CN104434914B - 1-[2-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]喹啉基)]乙酮在制备血管扩张剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种1‑[2‑(3‑氨基‑6‑甲基噻吩并[2,3‑b]喹啉基)]乙酮的药物新用途。本发明所提供的上述化合物(PU‑14)的新用途是其在制备血管扩张剂药物中的应用。本发明采用小鼠和大鼠离体胸主动脉和肠系膜动脉模型发现PU‑14具有直接舒张血管的作用，该作用与乙酰胆碱类似，具有内皮依赖性和NO依赖性；该作用可以被NOS抑制剂L‑NAME和环氧酶抑制剂吲哚美辛部分阻断。同时，体内和体外研究结果均证实UT‑B基因缺失或功能缺失可以通过调节L‑Arg‑NOS‑NO和L‑Arg‑arginase‑urea系统之间的相互作用发挥舒张血管作用。

Description

1-[2-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]喹啉基)]乙酮在制备血 管扩张剂中的应用
技术领域
本发明涉及1-[2-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]喹啉基)]乙酮在制备血管扩张剂中的应用。
背景技术
一、尿素通道蛋白抑制剂PU-14(优替)的一般特性
尿素通道蛋白抑制剂PU-14的结构式如式I所示：
其中文名称为：1-[2-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]喹啉基)]乙酮。
该化合物是发明人所属课题组前期通过对小分子化合物库筛选得到的一种高效低毒的小分子化合物，该研究成果已经申报国家专利，专利号为ZL201210232643.X。前期研究结果证明该小分子化合物对尿素通道蛋白UT-B具有明显的选择性阻断作用。该阻断作用在多种属动物红细胞体外模型上得到证实，包括人、家兔、大鼠、小鼠。其中代表化合物PU-14(优替)，在人、家兔、大鼠、小鼠红细胞体外模型上证实PU-14阻断UT-B的IC50分别是1.72、1.79、3.51and 5.19μM。同时，大鼠体内长期给药结果发现：200mg/kg/d PU-14皮下注射一周给药具有明显的利尿作用，而且无阳性对照药氢氯噻嗪导致的血中电解质紊乱和脂代谢和糖代谢异常的现象[1]。该研究结果得到了肾脏领域的著名专家，美国NIH的MarkA.Knepper教授的高度评价，他在同一期上撰写了评论文章，认为PU-14有极大的成药可能性。
二、研发新型血管扩张剂的科学意义
随着中国社会经济的发展，人们生活水平的提高和人口老龄化的加剧，高血压病、糖尿病等慢性非传染性疾病的发病率持续上升并成为主要致死原因。最近一次的大规模高血压病流行病学调查结果显示：中国已有高血压病患者1.6亿，发病率占总人口的18.8％。而且心血管疾病也一直是全球范围内造成死亡的最主要原因，因此，研发新型心血管疾病治疗药物是当前迫切需要[2-3]。
血管扩张剂是中国和世界卫生组织推荐的一线抗高血压药物，包括血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)；血管紧张素受体阻断剂(ARB)和钙通道拮抗剂。同时，一些血管扩张剂也可以用于心绞痛、心肌梗死和心功能不全的治疗。因此，研发新型的血管扩张剂具有重要的科学意义和临床意义。
参考文献：
1.Fei Li,Tianluo Lei,Juanjuan Zhu,Weiling Wang,Yi Sun,Jihui Chen,Zixun Dong,Hong Zhou and Baoxue Yang.A novel small-molecule thienoquinolinurea transporter inhibitor acts as a potential diuretic.Kidney Int 2013；83:1076-1086.
2.Naderi SH,Bestwick JP,Wald DS.Adherence to drugs that preventcardiovascular disease:meta-analysis on 376,162patients.Am J Med 2012；125:882-7.e1.
3.Michel Burnier,Gregoire Wuerzner,Harry Struijker-Boudier,and JohnUrquhart.Measuring,Analyzing,and Managing Drug Adherence in ResistantHypertension.Hypertension 2013；62:218-225.
