CN102373208A - 玉米逆境诱导型启动子的克隆及活性分析 - Google Patents

Abstract

玉米逆境诱导型启动子的克隆及活性分析属植物基因工程技术领域，本发明提供一种获得的玉米逆境诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1273bp区的DNA核苷酸序列；同时提供：用于玉米转化的逆境诱导型的植物表达载体，包含玉米逆境诱导型启动子序列和玉米脂氧合酶基因的5’非翻译区；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO 3的PCR引物，其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段；本发明可用于启动逆境相关基因的高效表达，应用于耐冷、耐旱和耐盐的转基因植物中，对于解决寒冷、干旱和盐害地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。

Description

玉米逆境诱导型启动子的克隆及活性分析

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一段DNA序列，在低温、干旱和盐害逆境胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达，具体来说，本发明涉及一种来源于玉米脂氧合酶(lipoxygenase)基因(ZmLOX10)，并在植物中高度表达的多重逆境诱导型启动子序列。

背景技术

在全球气候变化加剧，资源环境压力增大，金融危机影响加重，粮食供给下行趋势不断深化的背景下，保障我国粮食安全始终是一项紧迫而重要的战略任务。逆境胁迫是目前农业生产中影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。每年直接由盐碱、干旱、低温等逆境胁迫造成的农作物减产超过总产的20％左右。

玉米是我国三大粮食品种之一，种植面积和产量均居世界前列，对保障国家粮食安全，提高主要农产品供给能力非常重要。玉米属于逆境敏感型植物，生育期内极易受低温、干旱、盐渍等多元逆境胁迫的干扰和伤害。解决玉米生产中严重的多元逆境胁迫问题，提高玉米产量，除了常规育种技术以外，基于基因遗传转化的生物育种技术是一个重要的选择。虽然已有许多基因工程方法培育出抗性品种，但存在明显的缺陷，即：在基因工程中，用来控制目的基因表达的启动子主要以CaMV35S、玉米Ubiquitin等组成型表达启动子为主。该启动子虽能使目的基因过量表达，但它是无环境、组织和时间特异性的组成型表达的启动子。利用组成型表达启动子控制抗性相关基因的过量表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但正常环境条件下细胞内也会过量表达抗逆蛋白，对植物来说是一种能量浪费，而且正常环境下细胞内的抗逆蛋白长时间过量的积累可能妨碍植物的正常生长代谢，引起植物的形态发生改变，造成转基因植物生长发育严重停滞甚至死亡。因此，利用逆境诱导型启动子实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控抗逆基因在改良作物的抗性中成为当前研究的热点。

非生物胁迫，如干旱、高盐、低温和高温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节的主要机制之一是逆境胁迫有关的转录因子(调节蛋白)与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。国内外有一些关于逆境启动子的报道，rd29A启动子是胁迫诱导型启动子，受ABA、干旱、高盐及低温等逆境诱导，是目前抗逆植物基因工程中应用最广泛的诱导型启动子(李新玲等，2007；杨春霞等，2008；吴梅花等，2005；Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1993)。Yamaguchi-Shinozaki等(2001)分别利用CaMV 35S组成型启动子和rd29A逆境诱导型启动子获得了DREB 1A的转基因植株，结果显示rd29A::DREB 1A转基因植株的胁迫耐性明显高于35S::DREB1A的转基因植株，表明rd29A启动子能更有效地提高植物对低温、干旱和高盐等逆境胁迫的适应性。Brown等(2001)首次在冬麦中发现了受低温诱导的blt101.1基因启动子，并通过渐变缺失鉴定到了一个高度保守的TCA like元件(TCATCTTCTT)，表明该元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi等(2003)在小麦种分离到一个低温应答基因Wcor 15上游1.7kb的启动子序列，结果显示该区段内包含有4个CRT/DRE like序列，包括CCG AC核心基序，实验证明该启动子受低温和光诱导。

