CN102321131A - 半合成氨基糖苷类抗生素、制备方法及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半合成氨基糖苷类抗生素1-N-乙酰基小诺霉素或其药学上可接受的盐及其制备方法，1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法包括以下步骤：对小诺霉素碱基的C_2′-NH₂和C₃-NH₂进行甲酰化保护而获得3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素，再进行乙酰化反应得到1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素，所得的产物在碱溶液中进行水解反应，去2′-NH₂和3-NH₂的甲酰化保护而得到1-N-乙酰基小诺霉素。本发明的1-N-乙酰基小诺霉素经体外抗结核菌及抗菌活性试验，证明其对结核分枝杆菌革兰氏阳性菌和阴性菌均有较强的抗菌活性并且药物的耳、肾毒性大大降低，在临床上有较大的应用价值。

Description

半合成氨基糖苷类抗生素、制备方法及其药物组合物

技术领域

本发明涉及一种氨基糖苷类抗生素，具体涉及一种新抗菌化合物1-N-乙酰基小诺霉素或其盐、其制备方法以及含有该有效成分的药物组合物。

背景技术

自1944年由美国学者瓦克斯曼发现了第一个氨基糖苷类抗生素链霉素(streptomycin)以来，经过六十多年来的发展，该类抗生素已广泛用以抗感染疾病的治疗。氨基糖苷类抗生素不但抗菌谱广且没有类似青霉素那样的致命过敏反应，氨基糖苷类抗生素与β-内酰胺类抗生素联合使用时，对重症病患有较好的协同作用，故该类抗生素在临床治疗中发挥了较大的作用；但由于该类抗生素存在一定的耳、肾方面的毒副作用，故限制了它们在临床上的广泛使用。经过学者们的长期努力，现在已经研究和开发出许多对耳、肾毒性低且对多种耐药菌有较好抗菌效果的新药。例如小诺霉素(micronomicin)、半合成抗生素卡那霉素的丁酰苷基衍生物阿米卡星(丁胺卡那霉素)、卡那霉素B的丁酰苷基衍生物阿贝卡星、西梭米星的乙基衍生物奈替米星、庆大霉素B的异丝氨酸衍生物异帕米星和九十年代由我国赵敏、范瑾等人发明的国家一类新药庆大霉素C_1a乙基衍生物依替米星。

众所周知，结核病是一种由分枝结核杆菌感染引起的传染性疾病。已有资料表明，全球目前已有20亿人感染结核菌，活动性结核患者达1500万，每年新发结核患者达800-1000万。我国的结核病人数约占全球的14.3％，居世界第二位；全国活动性肺结核患者约有450万，每年约有13万人死于结核病，且呈现农村患者多、耐药患者多等特点，已经严重威胁到人们的健康和社会的稳定。

目前在氨基糖苷类抗生素中抗结核病的一线药物是链霉素，二线药物是卡那霉素、阿米卡星等。由于长期使用，多数结核杆菌已对其产生耐药性。另外，这些老药的耳、肾毒性较大，已不能满足人们的要求。因此，开发新型的氨基糖苷类抗结核药物亦刻不容缓。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是由于长期使用，多数结核杆菌已对现有抗菌药产生耐药性以及现有属于抗生素类抗结核病药物的耳、肾毒性较大，而提供对耐药菌有较好抗菌效果且耳、肾毒性降低的1-N-乙酰基小诺霉素或其盐，另外考虑到对这类药物其生产成本不能过高的特点，设计了高效、高产的路线，此外提供了含有上述有效成分的制剂。

实现本发明目的的技术方案是一种由下述式(I)表示的半合成氨基糖苷类抗生素1-N-乙酰基小诺霉素或其药用盐：

上述1-N-乙酰基小诺霉素的合成方法包括以下步骤：

①将结构式(II)的小诺霉素碱基的C_2′-NH₂和C₃-NH₂进行甲酰化保护而获得含有结构式(III)的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的混合物料；

②将步骤①所得的混合物料中的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素分离出来，再进行浓缩；

③将步骤②所得的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的浓缩液进行乙酰化反应获得结构式(IV)的1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素；

④将步骤③得到的1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素在碱溶液中进行水解反应，去2′-NH₂和3-NH₂的甲酰化保护而得到含有1-N-乙酰基小诺霉素的混合物料；

