞扩增群包含Ki-67、Pdx1、和/或Ngn3阳性细胞扩增群。

在例示性实施方案中，所述胰细胞是在体外扩增的。在一些实施方案中，所述胰细胞群是自患者获得的。在一些实施方案中，在体外将TWEAK-R激动剂施用于自患者获得的胰细胞。在例示性实施方案中，所述胰细胞群是自基本上胰管上皮细胞的群获得的。在其它实施方案中，所述胰细胞群是自分化成胰细胞的非胰细胞群获得的。在一些实施方案中，本质上非胰细胞的群包含全能干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、和成体干细胞中一种或多种。

本发明的各方面进一步涵盖治疗糖尿病的方法，包括如下步骤：a)在体外培养祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞，其中所述祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞是自具有糖尿病的患者分离的胰祖细胞、全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、和/或胚胎干细胞；b)用有效量的TWEAK-R激动剂诱导所述培养的祖细胞增殖以生成所述祖细胞的扩增群；并c)将所述祖细胞扩增群移植入所述具有糖尿病的患者的胰中；其中在所述患者中自所述移植的祖细胞再生生成胰岛素的胰细胞。在一些实施方案中，所述具有糖尿病的患者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述具有糖尿病的患者是人。

在本发明的例示性实施方案中，所述TWEAK-R激动剂选自下组：TWEAK，TWEAK类似物，TWEAK模拟物，和激动性TWEAK-R抗体。

在一些实施方案中，所述TWEAK-R激动剂是TWEAK。在一些实施方案中，TWEAK是具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的多肽。在例示性实施方案中，TWEAK是氨基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸249处的多肽。在一些实施方案中，TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸46至249。在别的实施方案中，TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸104至249。在还有别的实施方案中，TWEAK是氨基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸249处的多肽。

在例示性实施方案中，所述TWEAK-R激动剂是TWEAK类似物。在一些实施方案中，所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少80％相同的多肽。在一些实施方案中，所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽。

在例示性实施方案中，所述TWEAK类似物是TWEAK融合蛋白。在一些实施方案中，所述TWEAK融合蛋白包含SEQ ID NO：1的多肽和免疫球蛋白的Fc部分。

在别的例示性实施方案中，所述TWEAK-R激动剂是激动性TWEAK-R抗体。在一些实施方案中，所述激动性抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述激动性抗体是嵌合抗体。

附图简述

图1描绘来自自腺病毒载体过表达TWEAK(右边小图)或对照蛋白(左边小图)的小鼠的胰组织切片。苏木精和曙红(H&E)染色的切片显示于顶部小图，而对增殖标志物Ki-67染色的切片显示于底部小图。

图2在左边小图中显示胰腺癌中TWEAK-R表达的高频率，如通过人胰肿瘤组织微阵列的免疫组织化学染色测量的。中间和右边小图显示胰肿瘤组织样品中的TWEAK-R染色。

图3描绘代表性小鼠胰H&E染色的切片，显示胰组织的结构，横截面中可见管、岛、血管、和腺泡(标记的)。

图4显示用对照蛋白P1.17或TWEAK处理后来自小鼠的代表性胰组织切片。图4A和4B显示用P1.17(图4A)或TWEAK(图4B)处理后3天来自小鼠的Ki-67染色切片。图4C和4D显示用对照蛋白(图4C)或TWEAK(图4D)处理4天后对管上皮标志物CK和Ki-67免疫共染色的切片。

图5显示用对照蛋白P1.17(左边)、急性处理方案下的Fc-TWEAK(中间)、或慢性处理方案下的Fc-TWEAK(右边)处理4天后来自小鼠的代表性胰切片，对增殖标志物Ki 67免疫染色。所有显示的结果代表每个处理组4只小鼠。

图6显示在慢性处理方案下施用P1.17或Fc-TWEAK的小鼠的胰切片中Ki67阳性的管上皮细胞的百分比的曲线图。

图7显示在急性处理方案下施用P1.17或Fc-TWEAK的小鼠的胰切片中Ki-67阳性的管上皮细胞的百分比。

图8描绘慢性Fc-TWEAK处理下的小鼠的胰切片中管附近区中Ki-67阳性的细胞的百分比。

图9显示急性Fc-TWEAK处理下的小鼠的胰切片中管附近区中Ki-67阳性的细胞的百分比。

图10显示来自对照蛋白处理小鼠(图10A和10C)和TWEAK处理小鼠(图10B和10D)的胰连续切片，对CD3和F4/80染色。

图11显示来自持续3或10天每周两次用对照蛋白P1.17或TWEAK处理的TWEAK-R KO和野生型小鼠的胰切片中计数的Ki-67阳性管细胞(图11A)或管附近细胞(图11B)的数目。图11D显示来自用TWEAK处理3天的小鼠的胰切片中的TWEAK-R免疫荧光染色(同种型对照显示于图11C)。

图12描绘代表性图片，显示导入20ng/ml或50ng/ml Fc-TWEAK后24小时和96小时与用对照蛋白P1.17处理的细胞相比增多的人管细胞数目。

图13描绘小鼠胚胎发育期间Ngn3和Pdx1的动态表达。

图14显示4天慢性Fc-TWEAK处理后来自小鼠的Ngn3染色的胰组织。管附近细胞中对Ngn3的染色在圆圈中突显。

图15显示4天急性Fc-TWEAK处理后来自小鼠的胰组织，对Ngn3、管上皮标志物CK、和DAPI染色。

图16显示4天对照Ig处理(注射P1.17)或在急性或慢性剂量给药方案下用Fc-TWEAK处理后取自小鼠的胰组织中Ngn3阳性细胞的频率。通过单一切片上Ngn3阳性细胞数目除以总细胞数目来计算Ngn3阳性细胞的频率，如通过Aperio软件确定的。

图17显示4天急性Fc-TWEAK处理(右边小图，箭)或对照蛋白P1.17处理(左边小图)后胰管上皮细胞中对Pdx1的染色。

图18显示部分胰脏切除术后对TWEAK-R(Fn14；图18A和18C)或CK、胰岛素(INS)、和DNA(DAPI)(图18B和18D)染色的胰的连续切片。显示来自假手术的小鼠(图18E和18F)和来自部分胰脏切除术后4天的小鼠(图18G和18H)的胰的连续切片，对T细胞标志物CD3(图18E和18G)和巨噬细胞标志物F4/80(图18F和18H)染色。

图19显示来自用TWEAK处理18天的小鼠的胰切片中的再生灶。

图20显示部分胰脏切除术后4天野生型小鼠(白色柱)和TWEAK-R KO小鼠(黑色柱)中处于早期(“幼期”)、中期、和成熟期的再生灶的百分比。

图21显示部分胰脏切除术后4天来自野生型(A)和TWEAK-R KO(B)小鼠的对CK和Ki-67共染色的胰切片。

发明详述

本发明提供在体外或在体内使用治疗有效量的TWEAK受体(TWEAK-R)的激动剂再生胰组织和扩增胰细胞群的方法。这些方法可用于治疗需要增强胰祖细胞来进行细胞替补疗法的疾病或状况，包括例如糖尿病和导致整个或部分胰丧失的状况。

本发明至少部分涉及如下发现，TNF家族成员TWEAK能够扩增人和啮齿动物胰细胞群和诱导胰中出现内分泌谱系定向祖细胞。因此，TWEAK涉及如下一项或多项：i)去分化胰细胞(例如胰管上皮细胞)成能够分化成定向胰细胞谱系细胞的细胞；ii)刺激细胞增殖；和iii)增强细胞辅助、细胞聚集和/或细胞存活。

术语“胰细胞”指胰岛、腺泡、管细胞、或作为发育中的或成熟的胰中组织的成分的任何其它细胞。胰岛细胞包括α、β、δ、PP、和ε细胞。

TWEAK的生理作用

配体和受体的肿瘤坏死因子(TNF)超家族是细胞命运决策(包括存活、增殖、和分化)的重要调节物(Ware et al.，Cytokine Growth Factor Rev.14：181-4(2003))。它们在多种系统(包括骨、皮肤附属物诸如毛发和牙齿、和淋巴样组织)的器官发生和稳态中发挥关键作用。它们还例如在宿主防御、炎症应答、和适应性免疫的积极和消极调节中发挥复杂的免疫调节作用。

TWEAK(TNF样凋亡弱诱导物)，TNF配体超家族的一个成员，是一种II型跨膜蛋白，它能被切割来作为可溶性细胞因子发挥作用且由炎症细胞高度表达(Chicheportiche et al.，J.Biol.Chem.272：32401-10(1997))。TWEAK受体，TWEAK-R(也称作Fn14)，是一种由非淋巴样细胞类型表达的TNF受体超家族成员。TWEAK首先被记载为凋亡的弱诱导物(Chicheportiche et al.，J.Biol.Chem.272：32401-10(1997))，而已发现经由其关联受体TWEAK-R来触发多种细胞应答，范围从增殖到细胞死亡。TWEAK-R表达是高度可诱导的(Meighan-Mantha et al.，J.Biol.Chem.274：33166-76(1999)；Feng et al.，Am.J.Pathol.156：1253-61(2000))。一项对小鼠和人二者中正常对受损和患病组织中TWEAK和TWEAK-R表达的综合调查最近证明了在这两种物种中，TWEAK和特别是TWEAK-R的表达在正常组织中相对较低，但是在组织损伤和疾病的设置中经历显著上调。研究还显示了TWEAK-R由多种组织驻留祖细胞表达(Girgenrath et al.，EMBO J. 25：5826-39(2006))；Jakubowski et al.，J.Clin.Invest，115：2330-40(2005)；Perper et al.，J. Immunol.177：2610-20(2006))。

急性损伤后，炎性细胞因子诱导清除细胞流入以清除正在死亡的细胞和组织碎片，并经由受控细胞增殖、迁移和胞外基质周转来促进伤口闭合和愈合。最近，已提出炎症细胞还经它们对组织祖细胞的影响来调节组织再生的概念(Duffield et al.，Clin.Sci.(Lond) 104：27-38(2003))。然而，在慢性病的设置中，这些多面活性常常是失调的和致病的。现在清楚TWEAK是一种多功能细胞因子，在这点上与它的同胞TNF相似。TWEAK生理性地在急性损伤后和病理性地在慢性炎性疾病设置中发挥功能。与TNF不同，TWEAK在发育或稳态中不发挥明显作用。

