CN102370660B - 乌骨鸡血调节免疫的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乌骨鸡血粉的用途，其可用于调节非特异性的免疫活性，其包括促进细胞激素产生、促进脾脏免疫细胞的增生，以及提升自然杀手细胞和巨噬细胞的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于调节免疫活性的用途。
背景技术
由于医疗科技的进步，延长人类寿命，使得“人口高龄化”是近年来发达国家普遍所面临到的问题，目前台湾已迈进发达国家之林，人口高龄化的现象与所产生的问题也逐渐浮现。随着衰老的发生，人体内与免疫相关的器官包括制造淋巴细胞的骨髓、胸腺、脾脏以及淋巴结等的功能也会逐步下降，增加疾病感染及死亡的风险。除了衰老外，目前研究也显示现代人因为营养失调、压力或污染等因素加重免疫系统的负荷，在环境的刺激下易引起细胞激素的不正常分泌而导致慢性发炎，进而提高如中风、心肌梗塞、癌症、阿兹海默症、慢性风湿性关节炎、自体免疫疾病等文明病的发生。
以现代营养学的角度来说，许多中药材都具有抗氧化、抗衰老的潜在功效，例如在许多研究中都显示灵芝中三萜类及多醣体等特殊成份对于改善肝纤维化、改善过敏小鼠症状、增加小鼠学习记忆能力、抗肝癌、抗血癌等有显著的成效。其它如黄耆、人参、冬虫夏草、刺五加及何首乌等中药，亦有相关研究显示其具有免疫调节活性。但是中药材中的有效成份通常需要经过繁复的程序萃取，价格昂贵，而且伪劣中药材原料遍布市面，质量令人堪虑。
因此，本发明的目标即在寻找质量容易控管、制备方便又具有高免疫调节活性的保健食品或药品。
发明内容
本发明发现乌骨鸡血粉具有增加巨噬细胞活性及促进免疫细胞增殖的反应具有令人意外的提升效果。
因此，本发明一方面为提供一种乌骨鸡血粉用于调节免疫活性的用途，其中乌骨鸡血粉以包含下列步骤的方法制得：
(1)收集乌骨鸡血；
(2)将收集的乌骨鸡血予以干燥制成粉状而得。
本发明另一方面为提供乌骨鸡血粉用于促进细胞激素产生的用途。
本发明的再另一方面为提供乌骨鸡血粉用于提高脾脏免疫细胞增生能力的用途。
本发明的一个或多个具体实施例将会在下文做描述。本发明其它特征及优点也将可在以下实施例及权利要求中分别显见。
具体实施方式
本发明提供一种乌骨鸡血粉用于调节免疫活性的用途，其中乌骨鸡血粉以包含下列步骤的方法制得：
(1)收集乌骨鸡血；
(2)将收集的乌骨鸡血予以干燥制成粉状而得。
本发明中，乌骨鸡血的干燥方式可使用已知的任何可用于移除或降低水含量的技术，例如冷冻干燥或热风干燥。根据本发明，将乌骨鸡血粉中的水含量控制于约5％以下。根据本发明的一实施例，如使用热风干燥时，热风入风温度约100℃以上，出风温度约70℃～约150℃，所需时间约10秒以内，不需添加赋型剂。根据本发明的另一实施例，使用冷冻干燥直接将收集的乌骨鸡血制成粉末，冻干条件为约-10℃或以下，压力为约0.01torr，冷冻时间为约12小时以上。或可将乌骨鸡血于室温凝固后再进行冷冻干燥。本发明的一具体实施例中，以三阶段处理，包括第一阶段：鸡血处理-收集鸡血后，在约-10℃或以下直接进行冷冻，或先行凝固后再在约-10℃或以下进行冷冻以备后续处理；第二阶段：干燥制程-以约-20℃或以下，压力为约0.01torr或以下，处理约24小时以上冷冻干燥；或将乌骨鸡血加温至约70℃或以上，以流体进行热风干燥，热风入风温度约120℃以上，出风温度约85℃～110℃，所需时间约5秒以内，水含量控制于约5％以下；第三阶段：乌骨鸡血粉末处理-收集干燥后所得的粉末加以粉碎过筛。
本发明的乌骨鸡血粉较佳以口服给予，且可制备为任何口服形式的食品或药品。根据本发明，可将乌骨鸡血粉制备成胶囊形式，并保存于低温中。在一实例中，乌骨鸡血粉持续口服给予小鼠六周后，观察其体重及脾脏重量。结果显示给予乌骨鸡血粉的组别皆无显著性的改变，表示乌骨鸡血粉对于活体没有毒性。