⑤将步骤④所得的混合物料中的1-N-乙酰基小诺霉素分离出来再精制提纯。

上述步骤①中，在对小诺霉素碱基的C_2′-NH₂和C₃-NH₂进行甲酰化保护时，小诺霉素碱基与螯合剂先在溶剂中反应至TLC(薄层色谱)追踪检测小诺霉素碱基已反应完全；然后向上述反应液中加入甲酰化试剂继续反应，TLC追踪检测小诺霉素络合物已反应完全，停止反应；所得反应物料分层后取上层液，上层液经阳离子交换树脂脱去螯合离子，洗脱后浓缩备用；其中小诺霉素碱基与螯合剂的物质的量之比为1∶(3～5)，小诺霉素与甲酰化试剂的物质的量之比为1∶(3～5)。

所述螯合剂为特戊酸锌；所述甲酰化试剂为2-甲酰巯基苯并噻唑。

所述溶剂为二甲亚砜、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯或乙腈中的一种或任意2～3种组成的混合溶剂；溶剂总重为小诺霉素碱基质量的20～50倍。

上述步骤③中，在进行乙酰化反应时，将步骤②得到的浓缩液与乙酸酐在25～35℃下反应至TLC追踪检测3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素已反应完全；其中浓缩液中的3、2′-二-N-甲酰基小诺霉素与乙酸酐的摩尔比为1∶(1～3)。

上述步骤③中，进行乙酰化反应时，向反应瓶中加入步骤②得到的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素浓缩液，再向其中加入1-N-羟基苯并噻唑及甲醇，加完后搅拌至1-N-羟基苯并噻唑完全溶解后，加入乙酸酐甲醇溶液，在25～35℃下搅拌而发生生成1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的反应，用TLC追踪检测3、2’-二甲酰基小诺霉素反应完全，反应结束。

上述步骤④中，在碱溶液中进行水解反应时，是先将步骤③得到的混合物料浓缩除去溶剂甲醇，然后向浓缩液中加入2mol/L～5mol/L的碱溶液，在20～30℃下水解反应16至20小时；所述碱溶液为氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液，碱溶液的体积是浓缩液体积的1至3倍。

一种药物组合物，其中含有作为活性成分的上述半合成氨基糖苷类抗生素1-N-乙酰基小诺霉素或其药用盐，并且含有常规药用载体。

上述化合物在制备抗结核分枝杆菌的药物中的应用。

本发明具有积极的效果：

(1)本发明根据氨基糖苷类抗生素的构效关系理论，设计了多个有抗结核杆菌作用的半合成小诺霉素衍生物，小诺霉素抗菌谱近似庆大霉素，与其他的氨基糖苷的交叉耐药性也不大，它对革兰阳性菌和革兰阴性菌均显示较强的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌也有抗菌作用，且耳、肾毒性也较小。

对含有2-脱氧链霉胺的氨基糖苷类抗生素，除了在2-脱氧链霉胺的C1-NH2外，其余的氨基如被酰化或烷基化，生成的衍生物多数将失去或降低其抗菌活性并且也未见降低其母核耳、肾毒性情况。因此本发明在小诺霉素母核的2-脱氧链霉胺(2-DOS)1-N位上引进基团，并改进了通常引进该基团的方法；通过对新抗生素的药效试验筛选证实：本发明的半合成氨基糖苷类抗生素具有良好的抗结核杆菌作用，且其引进基团的方法更专一、高效。

(2)本发明的1-N-乙酰基小诺霉素经体外抗结核菌及抗菌活性试验，证明其对结核分枝杆菌(包括耐链霉素的结核分枝杆菌)、革兰氏阳性菌和阴性菌均有较强的抗菌活性，并且根据构效关系理论推断，小诺霉素的1-N位上的氨基被乙酰化后得到的半合成化合物1-N-乙酰基小诺霉素的耳、肾毒性大大降低，在临床上有较大的应用价值。