利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因的高效表达，从而改良作物对逆境胁迫的适应性已成为目前的研究热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的逆境相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种逆境诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)。

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的逆境诱导型启动子载体，该载体指导高水平表达目标基因ZmLOX10的逆境诱导型启动子序列和5’非翻译区。

本发明的第三个目的是提供一种检测启动子活性的瞬时表达体系，该体系能反映启动子诱导活性的高低。

为实现上述目的，本发明克隆了玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子区，并构建了用于转化的植物表达载体，所述载体中包含带有ZmLOX10基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米胚中进行诱导表达，并观察到该启动子与逆境诱导性相关的高水平活性。

本发明提供了一种获得的玉米逆境诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1273bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，低温、干旱和盐害可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。

获得的玉米逆境诱导型启动子序列源自玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)。

一种克隆得到的玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的+1bp至+170bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。

为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的低温、干旱和盐害诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米逆境诱导型启动子序列和玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的5’非翻译区。

上述用于玉米转化的逆境诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和LB(左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如pCAMBIA1301载体、pBI121载体。

本发明提供SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段。

关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。

本发明提供一种应用逆境诱导型二元载体的转基因植物，以及一种应用本发明所述进行瞬时表达的玉米成熟胚。

本发明提供来自玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的逆境诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行低温、干旱和盐害诱导型表达。

本发明有益效果在于可用于启动逆境相关基因的高效表达，应用于耐冷、耐旱和耐盐的转基因植物中，对于解决寒冷、干旱和盐害地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。

附图说明

图1为ZmLOX10-pro PCR电泳图

其中，M为DL2000Marker，自上而下大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，1-3为目的条带

图2为ZmLOX10-pro回收电泳图

图3为ZmLOX10-pro连T载体后菌液PCR图

其中，M为DL2000Marker，1-6为菌液PCR检测结果

图4为ZmLOX10-pro酶切电泳图

M为DL2000Marker

图5为大肠杆菌Top10中pCAMBIA1301::ZmLOX10Pro菌液PCR鉴定电泳图

其中，M为DL2000Marker，1-4为菌液PCR检测结果

图6为pCAMBIA1301::ZmLOX10Pro转农杆菌后菌液PCR检测电泳图

上述图中：M为DL2000Marker，1-5为农杆菌菌液PCR结果。

图7为植物表达载体构建示意图

图8为ZmLOX10启动子的GUS染色图(正面)

图9为ZmLOX10启动子的GUS染色图(背面)

其中，图8和图9中：从左至右依次为：pCAMBIA1301未处理、ZmLOX10未处理、ZmLOX10经低温诱导、ZmLOX10经PEG诱导、ZmLOX10经NaCl诱导

具体实施方式

下面结合附图介绍具体实施例：本发明的实施将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。

实施例1：玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子的克隆

玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1273bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的5’非翻译区序列中得到鉴定。

ZmLOX10登录在NCBI GenBank(登录号：NM_001112510)，序列表显示本发明上述基因的玉米逆境诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在SEQ ID NO.1中，翻译起始密码子ATG带有下划线，利用http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html网站预测转录起始位点，用+1标注。并用启动子分析网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析了启动子的核心元件。

CTAB方法提取玉米基因组DNA，以基因组DNA为模板扩增得到目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1443bp的特异条带(图1)，并利用胶回收试剂盒进行回收(图2)，回收片段与pMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T::ZmLOX10Pro，转化大肠杆菌Top10，挑取单菌落后摇菌，并进行菌液PCR检测(图3)，呈阳性的菌液保存并送公司测序。

更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子和170bp的5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，其反应程序为：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，31个循环；72℃10min；16℃停止。

表1：引物

上游引物	5′CGGAATTCGGACCTTACCTCTTTATGATTC 3′	SEQ ID NO：2
			下游引物	5′TGCCATGGAACGTACAGTACAGATGGCTTT  3′	SEQ ID NO：3

实施例2：玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)启动子表达载体的构建

将在实施例1中所克隆的玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)启动子和170bp的5’非翻译区ZmLOX10Pro(见序列表)插入到载体中，从而构建玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)启动子表达载体。

