CN102373220A

CN102373220A - 羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因

Info

Publication number: CN102373220A
Application number: CN2010102559093A
Authority: CN
Inventors: 李玉花; 解莉楠; 张旸; 王江
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-08-09
Filing date: 2010-08-09
Publication date: 2012-03-14

Abstract

羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因，它属于基因工程技术领域。本发明通过RACE法克隆获得耐盐碱能力极强的羊草的一种盐碱胁迫应答基因-14-3-3蛋白基因全长序列，然后，通过Northern检测和遗传转化检测其在盐碱胁迫下表达情况，分析它是否与抗盐碱胁迫相关。本发明获得的14-3-3蛋白基因编码区786bp，编码262个氨基酸。与禾本科其它植物大麦、小麦等相比同源性较高，DNA序列有约10％的差异，氨基酸序列有5％的差异，本发明获得的羊草14-3-3蛋白基因未见基因登录信息及相关序列信息报道。本发明所得基因Northern杂交显示其与植物抗盐碱胁迫相关。转化到露地菊后，转基因露地菊可以在含100mmol/L～200mmol/L NaCl的培养基上正常生长，根、植株生长情况明显好于未转化植株，且表现出较好的抗盐碱特性。

Description

羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种羊草的盐碱胁迫诱导蛋白基因。

背景技术

将植物转基因技术应用于强耐盐碱植物的培育是一种有效的途径，已经有各种基因获得专利的报道。目前，应用于农作物分子育种的抗盐碱基因多来源于非盐生的模式植物拟南芥、水稻等植物中，虽然通过转基因过量表达有提高作物抗逆性的报道，但是其转基因效率及功能尚有待提高。

我国大部分地区盐碱化土壤多为氯化盐(Cl^-)盐碱土，这种土壤主要表现为盐化影响，即Na⁺对植物的胁迫，而东北地区盐碱地的突出特点是不仅存在氯化盐(Cl^-)盐碱土，还有大面积的碳酸盐(CO₃ ^2-)盐碱土，即不仅存在高盐离子而且同时伴有高pH危害。目前，对植物耐盐碱的研究还大多集中于植物耐NaCl盐性，而对植物耐碱性特别是耐碳酸盐(高pH)研究还亟待深入。

羊草(Leymus chinensis)属禾本科赖草属植物，是一种广布于东北地区的优良牧草，尤其突出的是羊草具有较强的耐盐碱性，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因，是进行抗性基因筛选的良好材料。

发明内容

本发明目的是为了解决现有耐盐基因转化获得的耐盐转基因植物的耐盐能力不高的问题，克隆一种抗盐碱能力强的牧草羊草的一种盐碱胁迫应答基因一羊草(Leymus chinensis)碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因。这种抗逆相关基因可以用于科研与生产中，用于其详细的抗性机理等方面的研究，并通过转基因技术来培育抗逆植物新品种。羊草是一种广泛分布于东北地区的优良牧草，被称为 “牧草中的细粮”。另外，羊草还具有突出的耐盐碱性，可在黑龙江的盐碱土壤地区种植，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因。长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，而针对羊草的抗盐碱特性的研究也主要集中在生理学指标的测定上，但从分子生物学角度对羊草抗盐碱特性进行研究还比较少，远不能满足对其相关特性分子水平研究的要求。本发明通过克隆出抗盐碱能力很强的羊草的一种盐碱胁迫应答基因-盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因，然后通过Northern杂交和遗传转化技术检测其在盐碱胁迫下的表达情况，分析它是否与植物的抗盐碱能力相关。本发明的基因编码区长786bp，编码262个氨基酸。经序列同源性blast分析表明，与禾本科植物大麦、小麦等相比同源性较高，DNA序列有约10％的差异，氨基酸序列差异小于5％，本发明获得的羊草14-3-3蛋白基因未见基因登录信息。应用Northern杂交研究盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因在盐碱胁迫后的表达，结果发现该基因的表达受盐碱胁迫诱导。将克隆的14-3-3蛋白基因构建植物表达载体pCAMBIA-1301-14-3-3，转化露地菊中，发现转基因菊花与对照相比具有明显的抗盐碱能力，转基因露地菊可以在NaCl中能够正常生根、生长，而非转基因露地菊则出现生根抑制、生长缓慢现象，说明转基因露地菊具有明显的抗盐碱能力。

