CN102361882A - 短寡核苷酸的聚合方法以及通过该聚合方法制备的高分子寡核苷酸的应用 - Google Patents

短寡核苷酸的聚合方法以及通过该聚合方法制备的高分子寡核苷酸的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高分子寡核苷酸的聚合方法以及通过所述聚合方法制备的高分子寡核苷酸的应用，该方法的特征在于增加生物体内的稳定性。根据本发明的寡核苷酸的聚合方法具有能够将低分子量的寡核苷酸容易地聚合成高分子寡核苷酸的优点。并且，根据本发明而制备的高分子寡核苷酸，通过与亲水性高分子物质或无机物结合而能够稳定地传递到生物体内，因此可以广泛地应用于多种疾病的治疗等中。

Description

短寡核苷酸的聚合方法以及通过该聚合方法制备的高分子寡核苷酸的应用
技术领域
本发明涉及一种制备高分子寡核苷酸的方法以及通过所述方法制备的高分子寡核苷酸的应用，该方法的特征在于通过使短寡核苷酸聚合而增加生物体内的稳定性。
背景技术
近年来，发现siRNA对于在动物细胞内抑制特异性基因的表达效果优越，因此siRNA作为基因治疗药剂，受到人们关注。由于这些物质具有较高的活性和对基因的精确的选择性，因此在过去20年中开展着研究，并且期待着能够代替目前作为治疗药剂而正在应用的反义寡核苷酸(ODN)，作为治疗药剂使用。鉴于此，目前有30家以上的制药公司和生物工程公司正在致力于基于寡核苷酸(siRNA)的治疗药剂的开发。尤其是，近年来为了治疗诸如糖尿病、肥胖症、风湿病(rheumatism)、帕金森症(Parkinson′s disease)、B型肝炎、C型肝炎、艾滋病、癌症等疾病，正在开发与寡核苷酸(siRNA)有关的治疗药剂。
使用siRNA等寡核苷酸概念的治疗药剂，是为了调控特异性基因的表达代谢过程，特异性地降解任意重要的mRNA，并阻断靶标基因的转录和蛋白质的合成，从而治疗疾病。然而，寡核苷酸的稳定性低，在生物体内，因大量存在于血浆中的多种降解酶，会非常迅速地被降解。尤其是，这种药剂作为注射治疗剂使用时，如果不经过化学处理而变成稳定的状态，则会更加迅速地被破坏。并且，siRNA等寡核苷酸所具有的阴离子特性造成难以容易地通过具有相同的负电荷的细胞膜，结果降低了细胞内的传递性，从而导致其治疗效率急剧降低的问题。不仅如此，在生物体内，可能会将siRNA等寡核苷酸识别成外来物质，因此会引起免疫系统的副作用，并且寡核苷酸会影响不是原来的计划的基因部位的其他部位的基因，由此可能会在基因序列上引起交叉杂交(cross-hybridization)。
鉴于此，目前的现状是，为了在疾病治疗中所使用的基于寡核苷酸(siRNA)的治疗药剂的稳定性，并且为了使副作用最小化，要求开发出能够提高药物在生物体内的稳定性且能够使药物的副作用最小化的纳米颗粒、胶囊、微囊(micelle)等药物输送载体。
发明内容
技术问题
本发明是为了解决上述问题而提出的，其目的在于提供一种能够应用于提高siRNA等寡核苷酸在生物体内的稳定性的同时能够使药物的副作用最小化的高分子寡核苷酸。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供通过使短寡核苷酸彼此聚合而制备的高分子寡核苷酸。
并且，本发明提供在如上制得的高分子寡核苷酸上结合亲水性高分子物质或者无机物以进一步提高稳定性的高分子寡核苷酸的输送载体。
有益效果
根据本发明的高分子寡核苷酸与以前所使用的低分子量寡核苷酸相比，稳定性得到提高，因此可以在生物体内停留长时间长，可稳定地抑制靶标疾病基因的表达，从而可以有效地应用于多种疾病的治疗中。
附图说明
图1为利用两端基团为巯基(-SH基)的寡核苷酸(siRNA)的二硫键而结合的高分子量的寡核苷酸(siRNA)的制备模式图。
图2为通过电泳实验表示实施例1中两端基团为巯基(-SH基)的寡核苷酸(siRNA)发生化学聚合之前和之后的分子量变化的电泳图。
图3为通过电泳实验表示实施例1中通过聚合而得到的寡核苷酸(Poly-siRNA)按照二氯二苯二氯乙烷(Dichlorodiphenyltrichloroethane，DTT)的浓度降解成低分子的结果的电泳图。
图4为示出利用通过聚合而得到的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA)与带正电荷的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI(Mw 25K，1.8K))制备高分子寡核苷酸输送载体(纳米颗粒)的方法的图。
图5为表示对通过将实施例1中聚合而得到的寡核苷酸(Poly-siRNA)与聚乙烯亚胺(PEI，25K)相结合而制备的纳米颗粒和寡核苷酸进行电泳而得到的荧光图像的图。
图6为表示对通过将实施例2中聚合而得到的寡核苷酸(Poly-siRNA)与聚乙烯亚胺(PEI，1.8K)相结合而制备的纳米颗粒和寡核苷酸进行电泳而得到的荧光图像的图。
图7为根据实施例5中制备的寡核苷酸(Poly-siRNA)-聚乙烯亚胺(PEI，25K)纳米颗粒的浓度表示细胞内实验结果的图。
图8为根据实施例5中制备的寡核苷酸(Poly-siRNA)-聚乙烯亚胺(PEI，1.8K)纳米颗粒的浓度表示细胞实验结果的图。
具体实施方式
本发明的特征在于提供通过使低分子寡核苷酸之间发生聚合而制备的高分子寡核苷酸。