最近出现了新的证据，TWEAK能有力调节表达TWEAK-R的某些祖细胞类型的细胞命运决策。它表现为作为对肝祖细胞选择性的生长因子起作用(Jakubowski et al.，J. Clin.Invest.115：2330-40(2005))。TWEAK能在间充质谱系的祖细胞中上调促凋亡基因和细胞周期相关基因(Girgenrath et al.，EMBOJ. 25：5826-39(2006))，而且它抑制肌管形成和在分化条件下培养的成肌细胞中肌肉特异性转录因子的表达(Girgenrath et al.，EMBO J. 25：5826-39(2006)；Dogra et al.，J. Biol.Chem.281：10327-36(2006))。已在体外在其它细胞系统中总结了TWEAK所致分化阻断，包括3T3L1脂肪形成(Burkly et al，Cytokine40：1-16(2007)；Tiller et al，Endocrinology 150：5373-5383(2009)；Alexaki et al，J.Immunol 183：5948-5956(2009))、来自人间充质干细胞的软骨细胞分化、来自人原代成骨细胞前体细胞的成骨细胞生成(Perper et al.，J. Immunol.177：2610-20(2006)；Vincent et al，J.Bone Min Res 24：1434-1449(2009))、和小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞终末分化(Ando et al.，Arthritis Res.Ther.8：R146(2006))。然而，其它研究已指示在一些细胞中，TWEAK可具有相反的效果。例如，已显示TWEAK诱导而非抑制来自人单核细胞细胞系THP-1的破骨细胞分化(Polek et al.，J. Biol.Chem.278：32317-23(2003))。还已显示TWEAK通过上调成骨细胞上的RANKL来间接促进破骨细胞生成(Ando et al.，ArthritisRes.Ther.8：R146(2006))。对于神经元祖细胞，已显示TWEAK根据发育阶段具有不同效果：TWEAK在胚胎阶段祖细胞中促进神经突向外长出，不影响它们的增殖，但是它降低出生后祖细胞增殖，对神经突向外长出没有影响(Hamill et al.，J. Neurosci.Res.(2007))。对于红细胞样前体细胞，TWEAK表现出抑制生长以及分化(Felli et al.，J. Immunol.175：1464-72(2005))。如此，TWEAK诱导祖细胞增殖和抑制分化的能力在不同组织和发育阶段中可有所不同。

胰细胞的扩增

在一些实施方案中，本发明的方法包括使包含一个或多个胰细胞的第一细胞群与TWEAK-R激动剂接触，以由此获得第二细胞群。第二细胞群可包含比第一细胞群中的数目更高数目的胰细胞，例如多至少约50％、多2倍、多5倍、多10倍、多25倍、多50倍、多100倍、或多超过100倍。第二细胞群可包含更高数目的胰祖细胞，例如具有分化成定向胰细胞类型的细胞的能力的细胞。第二群还可包含更高数目的分化的胰细胞，例如岛、腺泡或管细胞。例如，第二细胞群包含相对于第一细胞群更高数目的β细胞，例如分泌胰岛素的细胞。第一细胞群可以在体外或在体内。第一细胞群可以在体外用TWEAK-R激动剂处理或接触，然后施用于患者。第一细胞群可以自患者获得。在一个实施方案中，第一细胞群自患者获得，在体外或离体与TWEAK-R激动剂接触，然后施用于与获得第一细胞群的患者相同或不同的患者。

第一细胞群可以由一个或多个细胞组成。例如，第一细胞群可以由至少约10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或10⁸个细胞组成。第一细胞群可包含约1至约10²个细胞；约10至约10³个细胞；约10²至10⁴个细胞；约10³至10⁵个细胞；约10⁴至10⁶个细胞；约10⁵至10⁷个细胞或约10⁶至10⁸个细胞。第一细胞群可以基本上由一类细胞或数类细胞组成。第一细胞群可富集了胰细胞，例如胰管上皮细胞。在某些实施方案中，第一细胞群中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是胰细胞，例如胰管上皮细胞。在某些实施方案中，第一细胞群不包含或基本上没有如下细胞，如果在第一细胞群中存在的话，其会在第二细胞群中占优势的细胞。“基本上没有”某种细胞的细胞群指包含少于约0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的那些不想要的细胞的细胞群。例如，在一个实施方案中，第一细胞群基本上没有间充质细胞和/或结缔组织细胞。

可以将第一细胞群与TWEAK-R激动剂一起温育，时间足以扩增期望数目和类型的胰细胞。例如，可将第一细胞群与TWEAK-R激动剂一起温育约5、10、18、24、30、36、42、或48小时。

在某些实施方案中，第一细胞群在体外用TWEAK-R激动剂处理并施用于患者。也可将第一细胞群施用于患者并用TWEAK-R激动剂处理患者。在某些实施方案中，在体外用TWEAK-R激动剂处理第一细胞群，将该群施用于患者，并用TWEAK-R激动剂处理该患者。当将TWEAK-R激动剂施用于患者时，它以足以再生或扩增期望胰细胞群的量和时间施用。

在例示性实施方案中，方法包括对患者施用治疗有效量的TWEAK受体激动剂以诱导所述患者的胰中胰祖细胞的增殖或出现。术语“胰祖细胞”指具有分化成定向胰细胞类型(或谱系)的细胞的能力的细胞。在别的实施方案中，方法包括通过用有效增强胰祖细胞的存活、表面粘附和/或增殖的量的TWEAK-R激动剂处理分离的胰细胞的培养物而在体外诱导胰祖细胞扩增。

在一些实施方案中，离体使用TWEAK-R激动剂来扩增胰祖细胞以诱导培养物中的细胞增殖。可将培养物中扩增的胰祖细胞移植入有所需要的患者中。要在体外扩增的胰祖细胞可以是自通过手术自个体获得的胰组织分离的胰祖细胞(稍后要将移植入个体中)。要在体外扩增的其它细胞可以是自尸体胰组织衍生的胰祖细胞、成体干细胞、胚胎干细胞(ESC)、上胚层干细胞(EpiSC)、全能干细胞、和/或诱导的多能干细胞(iPSC；已重编成多能状态的体细胞)。例示性iPSC是已转导基因Oct-4、Sox-2、c-Myc、和Klf的成年起源的干细胞，如Takahashi and Yamanaka(Cell126(4)：663-76(2006)记载的。其它例示性iPSC是已转导OCT4、SOX2、NANOG、和LIN28的成体干细胞(Yu，et al.，Science 318：1917-1920(2007))。要在培养物中扩增的胰细胞群可包括CK、Ki-67、Pdx1、和/或Ngn3阳性细胞。可在依照本发明的方法在体外使用TWEAK-R激动剂扩增之后将自通过手术自个体获得的组织分离的祖细胞移植回入相同个体中。在一些实施方案中，胰细胞的扩增涉及细胞的增殖。细胞群的“扩增”也可包括别的事件，例如促进细胞群或其亚群的附着、聚集和/或存活。术语“扩增”指在培养物中扩增细胞群，包括例如将细胞群扩增至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍。例如，在一个实施方案中，自用TWEAK-R激动剂处理的细胞群回收相对于未用TWEAK-R激动剂处理的相似或等同细胞群(例如相同比例的细胞类型)更多的胰细胞。

要在体外扩增的胰细胞可以自手术获得的胰组织样品或捐献的组织组织分离并培养，如Yatoh et al.(Diabetes 56：1802-9(2007)记载的，使用例如Linetsky et al.(Diabetes 46：1120-23(1997)的标准化方法或类似方法。如Yatohet al.记载的，在岛分离和纯化之后，可通过酶促分散分离的细胞来进一步纯化细胞，诸如通过暴露于胰蛋白酶和任选过滤，诸如用40-μm细胞过滤器，接着是使用微珠、免疫磁珠、或其它类似免疫亲和大量分选工具的免疫亲和分选。可以在免疫亲和分选中使用识别胰特异性细胞标志物的抗体，诸如针对CA19-9(一种遍及胰管树可见的细胞表面标志物)(Lefebvre et al.，Diabetes47：134-137(1998)；Bouwens et al.，Diabetologia 41：629-633(1998)；Gmyr et al.，Biochem Biophys Res.Com.320：27-33(2004))或Prominin I(CD133；Hori et al.，Stem Cells 26(11)：2912-20(2008))的抗体。可以以例如10⁶个细胞每个25cm²烧瓶表面积或其它适宜细胞密度在CMRL培养基(例如Invitrogen Gibco^TMCMRL培养基-1066)中在非组织培养处理的细胞培养烧瓶中培养粗制的或纯化的细胞。将TWEAK-R激动剂添加至培养细胞的生长培养基。TWEAK-R激动剂可以以相对于不提供TWEAK-R激动剂的细胞增强胰细胞的存活、粘附和/或增殖的浓度存在。例示性TWEAK-R激动剂浓度可以在例如1至100pg/ml或更少、100至1000pg/ml、1至100ng/ml、或100至1000ng/ml或更多的范围中。在一些实施方案中，TWEAK-R激动剂浓度可以介于1和100ng/ml之间，包括例如1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、和100ng/ml。

糖尿病和其它医疗用途

在一些实施方案中，方法对于治疗糖尿病是有用的。在例示性实施方案中，可以用一定量的TWEAK-R激动剂处理患者，其足以通过增多所述患者中的胰祖细胞数目来诱导分泌胰岛素的胰细胞再生(即治疗有效量)。在一些实施方案中，所述患者诊断有糖尿病或相关状况，然后施用TWEAK-R激动剂。糖尿病相关状况包括但不限于综合征x(代谢综合征)、胰岛素耐受性、肾病、酮酸中毒、高渗性高血糖非酮性综合征、胃轻瘫、糖尿病性肾病、和其它糖尿病相关状况。在一些实施方案中，治疗糖尿病的方法包括对已接受能够产生分泌胰岛素的胰细胞的祖细胞的移植物的具有糖尿病的患者施用一定量的TWEAK-R激动剂，其有效诱导自移植的祖细胞再生分泌胰岛素的胰细胞。在一些实施方案中，所述患者已接受尸体或通过手术获得的含有胰祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞的细胞的移植，其中随后施用TWEAK-R激动剂在移植的岛组织中诱导胰祖细胞再生。在别的实施方案中，所述患者已接受胰中的干细胞移植物，其中随后施用TWEAK-R激动剂诱导移植的干细胞再生。在一些实施方案中，同时施用所述胰干细胞移植物和所述TWEAK-R激动剂。在这些和别的实施方案中，可以移植多种胰祖细胞潜在来源，如上文详述的，接着施用TWEAK-R激动剂以促进胰组织再生。

本发明的一个实施方案包括治疗糖尿病的方法，包括a)在体外培养祖细胞，其中所述祖细胞是自具有糖尿病的患者或活的或尸体捐献者分离的胰祖细胞、来自所述患者的成体干细胞、胚胎干细胞、或诱导的多能干细胞，b)用有效量的TWEAK-R激动剂处理以生成祖细胞的扩增群；和c)将所述祖细胞扩增群移植入所述具有糖尿病的患者的胰中，其中在所述患者中自移植的祖细胞再生生成胰岛素的胰细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在移植之后施用有效量的TWEAK-R激动剂以促进移植的细胞及其衍生细胞的体内存活、扩增、和/或迁移。

在一些实施方案中，在具有1型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病；IDDM；T1D；青少年糖尿病)，已丧失功能性β细胞(靶向这些细胞的病理性自身免疫性应答所致)的患者中施用TWEAK-R激动剂来诱导胰祖细胞的增殖和/或出现。在其它实施方案中，在具有2型糖尿病的患者中施用TWEAK-R激动剂来诱导胰祖细胞的增殖和/或出现。2型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病；NIDDM；T2D；成年发作糖尿病)是一种复杂的代谢病，其涉及降低的对胰岛素的敏感性，且可以与胰中功能性β细胞量减少有关。在一些实施方案中，对2型糖尿病施用TWEAK-R激动剂与改善胰岛素敏感性的疗法组合。在一些实施方案中，所述患者具有青春晚期糖尿病(MODY)。

在一些实施方案中，为诱导胰祖细胞增殖而施用TWEAK-R激动剂的患者具有炎性状况。例示性炎性状况包括但不限于类风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病、血管炎、移植物排斥、再灌注损伤、盆腔炎性疾病、肾小球肾炎、慢性前列腺炎、慢性阻塞性肺病、银屑病、动脉粥样硬化、和骨关节炎。因而，在一些实施方案中，所述TWEAK-R激动剂可以与抗炎剂一起共施用。抗炎剂可包括免疫抑制剂、TNF抑制剂、皮质类固醇、非类固醇抗炎药物(NSAID)、缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)、等等。例示性抗炎剂包括例如泼尼松、甲泼尼龙曲安西龙、甲氨蝶

