CN109420158A - Metrnl抗血栓用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Metrnl的一种新用途，属于医药技术领域，即Metrnl在抗血栓中应用。本发明首次运用Metrnl全敲小鼠和Metrnl重组蛋白，通过小鼠断尾出血实验、小鼠动静脉旁路血栓实验、小鼠FeCl3肠系膜动脉损伤实验、血小板聚集实验、凝块收缩实验，发现Metrnl可用于抗血栓，Metrnl抑制可用于止血。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是Metrnl的抗血栓用途。
背景技术
Metrnl又称Subfatin、Cometin、Interleukin39，是近年来利用限食模型找到的一个新的脂肪因子，其在皮下脂肪组织、肠道上皮组织等部位高表达，与Meteorin是同源蛋白，但表达分布与功能却大不相同。目前，关于Metrnl蛋白功能的研究较少，有限的研究表明，Metrnl在胰岛素敏感性、神经突生长、白色脂肪棕色化、软骨细胞分化等方面具有功能活性。
国际公布号WO2010009732A1，中国公布号CN102164611A公开了METRNL在神经系统的疾病中的应用。中国专利文献CN103536903A公开了Metrnl蛋白在降血脂中的应用。中国专利文献CN103536904A公开了Metrnl蛋白在降血糖中的应用。中国专利文献CN104808004A公开了METRNL蛋白在诊断结肠癌中的应用。但是，关于Metrnl的抗血栓用途目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Metrnl的一种新用途。
本发明的第二个目的是，提供Metrnl抑制剂的一种新用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：Metrnl蛋白在制备抗血栓的药物中的应用。
Metrnl蛋白在制备抗血栓的保健食品中的应用。
所述的药物由有效剂量的活性成分Metrnl蛋白和药学上可接受的载体组成。
所述的药物上调Metrnl蛋白的表达。
所述的药物减少血栓生成。
Metrnl蛋白在制备抑制血小板聚集的药物中的应用。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：Metrnl抑制剂在制备止血的药物中的应用。
Metrnl抑制剂为Metrnl抗体。
本发明优点在于：
1、本发明首次通过动物实验发现，Metrnl可用于抗血栓。
2、本发明通过小鼠断尾出血实验发现，Metrnl全敲小鼠出血断断续续，出血量低于野生对照组小鼠。本发明通过小鼠动静脉旁路血栓实验发现，Metrnl全敲小鼠的湿血栓重、干血栓重都大于野生对照组小鼠。本发明通过小鼠FeCl3肠系膜动脉损伤实验发现，Metrnl全敲小鼠形成血栓并堵住血管伤口处血流所需的时间少于野生对照组小鼠。本发明通过血小板聚集实验发现，Metrnl全敲小鼠的血小板在ADP、Collagen、Thrombin三种激动剂作用下的聚集反应分别大于其野生对照组小鼠，Metrnl重组蛋白对C57小鼠的血小板聚集反应有明显抑制作用。本发明通过凝块收缩实验发现，Metrnl全敲小鼠的血小板凝块收缩速度快于其野生对照小鼠，Metrnl重组蛋白对C57小鼠血小板凝块收缩速度有明显抑制作用。
附图说明
附图1：Metrnl全敲小鼠培育流程图。
附图2：Metrnl全敲小鼠基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
附图3：Metrnl全敲小鼠(KO)及其野生型对照小鼠(WT)血清中Metrnl水平。
附图4：小鼠断尾出血情况。
附图5：小鼠出血量。＊P<0.05vs.WT。
附图6：小鼠血栓重。A图表示湿血栓重，B图表示干血栓重。＊P<0.05vs.WT。
附图7：小鼠血栓形成并堵住血管伤口处血流所需时间。＊P<0.05vs.WT。
附图8：小鼠血栓形成并堵住血管伤口处血流的代表图。图中黑色管道代表血管，管道内亮白色为聚集成团的荧光标记的血小板。图中KO、WT小鼠的血管直径分别为114μm、107μm，其血栓堵住血管血流所需时间分别为660S、810S。“Baseline”代表FeCl3损伤前的血管形态，“2min”、“5min”、“8min”、“10min”代表FeCl3损伤血管后第2min、5min、8min、10min时的血管形态，“Final”代表血栓完全堵住血管血流时的形态。
附图9：Metrnl全敲小鼠(KO)与野生对照组小鼠(WT)的血小板聚集实验。ADP、Collagen、Thrombin加至血小板悬液后终浓度分别为2μM、0.5μg/mL、0.05U/mL。
附图10：Metrnl重组蛋白对C57小鼠血小板聚集反应的影响。ADP、Collagen加至血小板悬液后终浓度分别为5μM、1μg/mL。