本文所述的“免疫活性”指非特异性免疫，或可称为“先天性免疫”，因其不需辨认抗原即可广泛的杀死或排除大多数有害的细菌或病毒，可视为免疫系统的第一道防线，主要的方式包括：吞噬作用、补体中和、干扰素或发炎作用等。自然杀手细胞和巨噬细胞皆属于非特异性免疫系统的一部分，主要的功能即在于吞噬体内的异物，避免感染发生。因此，若能提升自然杀手细胞及巨噬细胞的活性，代表非特异性免疫的功能相对地亦被提升。
根据一实例，为测试本发明的乌骨鸡血粉是否具有提升非特异性免疫的功能，将乌骨鸡血粉以三种不同剂量模式口服投予小鼠连续六周后，搜集脾脏细胞后以YAC-1细胞株为标的细胞，依一定比例(6.25∶1、12.5∶1、25∶1)混合作用一段时间，测试自然杀手细胞毒杀标的细胞能力。结果显示，乌骨鸡血粉在较低的作用/标的细胞比例(E/T比例)下能杀死较多的标的细胞，表示自然杀手细胞的活性被显著性地提升。在另一实例中，搜集腹腔巨噬细胞悬浮液，观察其吞吃经FITC标定的大肠杆菌的比例(吞吃比例(％))。结果发现给予乌骨鸡血粉的组别的腹腔巨噬细胞具有较高的吞吃比例，显示腹腔巨噬细胞的活性亦被提升。综合上述实验结果，证实乌骨鸡血粉具有加强非特异性免疫的功效，能够提升免疫细胞吞吃外来物质的能力。
除了提升非特异性免疫力外，本发明意外地发现乌骨鸡血粉亦具有刺激细胞激素(cytokine)产生的功效，特别是TNF-α。
在一实例中，取自口服投予乌骨鸡血粉六周的小鼠的脾脏细胞，经定量后分别加入到24孔平底细胞培养盘中，再加入细胞裂殖素(Con A)及脂多醣(LPS)共同培养以刺激脾脏中的免疫细胞分泌细胞激素。针对培养液进行酶免疫吸附分析后发现细胞激素IL-2，IL-4及TNF-α的含量皆有增加，证实乌骨鸡血粉能刺激免疫细胞分泌细胞激素。
脾脏中包含有大量成熟或分化中的淋巴细胞，是人体重要的免疫器官，在受到外来细菌或病毒的感染时，脾脏中的淋巴细胞会大量增生以启动免疫反应。本发明的乌骨鸡血粉亦意外地发现其具有提高脾脏免疫细胞增生的功效，其中该脾脏免疫细胞包括T细胞及B细胞。在一实例中，取自口服投予乌骨鸡血粉六周的小鼠的脾脏细胞，经给予细胞裂殖素(ConA)及脂多醣(LPS)刺激并培养后，能明显地观察到脾脏细胞的数量有显著性地提升，证明本发明的乌骨鸡血粉能够增加脾脏免疫细胞的数量，活体的免疫力可因此提升。
本发明将由下列实施例做进一步的说明，但实际发明并不受限于该用于展示的实施例。
实施例1：乌骨鸡血粉制备
(1)乌骨鸡血处理
乌骨鸡为由凯馨实业股份有限公司自行繁殖并提供用于制备乌骨鸡血粉。乌骨鸡血的采血方式为将鸡只电击之后，割开颈部动脉后直接收集乌骨鸡颈动脉血。将收集的乌骨鸡血直接放入-20℃冷冻库中冷冻；或亦可放置于室温下，至自然凝固成血块后，放入-20℃冷冻库中备用。
(2)干燥制程
冷冻的乌骨鸡血接着以冷冻干燥方式制成粉末，冻干条件为-20℃，压力为0.01torr，产量100公斤的处理时间设定为72小时，水含量控制于约5％以下；或以热风干燥方式制成粉末，热风入风温度约120℃以上，出风温度约85℃～110℃，所需时间约5秒以内，水含量控制于约5％以下。
(2)乌骨鸡血粉末处理
收集干燥后所得的粉末加以粉碎并过筛。
以本实施例制备的乌骨鸡血粉使用于下述动物实验中。
实施例2：实验动物及试验设计
雄性BALB/c小鼠购自乐斯科生物科技股份有限公司，驯化、检疫1～2周，试验8周龄小鼠，每组实验动物只数为10只。本品系实验动物已有丰富的基础参考数据与数据，可适用于特异性免疫功能评估试验。
实验动物饲养于标准动物房中，室内温度21～25℃、湿度55～75％、照明时间12小时。实验动物驯化1～2周后经由实验人员判断确保实验动物健康状况良好后，称重后以S型分组。5只为1个饲育笼饲养，以耳号区分实验动物个体，贴上Cage卡标示笼号、品系、周龄、动物编号、试验编号、试验组别、入室日期及试验期间。
在驯化、检疫及试验期间每日进行临床症状观察并记录动物是否有其它临床症状或死亡。节假日亦照常进行临床症状观察，以确保实验动物健康状况。试验期间实验动物自由摄取饲料及饮水并于每周定时测量实验动物体重变化及更换饲料。