羟氯喹

柳氮磺吡啶来氟米特

依那西普

英夫利西单抗

阿达木单抗

利妥昔单抗

阿巴西普

白介素-1、阿那白滞素(Kineret^TM)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、萘普生(naproxen)、阿司匹林(aspirin)、对乙酰氨基酚(acetominophen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、氯诺昔康(lornoxicam)、酮咯酸(ketorolac)、依托度酸(etodolac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、甲氯芬那酸(meclofenamicacid)、氟芬那酸(flufenamic acid)、托芬那酸(tolfenamic acid)、双氯芬酸(diclofenac)、奥沙普秦(oxaprozin)、阿扎丙宗(apazone)、尼美舒利(nimesulide)、萘丁美酮(nabumetone)、替尼达普(tenidap)、依那西普(etanercept)、托美丁(tolmetin)、保泰松(phenylbutazone)、羟布宗(oxyphenbutazone)、二氟尼柳(diflunisal)、双水杨酯(salsalate)、奥沙拉秦(olsalazine)或柳氮磺吡啶(sulfasalazine)等等。

在一些实施方案中，要施用TWEAK-R激动剂的患者没有炎性状况。

在一些实施方案中，可使用有效量的TWEAK-R激动剂在因生病、外伤性损伤、或化学处理具有受损的胰组织而需要胰细胞再生的患者中诱导胰组织再生。在一些实施方案中，所述患者已因生病或外伤性损伤而经历胰脏切除术。在一些实施方案中，所述生病是胰癌。胰癌包括腺癌、浆液性囊腺瘤、腺泡细胞癌、和胰神经内分泌肿瘤诸如胰岛素瘤。在一些实施方案中，所述患者是具有慢性胰腺炎的患者，其因与慢性胰腺炎有关的胰慢性炎症已经历胰脏切除术或已丧失功能性胰组织。在一些实施方案中，所述患者因胰遗传性病症、长期和大量酒精消耗、囊性纤维化病、高钙血症(血液中的钙水平高)、高脂血症、高甘油三酸酯血症(血脂水平高)、对某些药物的反应、自身免疫性状况、或未知原因而具有慢性胰腺炎。囊性纤维化病是最常见的遗传性胰病，最终导致胰变得严重瘢痕和缩小。因而，一个实施方案包括治疗与囊性纤维化病有关的胰病症。在一些实施方案中，在已经历胰脏切除术的患者中，包括但不限于具有胰癌的患者，施用TWEAK-R激动剂来诱导胰细胞再生，其中自移植的胰祖细胞或干细胞再生胰细胞。需要胰再生的患者还包括已丧失胰的一种或多种细胞或一种或多种功能的患者，包括例如具有前驱糖尿病状况、胰岛素耐受性、葡萄糖耐受受损、等等的患者。

患者中生成胰岛素的胰细胞的再生可通过检测跨膜蛋白27(Tmem27)、C肽血清水平升高、糖基化血红蛋白(Hb_A1c)降低、等等，或通过检测维持正常血液葡萄糖水平需要的胰岛素降低来测量。C肽是一种在β细胞分泌胰岛素之前蛋白水解切割胰岛素原以形成胰岛素时释放的肽。Tmem27，也称作collectrin，是一种细胞表面糖基化蛋白，自β细胞的质膜切割和脱落。这种切割过程是β细胞特异性的且看来在其它细胞类型中不发生(Akpinar，et al.，CellMetab.2(6)：385-97(2005))。Hb_A1c是一种糖基化形式的血红蛋白，主要用于鉴定较长一段时间里的平均血浆葡萄糖浓度。它以非酶促途径通过血红蛋白正常暴露于高血浆水平的葡萄糖而形成。

在一些实施方案中，在胰或胰区中或附近施用所述TWEAK-R激动剂。术语“胰区”指对于那些已丧失他们的一些或大部分胰的患者，胰在不丧失的情况中会驻留的区域。在一些实施方案中，在肝中和/或附近施用所述TWEAK-R激动剂。

在例示性实施方案中，所述胰祖细胞是管上皮细胞。在别的实施方案中，所述祖细胞是在管附近区中的细胞。

在一些实施方案中，为了激活内源的或移植的祖细胞而施用TWEAK-R激动剂的患者是哺乳动物。在例示性实施方案中，所述患者是人。在备选实施方案中，所述患者是啮齿动物，诸如例如小鼠或大鼠。

TWEAK-R激动剂

术语“TWEAK受体(TWEAK-R)激动剂”和“TWEAK-R激活剂”指任何能提升TWEAK受体(Fn14)信号传导，或能影响细胞内任何解读受体信号的药剂。TWEAK受体蛋白，Fn14，表征于国际申请No.PCT/US2001/028451，通过述及将其完整收入本文。这种I型跨膜蛋白的人和小鼠氨基酸序列在本文中分别作为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4提供。例示性TWEAK-R激动剂包括TWEAK、TWEAK融合蛋白诸如Fc-TWEAK、TWEAK类似物、和可溶性抗TWEAK-R激动性抗体。术语“TWEAK-R信号传导”指所有与TWEAK-R途径有关的分子反应及其所致后续分子反应。

作为TWEAK-R激动剂的TWEAK

在例示性实施方案中，TWEAK-R激动剂是TWEAK。在一些实施方案中，TWEAK是人TWEAK(SEQ ID NO：1)。在备选实施方案中，TWEAK是小鼠TWEAK(SEQ ID NO：2)。

在一些实施方案中，TWEAK是膜结合的，而且可以在包含脂质体的药物组合物或其它细胞或假细胞投递系统中投递。在一些实施方案中，TWEAK多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的一部分，其中所述多肽是可溶性TWEAK。TNF配体家族中的蛋白质特征在于通常是短亲水性氨基酸的短N端区段，常常含有数个赖氨酸或精氨酸残基，认为它们充当终止转移序列。这个N端区后面是跨膜区段，然后是将C端受体结合域与膜分开的可变长度的胞外区。此区有时称作“柄”。虽然TWEAK在内质网中作为II型跨膜蛋白合成，但是TWEAK也在它横穿跨高尔基网络时弗林蛋白酶家族的成员对其柄区内的蛋白水解切割后作为可溶性细胞因子分泌(Chicheportiche，et al.，J.Biol.Chem.272：32401-10(1997))。

可溶性TWEAK多肽可包括整个或部分柄序列，只要该多肽是自生成它的细胞分泌的。如此，为了创建可溶性分泌形式的TWEAK，会在DNA水平消除N端跨膜区和柄区的一些部分，而且任选用含有适合在所选表达系统中使用的蛋白水解切割位点诸如Tev蛋白酶切割位点的前导序列替换它们。技术人员能改变在分泌表达构建物中保留的柄区的量以优化受体结合特性和分泌效率二者。例如，可制备含有整个可能柄长度的构建物，即N端截短，使得会产生始于包括和介于人TWEAK(SEQ ID NO：1)氨基酸46和104之间的位置的多肽。在一些实施方案中，可溶性TWEAK多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸46至249或由SEQ ID NO：1的氨基酸46至249组成。在其它实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸104至249或由SEQ ID NO：1的氨基酸104至249组成。在其它例示性实施方案中，可溶性TWEAK多肽氨基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸46至104任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：1的位置249处。在别的实施方案中，TWEAK是可溶性小鼠TWEAK多肽，其氨基末端在包括和介于SEQ ID NO：2的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：2的位置249处。可溶形式的TWEAK能有效发信号且因此可作为药物施用，其模拟天然分泌形式和膜锚定形式的胞外域。在本发明中有用的TWEAK多肽及其可溶性型式记载于美国专利No.7,109,298，通过述及将其完整收入本文。

可以将编码期望可溶性多肽的DNA序列亚克隆入表达载体中，用于多肽生产，或者可以化学合成期望编码DNA片段。自重组宿主细胞纯化多肽得到如下事实推动，即多肽是分泌的，而且可溶性蛋白质一般适合于依照本发明的一些实施方案胃肠外施用。分泌的可溶性多肽可通过将表达期望多肽的完整细胞与培养液分开，例如通过离心，并对培养液(上清液)测定期望多肽的存在来鉴定(和与其非可溶性膜结合的对应物区分)。

TWEAK类似物

术语“TWEAK类似物”指自天然TWEAK多肽衍生但它的氨基酸序列有不同的多肽。它们的氨基酸序列有变化的TWEAK多肽可以是突变形式的TWEAK、TWEAK融合蛋白、和TWEAK片段。TWEAK类似物拥有TWEAK-R激动剂活性。

在一些实施方案中，TWEAK类似物是突变形式的TWEAK，其与野生型序列相比含有1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35、或35至40个不同氨基酸。这种类型的TWEAK类似物会具有与天然TWEAK，诸如例如SEQ ID NO：1的多肽、SEQ ID NO：1的氨基酸46至249和SEQ IDNO：1的氨基酸104至249至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％相同的氨基酸序列。在具体实施方案中，TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2至少80％相同的多肽。在其它具体实施方案中，TWEAK类似物是与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2至少85％相同的多肽。在其它实施方案中，TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少90％或至少95％相同或与SEQ ID NO：2至少90％或至少95％相同的多肽。

一般地，可对天然TWEAK多肽中存在的一个或多个氨基酸进行保守替代，对多肽的活性没有不利影响。保守替代的例子包括在物种之间(诸如在人和小鼠TWEAK之间)保守的TWEAK区域以外的氨基酸的替代，和不改变TWEAK二级和/或三级结构的氨基酸的替代。具体例子包括一种脂肪族残基替代另一种，诸如Ile、Val、Leu、或Ala替代另一种，或一种极性残基替代另一种，诸如Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之间的，或一种芳香族残基替代另一种，诸如Phe、Trp、或Tyr替代另一种。其它保守替代，诸如替代整个具有相似疏水性特征的区域，是本领域已知的且涵盖在本发明的方法中。生成突变形式的TWEAK的方法是分子生物学领域公知的，而且包括通过随机诱变、定点诱变、删除、和截短来改变DNA分子。具体技术包括聚合酶链式反应(PCR)诱变、饱和(即化学或放射)诱变、化学DNA合成、丙氨酸扫描诱变、寡核苷酸介导的诱变(在体外杂交至DNA模板，接着酶促延长)、盒式(重组)诱变)、和组合诱变(将随机简并序列引入TWEAK DNA中)。

在某些例示性实施方案中，TWEAK类似物是TWEAK融合蛋白。术语“融合蛋白”指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序列的嵌合蛋白。在一些实施方案中，TWEAK融合蛋白在TWEAK之外还包括一个或多个多肽部分，其增强体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白质复合物形成、和/或纯化中一种或多种。融合蛋白可以使用本领域公知的分子克隆技术来重组生成。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有上文所述TWEAK多肽，包括包含SEQ ID NO：1的序列或由SEQ ID NO：1的序列组成的多肽、具有SEQ ID NO：2的序列的多肽、或其本文所述可溶性形式。在某些实施方案中，TWEAK融合蛋白可含有上文所述突变形式的TWEAK。在其它例示性实施方案中，TWEAK融合蛋白包括纯化亚序列，诸如表位标签、FLAG标签、多组氨酸序列、或GST多肽。