附图说明

图1为14-3-3蛋白基因PCR扩增电泳图，1：DNA Marker DL2000；2：目的片段；图2为盐胁迫后羊草中14-3-3基因的表达，样品顺序由1至7分别为200mmol/L Na₂CO₃浇灌处理0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h；图3为露地菊“火焰”转14-3-3基因及未转基因苗盐处理生根效果CK：“火焰”为转化植株；2#：转基因株系2；5#：转基因株系5；A：NaCl浓度0；B：NaCl浓度 100mmol/L；C：NaCl浓度200mmol/L。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的编码区序列如说明书附图中所示。

具体实施方式二：本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的氨基酸序列如说明书附图中所示。

具体实施方式三：本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因按以下步骤制备：

(一)羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的克隆

首先利用TSE法提取羊草的总RNA，用Amersham Biosciences公司的mRNA纯化试剂盒分离mRNA。采用PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit，以盐碱胁迫下的羊草样品为试验方(Tester)，非盐碱条件下生长的羊草样品为消减方(Driver)构建羊草消减文库。

然后对文库克隆进行测序，测序引物为T7引物，cDNA文库克隆的测序仪为GE公司的MegaBACE^TM 1000DNA序列分析仪。通过对文库克隆的BlastX分析获得14-3-3蛋白基因片段，序列为：

GGCCAATCAGTGCCCCTCTCCCTCAGGCTTTGAGGCGGCTTCCTTGATCTC

ATCTCCGGCCCTCCTCTGTGTTATCGNGAGGTCCAGAGAGTCAAGTTGTCA

CGAAAAGTTGCATGATCAAGGTGCTGGGGCTTGTAGATTCCTCGCCGAGG

GAGTACAGCTCAGCAATAGACTTCATCAAATGCCTGCTTGGCACAGGTTGC

AAGCACGGTCTGGANGCAGTTCACCGGATTTCATAGGTAGAACCACCTGA

GGAAGTTAGACGTGCCAACGTC

根据获得的EST片段序列进行引物设计，利用RACE法，克隆获得羊草完整的14-3-3基因。用NCBI ORF FOUNDER寻找开放读码框，所获得的基因cDNA序列全长1108bp，编码区长786bp，编码262个氨基酸，结果见说明书附图。

根据14-3-3基因的序列设计引物，利用RACE法进行PCR扩增，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，在1108bp处得到了单一条带(见说明书附图1)，与预期结果一致。

(二)羊草14-3-3基因对逆境胁迫的应答

将温室(平均温度28℃，湿度约为60％，光照时间14h/d)中盆栽8周龄羊草分别用200mmol/L Na₂CO₃溶液浇灌，进行胁迫处理，分别在胁迫处理前，胁迫2，6，12，24，48，72h后取羊草地上部分，迅速放入液氮冷冻，-80℃保存备用。

TSE法提取不同胁迫条件下不同时间的羊草叶部总RNA，利用Northern杂交技术，研究羊草中该基因在Na₂CO₃胁迫处理下不同时间点的表达情况，结果见说明书附图2。

从图中可以看出，对照(非胁迫)羊草目的条带较弱，说明在非胁迫下羊草的14-3-3基因表达量很低。而在盐胁迫2h后，14-3-3基因表达明显增加，且在12h和24h时出现高峰，表明该基因能够对Na₂CO₃胁迫做出应答。

(三)外源14-3-3基因对露地菊耐盐性影响

进一步将羊草14-3-3基因构建到植物表达载体pCAMBIA-1301中，利用农杆菌介导法将其转入到露地菊‘火焰’中，其中长势良好的1个转化株系经PCR和Southern检测，表明14-3-3基因已整合到露地菊基因组中。

