CN102317776A - 利用连接基团与间隔基团提高碳纳米管基生物传感器灵敏度的方法 - Google Patents

利用连接基团与间隔基团提高碳纳米管基生物传感器灵敏度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过以合适的比例混合连接基团和间隔基团，并将该混合物固定在碳纳米管基生物传感器的碳纳米管的表面上，以检测即使极少量目标物质的方法。这种方法能检测飞摩尔水平的具体物质，并降低了传统碳纳米晶体管传感器的检测限。因此，所述方法可检测即使极少量的目标物质，因此所述碳纳米管基生物传感器是一种用作诊断疾病的医用传感器或环境传感器的非常有用的传感器。

Description

利用连接基团与间隔基团提高碳纳米管基生物传感器灵敏度的方法
技术领域
本发明涉及一种利用连接基团与间隔基团提高碳纳米管基生物传感器灵敏度的方法。
背景技术
碳纳米管是一类新型材料，其中由6个碳原子组成的六边形相互连接形成管状。由于准一维量子结构，这些碳纳米管显示了各种独特的量子现象，并且其具有与铜相似的电导率，比金刚石(在天然材料中具有最高的热导率)高约3倍的热导率，比钢高约100倍的机械强度以及与塑料一样低的密度。由于这些特性，碳纳米管被广泛应用于材料领域。此外，碳纳米管具有优异的化学稳定性，根据它们的结构可显示出半导电或导电特性，具有小至纳米级(10-9m)的直径，并为伸长的中空结构。由于这种特性，碳纳米管在平面显示器件、晶体管、储能材料等中显示出优异的器件特性，并且非常适用于各种纳米尺寸的电子器件。
当将这种纳米尺寸的碳纳米管作为传感器使用时，它们对外部环境非常敏感，使得高灵敏度的测量成为可能，可以缩短测量时间，减少操作所需的能量损耗，可不经蛋白质改性在水溶液中进行反应，并且由于其纳米尺寸，碳纳米管可以使各种器件一体化和小型化。
此外，这种利用碳纳米管制造的传感器以电气方式进行检测，并且因此其具有以下优势：它们不需要昂贵的大型系统，例如光学分析系统或其他分析系统，它们具有高灵敏度，可免去其他标识要求，它们可以进行实时分析并能促进小型和便携式传感器的发展。
对一般晶体管来说，源极和漏极之间的沟道电流是由第三栅电极控制的，然而，对碳纳米晶体管来说，电流流量是由检测出的化学物质或由带电分子控制的。也就是说，当气态分子或生物分子被吸附到碳纳米管表面上时，就会发生电荷的排出或积累，这导致碳纳米管器件电导率的变化。因为碳纳米管一般表现为p型半导体，所以由于带正电荷的蛋白质的吸附，正栅电极(即电导率)降低。
然而，为了利用碳纳米晶体管检测生物分子，检测反应应在德拜长度范围内发生。德拜长度是半导体技术中的一个非常重要的参数，是电荷不平衡被中和时所经过的距离的测量。例如，如果一个带正电的球体被注入n型半导体，可动载流将会集中在球体周围。在距离球体几德拜长度的距离处，带正电荷的球体和电子云将呈现中性。当正(+)电荷进入电子气或海时，电子将会集中于进入的带电粒子周围，因此电子密度将会增加。因此，带电粒子的电荷将会被屏蔽，以使它们不会影响大于德拜长度的区域。这种现象被称为德拜屏蔽。电子束集中以中和带电粒子的距离被称为德拜长度。
为了检测碳纳米晶体管传感器内的目标物质，固定在碳纳米管上的受体应具有小尺寸。一般而言，用于目标物质检测的抗体具有10～15nm的尺寸，其远大于在10mM离子浓度处约3nm的德拜长度。因此，这些抗体不容易检测到与目标物质的反应，这表明这些抗体具有低灵敏度。在严重情况下，这些抗体无法检测到该反应。因此，目标物质的受体的尺寸应该非常小。