在某些例示性实施方案中，TWEAK-R激动剂是包括免疫球蛋白诸如例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、IgM的Fc域的TWEAK融合蛋白(“Fc-TWEAK”)。如本文中使用的，免疫球蛋白的Fc部分具有免疫学领域给予该术语的通常含义。具体地，此术语指不含有来自抗体的两个抗原结合区(Fab片段)的抗体片段。Fc部分由来自两条重链的抗体恒定区(它们经由非共价相互作用和二硫键而联合)组成。Fc部分可包括抗体的铰链区且延长穿过CH2和CH3域至C端。Fc部分可进一步包括一个或多个糖基化位点。在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc部分含有突变，其设计来消除不想要的效应器功能和/或降低在重复和延长施用后诱导免疫应答的风险，如美国专利No.7,452,966中记载的。融合蛋白可包含例如谷胱甘肽-S转移酶(GST)、绿色荧光蛋白(GFP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、6xHis标签、Flag标签、等等，和/或可缀合至聚乙二醇(例如PEG化)，例如用于对融合蛋白降低免疫原性和/或提高循环半衰期。

TWEAK模拟物

在一些实施方案中，TWEAK-R激动剂是TWEAK模拟物或TWEAK肽模拟物。术语“TWEAK模拟物”或“肽模拟物”指制药业中通常作为具有与模板肽的特性类似的特性的药物使用的类型的非肽类似物(Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and Freidinger，TINS p.392(1985)；Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229(1987)，通过述及而收入本文)。模拟物常常借助计算机化分子建模来开发。在结构上与治疗上有用的肽相似的肽模拟物可用于生成等同的治疗或预防效果。一般地，模拟物在结构上与模范多肽(例如具有期望生物化学特性或药理学活性的多肽)诸如TWEAK片段相似，但是有一个或多个肽连接任选通过本领域公知方法被选自下组的连接替换：--CH₂NH--，--CH₂S--，--CH₂-CH₂--，--CH＝CH--(顺式和反式)，--COCH₂--，--CH(OH)CH₂--，和--CH₂SO--。用相同类型的D-氨基酸系统替代共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸替换L-赖氨酸)也可用于生成更稳定的肽。另外，包含共有序列或实质性相同的共有序列变异的约束肽可通过本领域已知方法来生成(Rizo and Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，通过述及而收入本文)，例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基。TWEAK类似物可以在序列方面与天然存在TWEAK配体氨基酸序列不同，或者可以以本文所述不涉及序列的方式有所不同，或二者。

激动性抗TWEAK-R抗体

与TNF配体和TNF配体受体家族的其它成员一样，TWEAK和TWEAK-R的结合复合物由对称结合三个TWEAK-R单体的TWEAK同三聚体组成。在组织学上，认为TNF受体家族成员通过配体诱导的受体单体三聚化来活化。然而，最近的证据指示TNF受体可以在细胞表面上作为预装配寡聚物存在，而且配体诱导的信号传导由预形成的受体寡聚物传输(综述见Chan，Cytokine.37(2)：101-7(2007))。虽然针对TNF家族受体的抗体能作为阻断受体-配体相互作用的拮抗剂起作用，但是它们也能作为诱导寡聚化、受体聚簇、和/或以其它方式激活受体信号传导的激动剂起作用(Pukac，et al.，Br.J.Cancer.92：1430-1441(2005)；Desbarats and Newell，Nat.Med.6(8)：920-3(2000))。结合且诱导受体活性的对TWEAK-R特异性的抗体已有记载(参见例如美国专利No.：7,208,151，通过述及而完整收入本文，和国际申请No.PCT/EP2006/004974)。别的例示性抗体记载于美国专利公布号20090324602，通过述及而完整收入本文。诱导受体活性的对TWEAK-R特异性的例示性抗体的重链和轻链序列分别在SEQ ID NO：5和6中提供。

通过结合并加强TWEAK-R寡聚化/聚簇或通过其它方式来活化TWEAK-R的诱导TWEAK-R活性的TWEAK-R抗体明确涵盖在本发明的方法中。在一些实施方案中，所述方法包括使用单一抗TWEAK-R抗体，包括单一抗TWEAK-R单克隆抗体。在其它实施方案中，所述方法包括在溶液中使用多种作为TWEAK-R激动剂起作用的抗TWEAK-R抗体。可使用针对TWEAK-R的不同表位的单克隆抗TWEAK-R抗体。也可使用针对TWEAK-R的不同和非交叠表位的多种抗TWEAK-R单克隆抗体。

术语“抗TWEAK-R单克隆抗体”指任何识别并结合TWEAK-R的单一表位的单克隆抗体。抗TWEAK-R单克隆抗体作为TWEAK-R交联剂的使用依赖于识别一种表位或两种或更多种非交叠表位的单克隆抗体的使用。别的表位(如由新的单克隆抗体所限定的)可通过继续自经免疫接种TWEAK-R或其片段的小鼠的脾细胞生成新的杂交瘤、通过免疫不同物种的动物、和通过使用不同路径的免疫接种来鉴定。

表位也可通过使用表面等离振子共振偶联层析技术评估不同单克隆抗体彼此竞争对TWEAK-R的结合的能力来直接绘图(Pharmacia BIAtechnologyHandbook，″Epitope Mapping″，Section 6.3.2，(May 1994)；还可参加Johne et al.，J.Immunol.Methods，160(2)：191-8(1993))。

作为TWEAK-R激动剂的抗TWEAK-R IgM单克隆抗体

包含超过通常两个IgG抗原结合位点的抗TWEAK-R单克隆抗体也会在溶液中作为多价细胞表面TWEAK-R交联剂发挥功能，而且因而会完全在依照本发明的TWEAK-R激动剂的定义之内。术语“多价配体”指具有超过一个受体结合位点且能够同时结合至少两个受体分子并使至少两个受体分子密切靠近的分子或复合物。例如，可以使用标准重组DNA和杂交瘤技术将抗TWEAK-R单克隆抗体的抗原结合位点构建成IgM分子(其具有10个抗原结合位点)。

或者，可以收集和富集用抗原单次免疫接种后通过杂交瘤融合技术分离的完整小鼠(或其它动物)IgM分子。富集IgM分子的一种方式是免疫CD40信号传导缺陷小鼠(Kawabe et al.，Immunity，1：167-78(1994)；Xu et al.，Immunity，1：423-31(1994))。这些小鼠不能有效生成IgG，而且因此它们对抗原攻击的应答富含IgM同种型。

抗TWEAK-R IgM抗体，凭借它们增多的效价，能有效聚集膜平面内的TWEAK-R分子，由此与它们具有两个抗原结合位点的IgG对应物相比增强TWEAK-R信号传导。用针对Fas受体的抗体看到了多价抗体在受体聚簇方面效率升高的一个显著例子，其中在溶液中IgM形式非常有力且正常二价IgG无效(Yonihara and Yonihara，J.Exp.Med.，169：1747-56(1989)；Alderson et al.，Int.Immunol.，6：1799-1806(1994))。

同样地，针对Fas受体的apo-1单克隆抗体是IgG3单克隆抗体。这种单克隆抗体有力活化Fas受体，这依赖于IgG3亚型独特的Fc相互作用来聚集成更大的多价形式。消除Fc区则创建不能联合成更大聚集物且无活性的F(ab)₂形式(Dhein et al.，J.Immunol.，149：316673(1992))。如此，通过类推，预测IgM型式的抗TWEAK-R单克隆抗体会是TWEAK-R的有力活化剂。

在一些实施方案中，TWEAK-R激动剂是交联的抗TWEAK-R单克隆抗体的复合物。术语“交联的抗TWEAK-R单克隆抗体”指使用抗TWEAK-R抗体或单克隆抗体交联剂，溶液中已彼此分子间交联以形成抗体聚集体的，或者已在表面或基质诸如微珠上彼此密切接近的固定化的针对TWEAK-R的抗体。术语“抗TWEAK-R抗体(或单克隆抗体)交联剂”指任何能共价或非共价聚集溶液中的抗TWEAK-R抗体，使得抗体能结合并加强靶细胞表面TWEAK-R信号传导的药剂。此类交联剂包括但不限于化学交联剂、与抗TWEAK-R抗体或单克隆抗体一部分反应的二抗、和可溶性的或表面结合的能结合抗TWEAK-R抗体的Fc受体(内源的或外源添加的)。

如本文中使用的，术语“抗体”指包括至少一个免疫球蛋白可变区的蛋白质，例如提供免疫球蛋白可变域的氨基酸序列或免疫球蛋白可变域序列。例如，抗体可包括重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)。在另一个例子中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段、F(ab′)₂片段、Fd片段、Fv片段、和dAb片段)以及完整抗体，包括例如IgA、IgG(包括例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgE、IgD、IgM型(以及它们的亚型)的完整和全长免疫球蛋白。术语还涵盖双特异性抗体、双特异性抗体片段、多聚体抗体、和多聚体抗体片段。免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型的。在一些实施方案中，抗体是糖基化的。

VH和VL区可进一步细分成称作“互补决定区”(“CDR”)的高变区，间插称作“框架区”(FR)的更加保守的区。FR和CDR的范围已精确限定(参见Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242；Chothia，C.et al.，J. MoI.Biol.，196：901-917(1987))。本文中使用Kabat定义。VH和VL每一个通常由三个CDR和四个FR构成，以如下次序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。

抗体的VH或VL链可进一步包括整个或部分重链或轻链恒定区，以由此分别形成免疫球蛋白重链或轻链。在一个实施方案中，抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体。免疫球蛋白重链和轻链可以通过二硫键而连接。重链恒定区通常包括三个恒定域，CH1、CH2、和CH3。轻链恒定区通常包括CL域。

在一些实施方案中，激动性抗体的一个或多个区可以是人的、实际上人的、或人源化的。“实际上人的”免疫球蛋白可变区是包括足够数目的人框架氨基酸位置，使得免疫球蛋白可变区在正常人中不引发免疫原性应答的免疫球蛋白可变区。“实际上人的”抗体是包括足够数目的人氨基酸位置，使得抗体在正常人中不引发免疫原性应答的抗体。“人源化的”免疫球蛋白可变区是经过修饰，使得修饰形式在人中引发比非修饰形式要更少的免疫应答的免疫球蛋白可变区。“人源化的”免疫球蛋白的记载包括例如美国专利No.6,407,213和5,693,762。例如，一个或多个可变区可以是人的或实际上人的。一个或多个CDR，例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2、和VL CDR3可以是人的。每一个轻链CDR可以是人的。VH CDR3可以是人的。一个或多个重链或轻链框架区可以是人的，例如FR1、FR2、FR3、和FR4。在一些实施方案中，整个框架区是人的。在一个实施方案中，人序列是种系序列(由种系核酸编码的序列)。一个或多个恒定区可以是人的、实际上人的、或人源化的。在其它实施方案中，至少70、75、80、85、90、92、95、或98％的框架区(包括FR1、FR2、和FR3总体，或FR1、FR2、FR3、和FR4总体)或整个抗体可以是人的、实际上人的、或人源化的。在有些情况中，人源化免疫球蛋白可以在一个或多个框架氨基酸位置处包括非人氨基酸。例如，FR1、FR2、和FR3总体可以与由人种系区段编码的人序列至少70、75、80、85、90、92、95、98、或99％相同或完全相同。