(3)本发明1-N-乙酰基小诺霉素的半合成过程中，通过对除1-N位外其他位置上的氨基保护，避免生成其他副产品，使得获得产品更纯、收率更高。

附图说明

图1为实施例1制备的1-N-乙酰基小诺霉素的质谱(MS)图。

图2为实施例1制备的1-N-乙酰基小诺霉素的紫外(UV)吸收光谱图。

图3为实施例1制备的1-N-乙酰基小诺霉素的红外(IR)吸收光谱图。

图4为实施例1制备的1-N-乙酰基小诺霉素的核磁共振氢谱图。

图5为实施例1制备的1-N-乙酰基小诺霉素的核磁共振碳谱图。

图6为实施例1制备的1-N乙酰基小诺霉素的无畸变极化转移增强谱(DEPT)。

图7为实施例1制备的1-N乙酰基小诺霉素氢氢相关谱(H-H-COSY谱)。

图8为实施例1制备的1-N乙酰基小诺霉素碳氢相关谱(C-H-COSY谱)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。

(实施例1、1-N-乙酰基小诺霉素及其制备方法)

本发明的半合成氨基糖苷类抗生素为1-N-乙酰基小诺霉素，分子式为C₂₂H₄₄N₅O₈，分子量为506，其构象式如下：

1-N-乙酰基小诺霉素以小诺霉素碱基(Base)为母核进行半合成制得。

以小诺霉素碱基为母核进行半合成制备1-N-乙酰基小诺霉素的反应方程式如下：

注：E-MCR指1-N-乙酰基小诺霉素，在药效试验例中代号为：FY-2。

制备过程所用的起始原料是硫酸小诺霉素，CAS号为66803-19-8。硫酸小诺霉素的构象式如下：

所述硫酸小诺霉素符合《中华人民共和国药典2005年版二部》第718页中所规定的质量标准，来源于江西制药有限公司(前系江西制药厂)，生产批准文号为国药准字H10910020。

将上述硫酸小诺霉素转换成半合成母核小诺霉素碱基的步骤如下：

硫酸小诺霉素→经阳离子交换树脂(如732树脂或HD-2)或大孔型树脂(如YRP-II)吸附→解吸→薄膜真空浓缩→小诺霉素碱基浓缩液→冷冻干燥得其固体物供半合成待用。

并且本实施例1-N-乙酰基小诺霉素的制备过程中，在甲酰化保护小诺霉素的C_2’-NH₂和C₃-NH₂时，所使用的特戊酸锌和2-甲酰巯基苯并噻唑均为自制。

特戊酸锌的制备方法如下：

向2L的三颈瓶中加入水800mL，升温至60～70℃；搅拌下向三颈瓶中加入特戊酸200g和碱式硫酸锌124g；再向三颈瓶中加入水200mL，将混合物料加热升温至96～98℃并在该温度范围内搅拌回流1小时使混合物料反应完全生成特戊酸锌；然后将其置于冰浴中冷却到4℃以下，抽滤上述反应产物并用4℃左右的冷丙酮洗涤固体，抽干后转移固体，使之在50℃至60℃下真空干燥，得137g特戊酸锌备用。

2-甲酰巯基苯并噻唑的制备方法如下：

向2L的三颈瓶中加入乙氰800mL、甲酸钠180g、甲酸50mL，将混合物料冷却至5℃以下，然后搅拌下向其中滴加乙酰氯150mL，滴加速度控制在每分钟30滴左右；滴加完乙酰氯后对混合物料加热至温度为18～20℃并在该温度范围内搅拌5～6小时；向三颈瓶中加入2-巯基苯并噻唑200g和乙腈500ml，加完后混合物料升温至32±1℃，保持该温度区间搅拌反应10小时使反应完全生成2-甲酰巯基苯并噻唑。抽滤上述反应产物并用冰水洗涤固体，转移固体在40℃下真空干燥，所得的甲酰巯基苯并噻唑备用。

1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法具体包括以下步骤：

①小诺霉素的甲酰化反应。

向空反应瓶中加入二甲亚砜1500mL、二氯甲烷1500mL，然后加入上述自制的特戊酸锌137g，搅拌使特戊酸锌完全溶解后再加入小诺霉素75g，在25～35℃下(本实施例为28℃)搅拌，从而发生生成小诺霉素特戊酸锌络合物的反应；用薄层色谱(TLC)追踪检测小诺霉素已反应完全后停止反应；然后向上述反应液中加入2-甲酰巯基苯并噻唑142.5g，在25～35℃下(本实施例为28℃)继续搅拌，从而发生生成3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的反应，反应0.5h停止反应。其中TLC的薄层板为60目硅胶板，展开剂为甲醇∶氯仿∶氨水(体积比10∶10∶1)，其中氨水为25wt％～28wt％的浓氨水。