发明内容
本发明的目的是提供尿素通道蛋白抑制剂PU-14的药物新用途。
本发明所提供的PU-14的药物新用途是其在制备血管扩张剂中的应用。
进一步的PU-14还可用于制备预防和/或治疗心血管的药物。
PU-14的结构式如式I所示：
以PU-14为活性成分制备的血管扩张剂以及预防和/或治疗心血管的药物也均属于本发明的保护范围。
所述药物可通过注射、口服、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述血管扩张剂的药物的用量一般为：20-100mg/人/天(注射)或25-100mg/人/天(口服)。
本发明通过UT-B基因敲除小鼠确定UT-B与血管张力调节的关系；以尿素通道蛋白UT-B阻断剂PU-14为工具药，研究其对大鼠胸主动脉血管张力的影响；同时，以L-Arg-NOS-NO和L-Arg-arginase-urea系统信号分子为靶标，系统研究其舒张血管的机制。实验结果表明：在离体胸主动脉的血管张力实验中，乙酰胆碱(ACh)引起的血管舒张作用，UT-B(-/-)小鼠明显优于UT-B(+/+)小鼠；尿素通道蛋白阻断剂PU-14具有乙酰胆碱(ACh)样的内皮依赖性血管舒张作用，该作用具有一定的量效关系；去掉血管内皮细胞时，该血管舒张作用消失；该舒张作用可以被NOS抑制剂L-NAME和环氧酶抑制剂吲哚美辛部分阻断；PU-14长期给药无引起电解质失衡和代谢异常的不良反应；研究结果提示尿素通道蛋白UT-B基因或功能缺失可以通过调节L-Arg-NOS-NO和L-Arg-arginase-urea系统之间的相互作用发挥舒张血管作用。
附图说明
图1为UT-B在血管内皮细胞的表达。
图2为ACh对UT-B基因敲除小鼠离体胸主动脉舒张作用的影响。
图3为PU-14对小鼠离体胸主动脉和肠系膜动脉血管张力的影响。
图4为PU-14对大鼠离体胸主动脉血管张力的影响。
图5为UT-B基因敲除对小鼠离体胸主动脉NOS、COX和精氨酸酶表达水平的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所使用的化合物PU-14按照ZL201210232643.X中实施例1的方法制备得到。
下述实施例中所使用的K-H液的组成如下：NaCl：8g/L，NaHCO3：0.35g/L，Na2HPO4·12H2O：0.126g/L，KCl：0.4g/L，KH2PO4：0.06g/L，MgSO4：0.098g/L，CaCl2：0.14g/L，葡萄糖：1g/L。
实施例1、PU-14扩张血管的药效学试验
1.UT-B在血管内皮细胞的表达
分离8周龄雄性UT-B(-/-)和UT-B(+/+)小鼠胸主动脉，冰冻切片，用免疫组化方法标记UT-B。图1中结果表明UT-B主要表达在血管内皮细胞膜上。
牛主动脉内皮细胞种于96孔板，100％融合时，4％多聚甲醛固定，进行免疫荧光染色。图1结果表明UT-B表达于牛主动脉内皮细胞膜上。
2.Ach对UT-B基因敲除小鼠离体胸主动脉舒张作用的影响
实验动物分组：雄性野生型小鼠UT-B(+/+)和UT-B敲除小鼠UT-B(-/-)，8周龄，每组10只。
方法：采用离体小鼠胸主动脉环张力测定方法。观察ACh对2组小鼠保留内皮的血管环的血管张力的影响。迅速打开胸腔，分离并取出整段胸主动脉，放入盛有预冷并通入混合气体(95％O2+5％CO2)的K-H液的培养皿中。将血管内的残余血冲洗干净，将血管剪成宽约3毫米的血管环。用两个不锈钢钩将血管环置于浴槽内，一端固定于充气的浴槽底部，另一端与传感器相连，控制通气速度为每秒1～2个气泡。血管环取静息张力2g，平衡约1.5h后，给PE(苯肾上腺素)刺激，待反应达到平衡时，冲洗，平衡后分别观察Ach引起的反应。结果如图2所示，与UT-B(+/+)小鼠相比，10μM ACh引起UT-B(-/-)小鼠胸主动脉明显舒张(含内皮)，p＜0.05,n＝20。图2右纵坐标为：ACh引起的最大舒张值与PE引起的最大收缩值之比的百分率。
