CN102335440A

CN102335440A - 两种含不同CpG序列PCV2-ORF2基因疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102335440A
Application number: CN2011103012149A
Authority: CN
Inventors: 李俊; 王金宝; 时建立; 吴家强; 程凯慧; 徐绍建; 丛晓燕
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2011-10-09
Filing date: 2011-10-09
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2031-10-09
Also published as: CN102335440B

Abstract

本发明为两种含有14个CpG-ODN重复基序及18个CpG-ODN重复基序和表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核酸疫苗。本发明是为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)基因免疫的效果，构建含14个及18个CpG基序和PCV2-ORF2的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF2。经酶切鉴定和序列测定，将重组质粒转染PK-15细胞，经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF2可表达PCV2Cap蛋白。该核酸疫苗中插入了具有免疫增强作用的CpG-ODN重复基序，可增强核酸疫苗的免疫效果，该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生Cap蛋白，使机体不断产生抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PCV2的防控中具有广阔的应用前景。

Description

两种含不同CpG序列PCV2-ORF2基因疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因疫苗使用的佐剂和其制备方法，具体是两种含有14个CpG-ODN重复基序及18个CpG-ODN重复基序的PCV2ORF2基因核酸疫苗。

技术背景

基因疫苗(gene vaccine)是近年来随着基因治疗而发展起来的第三代疫苗。它是将编码某一特定保护性抗原蛋白的外源基因与真核表达载体进行重组后，直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达出抗原蛋白质引起机体的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与常规疫苗相比，基因疫苗具有如下优点：免疫效果好；不散毒，无污染；保护性免疫持续时间长；方法简便、价格低廉；核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能；便于贮藏和运输；不受个体已有的免疫反应(如母源抗体)的影响。

猪圆环病毒是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型：PCV-1与PCV-2。PCV-2含有两个主要阅读框ORF1和OFR2。其中ORF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。

在核酸疫苗的免疫应答过程中，高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫水平，增强抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG-ODN(CpG寡聚脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序列已被证实能作为疫苗的高效免疫增强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。近来大量免疫学研究证实：含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果：(1)诱导B细胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素(IFN-γ)分泌。但CpG-ODN具有种属特异性，本发明中的CpG-ODN都是经过实验证实对猪具有免疫增强作用的序列。

附图说明

图1：PCV2的ORF2基因的PCR扩增产物，其中条带1为DNA标准DL 2000，条带2、3、4、7、9为阳性PCR产物(ORF2)，条带5、6、8为阴性PCR产物。

图2：重组质粒pVAX1-ORF2的PCR鉴定，其中条带1为DNA标准DL 2000，条带2-5为从pVAX1-ORF2上PCR扩增出的ORF2片段，条带6为阳性对照(从PCV2病毒DNA上扩增出的ORF2片段)。

图3：免疫荧光检测结果，其中图A为pVAX1-ORF2-CpG(14CpG)转染组间接免疫荧光检测结果(100x放大)，图B为pVAX1-ORF2转染组间接免疫荧光检测结果(100x放大)，图C为pVAX1空载体转染组间接免疫荧光检测结果(100倍放大)。

图4：仔猪平均日增重记录结果

图5：猪体温检测结果图

图6：猪外周血抗体水平检测结果

图7：病理组织切片图，其中，左侧一列(A组)为PBS组，中间一列(B组)为空载体组，右侧一列(C组)为疫苗(14CpG)注射组。

图8：攻毒后组织病理变化。

发明内容

本发明的第一个目的足提供两种新的供猪免疫疫苗使用的CpG-ODN基序，可使DNA疫苗产生更有效的免疫反应。

本发明的第二个目的是提供本发明核酸疫苗的制备方法。

本发明CpG-ODN作为免疫增强剂的优越性：制备方法简单，易于保存和运输；质量易于控制，易规模化生产，成本低廉，易于保存和运输；安全性好。细胞因子是机体内本身存在的免疫调节分子，对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调节网络的控制；易于构建和改造，利用分子生物学技术在基因水平可实现人们所期望的免疫应答强度和类型。

具体实施方式

本发明的佐剂的制备方法详述如下：

(1)人工合成不同的CpG-ODN基序

14个CpG-ODN重复基序：

(SEQ ID NO：1)

18个CpG-ODN重复基序：

(SEQ IDNO：2)

利用引物ORF2s、ORF2r扩增出PCV2SD1株的完整ORF2基因，序列如下：

ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAGAACGCCCTTCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCTGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTAAGTGA(SEQ ID NO：3)

(2)采用基因工程重组技术，选择合适的含酶切位点，将目的基因和CpG-ODN序列克隆入真核细胞表达载体pVAX1；

(3)用步骤(2)所得的重组质粒载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测序鉴定后，再进行扩增培养；