所用溶剂除上述二甲亚砜和二氯甲烷外，还可以从二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、乙氰中选择一种，或者是上述五种溶剂中的2至3种组成的混合溶剂。

②提取3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素。

将步骤①反应后的混合物料倒入分液漏斗中，分离取上层液；将上层液通入阳离子交换树脂(型号732)脱Zn²⁺，吸附速度为10mL/min，吸附完毕后用去离子水洗至中性，再用1mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液从而将3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素提取(洗脱)出来，然后薄膜真空浓缩得浓缩液50mL后备用。

③3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的乙酰化反应。

向250mL的三颈瓶中加入步骤②制备的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素浓缩液50mL，再向其中加入1-N-羟基苯并噻唑1.2g及甲醇40mL，加完后搅拌至1-N-羟基苯并噻唑完全溶解后，加入乙酸酐甲醇溶液，该乙酸酐甲醇溶液由4.8g的乙酸酐溶解在20mL的甲醇中制得，室温(25～35℃)下搅拌发生生成物为1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的反应，35～40min后，用TLC追踪检测3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素反应完全，反应结束。其中TLC的薄层板为60目硅胶板，展开剂为甲醇∶氯仿∶氨水(体积比10∶10∶1)，其中氨水为25wt％～28wt％的浓氨水。

④去甲酰化保护的水解反应。

将步骤③反应后的混合物料经薄膜浓缩除去溶剂甲醇，得到80mL的浓缩液，然后向浓缩液中加入2M的氢氧化钠溶液80mL；25℃±2℃的温度下水解反应18小时。

当然上述水解反应也可以在2M的氢氧化钾溶液中进行，氢氧化钾或者氢氧化钠的浓度可以更高(如4mol/L)。

⑤分离纯化。

将步骤④水解反应后的混合物料经弱酸型阳离子交换树脂(Amberlite CG-50)，吸附速度10mL/min，吸附完毕后用0.05M至1M的稀氨水梯度解析，即依次用0.05M、0.10M、0.25M、0.50M、0.75M、1M的稀氨水洗脱，用分布收集器收集洗脱液；再将合并的洗脱液经薄膜浓缩除去溶剂而得1-N-乙酰基小诺霉素浓缩液50～60mL(本实施例为55mL)；若将所得1-N-乙酰基小诺霉素的浓缩液冻干则得到1-N-乙酰基小诺霉素产品。

1-N-乙酰基小诺霉素产品分析：

1-N-乙酰基小诺霉素的质谱图(Q-Trap LC/MS/MS System质谱仪，ESI源)见图1。MS(m/e)506.3，427.2，415.3，417.2，390.9。质谱测得其分子离子峰m/e为506，与C₂₂H₄₄N₅O₈相符。

1-N-乙酰基小诺霉素由高分辨质谱仪(JMS-T100CS，日本产)检测得到的数据如下(其中Mass-实测分子量，Calc.Mass-理论分子量，Msss Difference-实测值与理论值差，Unsaturation Number-不饱和值)：

证实所得产品的分子式为C₂₂H₄₄N₅O₈。

1-N-乙酰基小诺霉素的紫外吸收光谱图(THERMO SPECTRONIC～VISION32SOFTWARE V1.25紫外分光光度计，溶剂为水)见图2。UV图谱显示末端吸收。

1-N-乙酰基小诺霉素的红外(IR)吸收光谱图(美国热电公司(Thermo)傅里叶变换红外光谱仪：Nicolet 5700，KBr压片测试)见图3。IR(KBr)：3267.1、3077.8、2973.7、1640.7、1549.3、1466.3、1378.4、1320.4、1291.6、1062.6、971.6、875.4、828.6、748.0、614.7、445.2。