实验动物在试验开始后经胃管强迫投予试验物质连续6周，每周第一天测量体重并调整当周投予剂量。乌骨鸡血粉依照建议剂量1、4及20mg/kg投予，每次每只小鼠所投予最大口服总体积不超过10ml/kg。试验组别分别如下：
负对照组：灭菌水
正对照组：50mg/kg双鹤极品灵芝(购自双鹤企业股份有限公司)
低剂量组：1mg/kg乌骨鸡血粉
中剂量组：4mg/kg乌骨鸡血粉
高剂量组：20mg/kg乌骨鸡血粉
统计方法
本试验数据以实验结果的平均值(Mean)±标准差(Standard deviationS.D.)来表示。采用SPSS计算机统计软件包各试验组的数据先依单因子变异数分析(One-way analysis of variance，ANOVA)进行定，再以Duncantest比较各组间是否具差异性。若P值小于0.05则表示两试验组之间具有统计上显著差异。
实施例3：乌骨鸡血粉对于体重和脾脏重量的影响
在试验期间各试验组动物的临床观察及牺牲后肉眼病变无特定的眼观病变，且各组间的体重变化及牺牲后脾脏重量无显著差异(表1及表2)，显示乌骨鸡血粉对于活体没有毒性。
表1体重变化
0周：为试验第1天未投药前的小鼠体重
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
表2脾脏重量
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物只数 | 脾脏重量(g) | 脾脏重量改变率 |
| NC | 0 | 10 | 0.1539±0.0180 | 0.00％ |
| TAL | 1 | 10 | 0.1476±0.0142 | -4.09％ |
| TAM | 4 | 10 | 0.1478±0.0266 | -3.96％ |
| TAH | 20 | 10 | 0.1607±0.0206 | 4.42％ |
| PC | 50 | 10 | 0.1429±0.0226 | -7.15％ |
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
实施例4：乌骨鸡血粉促进免疫细胞增生的功效
在试验结束后以实验动物CO2麻醉，剪开腹部，收集脾脏称重，再将脾脏组织于培养皿中压碎，以20G注射针筒反复抽吸得到单一细胞悬浮液。
取自实验动物脾脏之单一细胞悬浮液，定量细胞数为2.0×105细胞/井，分别加入不同的细胞裂殖素，T cell使用5μg/ml细胞裂殖素(Concanavalin A，Con A)；B cell使用10μg/ml细胞裂殖素(Lipopolysaccharide，LPS)，在37℃二氧化碳培养箱作用44小时。在第44小时加入CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay，作用4小时后加入10％SDS，利用OD 490nm测定吸光值。
结果如表3所示，显示在ConA作用下，乌骨鸡血粉中剂量组及高剂量组与负对照组比较后有上升情形，经统计分析后亦有显著差异(p＜0.05)。在LPS作用下，各试验组之间在统计分析上无明显差异性。在目前已知的研究中ConA和LPS可促进诱导小鼠外周边血液和脾脏淋巴细胞的增生，而淋巴细胞数量与免疫功能成正比。因此，乌骨鸡粉应具有促进免疫细胞增生，进而提升免疫功能之功效，且其增加T细胞增生之能力较正对照组好。
表3脾脏免疫细胞增生能力
*表示与负对照组相较，在统计上有显著差异。
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
实施例5：乌骨鸡血粉具有提升自然杀手细胞活性的功效
取自实验动物的脾脏细胞(含自然杀手细胞)，以YAC-1细胞株为标的细胞，依一定比例(6.25∶1、12.5∶1、25∶1)混合作用一段时间，测试自然杀手细胞毒杀标的细胞的能力。YAC-1 cell先以PKH67绿荧光染色套组标定，再依照上述比例加入已定量之脾脏细胞后放入CO2培养箱，于37℃下培养4小时。接着加入50μl PI(Propidium iodide)染剂染色细胞核，并利用流式细胞仪进行分析。