并且本发明的特征在于，在所述制备的高分子聚寡核苷酸上结合亲水性的高分子物质或者无机物，由此提供纳米颗粒形态的输送载体。
以下，详细说明本发明。
在本说明书中，“低分子寡核苷酸”或者“短寡核苷酸”是指，分子量在1bp以上且小于100bp(5个以下单体(monomer))的寡核苷酸，并且寡核苷酸包括在生物学研究以及医学上的疾病治疗上所应用的siRNA、DNA、RNA、反义核苷酸(antisense nucleotides)。
并且，“高分子寡核苷酸”是指分子量大的寡核苷酸，在本发明中可以是分子量为100bp以上且小于40000bp(5至2000个单体)的寡核苷酸。
所述高分子寡核苷酸可以通过使低分子寡核苷酸物理或者化学地彼此结合而制备。物理结合可以从氢键、电位结合、电荷结合、范德华力结合、疏水性键、亲水性键中选择，而化学结合可以是从二硫键(disulfide bonds)、二胺键(diamine bonds)、磺-胺键(sulfide-amine bonds)、羧-胺键(carboxyl-aminebonds)、酯键(ester bonds)以及共价键中选择的。通过这种物理结合或者化学结合，可以将低分子量的寡核苷酸制备成多种分子量的高分子寡核苷酸。优选地，可以采用化学结合的方式制备高分子寡核苷酸。通过二硫键等的化学结合，使短寡核苷酸聚合时，与采用物理结合的情形相比，不仅能够制备出多种分子量的高分子siRNA，而且能够得到阴离子特性的提高和结构稳定性，并且在生物体内更加稳定，因此是好的。
作为一种例子，寡核苷酸可以优选地为siRNA，更优选地为由15至30个核苷酸构成的siRNA。siRNA可以在生物体内抑制特异性基因的表达，因此在基因治疗上有用。另外，为了提高在生物体内的稳定性，可以将所述低分子siRNA寡核苷酸制备成高分子寡核苷酸。可以将两端基团为巯基(-SH基)的低分子siRNA通过化学交联以二硫键相结合，由此制备成高分子siRNA寡核苷酸(参考图1)。
并且，“高分子寡核苷酸输送载体”是指，将高分子寡核苷酸输送到生物体内的物质，是通过使低分子siRNA、DNA、RNA、反义核苷酸等寡核苷酸聚合而制得的高分子量的寡核苷酸上结合亲水性高分子物质或者无机物而制备的。在本发明中所制备的高分子量的寡核苷酸带有多个负(-)电荷，因此可以与带有正电荷的亲水性高分子或者无机物结合。在本发明的寡核苷酸中，尤其对于siRNA来说，与作为基因治疗药物所使用的高分子量的寡核苷酸(DNA)不同，其分子量小，呈低负电位，因此即使与呈正电位的高分子也是相对弱的结合，从而在细胞吸收过程中以及在生物体内容易被破坏，或者还可能引起副作用。因此，如果通过与呈正电位的亲水性高分子结合而形成纳米颗粒型复合体，则可以增加生物体内的稳定性，因此是优选的。或者，如果与氧化铁(Iron Oxide)、金(gold)等生物相容性无机物结合，则可以进一步增加分子量，能够使药物长时间停留在生物体内，因此是有用的(参考实施例2、图2)。
对于可以与所述siRNA寡核苷酸结合的亲水性高分子物质来说，只要具有生物相容性，则可以不受限制地使用，尤其可以使用病灶组织积聚效率较高的高分子物质。原因是，只有生物相容性和生物降解性优越，生物体内的稳定性才会优越，并且能够增加血液内的生物体浓度，从而可以在充分的时间内不断地积聚在癌变组织等病灶细胞或组织。作为可能的例子，包括：葡聚糖(dextran)、壳聚糖(chitosan)、乙二醇壳聚糖(glycol chitosan)、多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)、聚天冬氨酸(poly-aspartic acid)等生物体高分子物质；聚乙烯亚胺(Polyethylene imine，PEI)、聚(N-(2-羟丙基))甲基丙烯酰胺(poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamide)、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物(poly(divinyl ether-co-maleic anhydride))、苯乙烯-马来酸酐共聚物(poly(styrene-co-maleic anhydride))、聚乙二醇(poly(ethylene glycol))等合成高分子物质。
在所述高分子物质中，由于聚乙烯亚胺(PEI，Mw(重均分子量)为25K、1.8K)的高分子链上包含有多的正电子，因此适合与带负电荷的siRNA等寡核苷酸结合。本发明中所使用的聚乙烯亚胺的平均分子量可以在102至105a范围。
siRNA等寡核苷酸与聚乙烯亚胺(PEI)等高分子之间的结合可以是物理结合或者化学结合。其中优选根据电位结合的物理结合。所述方法与最大纳入量限制为10％左右的化学结合方法相比，最大纳入量达到95％而优越，因此可以克服通过化学结合的局限性，从而可以大幅增加药物含量。
如上所述，由siRNA等高分子寡核苷酸与亲水性高分子物质相结合的复合体在生物体内的稳定性高，可以抑制多种疾病(例如，癌症)或者病灶细胞的特异性基因的表达，因此可以有效地应用于疾病的预防和/或治疗。所述复合体是具有两亲性的纳米颗粒形态的物质，其大小可以在10至2000nm范围，参考图4，优选为10至800nm。