附图11：凝块收缩实验。A图所示为Metrnl全敲小鼠(KO)与野生对照组小鼠(WT)凝块收缩实验。B图为加入Metrnl重组蛋白(Metrnl)与对照溶剂(Vehicle)后，C57小鼠血小板凝块收缩实验。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：Metrnl全敲小鼠的构建方法及鉴定结果
1.Metrnl全敲小鼠的构建培育流程
Metrnl全身性敲除小鼠(简称为Metrnl-/-，或者KO)采用Cre-LoxP基因敲除系统(Diabetes 2015；64:4011-4022)，再根据图1流程进行交配繁殖。其中MetrnlloxP/loxP来自本单位，Ella-Cre小鼠购自上海南方模式生物科技发展有限公司，C57小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
2.Metrnl全敲小鼠的基因型鉴定
需鉴定Ella-Cre基因和Metrnl基因。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定，Ella-Cre基因阳性出现100bp条带；Metrnl敲除序列扩增产物为289bp，Metrnl野生序列扩增产物为150bp。如图2所示，Metrnl+/-；Ella-Cre小鼠出现100bp、150bp和289bp三条带(泳道1)；Metrnl+/-出现150bp和289bp两条带(泳道2)；Metrnl-/-全敲小鼠出现289bp一条带(泳道4)；野生对照小鼠出现150bp一条带(泳道3)。
3.Metrnl全敲小鼠的血液Metrnl水平鉴定
(1)血样处理
将小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉，先从胸骨柄下方打开腹腔，然后小心剪开膈肌打开胸腔，暴露心脏及下方血管，用1mL注射器从腔静脉缓慢抽取血液，转移至1.5mL EP管中，室温静置2h，离心(3000g×20min，4℃)，取上清存于-80℃。
(2)ELISA测定
采用ELISA方法测定小鼠血清中Metrnl水平，试剂盒购自R&D Systems公司。按照试剂盒提供的说明进行操作。
(3)结果
如图3所示，Metrnl全敲小鼠(KO)的血液Metrnl检测不到。
实施例2：Metrnl抗血栓实验方法和结果
1.小鼠断尾出血实验
本实验反映小鼠在出现相对大的血管破损时其控制流血的能力。
(1)出血时长记录
将小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(80mg/kg)进行麻醉，麻倒后第10min开始实验。将小鼠放至37℃加热垫上，用尺子自小鼠尾尖起量2mm并做标记，自标记处剪下尾尖，立即将小鼠尾巴浸入10mL 37℃生理盐水中，观察出血现象，记录出血情况。以剪尾开始计为“0”时刻，计时直至出血停止。出血停止3min视为出血停止。
(2)出血量计算
将上述搜集有动物鼠尾血液的生理盐水轻轻晃匀，冻存于-80℃。为制作血样标准曲线，取1只C57小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉，下腔静脉取血，快速吸取0、10、20、40、80、160、320μL血液分别加至10mL生理盐水中，立即轻轻晃匀，冻存于-80℃。次日将所有血样放至室温融化，晃匀，每管取1mL血样加至9mL红细胞裂解液中混匀，室温静置1h，取200μL上清加入96孔板于405nm波长测双复孔吸光度，并以C57小鼠的血量和吸光度值绘制标准曲线。
(3)结果
如图4所示，野生型小鼠(WT)断尾后皆为连续出血；而Metrnl全敲小鼠(KO)中有6例出血断断续续。如图5所示，Metrnl全敲小鼠(KO)的出血量明显小于野生对照组小鼠(WT)。
2.小鼠动静脉旁路血栓实验
小鼠动静脉旁路血栓实验利用手术线作为血栓形成表面，将手术线放置于动静脉之间，观察一定时间内血栓形成大小。
(1)装置制作
按照“PE-10管+PE-50管+一次性静脉输液针针管+8cm一次性静脉输液针软管+一次性静脉输液针针管+PE-50管+PE-10管”的顺序将各配件连接起来。其中PE-10管和PE-50管通过电烙铁融在一起，之后将PE-10管剪成1cm长，PE-50管仅用于连接一次性静脉输液针针管。另外，连接8cm一次性静脉输液针软管之前，先剪6cm长的手术缝合线并称其净重，再将手术线牵直放入软管中，然后连接软管和其他部件。装置制作完毕后将装置中充满12.5U/mL的肝素钠溶液。
(2)血栓称重
将小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉，固定四肢，分离左侧颈外静脉和右侧颈总动脉，先行颈外静脉插管，然后行颈总动脉插管，以右侧颈总动脉血流至左侧颈外静脉起开始计时，第20min时结扎右侧颈总动脉，接下来快速结扎左侧颈外静脉，取下装置，拉出软管内附有血栓的手术线，一起称湿重。之后将附有湿血栓的手术线放入70℃烘箱内烘6个小时，一起称干重。湿血栓重＝湿血栓及手术线总重-手术线净重。干血栓重＝干血栓及手术线总重-手术线净重。