(4)大量提取和纯化目的基因的重组质粒DNA。

(5)免疫原性的检测

实施例1.PCR扩增ORF2基因

根据PCV2SD1株(Gene bank accession number：DQ346683)全序列设计如下PCR引物。引物序列为ORF2s：5’-ATCgCTAgCgCCgCCACCATgACgTATCCAA-3’；ORF2r：5’-gCCgCgAAgCTTTCgCTTAgggTTAAgT-3’，为便于克隆，在上游引物和下游引物中分别添加了Nhe I酶切位点和Hind III酶切位点。PCR反应体系如下：10×PCR buffer 5μl；dNTP Mixture 4μl；P5s 2μl；P5r 2μl；模板2μl；Ex Taq E 0.5μl；用ddH₂O补至50μl。PCR扩增条件为：预变性95℃5min，变性94℃1min，，退火55℃1min，延伸72℃1min，35个循环后，72℃延10min。

PCR产物经8％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，表明扩增出了与ORF2相应的705bp的特异片段，与预期结果相符。

实施例2.pVAX1-ORF2载体的构建

用限制性内切酶Hind III/Nhe I消化PCR纯化产物和pVAX1，分别获得ORF2基因片段和线性载体pVAX1，将产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，按照上海生工胶回收试剂盒说明书进行。连接、转化、挑菌、提质粒、用限制性内切酶Hind III/Nhe I和测序鉴定。

以待鉴定重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经8g/L的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示，表明扩增出了与ORF2相应的705bp的特异片段，与预期结果相符。

将PCR阳性质粒送上海生工生物有限公司进行测序鉴定，测序结果与ORF2序列相符。如下所示(黑体字部分为ORF2序列)

ATGGCTGCGCGCACC

AAGCTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCCAGCCCATCTGTTTGTTTGC

实施例3.CpG-ODN的设计及合成

由上海生工生物工程有限公司合成不同的CpG-ODN基序

14个CpG-ODN重复基序：

18个CpG-ODN重复基序：

用Mlu I分别单酶切重组质粒pVAX1-ORF2和人工合成的CpG序列，取酶切产物分别在8g/L和20g/L的琼脂糖凝胶上进电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。回收片断用DNA连接试剂盒(DNA Ligation KitVer.2.0)进行连接，转化DH5α感受态细胞。将Mlu I酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物有限公司测序鉴定，测序结果与人工合成的CpG序列相符，如下所示(黑体字部分为CpG序列)：14个CpG-ODN重复基序测序结果：

TGTACGGGCCAGATATACGCGTT

CACGCGTTGACATTGA 18个CpG-ODN重复基序测序结果：

TGTACGGGCCAGATATACGCGT

ACGCGTTGACATTGA

实施例4.重组质粒的纯化和转染细胞

按常规方法提取质粒，按Promega试剂盒使用说明书进行纯化。使用Lipofectamine^TM 2000脂质体转染试剂盒(Invitrogen公司)转染正常生长的PK15细胞。

实施例5.目的蛋白的表达检测

将质粒和消化的PK15细胞一起转染，5％CO₂、37℃培养三天后，取出玻片，用PBS液冲洗三次，100％冷丙酮固定15～30min，再用PBS液洗涤三次；用含有5％BSA封闭2h，冲洗三次，每次5min；加入一抗(猪抗PCV2血清)，37℃作用2h后，冲洗3次；加入二抗(异硫氰荧光素标记的山羊抗猪IgG)，室温避光作用1h，冲洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于载玻片上，荧光显微镜下观察。结果如图3所示，在转染了pVAX1-ORF2-CpG质粒和pVAX1-ORF2质粒的细胞培养孔中都观察到了荧光，说明有目的蛋白表达，在转染了pVAX1空载体质粒的阴性对照组中未观察到荧光。

实施例6.疫苗免疫试验及攻毒保护性试验：

(1)试验设计

40头3周龄的仔猪，随机分成8组，每组5头，各组饲养管理条件相同。用紫外分光光度计测量所提取的含有14CpG和18CpG的质粒浓度，调整为200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，耳背部肌肉注射核酸疫苗。正常对照组注射1ml PBS，空载体组注射1ml pVAX1。于第1、14天进行疫苗免疫，于58天攻毒进行攻毒保护试验，攻毒用的PCV2SD1株病毒液为10^6.2TCID₅₀/ml，每头猪颈部肌肉注射1ml，于77天时将剩余试验猪全部剖杀。

