CN102329811A

CN102329811A - 一种氨苄青霉素抗性质粒载体及其制备与应用

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Publication number: CN102329811A
Application number: CN201110273904A
Authority: CN
Inventors: 傅向阳; 李威
Original assignee: SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd
Current assignee: SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2031-09-15
Also published as: CN102329811B

Abstract

本发明公开了一种氨苄青霉素抗性质粒载体及其制备与应用。本发明的氨苄青霉素抗性质粒载体的质粒骨架上含有抗氨苄青霉素基因，所述抗氨苄青霉素基因为β-内酰胺酶的编码基因与β-半乳糖苷酶α肽编码基因的融合基因。本发明的氨苄青霉素抗性质粒载体可用于构建重组载体。相比未改造的氨苄青霉素抗性质粒载体，转化有本发明的氨苄青霉素抗性质粒的菌株在培养过程中β-内酰胺酶泄漏显著减少，从而避免了β-内酰胺酶泄漏对于转化菌培养所造成的不利影响。

Description

一种氨苄青霉素抗性质粒载体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和微生物学领域。具体地讲，本发明涉及一种β-内酰胺酶泄漏减少的氨苄青霉素抗性质粒载体及其制备与应用。

背景技术

1973年，美国科学家发明了重组DNA技术，标志着人类认识生命本质并能按照自己意愿改造生命的新时期开始。在这之后的三十多年里，以重组DNA技术为基础的基因工程得到了蓬勃发展。基因工程技术通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，实现基因改造和重新组合，然后导入宿主细胞进行无性繁殖，并诱导重组基因的表达，产生出所需要的基因产物。基因工程技术不仅在基础研究中有着广泛的应用，也在数以千亿美元计的生物技术产业中发挥着重要作用。

载体是用来协助将目的基因引入宿主细胞进行增殖或表达的DNA片段。基因工程中常用的载体主要包括质粒、噬菌体和病毒三大类，其中以质粒的使用最为广泛。质粒是独立于细胞染色体外具有自我复制能力的双链环状DNA。最早使用的质粒载体是pBR322，它是一人工构建的DNA片段，分子大小为4.3kb，带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因以利于筛选的标志基因，并含有EcoRI、BamHI、HindIII等单一的限制酶切点以方便目的基因的克隆。

现今使用的质粒大多来自pBR322的改造，它们的一个共同特点是使用抗氨苄青霉素基因作为筛选标志。氨苄青霉素是现今使用最广泛的抗生素，它的抑菌机理是使细菌细胞膜的内层转肽酶失活从而抑制细胞壁的合成，细菌因无法合成完整的细胞壁而导致无法生长。抗氨苄青霉素基因(bla)编码β-内酰胺酶(β-lactamase)，β-内酰胺酶在胞质内合成后经自身信号肽引导进入周质空间(细胞内、外膜之间一狭窄区域)。跨膜后，信号肽被信号肽酶切除，产生成熟的β-内酰胺酶。β-内酰胺酶水解氨苄青霉素的β-内酰胺环使其失效，转化菌因而也得以在氨苄青霉素存在的环境下生长。可以看出，β-内酰胺酶分泌至周质空间是转化菌产生氨苄青霉素抗性的先决条件。有研究表明，大肠杆菌外膜蛋白的信号肽引导β-内酰胺酶至周质空间的效率相比β-内酰胺酶的自身信号肽要高出100倍以上。

然而，因为尚未知的原因，分泌至周质空间的β-内酰胺酶可进一步泄漏至胞外，将胞外环境中的氨苄青霉素破坏掉。当转化菌在琼脂固体培养基上培养时，泄漏至胞外的β-内酰胺酶在转化菌周围形成一个无氨苄青霉素选择压力的区域，在那个区域非转化菌也能够生长，形成大家所熟知的“卫星菌落”，这会干扰对转化菌的挑选。当转化菌被应用于液体培养基中培养时，β-内酰胺酶的泄漏会造成更严重的问题。由于β-内酰胺酶的迅速扩散，液体培养基中的氨苄青霉素会被全部破坏掉，使得整个环境的选择压力消失。转化菌细胞中的质粒存在分离不稳定性，质粒在细胞分裂过程中不是平均分配，在细胞分裂时会产生不含有质粒的细胞。在选择压力消失的环境中，不含有质粒的细胞会迅速生长。因为不含有质粒的细胞代谢负担比含有质粒的细胞要轻，不含有质粒的细胞生长速度比含有质粒的细胞要快。由于存在竞争优势，培养物最终将被不含有质粒的细胞所主导，含有质粒的细胞在培养物中只占很小的比例，这对相关的应用如质粒的抽提、蛋白质的表达等会造成严重的负面影响。