在本发明中的siRNA可以采用所有类型的siRNA，可以列举，能够治疗诸如肺部疾病(呼吸道合胞病毒(RSV)感染、流行性感冒(Flu)、非典型性肺炎(SARS)、流行性感冒(Influenza))、眼部疾病(老年性黄斑变性(AMD))、神经系统疾病(抑郁症(Depression)、老年痴呆症(Alzheimer)、亨廷顿病(Huntington disease)、脊髓小脑性共济失调(Spin ocerebellar ataxia)、肌肉萎缩性侧面硬化病(ALS)、神经病理性疼痛(Neuropathic pain)、脑炎(Encephalitis))、癌症(胶质母细胞瘤(Glioblastoma)、人类乳头瘤病毒(Human pailloma virus)感染、前列腺(Prostate)癌、腺癌(Adenocarcinoma))、消化系统疾病(肠易激疾病(Irritable bowel disease))、肝脏疾病(乙型肝炎病毒(HBV)感染、高胆固醇血症(Hypercholesterolemia))、关节疾病(类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis))、生殖系统疾病(单纯疱疹病毒(HSV))等疾病的siRNA。在输送载体中所包含的高分子寡核苷酸siRNA相对于输送载体的总重量可以包含1至99重量份。
另外，根据本发明制备方法而通过聚合制得的高分子寡核苷酸还可以作为用于治疗特定疾病的药理学上的组合物的有效成分而使用。因此，本发明提供包含有效剂量的高分子量寡核苷酸的药理学上的组合物。
为了实施给药，本发明的药理学上的组合物除了根据本发明而制得的高分子寡核苷酸输送载体之外，还可以进一步包含药理学上允许的1种以上的载体。
药理学上允许的载体应当要与本发明的有效成分可以配伍，可以将在食盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲食盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇以及这些成分中的一种以上成分混合而使用，并根据需要可以添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等其他常用的添加剂。并且，可以进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂以及润滑剂，制备成诸如水溶剂、悬浮剂、乳剂等注射剂型药剂。
并且，可以制成粉剂、片剂、胶囊剂、液剂、注射剂、软膏剂、糖浆剂等多种剂型，并且还可以使用单次剂量容器或者多剂量容器来提供，例如该容器可以使用密封安瓿以及瓶等。
本发明的药理学上的组合物可以采用口服给药或者肠外给药。但是，根据本发明的药理学上的组合物的给药途径不限于此，例如，可以采用口服、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、硬膜内、心内，经皮、皮下、腹腔、肠内、舌下以及局部给药。如此，为了在临床上实施给药，本发明的药理学上的组合物可以利用公知技术而制备成合适的剂型。例如，当采用口服给药时，可以混合惰性稀释剂或可食用载体，或者密封在硬质或软质的明胶胶囊中，或者压制成片剂，以此实施给药。作为口服给药的剂型，可以采用活性化合物与赋形剂混合的口服型片剂、口含片剂、片剂(troche)、胶囊剂、酏剂(elixirs)、悬浮剂、糖浆剂、封胶片(wafer)等剂型。并且，注射用剂型、肠外给药用剂型等各种剂型可以根据本技术领域的公知方法或者常用方法来制备。
对于本发明的组合物的给药量来说，根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率以及疾病的严重程度等，有多种范围，并且本技术领域的普通技术人员可以容易地决定。
本发明的实施方式
以下，通过实施例来详细说明本发明。
但是，以下实施例仅是用来举例说明本发明的，而本发明的内容并不限定于以下实施例。
实施例1：高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))的制备
将2mg的Dithiol(二巯基)-siRNA(RFP(Red Fluorescent Protein，红色荧光蛋白))溶于200μL的10mM HEPES缓冲液(1mM EDTA，pH 8.0)，在常温下，搅拌12小时，制备通过二硫键相结合的分子量在160～2000bp范围内的多种高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))(参考图1)。
实施例2：利用电泳检测的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))与高分子寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))的分子量比较