(3)结果
如图6所示，Metrnl全敲小鼠(KO)的湿血栓重、干血栓重都大于野生对照组小鼠(WT)。
3.小鼠FeCl3肠系膜动脉损伤实验
本实验是通过FeCl3溶液对肠系膜动脉壁造成化学损伤，利用荧光标记的血小板活体动态观察血管损伤处血栓形成情况，直至血栓完全阻断该处血流。
(1)血小板悬液制备
将小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉，用1mL注射器吸好约100μL的2％枸橼酸钠溶液，并润湿注射器内壁。小鼠麻倒后固定其四肢，沿腹正中线将其腹部打开(避免伤到血管)，小心拨开内脏，暴露出腹主动脉，用1mL注射器针头刺进腹主动脉取血(约取到1mL)，取血完毕后立即轻柔混匀血液和枸橼酸钠溶液，并转移至15mL离心管。离心(300g×2min，室温)。吸取血小板层至新15mL离心管；继续往装有剩余血细胞的15mL离心管中加300μL生理盐水，轻柔混匀，再次离心(300g×1min，室温)，吸取血小板层。两次血小板层溶液混在一起，离心(500g×3min，室温)，弃上层透明PPP(Poor Platelet Plasma)溶液，往离心管中加入适量37℃TB(Tyrode’sBuffer)溶液(含0.04U/mL Aprase)，小心吹打重悬血小板，于37℃孵育15min后用于实验。
(2)荧光标记的血小板制备
往血小板悬液中加入钙黄绿素荧光染料(终浓度为0.016μg/mL)，包上锡箔纸于37℃避光孵育30min。离心(510g×3min，室温)，弃上清，加入500μL 37℃TB溶液(含0.04U/mLAprase)，轻轻重悬血小板，避光。
(3)手术操作
将小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(100mg/kg)进行麻醉，麻倒后固定四肢，股静脉注射来自同种基因型小鼠的200μL血小板悬液至小鼠体内。沿腹正中线自胸骨柄下方起往腹部方向剪开长约1cm的切口(避免伤到血管)，将小鼠左侧卧，放入内置载玻片的培养皿(直径10cm)中，使载玻片高度与小鼠腹部开口齐平，小心牵拉出一段小鼠的小肠(避免出血)在载玻片上平整摊开。
(4)利用FeCl3制造肠系膜动脉损伤
在显微镜下选择合适视野的肠系膜动脉，全程电脑控制拍照。先观察1min，然后取一片浸润有10％FeCl3溶液的滤纸(1cm×2cm)，放至该肠系膜动脉上，持续1min诱导动脉损伤，拿走滤纸，显微镜下观察血栓形成情况。
(5)结果
如图7、图8所示，被FeCl3溶液损伤肠系膜动脉壁后，Metrnl全敲小鼠(KO)形成血栓并堵住血管伤口处血流所需的时间少于野生对照组小鼠(WT)。
4.血小板聚集实验
血小板聚集实验是用于观察血小板对不同激动剂反应性的经典方法。
4.1Metrnl全敲小鼠(KO)与野生对照组小鼠(WT)血小板聚集实验
(1)血小板悬液制备
同前述“3.小鼠FeCl3肠系膜动脉损伤实验，(1)”。
(2)血小板聚集
将血小板聚集仪事先预热，安装画笔，并将走纸速度调为1cm/min。往对照玻璃管中加300μLTB溶液；往样品玻璃管中加300μL血小板重悬液。启动画笔工作，先归零，直至线条稳定后，向样品管中加入适当浓度的激动剂，观察画笔走向，直至再次稳定。
(3)结果
如图9所示，Metrnl全敲小鼠(KO)的血小板在ADP、Collagen、Thrombin三种激动剂作用下的聚集反应分别大于其野生对照组小鼠(WT)。实验重复3次。
4.2Metrnl重组蛋白(Metrnl)与对照溶剂(Vehicle)对C57小鼠血小板聚集反应的影响
(1)血小板悬液制备
同前述“3.小鼠FeCl3肠系膜动脉损伤实验，(1)”。
(2)药物孵育
向血小板悬液中加入Metrnl重组蛋白溶液或等体积对照溶剂，混匀后继续孵育15min时间后用于实验。Metrnl重组蛋白购自R&D Systems公司，加至血小板悬液后终浓度为167ng/mL。
(3)血小板聚集
同前述“4.1Metrnl全敲小鼠(KO)与野生对照组小鼠(WT)血小板聚集实验，(2)”
(4)结果
如图10所示，Metrnl重组蛋白对C57小鼠的血小板聚集反应有明显抑制作用。实验重复3次。
5.凝块收缩实验
体外凝块收缩(Clot retraction)实验是评估血小板功能的实验。Clotretraction由血小板“outside-in”信号通路(经由血小板整联蛋白αⅡbβ3)介导，可使纤维蛋白块(fibrin clot)收缩进而导致血块变得更小更坚固，为形成不可逆血小板血栓所必需。
5.1Metrnl全敲小鼠(KO)与野生对照组小鼠(WT)凝块收缩实验
(1)血小板悬液制备
同前述“3.小鼠FeCl3肠系膜动脉损伤实验，(1)”。
(2)凝块收缩实验