按下表对各组进行免疫注射。

表1.1免疫接种动物试验分组情况

(2)免疫指标检测

于试验前、攻毒前称量试验仔猪的体重，试验期间每天测量体温，观察饮食等，观察疫苗的注射及攻毒对仔猪体重及生理指标的影响。

平均日增重：分别于试验前及攻毒前称取试验仔猪的重量，计算每组猪的平均日增重，并进行组间的显著性分析，结果如图4所示，其P≥0.05，差异不显著。

猪体温检测：验过程中每天对猪进行体温测量，结果如图5示。由图5知所有试验猪体温均正常或略有升高，无明显发烧情况，说明疫苗的注射，并没有引起猪体温的大波动。注射部位未发现红肿，各项生理指标稳定。

(3)猪外周血中抗体水平检测

疫苗免疫过程中，天、14天、28天、42天、56、63天、70天和77天采取仔猪外周血，分离猪外周血清，用ELLSA的方法检测其抗体水平，计算SP值。检测结果见图6，由上图可以看出不同CpG基序不同剂量引起的抗体水平变化。从0到14dpi，可见抗体水平不断上升，但是14dpi到28dpi只有H组抗体仍然上升，并且达到最高值0.89，随后下降。于58天进行攻毒，除了A、B、C三组，其他组抗体水平开始上升。攻毒一周后，H组抗体水平最高，且含18个CpG基序的F、G、H三组总体水平都好于含14个CpG基序的C、D、E三组。

(4)病理组织切片观察

于攻毒后3周将猪宰杀，采集各组猪的肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结等组织，经10％福尔马林固定、脱水、透明、浸蜡、切片、HE染色等组织切片步骤，做成石蜡包埋的组织切片。进行病理学观察，结果如图7所示，攻毒后各组体温均正常，未出现发烧现象。剖检后发现对照组猪肾苍白有散在白色病灶，胆囊肿大，颌下淋巴结、腹股沟淋巴结变硬，淋巴结切面呈均质苍白色，膀胱有出血点，肠系膜淋巴结肿大，肺有轻微的出血。出现典型的PCV2临床剖解变化，这与各免疫组基本没有白色病灶形成明显的对比。

组织病理变化检测结果见图8，由图可知：

1：对照组肺出血，肺泡萎缩；

2：免疫组(18CpG)肺泡充盈，间隔正常；

3：对照组淋巴结生发中心萎缩，不成形状；

4：免疫组(18CpG)淋巴结生发中心完整明显。

5：对照组脾脏出血，淋巴细胞核浓缩，核碎裂；

6：免疫组(18CpG)正常的脾脏结构；

7：对照组肾脏出血；

8：免疫组(18CpG)正常肾脏结果；

通过以上病理图片可见，对照组在攻毒后，病毒引起仔猪病理变化，而免疫组却没有病变。

Claims

1.一种含CpG重复基序的PCV2ORF2基因疫苗，其特征在于由PCV2SD1株的完整ORF2和CpG-ODN重复基序插入哺乳动物真核表达载体pVAX1获得，其中所述的CpG-ODN重复基序为14CpG-ODN重复基序或18CpG-ODN重复基序。

2.如权利要求1所述的PCV2ORF2基因疫苗，其特征在于所述的14CpG-ODN重复基序的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求1所述的PCV2ORF2基因疫苗，其特征在于所述的18CpG-ODN重复基序的序列如SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求1-3所述的PCV2ORF2基因疫苗，其特征在于所述的PCV2SD1株的完整ORF2的序列如SEQ ID NO：3所示。

5.如权利要求1所述的PCV2ORF2基因疫苗，其特征在于所述的PCV2SD1株的完整ORF2是使用如下引物扩增获得：

ORF2s：5’-ATCgCTAgCgCCgCCACCATgACgTATCCAA-3’

ORF2r：5’-gCCgCgAAgCTTTCgCTTAgggTTAAg T-3’。

6.权利要求1-5所述基因疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

(1)人工合成扩增PCV2SD1株完整ORF2的引物，在扩增ORF2的引物中引入了Hind III、Nhe I酶切位点，以PCV2SD1株的DNA为模板，应用PCR技术扩增ORF2全基因；

(2)通过酶切，将ORF2基因插入pVAX1相应的多克隆位点中，产生pVAX1-ORF2重组质粒，并进行酶切和PCR鉴定；

(3)人工合成14CpG-ODN重复基序和18CpG-ODN重复基序；

(4)将14CpG-ODN重复基序或18CpG-ODN重复基序通过MluI单酶切，连接到已构建好的真核表达载体pVAX1-ORF2的骨架结构中，构建CpG-pVAX1-ORF2重组质粒。

7.一种能够增强疫苗免疫效果的含CpG基序的寡核苷酸，其特征在于：所述寡核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

8.权利要求7所述的含CpG基序的寡核苷酸在增强核酸疫苗免疫效果中的应用。