培养基中氨苄青霉素的选择压力也会因为受培养基酸化影响而被破坏。随着培养时间的延长，细菌的代谢活动促使培养基的pH降低，而氨苄青霉素在酸性环境下易发生水解，这个问题可以通过调控培养基的pH或者采用羧苄青霉素来避免，因为羧苄青霉素在酸性环境中的稳定性相比氨苄青霉素要高很多。但是，羧苄青霉素的价格是是氨苄青霉素的数倍；而且，跟氨苄青霉素一样，羧苄青霉素不能抵抗β-内酰胺酶的水解作用。因此，减少甚至消除β-内酰胺酶的泄漏对于保持培养环境中的选择压力是至关重要的。

对于以重组蛋白质表达为目的的培养而言，保持培养环境的选择压力非常重要。如果选择压力消失，导致最终培养物中无质粒的细胞占主导，则由于目的基因的丢失，目标蛋白质的表达水平将很低。一些方法已经被报道用来减少β-内酰胺酶泄漏造成的负面影响，包括在培养物中加入β-内酰胺酶的抑制剂甲氧苯青霉素；洗涤细胞以去除β-内酰胺酶；使用高度稀释的培养物用于接种等。但是，这些方法并不解决β-内酰胺酶的泄漏问题，只是β-内酰胺酶的泄漏后的补救措施。因为每批次的培养都需要进行这些操作，这些方法费事、也不经济。同时，由于β-内酰胺酶的不断合成和泄漏，这些方法的效果是有限的。

发明内容

如背景技术中所述，为了减少培养过程中β-内酰胺酶泄漏造成的不利影响，已经提出了一些方法。但这些方法要求在每批次培养中都进行相关操作，既费事、又不经济。本发明的目的在于克服现有技术中的局限性，将减少β-内酰胺酶泄漏作为目标，而不是去想办法补救β-内酰胺酶泄漏造成的负面影响。在此基础上，提供一种减少携带有氨苄青霉素抗性质粒的大肠杆菌在培养过程中β-内酰胺酶泄漏的方法及其应用。

本发明主要通过对现有质粒载体质粒骨架上氨苄青霉素抗性基因的改造，来解决β-内酰胺酶泄漏的问题。

为了实现上述目的，本发明首先公开了一种氨苄青霉素抗性质粒载体，所述氨苄青霉素抗性质粒载体的质粒骨架上含有抗氨苄青霉素基因，所述抗氨苄青霉素基因为β-内酰胺酶的编码基因(bla)与β-半乳糖苷酶α肽编码基因(lacZα)的融合基因。

所述融合基因中，β-半乳糖苷酶α肽编码基因连接于β-内酰胺酶编码基因的3’端。β-半乳糖苷酶α肽编码基因与β-内酰胺酶编码基因直接相连，或者两者之间经连接肽编码基因连接，连接肽编码基因编码的连接肽应不影响融合蛋白功能。

常用的不影响融合蛋白功能的连接肽序列可以是：GlyGlySer，(GlyGlySer)₂，(GlyGlySer)₃，(GlyGlySer)₄，SerProGlySer，GlySerGlySerGly，(GlySerGlySerGly)₂，(GlySerGlySerGly)₃，GlyGlySerGlyGly，(GlyGlySerGlyGly)₂，(GlyGlySerGlyGly)₃，GlyGlyGlyGlySer，(GlyGlyGlyGlySer)₂，(GlyGlyGlyGlySer)₃，(His)₆，(His)₈，GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly或GlySerAlaGlySerAlaAlaGlySerGlyGluPhe。