将2个转基因露地菊株系和未转基因露地菊株系小芽接种在含有不同浓度NaCl的MS培养基中，培养10天后观察发现，在NaCl浓度为0的培养基中未转化株系和2个转化株系均能生根，但转化株系生根数量明显多于未转化植株，根长长于为转化植株，见说明书附图3。NaCl浓度100mmol/L情况下未转化株系生根情况受到明显抑制，根伸长仅3毫米左右，且数量明显少于NaCl浓度为0的培养基下生长的未转化植株和2个转化株系。同期比较，转化株系生根数量明显多于未转化植株，根长长于为转化植株，且与在NaCl浓度为0的培养基中的2个转化株系生根表现差异不明显。NaCl浓度200mmol/L情况下未转化株系和转化植株生根情况均受到明显抑制，没有看到明显的根部生长迹象。说明在盐存在的情况下转基因株系比未转基因株系生根能力更强，具有良好适应能力。

Claims

1.羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因，其特征在于羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的编码区序列如下所示：

ATGTCTACCGCTGAGGCAACCCGTGAGGAGAATGTGTACATGGCCAAGCTCGCCGAGCAGGCTGAGCG

TTATGAGGAGATGGTCGAATTCATGGAGAAGGTGGCAAAGACCGCTGATGTCGGTGAGCTCACTGTTG

AGGAGCGTAACCTGCTCTCTGTGGCTTACAAGAATGTGATTGGTGCCCGGAGGGCATCCTGGAGGATC

ATCTCGTCCATTGAGCAGAAGGAGGAGAGCCGTGGTAACGAGGCATATGTCGCTTCAATCAAGGAGTA

CCGTACCAGGATCGAAACTGAGCTCAGCAAGATCTGTGATGGCATCCTCAAGCTTCTGGACTCCCACC

TCGTCCCCTCTGCCACTGCAGCAGAGTCCAAGGTGTTCTATCTGAAAATGAAGGGTGATTACCACAGG

TACCTTGCGGAGTTCAAGGCGGGTGCTGAGAGGAAAGAAGCAGCTGAGAACACTCTTGTAGCATACAA

GTCAGCCCAGGACATTGCTCTTGCTGACTTGCCTACCACTCACCCGATAAGGCTTGGACTTGCACTCA

ACTTCTCAGTGTTCTACTATGAAATCCTGAACTCTCCAGACCGTGCTTGCAACCTTGCCAAGCAGGCA

TTTGATGAAGCTATTGCTGAGCTGGACTCCCTCGGCGAGGAATCCTACAAGGACAGCACCTTGATCAT

GCAACTTCTTCGTGACAACTTGACTCTCTGGACCTCCGATAACGCAGAGGAGGGCGGAGATGAGATCA

AGGAAGCCGCCTCAAAGCCTGAGGGAGAGGGGCACTGA。

2.羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因，其特征在于羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的氨基酸序列如下所示：

Met Ser Thr Ala Glu Ala Thr Arg Glu Glu Asn Val Tyr Met Ala Lys

Leu Ala Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Glu Glu Met Val Glu Phe Met Glu

Lys Val Ala Lys Thr Ala Asp Val Gly Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg

Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ala Arg Arg Ala

Ser Trp Arg Ile Ile Ser Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Ser Arg Gly

Asn Glu Ala Tyr Val Ala Ser Ile Lys Glu Tyr Arg Thr Arg Ile Glu

Thr Glu Leu Ser Lys Ile Cys Asp Gly Ile Leu Lys Leu Leu Asp Ser

His Leu Val Pro Ser Ala Thr Ala Ala Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu

Lys Met Lys Gly Asp Tyr His Arg Tyr Leu Ala Glu Phe Lys Ala Gly

Ala Glu Arg Lys Glu Ala Ala Glu Asn Thr Leu Val Ala Tyr Lys Ser

Ala Gln Asp Ile Ala Leu Ala Asp Leu Pro Thr Thr His Pro Ile Arg

Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn

Ser Pro Asp Arg Ala Cys Asn Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Glu Ala

Ile Ala Glu Leu Asp Ser Leu Gly Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr

Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp

Asn Ala Glu Glu Gly Gly Asp Glu Ile Lys Glu Ala Ala Ser Lys Pro

Glu Gly Glu Gly His