1-N-乙酰基小诺霉素的核磁共振氢谱图(VNS-600核磁共振仪，溶剂D₂O，TMS内标，600Hz)见图4。

¹H NMR(600Hz)δ，ppm：1.35(s，3H，6”-CH₃)，1.58(m，1H)，1.94(m，1H，4’-CH₂)，1.85(m，1H)，2.20(m，1H，2-CH₂)，2.01(s，3H，8-CH₃)，2.06(m，1H，3’-CH₂)，2.77(s，3H，7’-CH₃)，2.91(s，3H，7”-CH₃)，3.13(dd，1H，J＝13.2，3.0Hz)，3.26(dd，1H，J＝13.2，3.0Hz，6’-CH₂)，3.35(d，1H，J＝10.8Hz，3”-CH)，3.45(m，1H，3-CH)，3.71(t，1H，J＝9.6Hz，6-CH)，3.82(t，1H，J＝9.6Hz，5-CH)，4.00(t，1H，J＝9.6Hz，4-CH)，4.09(m，1H，1-CH)，4.12(d，1H，J＝12.6Hz)，3.41(d，1H，J＝12.6Hz，5”-CH₂)，3.56(m，1H，2’-CH)，4.06(dd，1H，J＝11.4，3.6Hz，2”-CH)，4.21(m，1H，5’-CH)，5.18(d，1H，J＝3.6Hz，1”-CH)，5.91(d，1H，J＝3.6Hz，1-CH)。

1-N-乙酰基小诺霉素的核磁共振碳谱图(VNS-600核磁共振仪，溶剂D₂O，TMS内标，600MHz)见图5。

1-N-乙酰基小诺霉素的无畸变极化转移增强(DEPT)谱(VNS-600核磁共振仪)见图6。

1-N乙酰基小诺霉素氢氢相关谱(H-H-COSY谱)见图7，检测仪器同上，溶剂D₂O。

1-N乙酰基小诺霉素碳氢相关谱(C-H-COSY谱)见图8，检测仪器同上，溶剂D₂O。

通过对上述核磁共振谱图及数据综合分析，该半合成化合物的碳、氢归属如下表1：

表1

(实施例2、硫酸1-N-乙酰基小诺霉素及其制备方法)

硫酸1-N-乙酰基小诺霉素是1-N-乙酰基小诺霉素分子与2.5个H₂SO₄分子相结合，分子式为C₂₂H₄₄N₅O₈·5/2H₂SO₄，分子量为750，其构象式如下：

硫酸1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法如下：

向实施例1所得1-N-乙酰基小诺霉素浓缩液50mL中加入3mol/L的硫酸，调节浓缩液pH为6.0；再向上述混合溶液中加入活性炭5g除去热源，过滤除去活性炭得硫酸1-N-乙酰基小诺霉素的浓缩液；然后将上述浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥即得硫酸1-N-乙酰基小诺霉素。

所制得的1-N-乙酰基小诺霉素硫酸盐为白色或类白色粉末的疏松固体，无臭，有吸湿性；该硫酸盐极易溶解在水中，在甲醇、乙醇、丙酮、冰醋酸、乙醚、氯仿和乙酸乙酯中几乎不溶；在水中具有右旋光性，茚三酮反应为阳性。

(实施例3、盐酸1-N-乙酰基小诺霉素及其制备方法)

盐酸1-N-乙酰基小诺霉素的分子式为C₂₂H₄₄N₅O₈·2HCl，分子量为578，其构象式如下：

盐酸1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法的其余部分与实施例2相同，不同之处在于：

向实施例1所得1-N-乙酰基小诺霉素浓缩液50mL中加入的酸为6N盐酸，将调节浓缩液pH为6.0。

(实施例4、1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法)

本实施例1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法其余部分与实施例1相同，不同之处在于：

步骤⑤中，对步骤④水解反应后的混合物料采用柱层析法进行分离，本实施例采用硅胶柱层析法，柱层析柱H∶D大于10，本实施例为12；所用洗脱剂为氯仿、甲醇和稀氨水的混合物，该混合物中，氯仿、甲醇、稀氨水的重量比为2∶1∶1，所述稀氨水的浓度为10wt％。

(实施例5、硫酸1-N-乙酰基小诺霉素注射液)

本实施例的活性成分是实施例2获得的硫酸1-N-乙酰基小诺霉素。

硫酸1-N-乙酰基小诺霉素的注射液的配方如下：

制备方法：将按照上述配方量称取的硫酸1-N-乙酰基小诺霉素和无水亚硫酸钠分别溶于配量液80％的注射用水中，加入EDTA二钠盐调节溶液pH值为6.8～7.0；加活性炭适量并加注射用水至全量，混匀后过滤除去活性炭，滤液再用0.22μm微孔滤膜精滤至净，然后充氮灌封于处方所定型号的安剖瓶中，再100℃流通蒸汽灭菌30分钟即得注射液。