结果如表4所示，E/T比例代表作用/标的细胞比例(Effecter/Targetratio)。在E/T比例为12.5比例下，各试验组与负对照组在统计上无显著差异；在E/T比例为25.0比例下，乌骨鸡血粉高剂量组与负对照具有显著差异(p＜0.05)；在E/T比例为50.0比例下，乌骨鸡血粉中剂量组与负对照具有显著差异(p＜0.05)，且其活化自然杀手细胞的能力较正对照组好。
表4自然杀手细胞活性
＊表示与负对照组相较，在统计上有显著差异(p＜0.05)。
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
实施例6：乌骨鸡血粉具有提升腹腔巨噬细胞活性的功效
巨噬细胞可以分别测定单核球(monocyte)或是中性白血球的吞噬能力，本发明利用吞噬大肠杆菌(E.coli)方法来加以测定。利用已完成荧光标记的E.coli，本试验使用吞吃分析套组(Phagocytosis analysis kit，购自晶研生化科技股份有限公司)在细胞吞噬后利用荧光流体计数仪来加以分析。详细的测定方法如下：将细胞悬浮液置于无菌管中冰浴，加入已标定的定量菌-FITC后，分别在37℃和0℃(空白组)置放30分钟。将细胞离心后，利用荧光流体计数仪以荧光强度计算细胞吞噬菌体之百分率，以比较细胞吞噬活性。吞吃比例(％)的计算为：
吞吃比例(％)＝含有荧光细胞数/总细胞数
结果如表5所示，乌骨鸡血粉的各剂量组之数据与负对照组比较后皆在统计上有显著差异(p＜0.05)，且其提升巨噬细胞吞吃能力的效果皆较正对照组高。在目前已知的研究中，提高巨噬细胞的吞噬能力可减少体内外来侵入物的量，因此可预期乌骨鸡血粉亦具有释放不同的细胞激素影响T-细胞的分化、影响淋巴细胞的活化、影响组织的再生与重整、抗菌、抗肿瘤等功能。
表5腹腔巨噬细胞活性
＊表示与负对照组相较，在统计上有显著差异(p＜0.05)。
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
实施例7：乌骨鸡血粉对于细胞激素分泌的影响
取自实验动物的脾脏细胞经定量后取5×105细胞/井分别加入到24孔平底细胞培养盘中，再加入5μg/ml细胞裂殖素(Con A)及10μg/ml脂多醣(LPS)，于CO2培养箱中培养48小时。收集胞裂激素检体，将每一个井中的细胞培养液取出，转入新的1.5ml微量离心管，于4℃中以250x g转速离心10分钟。取出上清液后，以酶免疫吸附分析(ELISA)细胞激素检测套组(购自eBioscience)测定免疫细胞激素分泌情形。
有关酶免疫吸附分析的步骤如下：将细胞激素抗体固着于96孔平底盘中，加入已知浓度的标准品及细胞培养液样品，于37℃反应1小时。再加入连结有生物素(biotin)的细胞激素抗体，于37℃反应1小时。再加入抗生物素蛋白-过氧化物酶(avidin-peroxidase)，于37℃反应1小时。加入受质呈色。最后，加入10％SDS溶液终止反应，测定OD 415nm的吸光值。
如表6所示，脾脏细胞经由细胞裂殖素(Con A及LPS)刺激后，细胞激素IL-2，IL-4及TNF-α皆有明显上升，其中乌骨鸡血粉高剂量组在脂多醣的刺激下，TNF-α生成量明显高于负对照组且具有统计差异(p＜0.05)。TNF-α为肿瘤坏死因子，由活化的巨噬细胞所分泌，可促进抗原的吞噬。因此，本实验证明乌骨鸡血粉具有提升免疫力的活性。
表6免疫细胞经刺激后分泌细胞激素的数据
＊表示与负对照组相较，在统计上有显著差异(p＜0.05)。
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
实施例8：乌骨鸡血粉对于血清抗体生成的影响