本发明的氨苄青霉素抗性质粒载体质粒骨架上的其他构架均为常规。

进一步的，所述融合基因编码序列为：SEQ ID NO：14的融合蛋白，或者所述融合基因编码的蛋白质其氨基酸序列与SEQ ID NO：14具有高度同源性。

进一步的，所述融合基因的序列为：SEQ ID NO：1，或者所述融合基因的序列与SEQ ID NO：1具有高度同源性。

本发明的氨苄青霉素抗性质粒载体可用将现有氨苄青霉素抗性质粒载体中的β-内酰胺酶编码基因采用所述融合基因替换的方法获得。

所述现有氨苄青霉素抗性质粒载体可以是任一具有氨苄青霉素抗性并以β-内酰胺酶编码基因作为其抗氨苄青霉素基因的载体。现有氨苄青霉素抗性质粒载体可以是如pET系统、pMAL系统、pTrc系统或pGEX系统中的载体。

本发明的氨苄青霉素抗性质粒载体可用于构建重组载体。转化有本发明的氨苄青霉素抗性质粒的菌株，相比转化有未改造的氨苄青霉素抗性质粒载体的菌株，转化菌培养过程中β-内酰胺酶泄漏显著减少，从而避免β-内酰胺酶泄漏对于转化菌培养所造成的不利影响。

本发明还提供了一种减少携带有氨苄青霉素抗性重组载体的菌株在培养过程中β-内酰胺酶泄漏的方法，选自以下任一：

1)采用本发明的氨苄青霉素抗性质粒载体构建重组载体，而后转化并用于培养；

2)将所述菌株携带的氨苄青霉素抗性重组载体进行基因改造，将该氨苄青霉素抗性重组载体质粒骨架中的β-内酰胺酶编码基因改造为β-内酰胺酶的编码基因与β-半乳糖苷酶α肽编码基因的融合基因，而后转化并用于培养。

所述菌株为大肠杆菌菌株，菌株可以是BL21，BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS，DH5α，DH10B，JM109，Mach1T1，Origami，Origami(DE3)，Origami(DE3)pLysS，Origami B，Origami B(DE3)，Origami B(DE3)pLysS，Rosetta，Rosetta(DE3)，Rosetta(DE3)pLysS，TG1，TOP10或XL1-Blue。

本发明将编码β-内酰胺酶的DNA片段与编码β-半乳糖苷酶α肽的DNA片段融合得到融合基因，再用融合基因替换原质粒上β-内酰胺酶编码基因，或者将原质粒上β-内酰胺酶编码基因改造为融合基因。融合基因编码的融合蛋白保留β-内酰胺酶的活性，转化菌能够在含有氨苄青霉素的环境中正常生长；但在另一方面，融合蛋白的分泌水平大大降低，泄漏至胞外的量也极大地减少，导致胞外的β-内酰胺酶活力极低，从而达到了减少β-内酰胺酶泄露的目标。此方法从基因改造的角度来达到减少β-内酰胺酶泄露的目标，质粒载体改造好后，具有一劳永逸的特点，不需像其它方法那样，为避免β-内酰胺酶泄露造成的负面影响在每批次培养都需要进行相关操作，因而更简便和经济。

附图说明

图1β-内酰胺酶与改造后的β-内酰胺酶与β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白在过表达条件下的泄漏情况

M：标准分子量蛋白质；

1：BL21(DE3)/pOmpAssbla(表达β-内酰胺酶)胞内可溶性蛋白质；

1IB：BL21(DE3)/pOmpAssbla胞内包涵体；

2：BL21(DE3)/pXYZ3(表达β-内酰胺酶与β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白)胞内可溶性蛋白质；

2IB：BL21(DE3)/pXYZ3胞内包涵体；

1’：BL21(DE3)/pOmpAssbla胞外蛋白质；

2’：BL21(DE3)/pXYZ3胞外蛋白质；

(箭头表示目标蛋白质的包涵体及胞外蛋白质条带)。

图2以pGEX-4T-1质粒骨架上β-内酰胺酶编码基因的改造为例说明在质粒上实现该基因改造的方法

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的适用范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件进行。