(实施例6、硫酸1-N-乙酰基小诺霉素冻干粉针剂)

本实施例的活性成分是实施例2获得的硫酸1-N-乙酰基小诺霉素。

硫酸1-N-乙酰基小诺霉素的冻干粉针剂的配方如下：

制备方法：将处方量的焦亚硫酸钠、氯化钠和活性成分加入配量液70％的新鲜灭菌注射用水中，待溶质全部溶解后加入低分子右旋糖酐并用灭菌注射用水加至全量，混匀后测得溶液pH为6.8～7.0，溶液用0.22μm微孔滤膜两次无菌过滤后，按每瓶2.0mL将滤液分装于管制瓶中，半加塞后置于冷冻干燥机中冻干，待干燥后真空压塞，轧盖，贴标签，即得冻干粉针剂。

(实施例7、硫酸1-N-乙酰基小诺霉素氯化钠注射液大输液)

本实施例的活性成分是实施例2获得的硫酸1-N-乙酰基小诺霉素。

配方如下：

制备方法：称取处方量的活性成分和辅料，溶于配量液80％的新鲜灭菌注射水中，加入EDTA二钠盐调整溶液pH为6.8～7.0；加活性炭适量并加注射用水至全量，混匀后过滤除去活性炭，滤液再用0.22μm微孔滤膜精滤至净，然后充氮灌封于150ml大输液瓶中，100℃流通蒸汽灭菌30分钟即得大输液。

(实施例8、硫酸1-N-乙酰基小诺霉素软膏剂)

本实施例的活性成分是实施例2获得的硫酸1-N-乙酰基小诺霉素，配方如下：

制备方法：准确称取处方量的活性成分和辅料，将硫酸1-N-乙酰基小诺霉素溶于重蒸馏水中后加入明胶和甘油，混合均匀后待明胶溶胀形成凝胶后即得软膏剂。

(实施例9、硫酸1-N-乙酰基小诺霉素滴眼液)

本实施例的活性成分是实施例2获得的硫酸1-N-乙酰基小诺霉素，配方如下：

制备方法：准确称取处方量的活性成分和辅料，搅拌下氯化钠和焦亚硫酸钠溶解于配量液80％的蒸馏水中后，加入活性成分，搅拌溶解后用0.5M的氢氧化钠溶液调节溶液pH为7.0左右，补加蒸馏水至1000ml后混匀，溶液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，澄明液灌装于滴眼瓶中，每瓶灌8.0mL，加盖置于100℃流通空气灭菌30分钟，经澄明度检查后印标扦、包装。

(试验例1、1-N-乙酰基小诺霉素体外抗结核分枝杆菌试验)

1-N-乙酰基小诺霉素的体外抗结核分枝杆菌的试验一方面是观察1-N-乙酰基小诺霉素对结核分枝杆菌的抑制作用；另外考虑到多数结核分枝杆菌对现有抗结核药物已经产生耐药性，因此本试验另一方面观察1-N-乙酰基小诺霉素对耐链霉素的结核分枝杆菌的抑制作用。

一、试验材料

1、菌株：结核分枝杆菌标准株H37Rv，来自国家菌种保藏中心(ATCC95054)；链霉素单耐药菌株BD2772-3，来自上海肺科医院结核病(肺)重点实验室保存的结核分枝杆菌临床分离株。

2、液体培养基：Middlebrook 7H9培养基(含DADC营养添加剂)：Middlebrook7H9培养基干粉5.9g，溶于900ml水后高压灭菌，pH为6.8至7.0，使用前加DADC营养添加剂100mL；其中培养基干粉和添加剂均购自美国BD公司。

3、受试药物：实施例1制备的1-N-乙酰基小诺霉素冻干粉(简称FY-2)；购自美国SIGMA公司的链霉素。

二、实验方法

1、受试菌种的培养

(1)结核分枝杆菌的培养

将结核分枝杆菌标准株H37Rv转入液体培养基，在37℃下培养2周；吸取培养菌液少许(本试验例吸取0.1mL)，移入4ml液体培养基中，加入直经2～3mm的无菌玻璃珠10～20粒(本实验例为15粒)，振荡20～30秒，静止沉淀10～20分钟(本实验例为15分钟)后吸取菌悬液上清液，用液体培养基调整比浊至1个麦氏单位，再稀释100倍，相当于1×10CFU/ml备用。