抗体可以缀合至模块，例如可以缀合至聚乙二醇(例如PEG化)，例如用于对抗体降低免疫原性和/或延长循环半衰期。

抗体生成

结合TWEAK-R的抗体可通过多种手段依照标准方案来生成，包括免疫接种(例如使用动物)或体外方法(诸如噬菌体展示)(参见例如“Antibodies：ALaboratory Manual，”ed.by Harlow and Lane，Cold Spring Harbor press：1988)。整个或部分TWEAK受体或表达TWEAK受体的细胞可用作免疫原或选择靶。例如，TWEAK受体或其片段或表达TWEAK受体的细胞可用作免疫原。在一个实施方案中，经过免疫的动物含有具有天然的、人的、或部分人的免疫球蛋白基因座的生成免疫球蛋白的细胞。在一个实施方案中，非人动物包括至少部分人免疫球蛋白基因。例如，有可能用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体生成缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可生成和选择自具有期望特异性的基因衍生的抗原特异性单克隆抗体。参见例如XENOMOUSE^TM，Green etal.，Nat.Gen.，7：13-21(1994)；美国专利公布No.2003/0070185；美国专利No.5,789,650；国际专利公布No.WO 96/34096。

针对TWEAK受体的非人抗体也可例如在啮齿动物中生成。非人抗体可以人源化(例如EP 239400；美国专利No.6,602,503；5,693,761；和6,407,213中记载的)、去免疫、或以其它方式修饰以使之成为上文所述实际上人的。

EP 239400(Winter et al.)记载了通过将一种物种的互补决定区(CDR)替代(在给定可变区内)成另一种物种的来改变抗体。通常，将非人(例如鼠)抗体的CDR替代入人抗体的对应区中，这通过使用重组核酸技术生成编码期望的经过替代的抗体的序列来实现。可添加期望同种型(通常是CH的γI和CL的κ)的人恒定区基因区段，而且可以在哺乳动物细胞中共表达人源化重链和轻链基因以生成可溶性人源化抗体。也可使用其它用于人源化抗体的方法。例如，其它方法可考虑抗体的三维结构、在三维上接近结合决定簇的框架位置、和免疫原性肽序列。参见例如国际申请No.WO 90/07861；美国专利No.5,693,762；5,693,761；5,585,089；5,530,101；6,407,213；Tempest et al.，Biotechnology 9：266-271(1991)。

结合TWEAK受体的完全人的单克隆抗体可例如使用体外引发的人脾细胞来生成，如Boerner et al.，J.Immunol.，147：86-95(1991)记载的。它们可通过全集克隆来制备，如Persson et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A，88：2432-2436(1991)；Huang and Stollar，J.Immunol.Methods，141：227-236(1991)；或美国专利No.5,798,230记载的。使用标准噬菌体技术，大型未免疫人噬菌体展示库也可用于分离能开发成人治疗剂的高亲和力抗体(参见例如Hoogenboom etal.，Immunotechnology，4：1-20(1998)；Hoogenboom et al.，Immunol Today，2：371-378(2000)；美国专利公布No.2003/0232333)。

抗体和蛋白质生产

本文所述抗体和其它蛋白质可在原核和真核细胞中生产。在一个实施方案中，抗体在酵母细胞诸如毕赤氏酵母属(Pichia)(参见例如Powers et al.，J.Immunol.Methods，251：123-35(2001))、汉逊氏酵母属(Hanseula)、或糖酵母属(Saccharomyces)中表达。

抗体，特别是全长抗体，例如IgG，可以在哺乳动物细胞中生产。用于重组表达的例示性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr^-CHO细胞，记载于Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，77：4216-4220(1980)，其中重组构建物包括DHFR选择标志，如Kaufman andSharp，MoI.Biol.，159：601-621(1982)中记载的)、淋巴细胞细胞系包括NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、K562细胞、和来自转基因动物(诸如转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是乳房上皮细胞。

在编码免疫球蛋白域的核酸序列之外，重组表达载体可携带别的核酸序列，诸如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标志基因。选择标志基因便于选择已导入有载体的宿主细胞(参见例如美国专利No.4,399,216；4,634,665；和5,179,017)。例示性选择标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr^-宿主细胞及甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

在一种用于重组表达抗体或抗体片段的例示性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链二者的重组表达载体导入dhfr^-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作连接增强子/启动子调节元件(例如自SV40、CMV、腺病毒等等衍生的，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其容许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已转染有载体的CHO细胞。培养选定的转化宿主细胞以容许表达抗体重链和轻链，并自培养液回收完整抗体。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化子、培养宿主细胞、和自培养液回收抗体。例如，有些抗体可以用蛋白A或蛋白G通过亲和层析来分离。

抗体(和Fc融合物)也可包括修饰，包括例如改变Fc功能的修饰。此类修饰包括降低或消除与Fc受体或与C1q，或二者的相互作用的变化。例如，可以在一个或多个残基处突变人IgG1恒定区，包括例如残基234和237中的一个或多个，依照美国专利No.5,648,260中的编号方式。其它例示性修饰包括美国专利No.5,648,260中记载的那些。

对于激动性抗体和一些包括Fc域的TWEAK融合蛋白，抗体/蛋白质生产系统可设计成合成具有糖基化Fc区的抗体或融合蛋白。例如，IgG分子的Fc域可以在CH2域中的天冬酰胺297处糖基化。Fc域也可包括其它真核翻译后修饰。在其它情况中，以未糖基化的形式生产蛋白质。

抗体和其它蛋白质也可通过转基因动物来生产。例如，美国专利No.5,849,992记载了一种用于在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建转基因，其包括乳特异性启动子和编码感兴趣抗体(例如本文所述抗体)和分泌信号序列的核酸序列。由此类转基因哺乳动物的雌性动物产生的乳包括其中分泌的感兴趣蛋白质，例如抗体或Fc融合蛋白。蛋白质可以自乳纯化，或者对于一些应用，直接使用。

配制剂和施用路径

本发明的方法包括将有效剂量的TWEAK-R激动剂施用于患者以诱导胰组织再生。为给定患者确定优选药物配制剂和治疗有效剂量方案完全在本领域技术范围之外，要考虑例如患者的状况和重量、期望处理的程度和患者对处理的耐受。

TWEAK-R激动剂可通过任何与该激动剂相容的施用路径来施用，而且可以与适用于施用路径的药学可接受载体一起配制。此类载体是本领域技术人员公知的。施用可以例如静脉内、腹膜内、口服、经植入物、经粘膜、经皮、肌肉内、和皮下实施。优选施用路径是胃肠外和特别是静脉内、腹膜内、和囊内。处理可以基于门诊患者在较长时段里进行。治疗剂的日剂量预期在约0.01至1000μg/kg体重、和更优选约10至300μg/kg体重的范围中，尽管精确剂量会随采用的具体治疗剂和具体患者的医学状况和历史而变化。

以下采用多种常规使用载体的投递系统只是依照本发明的方法施用TWEAK-R激动剂所设想的许多实施方案的代表。

在一些实施方案中，TWEAK-R激动剂经可注射药物投递系统来施用。此类系统可包括溶液、悬浮液、凝胶、微球体和聚合可注射剂，而且可包含赋形剂诸如改变溶解度的药剂(包括例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(包括例如聚己内酯和聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA))。

在一些实施方案中，TWEAK-R激动剂经可植入系统来施用。可植入系统可包括杆和盘，而且可含有赋形剂诸如PLGA和聚己内酯。

用于TWEAK-R激动剂的口服投递系统包括片剂和胶囊剂。这些可含有赋形剂诸如粘合剂(例如羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、其它纤维质材料和淀粉)、稀释剂(例如乳糖和其它糖、淀粉、磷酸二钙和纤维质材料)、崩解剂(例如淀粉聚合物和纤维质材料)和润滑剂(例如硬脂酸盐和滑石)。

用于TWEAK-R激动剂的经粘膜投递系统包括贴剂、片剂、栓剂、阴道栓剂、凝胶剂和乳膏剂，而且可含有赋形剂诸如增溶剂和增强剂(例如丙二醇、胆汁盐和氨基酸)，和其它媒介(例如聚乙二醇、脂肪酸酯及衍生物、和亲水性聚合物诸如羟基丙基甲基纤维素和透明质酸)。

皮投递系统包括例如水性和非水性凝胶、乳膏剂、复合型乳剂、微乳剂、脂质体、软膏剂、水性和非水性溶液、洗剂、气雾剂、烃基材和粉剂，而且可含有赋形剂诸如增溶剂、渗透增强剂(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和亲水性聚合物(例如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。

用于可重建投递系统的溶液、悬浮液和粉包括媒介诸如悬浮剂(例如树胶、zanthan、纤维质和糖)、湿润剂(例如山梨醇)、增溶剂(例如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠、司盘、吐温、和鲸蜡基吡啶)、防腐剂和抗氧化剂(例如对羟基苯甲酸酯、维生素E和C、和抗坏血酸)、抗结块剂、涂层剂、和螯合剂(例如EDTA)。

TWEAK-R激动剂可以例如放置入有或无刺激摄取或稳定性的辅因子的无菌等张配制剂中。配制剂优选是液体，或者可以是冻干粉。例如，TWEAK激动剂可以用包含5.0mg/ml柠檬酸单水合物、2.7mg/ml柠檬酸三钠、41mg/ml甘露醇、1mg/ml甘氨酸和1mg/ml聚山梨酯20的配制剂稀释。此溶液可以冻干，在冷冻下贮存和在施用之前用无菌注射用水(U.S.P)重建。

本发明的药物组合物也可使用微球体、脂质体、其它微粒投递系统或持续释放配制剂(在受影响组织或血流中、附近放置或以其它方式联系)来施用。持续释放载体的合适例子包括成形产品诸如栓剂或微囊剂形式的半透性聚合物基质。可植入或微囊持续释放基质包括聚乳酸(美国专利No.3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers，22：547-56(1985))；聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或乙烯-乙酸乙烯(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech，12：98-105(1982))。

本发明的方法还包括将有效量的TWEAK-R激动剂投递至分离的、培养的胰细胞以诱导所述细胞在体外扩增。

本发明的方法、配制剂、和剂量可以在糖尿病的已知模型中评估。这些模型包括动物模型诸如以下实施例中描述的小鼠模型。当在动物模型中测试本发明的组合物时，生物学治疗剂应当在动物中具有活性。例如，小鼠激动性抗TWEAK-R抗体可代替人抗体使用，如果人抗体与小鼠TWEAK-R不交叉反应的话。

以下实施例提供本发明的示例性实施方案。技术人员会认识到不改变本发明的精神或范围可实施的众多更改和变更。此类更改和变更涵盖在本发明的范围之内。实施例不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1-TWEAK过表达诱导胰管细胞增生

扩增胰中的前体细胞的新策略会构成通向源自生成胰岛素的β细胞量不足的糖尿病治疗的重大进步。TWEAK是TNF细胞因子超家族的一个成员，介导多效效果，包括促炎性活性、血管发生、和调节细胞存活、增殖和死亡，经由其受体TWEAK-R(FGF可诱导分子14；Fn14)进行。TWEAK-R由上皮和间充质细胞表达，而且经NF-κB、MAPK和AKT途径发信号。有趣的是，TWEAK-R表达在正常情况中以相对较低的水平表达，而且在组织损伤和再生、和慢性炎性疾病的背景中高度上调，支持此途径在协调急性炎症和组织修复中的生理作用和慢性炎性疾病中的病理作用。TWEAK-R由多种祖细胞类型表达，包括胆管相关肝祖细胞，间充质干细胞，以及骨骼肌、软骨、骨、脂肪细胞和神经元祖细胞。在肝中，TWEAK诱导管相关祖细胞扩增。虽然胰祖细胞的身份仍然未知，但是一些先前研究提出了胰祖细胞衍生自管上皮。我们当前正在调查TWEAK/TWEAK-R途径是否在调节胰祖细胞和再生中发挥重要作用。