实施例1β-内酰胺酶与改造后的β-内酰胺酶与β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白在过表达条件下的泄漏情况对比

1.1表达载体的构建

1.1.1大肠杆菌外膜蛋白A(outer membrane protein A，ompA)基因扩增

以大肠杆菌基因组为模板，ompA-F(5’-ggaattccatatgAAAAAGACAGCTATCGCGATTG-3’SEQID NO：2)和ompA-R(5’-cggggtaccGAACTGGTAAACGATACCC-3’SEQ ID NO：3)为上、下游引物，PCR反应扩增包含信号肽的全长基因，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用生工生物工程(上海)有限公司提供的“SanPrep柱式胶回收试剂盒”回收目的片段，得到ompA基因扩增产物。

1.1.2β-内酰胺酶的过表达载体构建

文献报道，大肠杆菌外膜蛋白A信号肽(ompAss)引导β-内酰胺酶的分泌相比其自身信号肽效率要高出100倍以上，构建融合基因并置于T7强启动子下表达，具体方式如下：以ompA-F为上游引物，Lactam-R(5’-cccaagcttatcaCCAATGCTTAATCAGTGAG-3’SEQ ID NO：4)为下游引物，IPOM(5’-GTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCCACCCAGAAACGCTGGTGAAAG-3’SEQ IDNO：5)为中间搭桥引物，以ompA基因扩增产物(ompA信号肽模板)和pGEX-4T-1质粒(β-内酰胺酶编码基因模板)为模板，通过重叠PCR扩增编码ompA信号肽和β-内酰胺酶成熟蛋白质的杂合基因。产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收目的片段。纯化产物经NdeI和HindIII双酶切后，连入经同样酶切的pET24a载体，测序后获得正确的克隆，质粒命名为pOmpAssbla。

1.1.3β-内酰胺酶(β-lactamase)与β-半乳糖苷酶α肽(β-galactosidase αpeptide)的融合蛋白质的过表达载体构建

以质粒pMALp2x为模板，lacZα-F(5’-gtcggtaccGCACTGGCCGTCGTTTTAC-3’SEQ IDNO：6)和lacZα-R(5’-cccaagctttcaTCCGCCAAAACAGCCA-3’SEQ ID NO：7)为上、下游引物，PCR反应扩增β-半乳糖苷酶α肽的编码基因lacZα，产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收目的片段。纯化产物经KpnI和HindIII双酶切后，连入经同样酶切的pET32a载体，测序后获得正确的克隆，质粒命名为pXYZ1。

以质粒pOmpAssbla为模板，ompA-F和bla-R(5’-ggggtaccCAACCAATGCTTAATCAGTGAG-3’SEQ ID NO：8)为上、下游引物，PCR反应扩增编码ompA信号肽与β-内酰胺酶成熟蛋白质(不含终止子)的杂合基因，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收目的片段。纯化产物经NdeI和KpnI双酶切后，连入经同样酶切的pXYZ1载体，测序后获得正确的克隆，质粒命名为pXYZ2。

用NdeI和HindIII对质粒pXYZ2进行双酶切，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收小片段(ompAss-bla-lacZα杂合基因)，纯化后连入经同样酶切的pET24a载体，测序后获得正确的克隆，质粒命名为pXYZ3。

1.2蛋白质表达与检测

构建好的质粒pOmpAssbla和pXYZ3分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，得到的工程菌命名为BL21(DE3)/pOmpAssbla和BL21(DE3)/pXYZ3。

分别挑取BL21(DE3)/pOmpAssbla和BL21(DE3)/pXYZ3单菌落接入含有50mg/L卡那霉素的MR培养基中，30℃，200rpm，过夜培养。

将过夜培养的BL21(DE3)/pOmpAssbla和BL21(DE3)/pXYZ3按5％的接种量接入含有50mg/L卡那霉素的MR培养基中，30℃，200rpm，培养至OD₆₀₀≈3.0时，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，诱导培养3.5小时。