更具体地说，分别用EcoRI和NcoI酶切重组质粒pMD18-T::ZmLOX10Pro和植物表达载体pCAMBIA1301(图4)，分别回收目的片段和pCAMBIA1301，用T4连接酶连接，获得pCAMBIA1301::ZmLOX10Pro表达载体，用于驱动GUS基因的表达。经PCR鉴定(图5)获得的启动子片段与预期结果相同。利用电击法转化农杆菌EHA105，并进行菌液PCR检测(图6)。

在图7中，以编码β-葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因。此外35S-pro代表HPTII的启动子，而35S-ter代表它的终止子，ZmLOX10Pro代表GUS的启动子，而Nos-ter代表它的终止子。

实施例3：鉴定本发明所述的玉米逆境诱导型启动子的活性

为鉴定启动子的逆境诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法将玉米的胚干旱处理，再检测GUS的活性。

3.1受体材料的准备

先将玉米种子在水中浸泡1d，让其充分吸水，放入24℃的环境中催芽1d，然后将种子纵切成两半备用。

3.2农杆菌菌液的准备

将农杆菌EHA105接种于YEP(50mg/L rif、50mg/L kan)固体培养基上，28℃暗培养，至长出单菌落。挑取单菌落，接种在5mL含有相应抗生素的YEP液体培养基中，于28℃，200r/min振荡培养。待菌液长至OD₆₀₀＝0.4～0.6时，将菌液按1∶10的比例进行二次活化。当OD₆₀₀＝0.4～0.6时，吸取菌液置于无菌离心管中，5000rpm离心10min，弃上清，用等体积的MS液体培养基重悬，备用。

3.3农杆菌侵染

取种子中有胚根和芽的一部分放入50ml离心管中，加入适量活化好的农杆菌菌液，抽滤侵染5min左右后将种子放于湿润的滤纸上，24℃条件下暗处共培养24h。

3.4GUS染色

分别在低温(4℃)、20％PEG、200mM的NaCl中诱导培养6h，然后将玉米种子放于GUS检测液中，抽滤3min，于37℃过夜。GUS检测液：3mg/ml X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH＝7.0)，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100，10％甲醇。如图8和图9所示，经过低温、PEG和NaCl诱导的胚根中显示出高水平的GUS活性，其中经过低温处理的启动子活性最强，而未经诱导的组织显示出低水平的GUS活性。

工业实用性

如上所述，本发明提供了玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)逆境诱导型启动子和5’非翻译区。

本发明还提供了分别将启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而制得的植物表达载体。

经使用所述的植物表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子和5’非翻译区使得能够进行干旱诱导型的表达。因此，本发明可用于提高耐低温、干旱和盐害基因的启动活性，最终获得能用于生产的抗逆性强的粮食作物或植被。

SEQ ID NO.1的序列(带功能元件标记)

(i)序列特征：(A)长度：-1bp -1273bp；+1bp至+170bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