往血小板悬液(250μL)中依次加入5μL自体PPP溶液、2.5μL 0.1mM CaCl2溶液、1μL100U/mL thrombin，轻柔混匀，转移至透明玻璃管中，静置观察悬液收缩情况，实时拍照。
(3)结果
如图11-A所示，Metrnl全敲小鼠(KO)的血小板凝块收缩速度快于其野生对照小鼠(WT)。实验重复3次。
5.2Metrnl重组蛋白(Metrnl)与对照溶剂(Vehicle)对C57小鼠血小板凝块收缩实验的影响
(1)血小板悬液制备
同前述“3.小鼠FeCl3肠系膜动脉损伤实验，(1)”。
(2)药物孵育
向血小板悬液(250μL)中加入Metrnl重组蛋白溶液或等体积对照溶剂，混匀后继续孵育15min时间后用于实验。Metrnl重组蛋白加至血小板悬液后终浓度为1.923μg/mL。
(3)凝块收缩实验
同前述“5.1Metrnl全敲小鼠(KO)与野生对照组小鼠(WT)凝块收缩实验，(2)”
(4)结果
如图11-B所示，Metrnl重组蛋白对C57小鼠血小板凝块收缩速度有明显抑制作用。实验重复3次。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.Metrnl蛋白在制备抗血栓的药物中的应用。
2.Metrnl蛋白在制备抗血栓的保健食品中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物由有效剂量的活性成分Metrnl蛋白和药学上可接受的载体组成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物上调Metrnl蛋白的表达。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物减少血栓生成。
6.Metrnl蛋白在制备抑制血小板聚集的药物中的应用。
7.Metrnl抑制剂在制备止血的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，Metrnl抑制剂为Metrnl抗体。
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|---|---|---|---|
| CN201710778140.5A CN109420158A (zh) | 2017-09-01 | 2017-09-01 | Metrnl抗血栓用途 |
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| CN109420158A true CN109420158A (zh) | 2019-03-05 |
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| CN (1) | CN109420158A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022109141A1 (en) * | 2020-11-19 | 2022-05-27 | The Johns Hopkins University | Immuno-oncology targets to improve t-cell metabolic response |
Citations (2)
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| WO2015062167A1 (zh) * | 2013-10-29 | 2015-05-07 | 中国人民解放军第二军医大学 | Metrnl蛋白在制备降血脂降血糖药物中的应用 |
| CN107088223A (zh) * | 2016-02-17 | 2017-08-25 | 中国人民解放军第二军医大学 | Metrnl蛋白或基因在治疗内皮功能受损中的应用 |
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2017
- 2017-09-01 CN CN201710778140.5A patent/CN109420158A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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| WO2015062167A1 (zh) * | 2013-10-29 | 2015-05-07 | 中国人民解放军第二军医大学 | Metrnl蛋白在制备降血脂降血糖药物中的应用 |
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| 郭玲玲等: "Metrnl在肥胖小鼠模型中的表达", 《解剖学杂志》 * |
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