自实验动物的眼窝或是牺性采血所得的血液样本，经离心3600rpm10分钟后，取上层血清，以酶免疫吸附分析测定血清中各项抗体浓度。有关酶免疫吸附分析的步骤如下：将细胞激素抗体固着于96孔平底盘中，加入已知浓度的标准品及细胞培养液样品，于37℃反应1小时。再加入连结有生物素(biotin)的细胞激素抗体，于37℃反应1小时。再加入抗生物素蛋白-过氧化物酶(avidin-peroxidase)，于37℃反应1小时。加入受质呈色。最后，加入10％SDS溶液终止反应，测定OD 415nm的吸光值。
结果如表7所示，在试验期间(试验第0、3及6周)所分析的血清抗体生成值(IgM及IgG)各组实验物动之间并无明显差异及增加情形。
表7血浆抗体生成
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
实施例9：脾脏细胞及表面标记分析
将取自脾脏的单一细胞悬浮液，利用Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythin(PE)和PE-Cry5光染色单株抗体将脾脏细胞与含有FITC、PE及PE-Cry5光染色单株抗体(购自eBioscience)的磷酸缓冲溶液混合，避光染色30分钟后，将细胞离心，以磷酸缓冲溶液清洗，再加入1％三聚甲醛(paraformaldehyde)固定。淋巴细胞定量后，利用流式细胞仪计算细胞表面抗原的比例和数目。
结果如表8所示，各剂量组与负对照组在统计上无差异性。综合上述所有实验，显示乌骨鸡血粉具有促进细胞增生能力、自然杀手活性、吞噬细胞吞噬能力及细胞激素(TNF-α)生成的攻效，且不会影响血清抗体(IgM及IgG)生成及影响免疫细胞分类比例。
表8免疫细胞表面抗体生成
NC：负对照组
TAL：乌骨鸡血粉低剂量组
TAM：乌骨鸡血粉中剂量组
TAH：乌骨鸡血粉高剂量组
PC：双鹤极品灵芝胶囊
所属技术领域的技术人员将可在不背离本发明精神之下，根据实施例进行改变和修改。要注意的是，本发明并不受限于说明书中实施例所公开的范围，而涵盖于其它根据权利要求公开的所有变化的形式。
Claims (11)
1.一种乌骨鸡血粉用于制备调节免疫活性的食品或药物的用途：仅以乌骨鸡血粉为有效成份。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该乌骨鸡血粉以包含下列步骤的方法制得：
(1)收集乌骨鸡血；
(2)将收集的乌骨鸡血予以干燥制成粉状而得。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，该收集的乌骨鸡血先予以冷冻保存。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，该乌骨鸡血粉以冷冻干燥或热风干燥制得。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该乌骨鸡血粉以口服给予。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该调节免疫活性指调节非特异性免疫功能。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，该调节非特异性免疫功能包括提升自然杀伤细胞和吞噬细胞的活性。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其可促进产生细胞激素。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，该细胞激素系为IL-2、IL-4或TNF-α。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其可提高脾脏免疫细胞增生能力。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，该免疫细胞为B细胞和T细胞。
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