为了确定升高的TWEAK水平是否对胰细胞再生有影响，使用腺病毒表达载体在小鼠中过表达TWEAK，然后在组织学上观察来自小鼠的胰样品。通过将可溶性TWEAK编码序列插入复制缺陷型腺病毒载体中，在组成性CMV启动子控制下来构建含有鼠TWEAK的编码序列的腺病毒。通过标准方法(Ng，P.，et al.，Hum.Gene Ther.，11：693-699(2000)；Ng，P.，et al.，Hum.GeneTher.，10：2667-267(1999))创建含有在组成性CMV启动子控制下的TWEAKORF的重组腺病毒颗粒，称作“adeno-TWEAK”。简言之，经由标准方法在293细胞中创建表达可溶性鼠TWEAK的第一代腺病毒载体(E1，E3删除，血清型5)(同上)。使用双重氯化铯密度平衡梯度离心纯化载体，然后贮存于-80℃(在10mM Tris-HCl、1mM MgCl₂、10％甘油vol/vol，pH 8.0中)。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)在体外用A549细胞(ATCC)和在体内用静脉内给予载体的小鼠都验证了来自此载体的鼠TWEAK表达。以相同方式构建含有GFP的编码序列的对照腺病毒，称作“adeno-GFP”。将TWEAK编码腺病毒投递至购自Taconic Farms或Jackson Laboratories的6-8周龄野生型C57Bl/6雌性小鼠。在对照和实验小鼠中都使用10¹¹个病毒颗粒的总腺病毒载体剂量以确保较好的转导效率。血清TWEAK水平在注射后8天通常为约300ng/ml，注射后14天为50ng/ml，而注射后27天为27ng/ml。注射后3周，自安乐死小鼠分离胰，固定，切片，并对Ki-67蛋白(增殖的一种细胞标志物)染色。

如图1所示，感染adeno-TWEAK的小鼠中胰中的管周区域中的增殖细胞数目远远大于感染adeno-GFP的对照小鼠。

实施例2-TWEAK-R在胰管衍生细胞上表达

通过mRNA微阵列分析测量了自正常大鼠胰或部分胰脏切除术后2³/₄天分离的胰管细胞中的TWEAK-R表达水平。微阵列分析是使用标准规程实施的(参见Flamez et al.，Diabetes，51：2018-2024(2002)；Webb，et al.，Proc NatlAcad Sci USA，97：5773-5778(2000))。正常胰和胰脏切除术后管细胞生成可检测的TWEAK-R mRNA，而分离的胰岛没有。

TWEAK-R在认为源自管细胞的胰腺癌上高频率表达(Han et al.，CancerRes.，62(15)：4532(2002))。图2显示了人胰肿瘤中通过对人胰肿瘤组织微阵列的免疫组织化学染色来检测的TWEAK-R表达。42份组织样品中有16份(42％)是TWEAK-R阳性的。

实施例3-Fc-TWEAK诱导胰管上皮和管附近区域中的细胞增殖

以单次注射(急性处理)或初始注射后每周两次(慢性处理；在第0、3、7、10、和14天实施注射)给8至10周龄成体C57Bl/6雌性小鼠注射200μgFc-TWEAK或对照蛋白P1.17。在多个时间点通过手术自氯胺酮/赛拉嗪麻醉的小鼠获得胰组织，并在取出胰组织后立即处死小鼠。小鼠在处死那天不接受Fc-TWEAK或P1.17注射。将组织样品固定，切片，并对增殖标志物Ki-67免疫染色。

图3显示了代表性苏木精和曙红(H&E)染色的小鼠胰横切片。胰由腺泡、管、和岛组成。胰管周围不显示腺泡、岛、或血管细胞的典型结构的细胞称作管附近细胞。

图4含有代表性图像，显示Fc-TWEAK处理后3天胰管区域中细胞增殖升高，如通过Ki-67染色明显的(标尺＝200μm)。图4A显示了用对照蛋白P1.17处理后管区域中存在的增殖，而图4B显示了接受Fc-TWEAK相同时间长度的小鼠中相同区域中存在数目增多的增殖细胞。图4C和D显示了对照(图4C)或Fc-TWEAK(图4D)处理后第4天对管上皮标志物CK和Ki-67共染色的胰组织。TWEAK处理细胞中CK和Ki-67染色的交叠证明了管上皮细胞的增殖。

急性Fc-TWEAK处理或慢性Fc-TWEAK处理后第4天管区域中增殖细胞的增多是相似的(图5)。这些结果代表每个处理组4只小鼠。

Fc-TWEAK或P1.17处理1、3、4、5、10、和18天后对Ki-67呈阳性的管细胞的百分比通过对每个动物个体的给定切片的多个视野中Ki-67阳性管细胞数目和管细胞总数目计数来计算。与对照Ig蛋白P1.17处理相比，给予慢性Fc-TWEAK处理的小鼠的这些百分比显示于图6，而给予急性Fc-TWEAK处理的小鼠的这些百分比显示于图7。(数据显示为均值±均值的标准误差[SEM；n＝4]。)对于这两个处理方案，Ki-67阳性管上皮细胞数目在Fc-TWEAK处理的小鼠中与对照Ig处理的小鼠相比增多。还对管附近区域中Ki-67染色阳性的细胞的百分比定量，通过对每个动物个体的给定切片的多个视野中每个管的Ki-67阳性管附近细胞数目和管细胞总数目计数来进行，给予慢性Fc-TWEAK处理的小鼠显示于图8而给予急性处理的小鼠显示于图9。(如图6和7中，数据显示为均值±SEM[n＝4]。)如对管上皮细胞观察到的，Fc-TWEAK处理相对于对照Ig处理增加管附近区域中增殖细胞数目。慢性Fc-TWEAK处理是管相关区域中更久的时间点(第10天和第18天)持续的细胞增殖所需要的。图6-9中显示相对于它们各自对照显著诱导增殖的测量(p＜0.05)以星号标示。

TWEAK处理不诱导一般性胰炎症。图10含有代表性图像，显示CD3(T细胞标志物)和F4/80(巨噬细胞标志物)的免疫染色在来自慢性TWEAK处理后第4天小鼠的胰切片上相对于对照没有升高(标尺＝200μm)。在急性或慢性处理方案下在所有实施的时间点(第1、3、4、5、10和18天)获得了类似结果。

实施例4-TWEAK对管区中的胰细胞增殖的促有丝分裂效果是经由TWEAK-R介导的

TWEAK-R KO小鼠的生成有记载(Jakubowski et al.，J. Clin.Invest.115：2330-40(2005))。简言之，分离含有完整鼠TWEAK-R基因的10-kb Kpn1基因组DNA片段，并设计打靶载体来删除头2个外显子，它们含有TWEAK-R的完整胞外配体结合域。将靶载体转染入J1129ES细胞系中并用G418选择。使用Southern印迹对ES细胞克隆筛选同源重组，并将正确克隆注射入C57BL/6胚泡以生成嵌合体。经由进一步繁殖获得对靶定TWEAK-R等位基因杂合的小鼠，并使用Southern印迹或PCR来鉴定。通过Northern印迹和RT-PCR二者验证了无效突变。在129背景上将小鼠繁殖至纯合。在SPF条件下将TWEAK-R突变回交到C57BL/6背景上5次。

持续3或10天每周两次用对照蛋白P1.17或TWEAK处理TWEAK-R KO和野生型小鼠。来自小鼠的胰切片对Ki-67免疫染色。图11显示了切片中计数的Ki-67阳性管细胞(图11A)或管附近细胞(图11B)的数目。数据显示为均值±SEM(n＝4)。星号指示TWEAK处理样品和对照样品之间的p值小于0.05。虽然Ki-67阳性管和管附近细胞的百分比在来自用TWEAK处理的WT小鼠的胰切片中大于在用对照蛋白处理的小鼠中，但是用TWEAK处理的TWEAK-RKO小鼠中Ki-67阳性细胞相对于用对照蛋白处理的小鼠没有增多。如此，TWEAK-R是TWEAK对胰管上皮细胞的增殖效果所需要的。

此外，TWEAK-R在TWEAK处理小鼠中在胰管上皮中特异性表达，如TWEAK-R免疫染色的(图11D)或同种型对照免疫染色的(图11C)TWEAK处理后第3天来自小鼠的胰切片(标尺＝100μm)上明显的。

实施例5-TWEAK诱导培养的人胰管细胞扩增

在分离后的生长扩增阶段期间将重组TWEAK添加至纯化的人管细胞(对胰癌的一种血清学标志物CA19-9呈阳性)的培养物。人管细胞是如Yatoh etal(Diabetes，56：1802-9(2007))所述分离的。简言之，通过Ricordi(E.Linetskyet al.，Diabetes，46：1120-23(1997))的标准方法消化人胰组织并分离岛，之后容许剩余组织在锥形管中沉降。然后吸出上清液以除去包括死细胞的低密度成分，并用胰蛋白酶/EDTA溶液分散剩余细胞以获得单细胞，称作“粗制的”或“未纯化的”管细胞。然后用对遍布人管树的细胞上存在的碳水化合物标志物CA19-9特异性的抗体通过免疫磁分选实现自此粗制的细胞制备物纯化管细胞。将纯化的管细胞分配入非组织培养T烧瓶中，在那里在培养基中扩增它们，没有或有在培养启动时添加重组可溶性TWEAK。TWEAK是如先前所述制备的(Jakubowski et al.，J. Cell Science，115：267-74(2002))。在第3天将细胞培养基更换成有或无TWEAK的新培养基，并在第1天和第4天对细胞拍照，通过血细胞计量术计数，并提取mRNA供进一步研究用。在来自四种胰的组织中，暴露于TWEAK(20或50ng/ml)的样品具有比未暴露于TWEAK的相同胰更多的健康细胞数，如图12中的代表性照片中明显的。

此发现指示，在长达自器官供体取出胰后36小时的免疫磁分选后至少一些纯化的人管群是响应TWEAK的，可能是经由TWEAK-R介导的。纯化的CA19-9阳性细胞群在分选后不含有胰岛素阳性细胞，如通过免疫染色或通过RT-PCR测试的。然而，在NODscid小鼠(Yatoh et al.Diabetes，56：1802-1809(2007))的肾囊下植入后4周，这些细胞能变成管的小管，有1％胰岛素阳性细胞，指示这些细胞群中存在胰祖细胞。