-1273 ATTGCCGTAG CGTTGGAGCT TTCCAACAGT ACGAGCCAAT CACTATGCTA CTAGCTAGCA

                                         CAAT-box

-1213 GCTAGCAACA ACACAAAACC TCATGTTGTC CTTTTATCGA TGTCACAGTG TGCACATTTG

                                     TATA-box

-1153 ATAGCAAGAG GCGTTCGGCC CGCAACACCT TTCGTTTTAC CCGCCGCTAC CCTAGAATAT

                                         TATA-box

-1093 CTGGCAGTGA AAAACTTGGT AAAAATGCCC TCCAGTAGTA CAATCATAGA ATGCATGGCT

                                             CAAT-box

-1033 ATACATGTGG CGTTAGAAAT GTTGTTAGTT AGTGTTTCCA AACACTCCAT CTTTTACCGC

      TATA-box                                        TCA-element

-973  GCAAACGTGC GAGATATATA GTTGCAACAA TATAATAATA TAACACGTTA AAAATATATA

                   TATA-box      CAAT-box         G-box

-913  ATTCTGGTCT TGTTTTTGCC AAACTTAACT TCATCTTGAT TTATTGTACG ACAAAAGCAA

-853  CCCATCGTCC AAACCAGTGC TAGAAATATG GGCCACGTTT TTTAGGCTAG CACGAGCACC

                                        ABRE

-793  ATTCAAAAAT AGAAACTTAA AGCATGCTCC AGCATGAAAT AATATGAGTC AAGCTAATAC

                 AE-box

-733  AGTCCAAAGA CGAGCCTCAA ATTCCAACCC GTCGGACCTA AAATTTCGTC CCGTCGCCGT

                       CAAT-box

-673  CGCCCTGGGA CGGCTCGCAC GTATGGGCTG GGCTTGGGTT GGCACGGTCT AATAAAGCTT

                        ABRE

-613  ATTGTTTTTT TAGTTTAGTA AGCTATAGAG TTTATATGTT TGTAATATTT AGATTTTATG

-553  TGGTTAAATG ATGCTCGCAT TGTTTAATAT CTTTAATTAG TAAGATATGA ACTTTATGTG

        GT1-motif

-493  ATTGCAATAT TTGGATTTTA TATGGTTTAA ATATATGGAT CGGACATTGA CCGACGCAGG

            CAAT-box           ARE                     Box-W1 MBS

-433  CCAACAAAGA CAGGACATGT TTTAGGATCG GACTAGACCA CTGTTTCTAC TCTTTAGGCT

                                                    5UTR Py-rich stretch

-373  CGCACGACAC GACCTAAAAT TTTTTAGACC TTCTTAGTCC AAACCCGTTT GGAACGAACC

                         HSE TATA-box

-313  ACAAAGTGGA CCCGGCCAAT TCCCATCACT AGTCCAAACA CACAATCCAG GACATACGAC

                      CAAT-box                  CAAT-box

-253  ATACACTACA CACACAGAGT CACAGACAGA CCAGCGCTCT GCATGGCCAT CATTCTGGTG

-193  ACCACGCAAA AAGGACCAGC CATTCCCGGG CAAAGATGGT TTCAGAAGCC AGCGAGCTTG

                                           ARE

-133  GCATTGGCAC ACACTATACA CACTGGTCGC TGATATTTCG ATTCCCCACG TGCGACACGG

                      TATA-box                           ABRE

-73  CATCTACCCG TCGAGGAACT CCACATCTCT CCATGAAGCT CGCTATATAT GCATGTGAGC

                                                   TATA-box

                   +1

-13  TTGGCATTGG CACACCACAG AGCAGCCACT TGGATCCGGT GCTCAGCGGA ACAGCTAGCT

                              CAT-box

+48  ATAGCCTGTA GCTAGCAGCT AGCTTCAGTC ACAGGCCGGA CGGTCGGCTC ACACACAGCT

     TATA-box

+108 AGCCGCCGCC GCCGCTAGCT TAGCCACCAG TAGTCCGATC TGATCTACAG GCAAGGGGCA

+168 ACTAGCTAGC TAGCCGCGCG CCGGCGCCAT G

Claims (5)

1.一种获得的玉米逆境诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于SEQID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1273bp区的DNA核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的获得的玉米逆境诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列源自玉米脂氧合酶基因ZmLOX10。

3.根据权利要求2所述的获得的玉米逆境诱导型启动子序列，其特征在于一种克隆得到的玉米脂氧合酶基因ZmLOX10的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的+1bp至+170bp区的DNA核苷酸序列。

4.一种用于玉米转化的逆境诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米逆境诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米脂氧合酶基因ZmLOX10的5’非翻译区。

5.SEQ ID NO：2和SEQ ID NO 3的PCR引物，其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ IDNO：1的序列DNA片段。

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