CN102349911A - 优体必及其衍生物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优体必及其衍生物的新用途，优体必及其衍生物在制备利尿药物中的应用。运用红细胞尿素通道抑制剂筛选模型，通过高通量筛选系统从小分子化合物库中筛选出具有抑制尿素通道UT-B活性的线索化合物。从线索化合物540个衍生物中筛选出具有最佳量效关系的候选化合物“优体必”，优体必及其部分衍生物具有较强的抑制尿素通道UT-B和UT-A1通透尿素活性的效能，其在体外对尿素通道UT-B和UT-A1抑制的半数有效剂量均在微摩尔水平，且在有效剂量范围内无明显的细胞毒性；优体必对UT-B通透尿素活性的抑制作用具有可逆性。优体必及其衍生物有望成为不引起机体电解质紊乱、具有降低血压作用、可长期使用的特效利尿药。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，主要涉及优体必及其衍生物的新用途。
背景技术
利尿剂的应用和研发热点
利尿药（Diuretics）作用于肾脏，通过增加电解质和水的排出发挥利尿作用。临床上主要用于治疗心衰、肾衰、肾病综合症等原因引起的水肿，也可用于某些非水肿性疾病，如高血压、肾结石、高钙血症等的治疗，尤其是在高血压病的治疗中发挥举足轻重的作用。
根据药物的作用部位和机制，目前常用利尿药主要分为：袢利尿药（高效能利尿药）、噻嗪类利尿药（中效能利尿药）、保钾利尿药（低效能利尿药）、碳酸酐酶抑制药、渗透性利尿药(参看图1)。高效能利尿药和中效能利尿药分别通过特异性的抑制髓袢升支Na+/K+/2Cl-共同转运子和远曲小管Na+/Cl-共同转运子，抑制NaCl的重吸收，降低肾的尿浓缩功能达到利尿的效果，但长期使用可造成低血钾，低血钠、低血镁等电解质紊乱。低效能利尿药通过拮抗醛固酮，排钠保钾发挥利尿作用，但易引起高血钾。碳酸酐酶抑制药通过抑制HCO3-的重吸收发挥利尿作用，但因尿中HCO3-、K+、水的排出增多，可引起代谢性酸中毒、低血钾等不良反应。渗透性利尿药是唯一不引起电解质紊乱的利尿药，主要有甘露醇和尿素，其在通过肾脏时增加水的排出发挥利尿作用。由于目前常用的渗透性利尿药通过提高血浆渗透压、增加血容量发挥脱水的作用，可快速造成短暂的血压升高。因此，寻找和开发靶向性作用于肾脏的渗透性利尿药具有重要的意义。
．尿素通道可作为新型利尿药作用的靶点
尿素是尿液中含量最丰富的溶质，在肾脏各部分尿素通道（urea transporter，UT）的介导下，形成从肾皮质至肾髓质的渗透压梯度，带动水和部分溶质的重吸收而发挥浓缩尿液的作用。尿素通道是特异性介导尿素通透的膜通道蛋白，包含UT-A（UT-A1至UT-A6）和UT-B两个亚家族，该家族共有5个成员在肾脏的不同部位表达，UT-A1、UT-A3 和UT-A4（UT-A4 仅在大鼠表达）在肾脏集合管上皮细胞表达，UT-A2 在肾脏髓袢降支细段表达；UT-B 表达于肾脏直小血管降支内皮细胞，这些蛋白介导相应部位的尿素通透性，在尿浓缩机制中发挥重要作用。
外源性补充尿素，可发挥渗透性利尿作用，如果内源性阻断尿素通道蛋白的功能，降低肾脏尿浓缩能力，是否可以达到渗透性利尿的目的？尿素通道基因敲除小鼠的肾脏生理学研究结果给出了答案。UT-B基因敲除小鼠的生长发育、肾脏重量、肾小球滤过率以及尿中尿素以外其他主要溶质（Na+、K+、Cl-）的清除率均无异常改变，但其尿浓缩能力发生了明显改变：尿量增加、尿渗透压降低、尿与血中尿素浓度比值仅为野生型小鼠的50%。 UT-Al／UT-A3基因缺失小鼠尿量比野生型小鼠高3倍，尿浓缩能力下降到野生型小鼠尿浓缩能力的35％。由此可见，尿素通道蛋白可作为新型利尿剂作用的靶点，通过选择性敲除UT-B或UT-A1/UT-A3降低尿浓缩能力，在不引起电解质紊乱的情况下发挥尿素选择性利尿作用。进一步研究发现， UT-B敲除小鼠的收缩压（systolic）、舒张压(diastolic)和平均血压(mean)均明显低于野生型小鼠。由此可见，尿素通道蛋白抑制剂不仅具有渗透性利尿的作用，还通过减少血容量起到降压的效果，并且避免了机体电解质紊乱的不良反应，适合高血压等慢性病人长期使用，为新型利尿药的研发提供了新的方向。
以UT-B为靶点尿素通道抑制剂筛选模型的建立