实施例6-Fc-TWEAK诱导胰祖细胞标志物表达

图13显示了小鼠胚胎发育期间调节胰祖细胞谱系规范的转录因子Ngn3和Pdx1的动态表达。Pdx1在胰祖细胞中以低水平表达且在岛β细胞中以高水平表达，而Ngn3在内分泌祖细胞中瞬时表达但在出生后消失。如实施例3所述获得了来自用Fc-TWEAK处理的成体小鼠的胰组织样品，并对Ngn3、管上皮标志物CK、和DNA(DAPI)免疫组织化学染色。罕见的Ngn3阳性细胞簇在慢性(图14)或急性(图15)Fc-TWEAK处理后第4天在管区中是明显的。(图15A显示了Ngn3染色，图15B显示了CK染色，图15C显示了Ngn3和CK共染色，而图15D显示了Ngn3和DAPI共染色。)图16显示了这些样品中Ngn3阳性细胞的频率，是通过单一切片中观察到的Ngn3阳性细胞数目除以该切片中计数的细胞总数目来确定的。图16中的每个点是来自动物个体的两张随机完整足迹法胰切片的平均，水平条指示每组四只小鼠的均值。Fc-TWEAK还在管上皮细胞中诱导低表达水平的Pdx1，如图17所示。Fc-TWEAK处理诱导细胞表达内分泌谱系规范因子指示TWEAK提高具有胰祖细胞潜力的细胞的频率。

实施例7-慢性Fc-TWEAK处理18天模拟对部分胰脏切除术的响应

对八周龄小鼠进行部分胰脏切除术，并在手术后4天切出胰。图18显示了部分胰脏切除术后第4天来自8只小鼠的胰连续切片的代表性图像，对TWEAK-R(图18A和C)或CK、胰岛素、和DNA(DAPI)染色(图18B和D)。图18A和B显示了未成熟再生灶的代表性图像，而图18C和D显示了成熟灶的代表性图像。来自伪手术小鼠(图18E和F)和来自Px后4天的小鼠(图18G和H)的胰的连续切片对T细胞标志物CD3(图18E和G)和巨噬细胞标志物F4/80(图18F和H)染色。与伪手术的胰中CD3和F4/80的低表达相比，部分胰脏切除术后在再生灶中特异性诱导CD3阳性T细胞和F4/80阳性巨噬细胞。

还在每周两次TWEAK处理后第18天在4/4只动物中鉴定出再生灶(图19A，低放大倍数的代表性H&E染色的胰切片显示整个再生区域)。在对照小鼠中没有观察到再生灶。TWEAK处理小鼠的连续切片对Ki-67(图19B)、CK(图19C)、胰岛素(图19D)、胰高血糖素(图19E)染色。来自另一个Fc-TWEAK处理胰的连续切片用H&E(图19F)、对CD3(图19G)、对F4/80(图19H)染色，而其它连续切片对TWEAK-R(图19J)和同种型对照(图19I)染色。岛标记为“i”。标尺＝50μm。因此，18天慢性TWEAK处理诱导的再生灶区域模拟那些在部分胰脏切除术后观察到的，包括被间充质细胞包围的高度增殖小管、一些表达激素的管细胞以及分散的表达激素的细胞(胰岛素或胰高血糖素)和升高的CD3和F4/80表达。

实施例8-TWEAK-R/TWEAK途径对于部分胰脏切除术后的胰再生是重要的

为了检查TWEAK-R/TWEAK途径在胰脏切除术后的胰再生中的作用，在胰脏切除术后4天在野生型和TWEAK-R KO小鼠中检查了再生。图20显示了部分胰脏切除术后4天野生型小鼠(白色柱)和TWEAK-R KO小鼠(黑色柱)中处于早期(“幼期”)、中期、和成熟期的的再生灶的百分比。再生灶的数目和分期是对每只动物至少两张切片评估的。切片相隔至少200μm，而且每组有六只动物。在伪手术小鼠中没有鉴定出再生灶。(图20中的数据显示为均值±SEM，而且星号指示比较TWEAK-R KO与野生型小鼠的p值小于0.05。)处于幼期的再生灶的数目在TWEAK-R KO小鼠中相对于野生型小鼠增多。部分胰脏切除术后4天来自TWEAK-R KO和野生型小鼠对CK和Ki-67共染色的胰切片显示了Ki-67阳性管上皮细胞的出现在TWEAK-R KO小鼠中(图21B)与野生型小鼠(图21A)相比减少(标尺＝200μm)。

实施例9-确定：TWEAK处理能产生分化中的和/或完全分化的胰细胞类型，它们来自具有祖细胞潜力的细胞

使用对Ki-67和各种细胞谱系标志物双重染色的切片的用Fc-TWEAK处理的小鼠的胰组织内特定细胞类型的增殖的分析确定增殖中的细胞类型的身份。Ki-67和胰祖细胞标志物的共表达指示TWEAK诱导祖细胞扩增。然而，由于Ki-67只在细胞周期期间表达，因此自Ki-67阳性细胞分化的祖细胞可表达祖细胞标志物且不再表达Ki-67。因此，Fc-TWEAK处理小鼠的胰组织中表达胰祖细胞标志物的细胞数目增多指示TWEAK处理提高具有胰祖细胞潜力的细胞的频率，如实施例6所示。

另外，经TWEAK诱导的细胞分化的能力通过鉴定共表达不同细胞类型正常特征性标志物的“移行细胞”来测定，其指示一种细胞类型变成另一种细胞类型的转换。此类标志物的例子包括但不限于共表达的管和祖细胞标志物、管和激素标志物诸如胰岛素、及祖细胞和激素标志物。经TWEAK诱导的细胞分化的能力也可通过找到分散的激素阳性细胞或激素阳性细胞簇，诸如胰岛素阳性细胞的区域内新形成的增殖小管灶区域的外观来测定。经TWEAK诱导的细胞分化成成熟胰细胞类型诸如岛β细胞的能力也可通过谱系示踪研究来测定。

用于这项分析的例示性标志物包括祖细胞标志物，诸如例如Pdx-1-一种早期前肠和胰祖细胞标志物，是所有胰细胞类型的发育所需要的(Jonssonet al.，Nature，371：606-609(1994)；Offield et al.，Development，122：983-985(1996))，且在正常成体动物中在岛中和在复制中的管中表达(Sharma et al.，Diabetes，48：507-513(1999))；巢蛋白(Seaberg et al.，Nat Biotechnol，22：1115-1124(2004))；c-met(Suzuki et al.，Diabetes，53：2143-2152(2004))；E-钙粘蛋白，β-联蛋白，和缺刻成分(Jensen et al.，Gastroenterology，128：728-741(2005))；Hes-1，在正常成体胰中由泡心细胞和一些管细胞表达的一种早期胰祖细胞标志物(Stanger et al.，Cancer Cell，8：185-195(2005))；Ngn3，只在不表达内分泌激素的胰祖细胞中检测到的一种瞬时表达的转录因子(Gradwohlet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，97：1607-1611(2000))。

其它合适标志物包括(1)管标志物，诸如例如扁豆(Dolichos biflorus)凝集素(DBA)凝集素，它标记整个管树，从共同胆/胰管直到泡心细胞和一些胚胎胰祖细胞；细胞角蛋白CK-19和CK-20；碳酸酐酶II；和粘蛋白1；(2)腺泡标志物，诸如例如淀粉酶；(3)内分泌细胞标志物，诸如例如胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、和胰多肽；(4)卵形细胞标志物，诸如例如α-胎蛋白、细胞角蛋白19、清蛋白、和c-kit；和(5)非胰细胞标志物，诸如例如CD45(造血细胞)和α-SMA(基质细胞)。

说明书内的实施方案提供了本发明实施方案的例示且不应解释为限制本发明的范围。技术人员容易认识到本发明涵盖许多其它实施方案。通过述及而完整收录本公开文本中引用的所有出版物和专利。如果通过述及而收录的材料与本说明书矛盾或不一致的话，说明书会代替任何此类材料。本文中对任何参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。

除非另外指明，说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示组分、反应条件、等等的数量的数目要理解为在所有情况中有术语“约”修饰。因而，除非另外相反地指明，数值参数是近似值且可随本发明试图获得的期望特性而变化。最低限度，而且不是作为将等同原则的应用限制于权利要求的范围的尝试，每个数值参数应当根据有效数字个数和普通舍入法来解释。

除非另外指明，一系列要件前面的术语“至少”要理解指该系列中的每一个要件。本领域技术人员会认识，或使用常规实验就能够确定，本文中描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。所附权利要求意图涵盖此类等同方案。

Claims (141)

1.一种在患者中诱导胰组织再生的方法，包括对需要该方法的患者施用足以诱导胰组织再生的治疗有效量的TWEAK受体(TWEAK-R)激动剂。

2.权利要求1的方法，其中胰组织是胰岛组织。

3.权利要求2的方法，其中胰岛组织包含岛β细胞。

4.权利要求1的方法，其中所述患者已丧失胰组织。

5.权利要求1的方法，其中所述患者具有糖尿病，且所述方法包括对所述患者施用有效诱导分泌胰岛素的胰组织再生的量的TWEAK-R激动剂。

6.权利要求5的方法，其中糖尿病是1型糖尿病。

7.权利要求5的方法，其中糖尿病是2型糖尿病。

8.权利要求4的方法，其中所述患者已经历胰组织切除。

9.权利要求8的方法，其中所述患者具有癌症。

10.权利要求9的方法，其中所述癌症是胰癌。

11.权利要求1的方法，其中所述患者已接受胰中的细胞或组织移植物，其中所述移植物包含能够分化成胰细胞的祖细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述移植物包含胰祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞。

13.权利要求12的方法，其中所述胰祖细胞是CK-、Ki-67-、Pdx1-和/或Ngn3-阳性细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述胰祖细胞是胰管上皮细胞或管附近细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述移植物基本上只由胰管上皮细胞组成。

16.权利要求11的方法，其中所述祖细胞是能够分化成胰细胞的胚胎干细胞、成体干细胞、全能干细胞或多能干细胞。

17.权利要求11的方法，包括在施用TWEAK-R激动剂之前施用所述移植物。

18.权利要求11的方法，其中同时施用所述移植物和所述TWEAK-R激动剂。

19.一种在患者中治疗糖尿病的方法，包括对糖尿病患者施用i)包含能够分化成胰细胞的祖细胞的细胞或组织移植物，和ii)足以诱导胰组织再生的治疗有效量的TWEAK-R激动剂。

20.一种在已经历部分胰脏切除术的患者中再生胰组织的方法，包括对所述患者施用在所述患者中有效诱导胰祖细胞再生的量的TWEAK-R激动剂，其中所述祖细胞驻留在所述患者中或移植入所述患者中。

21.权利要求1、19、或20的方法，进一步包括对所述患者共施用抗炎剂或免疫调控剂。

22.权利要求1、19、或20的方法，其中所述患者没有炎性状况。

23.权利要求1、19、或20的方法，其中在胰或胰区中或附近施用所述TWEAK-R激动剂。

24.权利要求1、19、或20的方法，其中所述患者是哺乳动物。

25.权利要求1、19、或20的方法，其中所述患者是人。

26.一种扩增胰细胞群的方法，包括使包含至少一个胰祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞的胰细胞群与TWEAK-R激动剂接触以获得扩增的胰细胞群。