(2)耐链霉素的结核分枝杆菌的培养

耐链霉素的结核分枝杆菌的培养方法与结核分枝杆菌的培养方法基本相同，不同之处在于，向液体培养基中转入的受试菌株为链霉素单耐药菌株BD2772-3。

2、受试药物溶液的准备

将1-N-乙酰基小诺霉素用蒸馏水溶解，溶液用孔径0.22μm的滤膜过滤待用，所配置的溶液的浓度为512μg/mL。链霉素溶液的配置方法与上述1-N-乙酰基小诺霉素溶液的配置方法相同。

3、对比实验

检测时，取浓度为512μg/mL的药物溶液100μL至96孔微孔板中，再加入1mg/mL浓度的菌液100μL，然后向微孔板的各孔穴中加入液体培养基稀释，使各孔穴中的药物浓度分别为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL，于37℃下培养。同一药物稀释度设三组平行对照，对照组不加药物，接菌量分别设置为100％、10％和1％。观察两种药物对结核分枝杆菌和其中的耐链霉素的结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。

三、实验结果

表2

(表一中FY-2表示1-N-乙酰基小诺霉素，--表示未检测。)

由上表数据可见FY-2对结核分枝杆菌，特别是对其中的链霉素耐药菌株有较好的体外抑制作用。

(试验例2、1-N-乙酰基小诺霉素体外抗菌试验)

一.实验材料

1、实验药品

1-N-乙酰基小诺霉素(FY-2)，以庆大霉素国家标准品为对照检测效价：850u/mg。

硫酸小诺霉素注射液，规格：1mL:30mg(30万单位)，天津药业集团新郑股份有限公司。

庆大霉素注射液，规格：2mL:2mg(8万单位)，武汉爱民制药有限公司。

分别用无菌水稀释上述三种药品，活性成分的终浓度分别为128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.06mg/L、0.03mg/L、0.015mg/L、0.008mg/L。

2、实验菌株

实验菌株为2008年1月至2009年10月在四川、北京地区的三等甲级医院收集的临床分离的6种共40株细菌；其中革兰阳性菌21株，革兰阴性菌19株。所有实验菌株均用API系统进行鉴定。实验中用金葡球菌(ATCC25923、ATCC29213)，大肠埃希菌(ATCC25922)，绿脓杆菌(ATCC27853)做质控对照；用未含抗生素实验平皿做为实验菌生长对照。实验菌株详见表3。

表3  实验菌株

3、实验菌用培养基：Mueler-Hinton(M-H)药敏培基。

二、实验方法--最低抑菌浓度(MIC)实验

采用琼脂平皿二倍稀释药，多点接种仪(DenleyA400，EngLand)种菌法进行最低抑菌浓度MIC测定。将各实验菌稀释至106cfu/mL，然后接种在含有不同浓度的抗菌素相应培基的平皿中，置摄氏37度孵育18小时，以最小抑制细菌生长的抗菌素浓度值判为最低抑菌浓度MIC值。

三、试验结果见表4和表5：

表4  FY-2体外试验MIC测定结果

注：金葡菌MRSA，MSSA分别为甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)，甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)

表葡菌MRSE，MSSE分别为甲氧西林耐药表葡菌(MRSE)，甲氧西林敏感表葡菌(MSSE)

由表4可知，在本次试验条件下，FY-2对所试菌株呈现有抗菌活性。

另外，FY-2与小诺霉素和庆大霉素相比较，FY-2体外对革兰阳性菌的抗菌活性不如对照药品中的小诺霉素和庆大霉素，对革兰阴性菌中的大肠埃希菌的抗菌活性比小诺霉素略好些，与庆大霉素的抗菌活性相当；对所试肺炎克雷伯菌的抗菌活性优于小诺霉素和庆大霉素；对所试绿脓杆菌的抗菌活性和小诺霉素及庆大霉素相近。