根据红细胞膜高水平表达水通道蛋白AQP1（特异性通透水的膜蛋白）和尿素通道蛋白UT-B的特性，Verkman等建立了尿素通道抑制剂的筛选模型。红细胞在1.25M乙酰胺(尿素类似物)生理溶液中孵育一段时间后，快速放到等渗生理盐水中，红细胞内外高渗透压差促使膜上AQP1快速转运水至细胞内， UT-B快速转运乙酰胺出细胞，使红细胞内外渗透压迅速达到平衡，细胞体积变化不明显。如果尿素通道被阻断，红细胞内外渗透压差促使AQP1快速转运水进入细胞，红细胞体积迅速增大以致破裂后释放出血红蛋白，通过酶标仪检测红细胞悬液的710nm 吸光度值计算红细胞溶解率，可作为化合物对尿素通道蛋白UT-B 活性抑制作用的评价指标，也是尿素通道抑制剂筛选模型的理论基础。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种优体必及其衍生物的新用途。
（1）以优体必及其衍生物为活性成分，发挥渗透性利尿、降低血压作用的药物。
（2）优体必及其衍生物在制备渗透性利尿剂、降压药中的应用。
（3）以优体必及其衍生物为活性成分作为研究尿素通道蛋白功能和作用机制的工具药。
（4）优体必及其衍生物在制备研究尿素通道蛋白功能和作用机制的工具药中的应用。
上述药物制备包含固体、半固体、液体和气体等类，即常规的片剂、丸剂、胶囊剂、注射液、口服液等剂型均可。
化合物名：优体必
优体必化学名：
中文：3-(3-磺酰胺基-4-甲基)苯基-8-(N-对甲氧基苯基)氨基苯并[d]哒嗪
英文：3-(3-sulfoamido-4-methyl)phenyl-8-(N-p-methoxyphenyl)aminobenzo(d)pyridazine
优体必化学结构：
优体必及衍生物化学结构和合成路线：
本发明应用的优体必通过化学合成制得，运用红细胞尿素通道抑制剂筛选模型，通过高通量筛选系统从小分子化合物库中筛选出具有抑制尿素通道UT-B活性的线索化合物。从线索化合物540个衍生物中筛选出具有最佳量效关系的候选化合物“优体必”，优体必及其部分衍生物具有较强的抑制尿素通道UT-B（如图2，3所示）和UT-A1（如图4所示）通透尿素活性的效能，其在体外对尿素通道UT-B和UT-A1抑制的半数有效剂量均在微摩尔水平，且在有效剂量范围内无明显的细胞毒性（如图5所示）；优体必对UT-B通透尿素活性的抑制作用具有可逆性（如图6所示）。目前，国内外尚未见优体必化学特性和渗透性利尿、降血压作用的相关报道。优体必及其衍生物有望成为不引起机体电解质紊乱、具有降低血压作用、可长期使用的特效利尿药。
附图说明
图1为利尿药作用靶点图；
图2为优体必对尿素通道抑制活性图；
图3为优体必对人和小鼠红细胞膜UT-B通透尿素抑制作用的剂量效应关系图；
图4为优体必对MDCK细胞膜UT-A1尿素通透性的抑制作用的剂量效应关系图；
图5为优体必的细胞毒性作用图；
图6为优体必对尿素通道蛋白UT-B 抑制作用具有可逆性的示意图。
具体实施方式
．红细胞尿素通道抑制剂筛选模型的实验步骤
1） 取血后立即混悬于含有肝素钠PBS的15 ml刻度离心管中，离心，3000 r/min，10 min, 弃上清；
2 ）加入等量的PBS混悬洗涤红细胞，离心，3000 r/min，10 min，弃上清；
3 ）用含1.25M乙酰胺的高渗PBS稀释红细胞至2%的细胞悬液；
4 ）红细胞悬液置于室温孵育2 h使细胞内外乙酰胺浓度平衡，定时用移液器进行混合；
5 ）取99 μl 上述红细胞悬液置于96孔圆底微孔板各孔中，然后加入1 μl待测化合物，混匀，室温孵育6 min（待测化合物终浓度为20 μM，DMSO终浓度为1%）；
6 ）另取96孔平底黑壁微孔板，每孔加入180 μl 等渗PBS(含1% DMSO)；
7 ）取上述红细胞悬液20 μl，迅速加入96孔板中，快速混匀；
8 ）5 min内用酶标仪测吸光度值，波长710 nm；
9 ）每块微孔板均设阳性对照孔（非特异性UT - B抑制剂phloretin）、阴性对照孔（PBS）。
按以下公式计算红细胞溶解率：
红细胞的溶解率百分比计算公式，其中Atest是测试孔的吸光度值，Aneg是阴性对照孔的吸光度值，Apos是阳性对照孔的吸光度值。通过测吸收波长710计算红细胞裂解率, 吸光度值稳定，至少一小时吸光度值无变化。
．红细胞高通量筛选模型筛选条件的优化
采用不同浓度的乙酰胺（0-3.0 M）孵育红细胞后测710 nm的吸光度值，绘制出量效曲线。结果显示，乙酰胺浓度约为1.1-1.25 M时，阳性对照组（phloretin）与溶剂对照组的吸光度值差值最大，因此选择1.1-1.25 M的乙酰胺进行后续实验。