3.PU-14对C57小鼠离体胸主动脉和肠系膜动脉血管张力的影响
实验动物分组：雄性C57小鼠，8周龄，每组10只。
方法：采用离体小鼠主动脉环张力测定方法。观察PU-14对小鼠保留内皮或去内皮的血管环的血管张力的影响。小鼠麻醉后断头处死，迅速打开胸腔，分离并取出整段胸主动脉，放入盛有预冷并通入混合气体(95％O2+5％CO2)的K-H液的培养皿中。将血管内的残余血冲洗干净，将血管剪成宽约3毫米的血管环。用两个不锈钢钩将血管环置于浴槽内，一端固定于充气的浴槽底部，另一端与传感器相连，控制通气速度为每秒1～2个气泡。对照组的血管环不做任何处理，平衡1小时，给予苯肾上腺素(10-6mol/l)，当血管收缩达平台时，依次给予不同浓度的PU-14(从低到高，依次为0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30μM)，第一个浓度达平台时再给予下一个浓度。去内皮组的血管环用灌胃针反复摩擦血管内壁以去除血管内皮，平衡1小时，给予苯肾上腺素(10-6mol/L)，收缩达平台后，再给予乙酰胆碱(10-5mol/L)，若舒张程度小于10％，则认为内皮去除彻底；再平衡1小时，给予苯肾上腺素，余下处理同对照组。L-NAME组的血管环不做处理，平衡1小时后，给予L-NAME(10-4mol/l)孵育30分钟，换新的平衡液洗去L-NAME，给予苯肾上腺素，余下操作同对照组。
在上述迅速打开胸腔的同时，还迅速打开腹腔，找到近幽门10cm内的带系膜的肠管，延肠系膜血管走行方向扇形剪断，放入盛有预冷并通入混合气体(95％O2+5％CO2)的K-H液的培养皿中，在解剖显微镜下小心分离肠系膜血管2级动脉分支，剪取2-3mm无分支的血管环。其余操作同胸主动脉。
结果如图3所示，PU-14可以引起C57小鼠的胸主动脉和肠系膜动脉舒张，呈剂量依赖性。内皮缺失，PU-14的舒血管作用消失。L-NAME(Nω-Nitro-L-arginine methylesterhydrochloride，Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐)可阻断PU-14的作用。
4.PU-14对大鼠离体胸主动脉血管张力的影响
实验动物分组：雄性Wistar-Kyoto大鼠，8周龄，每组10只。
方法：采用离体大鼠胸主动脉环张力测定方法。观察PU-14对保留内皮或去内皮的血管环的血管张力的影响。迅速打开胸腔，分离并取出整段胸主动脉，放入盛有预冷并通入混合气体(95％O2+5％CO2)的K-H液的培养皿中。将血管内的残余血冲洗干净，将血管剪成宽约3毫米的血管环。用两个不锈钢钩将血管环置于浴槽内，一端固定于充气的浴槽底部，另一端与传感器相连，控制通气速度为每秒1～2个气泡。观察它们对PU-14的影响。对照组的血管环不做任何处理，平衡1小时，给予苯肾上腺素(10-6mol/l)，当血管收缩达平台，分别给予不同浓度的PU-14(4,10,25μM)，观察不同浓度的PU-14舒张血管的程度。去内皮组的血管环用灌胃针反复摩擦血管内壁以去除血管内皮，平衡1小时，给予苯肾上腺素(10-6mol/L)，收缩达平台后，再给予乙酰胆碱(10-5mol/L)，若舒张程度小于10％，则认为内皮去除彻底；再平衡1小时，给予笨肾上腺素，余下处理同对照组。阿托品组的血管环不做处理，平衡1小时后，给予阿托品(10-5mol/l)孵育30分钟，换新的平衡液洗去阿托品，给予苯肾上腺素，余下操作同对照组。L-NAME组的血管环不做处理，平衡1小时后，给予L-NAME(10-4mol/l)孵育30分钟，换新的平衡液洗去L-NAME，给予苯肾上腺素，余下操作同对照组。吲哚美锌组的血管环不做处理，平衡1小时后，给予吲哚美锌(10-6mol/l)孵育30分钟，换新的平衡液洗去吲哚美锌，给予苯肾上腺素，余下操作同对照组。L-NAME和吲哚美锌组的血管环不做处理，平衡1小时后，给予L-NAME(10-4mol/l)和吲哚美锌(10-6mol/l)孵育30分钟，换新的平衡液洗去L-NAME和吲哚美锌，给予苯肾上腺素，余下操作同对照组。