表5  FY-2体外试验的MIC₅₀与MIC₉₀比较

由表5可知，FY-2对所试的金葡球菌，MIC₅₀为4μg/mL，MIC₉₀为8μg/mL；对所试验的表葡球菌，MIC₅₀为2μg/mL，MIC₉₀为16μg/mL；对所试验的链球菌属，MIC₅₀为64μg/mL，MIC₉₀为64μg/mL；对所试验的大肠埃希菌，FY-2样品的MIC₅₀为16μg/mL，MIC₉₀为32μg/mL；对所试验的克雷伯肺炎菌的MIC₅₀为2μg/mL，MIC₉₀为4μg/mL；对绿脓杆菌，FY-2样品的MIC₅₀为8μg/mL，MIC₉₀为32μg/mL。

Claims (10)

1.一种由下述式(I)表示的半合成氨基糖苷类抗生素1-N-乙酰基小诺霉素或其药用盐：

2.一种如权利要求1所述的的1-N-乙酰基小诺霉素的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

①将结构式(II)的小诺霉素碱基的C_2′-NH₂和C₃-NH₂进行甲酰化保护而获得含有结构式(III)的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的混合物料；

②将步骤①所得的混合物料中的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素分离出来，再进行浓缩；

③将步骤②所得的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的浓缩液进行乙酰化反应获得结构式(IV)的1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素；

④将步骤③得到的1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素在碱溶液中进行水解反应，去2′-NH₂和3-NH₂的甲酰化保护而得到含有1-N-乙酰基小诺霉素的混合物料；

⑤将步骤④所得的混合物料中的1-N-乙酰基小诺霉素分离出来再精制提纯。

3.根据权利要求2所述的1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法，其特征在于：步骤①中，在对小诺霉素碱基的C_2′-NH₂和C₃-NH₂进行甲酰化保护时，小诺霉素碱基与螯合剂先在溶剂中反应至TLC(薄层色谱)追踪检测小诺霉素碱基已反应完全；然后向上述反应液中加入甲酰化试剂继续反应，TLC追踪检测小诺霉素络合物已反应完全，停止反应；所得反应物料分层后取上层液，上层液经阳离子交换树脂脱去螯合离子，洗脱后浓缩备用；其中小诺霉素碱基与螯合剂的物质的量之比为1∶(3～5)，小诺霉素与甲酰化试剂的物质的量之比为1∶(3～5)。

4.根据权利要求3所述的1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法，其特征在于：所述螯合剂为特戊酸锌；所述甲酰化试剂为2-甲酰巯基苯并噻唑。

5.根据权利要求3所述的1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法，其特征在于：所述溶剂为二甲亚砜、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯或乙腈中的一种或任意2～3种组成的混合溶剂；溶剂总重为小诺霉素碱基质量的20～50倍。

6.根据权利要求3所述的1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法，其特征在于：步骤③中，在进行乙酰化反应时，将步骤②得到的浓缩液与乙酸酐在25～35℃下反应至TLC追踪检测3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素已反应完全；其中浓缩液中的3、2′-二-N-甲酰基小诺霉素与乙酸酐的摩尔比为1∶(1～3)。

7.根据权利要求6所述的1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法，其特征在于：步骤③中，进行乙酰化反应时，向反应瓶中加入步骤②得到的3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素浓缩液，再向其中加入1-N-羟基苯并噻唑及甲醇，加完后搅拌至1-N-羟基苯并噻唑完全溶解后，加入乙酸酐甲醇溶液，在25～35℃下搅拌而发生生成1-N-乙酰基-3、2’-二-N-甲酰基小诺霉素的反应，用TLC追踪检测3、2’-二甲酰基小诺霉素反应完全，反应结束。

8.根据权利要求7所述的1-N-乙酰基小诺霉素的制备方法，其特征在于：步骤④中，在碱溶液中进行水解反应时，是先将步骤③得到的混合物料浓缩除去溶剂甲醇，然后向浓缩液中加入2mol/L～5mol/L的碱溶液，在20～30℃下水解反应16至20小时；所述碱溶液为氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液，碱溶液的体积是浓缩液体积的1至3倍。

9.一种药物组合物，其中含有作为活性成分的权利要求1所述的半合成氨基糖苷类抗生素1-N-乙酰基小诺霉素或其药用盐，并且含有常规药用载体。

10.如权利要求1所述化合物在制备抗结核分枝杆菌的药物中的应用。

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