．发现尿素通道抑制剂线索化合物的方法
为增加发现尿素通道线索化合物的机会，申请人首先根据UT-B蛋白分子结构，以计算机化学模拟方法对Asinex公司小分子化合物库目录进行计算机模拟筛选，购买2413个化合物后溶于DMSO，在96孔微孔板中稀释成1mM浓度应用液作为筛选化合物库。
取人、小鼠两个种属的红细胞，通过红细胞尿素通道抑制剂筛选模型对上述筛选化合物库进行尿素通道抑制剂的初步筛选，筛选化合物浓度为10μM，重复筛选一次，两轮共得到具有对不同种属UT-B选择性抑制活性的线索化合物8个（结果见表1）。
| 红细胞来源 | 初筛（hits） | 复筛（hits） |
| 人 | 15 | 5 |
| C57小鼠 | 11 | 3 |
表1. 小分子筛选化合物库2413个化合物初筛和复筛的结果
4．最佳线索化合物的确定
以筛选获得的线索化合物结构的母核为基础，在Asinex公司产品目录中搜寻获得540个化学结构类似物，建立二次筛选小分子库，应用红细胞尿素通道抑制剂筛选模型筛选获得剂量效应实验结果（结果见表2）。经分析比较，选择对两个种属、尤其是人红细胞膜尿素通道均有较好抑制作用的化合物B04作为候选化合物，命名为优体必（表2中黄色标示的内容)。
表2. 二次筛选小分子库的筛选结果
5. 优体必特异性抑制尿素通道
为进一步确定优体必抑制尿素通道UT-B的活性和剂量效应，我们采用停流（Stopped flow)实验检测不同浓度优体必对人和小鼠红细胞膜UT-B尿素通透性的抑制作用，具体结果如图3所示。经过优体必孵育的红细胞对尿素的通透性受到明显抑制，优体必对人和小鼠红细胞膜UT-B对尿素的通透性具有明显的剂量效应关系(如图3中A,B所示)，其中优体必对人红细胞膜通透性的抑制作用较小鼠红细胞膜更为敏感，效果更强，优体必对人和小鼠红细胞膜通透性抑制作用的半数有效剂量分别为0.03μM和1.5μM (如图3中C所示)。
除此以外，我们还采用停流（Stopped flow)实验检测不同浓度优体必对外源性表达UT-A1的MDCK细胞膜UT-A1尿素通透性的抑制作用，其半数有效剂量约为0.22μM（如图4所示）。
．优体必无明显细胞毒性
我们采用MTT法检测上述化合物对MDCK细胞的毒性（如图5所示）。OD490数值显示，低于10微摩浓度的化合物优体必对细胞没有细胞毒性，在大于10微摩浓度时具有一定的细胞毒作用。
．优体必可逆性抑制尿素通道
先以5μM 剂量优体必孵育人红细胞5min后，在1小时内用PBS洗红细胞3次，每次5分钟后测量结果，结果表明PBS可洗去优体必并消除其对红细胞膜UT-B 尿素通透活性的抑制作用（如图6所示），提示优体必对UT-B通透尿素活性的抑制作用具有可逆性。
Claims (4)
1.以优体必及其衍生物为活性成分，发挥渗透性利尿、降低血压作用的药物。
2.优体必及其衍生物在制备渗透性利尿剂 、降压药中的应用。
3.以优体必及其衍生物为活性成分作为研究尿素通道蛋白功能和作用机制的工具药。
4.优体必及其衍生物在制备研究尿素通道蛋白功能和作用机制的工具药中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN102702109A (zh) * | 2012-06-15 | 2012-10-03 | 华东理工大学 | 苯磺酰胺类化合物及其用途 |
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2011
- 2011-08-08 CN CN201110225261XA patent/CN102349911A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MARC H. LEVIN ET AL,: "Urearetics: a small molecule screen yields nanomolar potency inhibitors of urea transporter UT-B", 《FASEB J》 * |
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| CN102702109B (zh) * | 2012-06-15 | 2014-07-23 | 华东理工大学 | 苯磺酰胺类化合物及其用途 |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20120215 |