在溶于HEPES缓冲液(pH 8.0)的500ng/1μl的分子量为21bp的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))和高分子寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))中，混合1μL的上样缓冲液(loading buffer)和8μL的DEPC水，然后与分子量标准(Marker)(100bp梯度)一同，分别加样(loading)到8％丙烯酰胺凝胶(acrylamide gel)上，然后在150V条件下，进行电泳35分钟。此后，用SYBR-gold染色剂染色后，得到荧光图像。与分子量标准比较，可以确认，制备出分子量为160～2000bp的多种分子量的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))(参考图2)。
实施例3：基于电泳检测的按照二氯二苯二氯乙烷(DT)的浓度降解为低分子的结果确认
在溶于HEPES缓冲液(pH 8.0)的10μg/10μl的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))中，分别混合200倍-1倍摩尔过量的二氯二苯二氯乙烷(DT)(25μg/10μl-0μg/10μl)，在37℃下，放置90分钟，然后采用与实施例2相同的方法，实施电泳检测，得到荧光图像。如图3所示，可以确认，根据可降解二硫键的二氯二苯二氯乙烷(DT)，高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))降解成寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))(参考图3)。即，可以确认，所述高分子寡核苷酸是通过二硫键而结合的。
实施例4：高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K，1.8K)纳米颗粒的制造
在溶于HEPES缓冲液(pH 8.0)的20μg/10μl的分子量为21bp的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))和分子量在160～2000bp范围内的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))中，分别混合200μg/10μl的10倍至0倍(0倍时作为对照组使用)重量过量的Mw 25K的聚乙烯亚胺(PEI)以及0μg/10μl的10倍至0倍(0倍时作为对照组使用)重量过量的Mw 1.8K的聚乙烯亚胺。常温下，放置30分钟。将所述制备模式图示出在图4中。
实施例5：基于电泳检测的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K)纳米颗粒的稳定性实验
对在实施例4中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K)纳米颗粒或者高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K)纳米颗粒，采用与实施例2相同的方法，进行电泳检测，确认荧光图像。确认，通过混合PEI(25K)5倍重量过量的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))与PEI(25K)，形成相比寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))更稳定的复合体(参考图5)。
实施例6：基于电泳检测的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 1.8K)纳米颗粒的稳定性实验
对在实施例4中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw 1.8K)纳米颗粒和高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 1.8K)纳米颗粒，采用与实施例2相同的方法，进行电泳检测，然后通过纳米荧光图像进行确认(参考图6)。确认，当混合PEI(Mw 1.8K)2.5倍重量过量的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))与PEI(Mw 1.8K)时，形成相比寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))更稳定的复合体(参考图6)。
实施例7：基于细胞实验的将高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K)纳米颗粒作为寡核苷酸(siRNA)输送载体的效果评价
在寡核苷酸(siRNA(RFP))浓度为50nM、25nM的在实施例4和5中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K)(5∶1重量比)纳米颗粒或者高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K)(5∶1重量比)纳米颗粒、对照组(空白对照，Mono-siRNA(RFP)，Poly-siRNA(RFP))中，加入可表达RFP(红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein))的RFP-B16/F10(1.2×105/皿)细胞，经过24小时后，获得抑制RFP表达效果的图像。