将菌液于12000rpm离心5分钟后，取发酵液上清制备样品用于目标蛋白质泄漏的检测。

菌体用20mM pH 8.0的磷酸缓冲液重悬，超声破碎，将破碎液于12000rpm离心10分钟后，分别取上清和沉淀制备样品用于胞内可溶性蛋白质和包涵体的检测。

MR培养基是以甘油为碳源的合成培养基，培养基组分明确。BL21(DE3)在MR培养基中生长时，细胞外膜的通透性提高，分泌至周质空间的蛋白质大部分泄漏至发酵液中。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析制备的蛋白质样品后发现，β-内酰胺酶过表达后大部分泄漏至发酵液中，而β-内酰胺酶与β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白过表达后，绝大部分以包涵体的形式存在，发酵液中检测不到融合蛋白(图1)。这表明，将β-半乳糖苷酶α肽与β-内酰胺酶融合是阻止β-内酰胺酶泄漏至胞外环境的好方法。

另一方面，BL21(DE3)/pXYZ3可以在含有50mg/L卡那霉素和100mg/L氨苄青霉素的双抗平板上生长，这表明，β-内酰胺酶与β-半乳糖苷酶α肽融合后仍然保留β-内酰胺酶的活性。因此，将编码β-内酰胺酶的DNA片段与编码β-半乳糖苷酶α肽的DNA片段融合得到的融合基因作为抗性基因是可行的。

实施例2质粒上β-内酰胺酶编码基因的改造

下面以商品化质粒pGEX-4T-1为例，将质粒骨架上β-内酰胺酶编码基因改造为编码β-内酰胺酶与β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白的融合基因。

2.1载体的改造

以引物对MutNheI-F(5’-GAACTACTTACTCTAGCTAGCCGGCAACAATTAATAG-3’SEQ ID NO：9)、MutNheI-R(5’-CTATTAATTGTTGCCGGCTAGCTAGAGTAAGTAGTTC-3’SEQ ID NO：10)和MutHindШ-F(5’-GTAACTGTCAGACCAAGCTTACTCATATATACTTT-3’SEQ ID NO：11)、MutHindШ-R(5’-AAAGTATATATGAGTAAGCTTGGTCTGACAGTTAC-3’SEQ ID NO：12)为引物，以质粒pGEX-4T-1为模板，PCR反应扩增整个质粒，扩增产物为带缺刻的开环质粒。用限制性内切酶DpnI(DpnI的识别序列为甲基化的GATC，GATC几乎在各种质粒中都会出现且不止一次)切割PCR产物，原来的模板质粒pGEX-4T-1来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开。Dpn I酶消化模板质粒后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌单菌落培养、抽提质粒并送交测序。经筛选，得到产生目标突变的质粒，新的质粒命名为pGEXM。相比较pGEX-4T-1，pGEXM质粒骨架上产生了一个Nhe I和一个HindIII酶切位点。其中，HindШ酶切位点由引物对MutHindШ-F、MutHindШ-R引入，其位点位于β-内酰胺酶编码基因的终止密码子之后，对β-内酰胺酶编码基因无任何影响。NheI酶切位点由引物对MutNheI-F、MutNheI-R引入，其位点位于β-内酰胺酶编码基因3’端，此位点突变采用的是同义突变，即改造只限于碱基突变，编码的氨基酸序列完全未变。这样，就保证了pGEXM质粒上抗性基因所编码的β-内酰胺酶跟质粒pGEX-4T-1完全一致。

以质粒pXYZ3为模板，Mbla-F(5’-gctagctagcCGGCAACAATTAATAGACTG-3’SEQ ID NO：13)和lacZ α-R为上、下游引物，PCR反应扩增β-内酰胺酶编码基因3’端部分序列及β-半乳糖苷酶α肽的编码DNA，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收目的片段。纯化产物经Nhe I和HindШ双酶切后，连入经同样酶切的pGEXM载体，改造后的质粒命名为pGEXMZ。pGEXMZ质粒上氨苄青霉素抗性基因的序列符合SEQ ID NO：1，该抗性基因编码的是β-内酰胺酶与β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白，融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：14，全长349个氨基酸。其中，第1-23位氨基酸为β-内酰胺酶信号肽序列，第24-286位氨基酸为β-内酰胺酶成熟蛋白质序列，第291-349位氨基酸为β-半乳糖苷酶α肽序列，信号肽在跨膜后会被切除。