结果如图4所示，4μM、10μM和25μM的PU-14可以引起血管舒张反应，而且具有一定的剂量依赖性。阿托品对PU-14引起的血管舒张反应无影响，L-NAME和吲哚美辛可以部分阻断PU-14的血管舒张作用，其中L-NAME的阻断作用更明显，提示PU-14可以通过释放NO发挥舒张血管作用。图4上纵坐标代表血管张力，单位是g。图4下纵坐标为：PU-14引起的最大舒张值与PE引起的最大收缩值之比的百分率。
由上述3、4的结果可知，PU-14可扩张胸主动脉血管和肠系膜动脉血管。进而表明PU-14可用于扩张动脉血管。
5.UT-B基因敲除对小鼠离体胸主动脉NOS、COX和精氨酸酶表达水平的影响
采用Western blot方法检测小鼠胸主动脉中NOS、COX和精氨酸酶的表达水平。结果如图5所示，UT-B基因敲除可以引起eNOS(内皮型一氧化氮合成酶)、p-eNOS(磷酸化一氧化氮合酶)、COX-1和COX-2表达水平升高，精氨酸酶I表达水平下降。该结果提示UT-B基因敲除可以通过eNOS、p-eNOS表达水平上调增加血管内皮细胞中NO的合成发挥舒张血管和降压作用。由于血管内皮细胞中尿素的堆积反馈抑制精氨酸酶的表达水平，间接上调eNOS的表达水平。UT-B基因敲除也导致COX上调，但是原因尚不清楚6.PU-14长期给药对大鼠血中电解质和代谢指标的影响
实验动物分组：雄性SD大鼠18只，8周龄，每组6只，分为对照组、PU-14给药组和阳性药物氢氯噻嗪给药组。
给药方式为皮下注射给药，每日给药4次，连续给药一周。对照组给予溶剂40％β-环糊精，剂量为2.5ml/kg；PU-14给药剂量为200mg/kg/d；氢氯噻嗪7.2mg/kg/d。每天收集尿液。一周后取血，送至临床检验科检测各项生化指标。具体指标见表1。由表1可知，给药一周后，PU-14组血清中电解质Na+、K+、Cl-的水平都没有变化，血脂也没有变化；但是，阳性药物氢氯噻嗪血清中Na+、K+、Cl-及血脂与对照组相比都明显增高，说明PU-14不同于传统的利尿药，不引起电解质和代谢紊乱。
表1PU-14长期给药对大鼠血中电解质和代谢指标的影响
对照组 PU-14给药组 氢氯噻嗪给药组
血清Na+(mmol/L) 142.0±1.5 141.6±0.2 139.0±0.6##
血清K+(mmol/L) 5.5±0.3 4.9±0.4 4.4±0.2*
血清Cl-(mmol/L) 96.3±0.3 95.2±0.2 93.0±0.01**##
总胆固醇(mmol/L) 1.38±0.04 1.32±0.03 1.71±0.1*##
甘油三酯(mmol/L) 0.44±0.03 0.53±0.07 0.58±0.04*
高密度脂蛋白(mmol/L) 0.39±0.01 0.38±0.01 0.45±0.06
低密度脂蛋白(mmol/L) 0.47±0.01 0.43±0.03 0.56±0.02*#
*：与对照组相比，p<0.05，**：与对照组相比，p<0.01，#：与PU-14组相比，p<0.05，##：
与PU-14组相比，p<0.01。

Claims (1)

1.式I所示的化合物在制备血管扩张剂中的应用；
式I。
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