图7为将高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 25K)纳米颗粒与对照组对比而示出细胞内寡核苷酸(siRNA(RFP))输送、发挥功能(抑制RFP表达)的图像。从图7中可以得知，高分子寡核苷酸纳米颗粒的细胞内浓度更高。
实施例8：基于细胞实验的将高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 1.8K)纳米颗粒作为寡核苷酸(siRNA)输送载体的效果评价
在寡核苷酸(siRNA(RFP))浓度为400nM、200nM、100nM的在实施例4和5中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw 1.8K)(2.5∶1重量比)纳米颗粒或者高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)(2.5∶1重量比)纳米颗粒、对照组(空白对照，Mono-siRNA(RFP)，Poly-siRNA(RFP))中，加入可表达RFP的RFP-B16/F10(1.2×105/皿)细胞，经过24小时后，获得抑制RFP表达效果的图像。
图8为将高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw 1.8K)纳米颗粒与对照组对比而示出细胞内寡核苷酸(siRNA(RFP))输送、发挥功能(抑制RFP表达)的图像。

Claims (13)

1.一种制备高分子寡核苷酸的方法，该高分子寡核苷酸的分子量在100bp以上且小于40000bp，并且由5至2000个单体构成，其特征在于，通过物理结合或者化学结合而使分子量在1bp以上且小于100bp的低分子寡核苷酸结合，由此增加生物体内的稳定性。
2.如权利要求1所述的制备高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述寡核苷酸从由DAN、RNA、siRNA以及反义核苷酸组成的组中选择。
3.如权利要求1所述的制备高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述低分子寡核苷酸是由15至30个核苷酸构成的siRNA。
4.如权利要求3所述的制备高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述siRNA是以下组中选择的，
肺部疾病：呼吸道合胞病毒感染、流行性感冒、非典型性肺炎、流行性感冒；
眼部疾病：老年性黄斑变性；
神经系统疾病：抑郁症、老年痴呆症、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、肌肉萎缩性侧面硬化病、神经病理性疼痛、脑炎；
癌症：胶质母细胞、人类乳头瘤病毒感染、前列腺癌、腺癌；
消化系统疾病：肠易激疾病；
肝脏疾病：乙型肝炎病毒感染、高胆固醇血症；
关节疾病：类风湿关节炎；
生殖系统疾病：单纯疱疹病毒。
5.如权利要求1所述的制备高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述物理结合从氢键、电位结合、电荷结合、范德华力结合、疏水性键以及亲水性键中选择。
6.如权利要求1所述的制备高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述化学结合是从二硫键、二胺键、硫-胺键、羧-胺键、酯键以及共价键中选择的。
7.一种高分子寡核苷酸的输送载体，其特征在于，该输送载体是在根据权利要求1至6中任意一项所述的方法制备的高分子寡核苷酸上结合从以下组中选择的一种以上的高分子物质而得到的，
生物体高分子物质：葡聚糖、壳聚糖、乙二醇壳聚糖、多聚-L-赖氨酸、聚天冬氨酸；
合成高分子物质：聚乙烯亚胺、聚(N-(2-羟丙基))甲基丙烯酰胺、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙二醇。
8.一种高分子寡核苷酸的输送载体，其特征在于，该输送载体是在根据权利要求1至6中任意一项所述的方法制备的高分子寡核苷酸上结合从氧化铁、金中选择的生物相容性无机物而得到的。
9.如权利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的输送载体，其特征在于，所述高分子寡核苷酸的输送载体是具有两亲性的纳米颗粒形态的载体。
10.如权利要求9所述的高分子寡核苷酸的输送载体，其特征在于，具有所述两亲性的高分子纳米颗粒的大小为10至800nm。
11.如权利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的输送载体，其特征在于，所述高分子寡核苷酸的输送载体的大小为10至2000nm。
12.如权利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的输送载体，其特征在于，高分子寡核苷酸相对于100重量份的高分子寡核苷酸的输送载体，包含1至99重量份。
13.如权利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的输送载体，其特征在于，所述高分子寡核苷酸的输送载体在水中形成球形的自聚集体。
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