2.2β-内酰胺酶泄漏的对比

构建好的质粒pGEXM和pGEXMZ分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，得到的工程菌命名为BL21(DE3)/pGEXM和BL21(DE3)/pGEXMZ。

分别挑取BL21(DE3)/pGEXM和BL21(DE3)/pGEXMZ单菌落接入含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。

将菌液稀释10倍，用分光光度计检测600nm下的吸光度以测定菌浓。另取菌液于12000rpm离心5分钟后，取发酵液上清检测β-内酰胺酶的活力。

β-内酰胺酶的活力测定是以青霉素G钾盐为底物，β-内酰胺酶能够水解青霉素G钾盐使其在240nm的特定吸收峰消失。取50μL发酵液上清跟950μL含有200μg/mL青霉素G钾盐的磷酸缓冲液(50mM，pH 7.0)混合，37℃下反应30分钟，测定240nm下的吸光度。β-内酰胺酶的活力以反应时间内青霉素G钾盐被水解的百分比表示。

表1β-内酰胺酶编码基因的改造对菌体生长和β-内酰胺酶泄漏的影响

根据上述实施例中实验结果，β-内酰胺酶编码基因的改造对菌体生长没有明显的影响，两组培养的菌浓相差不大。另一方面，β-内酰胺酶编码基因改造后相比未改造的情况下β-内酰胺酶的泄漏大大减少，发酵液中β-内酰胺酶活力很低，这对于保持培养环境中的选择压力是有利的。

在本实施例中，通过基因改造的方法实现了pGEX-4T-1质粒骨架上β-内酰胺酶编码基因的改造，也可以先在体外将编码β-内酰胺酶的基因与编码β-半乳糖苷酶α肽的DNA序列融合得到融合基因，再将构建的融合基因替换掉质粒骨架上β-内酰胺酶编码基因，其效果是一样的。

Claims

1.一种氨苄青霉素抗性质粒载体，所述氨苄青霉素抗性质粒载体的质粒骨架上含有抗氨苄青霉素基因，所述抗氨苄青霉素基因为β-内酰胺酶的编码基因与β-半乳糖苷酶α肽编码基因的融合基因。

2.如权利要求1所述氨苄青霉素抗性质粒载体，其特征在于，所述融合基因中，β-半乳糖苷酶α肽编码基因连接于β-内酰胺酶编码基因的3’端。

3.如权利要求1所述氨苄青霉素抗性质粒载体，其特征在于，所述融合基因中，β-半乳糖苷酶α肽编码基因与β-内酰胺酶编码基因直接相连，或者两者之间经连接肽编码基因连接。

4.如权利要求1所述氨苄青霉素抗性质粒载体，其特征在于，所述融合基因编码序列为：SEQ ID NO：14的融合蛋白，或者所述融合基因编码的蛋白质其氨基酸序列与SEQ ID NO：14具有高度同源性。

5.如权利要求1所述氨苄青霉素抗性质粒载体，其特征在于，所述融合基因的序列为：SEQ ID NO：1，或者所述融合基因的序列与SEQ ID NO：1具有高度同源性。

6.权利要求1-5任一所述氨苄青霉素抗性质粒载体的制备方法，为将现有氨苄青霉素抗性质粒载体中的β-内酰胺酶编码基因采用β-内酰胺酶的编码基因与β-半乳糖苷酶α肽编码基因的融合基因替换的方法获得。

7.权利要求1-5任一所述氨苄青霉素抗性质粒载体用于构建重组载体的用途。

8.一种减少携带有氨苄青霉素抗性重组载体的菌株在培养过程中β-内酰胺酶泄漏的方法，选自以下任一：

1)采用权利要求1-5任一所述氨苄青霉素抗性质粒载体构建重组载体，而后转化并用于培养；

9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌菌株，菌株可以是但不限于：BL21，BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS，DH5α，DH10B，JM109，Mach1T1，Origami，Origami(DE3)，Origami(DE3)pLysS，Origami B，OrigamiB(DE3)，Origami B(DE3)pLysS，Rosetta，Rosetta(DE3)，Rosetta(DE3)pLysS，TG1，TOP10或XL1-Blue。