27.权利要求26的方法，其中所述胰细胞群基本上由胰祖细胞组成。

28.权利要求27的方法，其中所述胰祖细胞是胰管上皮细胞和/或管附近细胞。

29.权利要求28的方法，其中所述胰祖细胞是CK-、Ki-67-、Pdx1-和/或Ngn3-阳性细胞。

30.权利要求28的方法，其中所述胰细胞群基本上只由胰管上皮细胞组成。

31.权利要求26的方法，其中所述扩增的胰细胞群包含扩增的胰岛素阳性细胞群。

32.权利要求26的方法，其中所述扩增的胰细胞群包含扩增的CK-、Ki-67-、Pdx1-和/或Ngn3-阳性细胞群。

33.权利要求26的方法，其中所述胰细胞群在体外。

34.权利要求26的方法，其中所述胰细胞群是自患者获得的。

35.权利要求34的方法，其中所述使自患者获得的胰细胞与所述TWEAK-R激动剂接触在体外发生。

36.权利要求26的方法，其中所述胰细胞群是自分化成胰细胞的本质上非胰细胞群获得的。

37.权利要求36的方法，其中所述本质上非胰细胞群包含全能干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、和成体干细胞中一种或多种。

38.一种治疗糖尿病的方法，包括下述步骤：

a)在体外培养祖细胞，其中所述祖细胞是自具有糖尿病的患者分离的胰祖细胞、全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、或胚胎干细胞；

b)用有效量的TWEAK-R激动剂诱导所述培养的祖细胞增殖以生成所述祖细胞的扩增群；并

c)将所述祖细胞扩增群移植入所述具有糖尿病的患者的胰中；其中在所述患者中自所述移植的祖细胞再生生成胰岛素的胰细胞。

39.权利要求38的方法，其中所述患者是哺乳动物。

40.权利要求39的方法，其中所述患者是人。

41.权利要求1至40任一项的方法，其中所述TWEAK-R激动剂选自下组：TWEAK，TWEAK类似物，TWEAK模拟物，和激动性TWEAK-R抗体。

42.权利要求41的方法，其中所述TWEAK-R激动剂是TWEAK。

43.权利要求42的方法，其中TWEAK是具有序列SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的多肽。

44.权利要求42的方法，其中TWEAK是氨基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸249处的多肽。

45.权利要求44的方法，其中TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸46至249。

46.权利要求44的方法，其中TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸104至249。

47.权利要求42的方法，其中TWEAK是氨基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸46和104之间的任何位置处和羧基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸249处的多肽。

48.权利要求41的方法，其中所述TWEAK-R激动剂是TWEAK类似物。

49.权利要求48的方法，其中所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少80％相同的多肽。

50.权利要求48的方法，其中所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽。

51.权利要求48的方法，其中所述TWEAK类似物是TWEAK融合蛋白。

52.权利要求51的方法，其中所述TWEAK融合蛋白包含SEQ ID NO：1的多肽和免疫球蛋白的Fc部分。

53.权利要求41的方法，其中所述TWEAK-R激动剂是激动性TWEAK-R抗体。

54.权利要求53的方法，其中所述激动性抗体是单克隆抗体。

55.权利要求53的方法，其中所述激动性抗体是人源化抗体。

56.权利要求53的方法，其中所述激动性抗体是嵌合抗体。

57.一种药物组合物，包含TWEAK-R激动剂，用于在有所需要的患者中诱导胰组织再生。

58.权利要求57的组合物，其中胰组织是胰岛组织。

59.权利要求58的组合物，其中胰岛组织包含岛β细胞。

60.权利要求57的组合物，其中所述患者已丧失胰组织。

61.权利要求60的组合物，用于在患有糖尿病的患者中诱导分泌胰岛素的胰组织再生。

62.权利要求61的组合物，其中糖尿病是1型糖尿病。

63.权利要求61的组合物，其中糖尿病是2型糖尿病。

64.权利要求60的组合物，用于治疗已经历胰组织切除的患者。

65.权利要求64的组合物，其中所述患者具有癌症。

66.权利要求65的组合物，其中所述癌症是胰癌。

67.权利要求57的组合物，其中所述患者已接受包含能够分化成胰细胞的祖细胞的细胞或组织移植物。

68.权利要求67的组合物，其中所述移植物包含胰祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞。

69.权利要求68的组合物，其中所述胰祖细胞是CK-、Ki-67-、Pdx1-和/或Ngn3-阳性细胞。

70.权利要求69的组合物，其中所述胰祖细胞是胰管上皮细胞或管附近细胞。

71.权利要求70的组合物，其中所述移植物基本上只由胰管上皮细胞组成。

72.权利要求67的组合物，其中所述祖细胞是能够分化成胰细胞的胚胎干细胞、成体干细胞、全能干细胞或多能干细胞。

73.权利要求67的组合物，在施用所述移植物之后施用于所述患者。

74.权利要求67的组合物，与施用所述移植物同时施用于所述患者。

75.一种药物组合物，包含TWEAK-R激动剂，用于在患者中治疗糖尿病，施用于具有糖尿病的患者，还对该患者施用包含能够分化成胰细胞的祖细胞的细胞或组织移植物。

76.一种药物组合物，包含TWEAK-R激动剂，用于在已经历部分胰脏切除术的患者中再生胰组织，施用于所述患者以诱导胰祖细胞再生，其中所述祖细胞驻留在所述患者中或移植入所述患者中。

77.权利要求57或76的组合物，与抗炎剂或免疫调控剂一起共施用于所述患者。

78.权利要求57或76的组合物，其中所述患者没有炎性状况。

79.权利要求57或76的组合物，用于在胰或胰区中或附近施用。

80.权利要求57或76的组合物，其中所述患者是哺乳动物。

81.权利要求57或76的组合物，其中所述患者是人。

82.权利要求57至81任一项的药物组合物，其中所述TWEAK-R激动剂选自下组：TWEAK，TWEAK类似物，TWEAK模拟物，和激动性TWEAK-R抗体。

83.权利要求82的组合物，其中所述TWEAK-R激动剂是TWEAK。

84.权利要求83的组合物，其中TWEAK是具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的多肽。

85.权利要求83的组合物，其中TWEAK是包含SEQ ID NO：1的序列一部分的多肽，其中所述多肽氨基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸249处。

86.权利要求85的组合物，其中TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸46至249。

87.权利要求85的组合物，其中TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸104至249。

88.权利要求83的组合物，其中TWEAK是氨基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸249处的多肽。

89.权利要求82的组合物，其中所述TWEAK-R激动剂是TWEAK类似物。

90.权利要求89的组合物，其中所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少80％相同的多肽。

91.权利要求89的组合物，其中所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽。

92.权利要求89的组合物，其中所述TWEAK类似物是TWEAK融合蛋白。

93.权利要求92的组合物，其中所述TWEAK融合蛋白包含SEQ ID NO：1的多肽和免疫球蛋白的Fc部分。

94.权利要求82的组合物，其中所述TWEAK-R激动剂是激动性TWEAK-R抗体。

95.权利要求94的组合物，其中所述激动性抗体是单克隆抗体。

96.权利要求94的组合物，其中所述激动性抗体是人源化抗体。

97.权利要求94的组合物，其中所述激动性抗体是嵌合抗体。

98.TWEAK-R激动剂在配制用于在患者中诱导胰组织再生的药物中的用途。

99.权利要求98的用途，其中胰组织是胰岛组织。

100.权利要求99的用途，其中胰岛组织包含岛β细胞。

101.权利要求98的用途，其中所述患者已丧失胰组织。

102.权利要求101的用途，其中所述患者具有糖尿病，且所述药物用于诱导分泌胰岛素的胰组织再生。

103.权利要求102的用途，其中糖尿病是1型糖尿病。

104.权利要求102的用途，其中糖尿病是2型糖尿病。

105.权利要求101的用途，其中所述患者已经历胰组织切除。

106.权利要求105的用途，其中所述患者具有癌症。

107.权利要求106的用途，其中所述癌症是胰癌。

108.权利要求98的用途，其中所述患者已接受胰中的细胞或组织移植物，其中所述移植物包含能够分化成胰细胞的祖细胞。

109.权利要求108的用途，其中所述移植物包含胰祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞。

110.权利要求109的用途，其中所述胰祖细胞是Ki-67-、Pdx1-和/或Ngn3-阳性细胞。

111.权利要求110的用途，其中所述胰祖细胞是胰管上皮细胞或管附近细胞。

112.权利要求111的用途，其中所述移植物基本上只由胰管上皮细胞组成。

113.权利要求108的用途，其中所述祖细胞是能够分化成胰细胞的胚胎干细胞、成体干细胞、全能干细胞或多能干细胞。

114.权利要求108的用途，其中在施用所述移植物之后将所述药物施用于所述患者。

115.权利要求108的用途，其中同时施用所述药物和所述移植物。

116.TWEAK-R激动剂在配制用于在患者中治疗糖尿病的药物中的用途，其中将所述药物施用于具有糖尿病的患者，还对该患者施用包含能够分化成胰细胞的祖细胞的细胞或组织移植物。

117.TWEAK-R激动剂在配制用于在已经历部分胰脏切除术的患者中再生胰组织的药物中的用途，其中将所述药物施用于所述患者以诱导胰祖细胞再生，其中所述祖细胞驻留在患者中或移植入所述患者中。

118.权利要求98或117的用途，其中将所述药物与抗炎剂一起共施用于所述患者。

119.权利要求98或117的用途，其中所述患者没有炎性状况。

120.权利要求98或117的用途，其中在胰或胰区中或附件施用所述药物。

121.权利要求98或117的用途，其中所述患者是哺乳动物。

122.权利要求98或117的用途，其中所述患者是人。

123.TWEAK-激动剂用于治疗糖尿病的用途，其中使用所述TWEAK-R激动剂来诱导培养的祖细胞或能够去分化成胰祖细胞的细胞增殖以生成祖细胞的扩增群，其中所述祖细胞是自具有糖尿病的患者分离的胰祖细胞、全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、或胚胎干细胞，且其中将所述祖细胞扩增群移植入所述具有糖尿病的患者的胰中，且其中在所述患者中自所述移植的祖细胞再生生成胰岛素的胰细胞。

124.权利要求123的用途，其中所述患者是哺乳动物。

125.权利要求124的用途，其中所述患者是人。

126.权利要求98至125任一项的用途，其中所述TWEAK-R激动剂选自下组：TWEAK，TWEAK类似物，TWEAK模拟物，和激动性TWEAK-R抗体。

127.权利要求126的用途，其中所述TWEAK-R激动剂是TWEAK。

128.权利要求127的用途，其中TWEAK是具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的多肽。

129.权利要求127的用途，其中TWEAK是包含SEQ ID NO：1的序列一部分的多肽，其中所述多肽氨基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：1的氨基酸249处。

130.权利要求129的用途，其中TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸46至249。

131.权利要求129的用途，其中TWEAK包含SEQ ID NO：1的氨基酸104至249。

132.权利要求127的用途，其中TWEAK是包含SEQ ID NO：2的序列一部分的多肽，其中所述多肽氨基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸46和104之间的任何位置处且羧基末端在SEQ ID NO：2的氨基酸249处。

133.权利要求126的用途，其中所述TWEAK-R激动剂是TWEAK类似物。

134.权利要求133的用途，其中所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少80％相同的多肽。

135.权利要求133的用途，其中所述TWEAK类似物是与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽。

136.权利要求133的用途，其中所述TWEAK类似物是TWEAK融合蛋白。

137.权利要求136的用途，其中所述TWEAK融合蛋白包含SEQ ID NO：1的多肽和免疫球蛋白的Fc部分。

138.权利要求126的用途，其中所述TWEAK-R激动剂是激动性TWEAK-R抗体。

139.权利要求138的用途，其中所述激动性抗体是单克隆抗体。

140.权利要求138的用途，其中所述激动性抗体是人源化抗体。

141.权利要求138的用途，其中所述激动性抗体是嵌合抗体。

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