由于这个原因，作为固定在碳纳米晶体管传感器上用于检测目标物质的受体，目前使用小尺寸的材料，例如核酸适体。然而，因为很多用于多种疾病诊断的核酸适体尚未开发，所以需要用作受体的替代材料，并且新受体的开发也是迫切需要的。最近，开发了一种在碳纳米晶体管传感器中使用抗体片段作为受体降低传感器灵敏度的方法。但是，这种方法不方便，因为在碳纳米晶体管传感器的表面改性期间，必须进行用酶消化抗体的处理。
因此，为了减少这种处理的数量，本发明人引入了连接基团和间隔基团，以确保受体间的间距，并且开发了一种在连接基团上固定受体的方法，所述受体与目标物质结合或反应，从而完成本发明。
发明内容
【技术问题】
本发明的目的在于提供一种能够检测甚至极少量目标物质的碳纳米管基生物传感器、利用其检测目标物质的方法及其制造方法。
【技术方案】
为了实现上述目的，本发明提供一种包括连接基团与间隔基团的碳纳米管基生物传感器、利用其检测目标物质的方法及其制造方法。
一方面，本发明提供一种碳纳米管基生物传感器，其包括：连接基团与间隔基团，所述连接基团与间隔基团被固定在碳纳米晶体管的碳纳米管的表面上；以及生物受体，所述生物受体被固定在所述连接基团上，其中所述连接基团的一端是芘基或石墨，所述间隔基团是一种具有由以下通式1所表示的结构的化合物：
[通式1]
X-L-Y
其中X为芘基或石墨，L为(CH2)n，其中n为一个1～4的整数，Y为羟基(-OH)。
间隔基团一端的芘基或石墨可以被吸附到碳纳米管上，间隔基团另一端的羟基(-OH)可以防止非特异性吸附。
在一个实施例中，通式1的间隔基团中X可以是芘基。更具体地说，间隔基团可以是1-芘丁醇。
连接基团一端的芘基或石墨可以被吸附到碳纳米管上。
在一个实施例中，连接基团可以是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯。
所述连接基团和间隔基团的混合比例优选为1∶1～1∶9，更优选为1∶3。
生物受体可以是但不限于：抗体、酶、蛋白质、肽、氨基酸、核酸适体、脂、辅因子或碳水化合物。优选地，它可以是一种单克隆抗体、多克隆抗体或抗体结合位点片段。与生物受体结合的目标物质作为栅极。
在一个实施例中，本发明提供一种碳纳米管基晶体管生物传感器，其中连接基团是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯；间隔基团是1-芘丁醇；以及生物受体是抗人IgG F(ab′)2。
碳纳米晶体管沟道区优选具有相互缠绕的单壁和多壁碳纳米管的结构。
单壁碳纳米管优选具有直径为2～4nm的碳纳米管，多壁碳纳米管优选具有直径为50nm或50nm以下的碳纳米管，但本发明的范围不限于此。
另一方面，本发明提供一种利用碳纳米管基生物传感器检测目标物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将连接基团和间隔基团固定在碳纳米晶体管沟道区的碳纳米管上；
(ii)将能够与所述目标物质结合的生物受体固定在所述连接基团上；
(iii)对所述碳纳米晶体管的电导率变化进行测量；以及
(iv)根据所述电导率变化的数据对所述目标物质进行检测或量化；
其中所述连接基团的一端是芘基或石墨，所述间隔基团是一种具有由以下通式1所表示的结构的化合物：
[通式1]
X-L-Y
其中X是芘基或石墨，L为(CH2)n，其中n是一个1～4的整数，Y是羟基(-OH)。
另一方面，本发明提供一种碳纳米管基生物传感器的制造方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将连接基团和间隔基团固定在碳纳米晶体管沟道区的碳纳米管上；以及
(ii)将能够与目标物质结合的生物受体固定在所述连接基团上；
其中所述连接基团的一端是芘基或石墨，所述间隔基团是一种具有由以下通式1所表示的结构的化合物：
[通式1]
X-L-Y
其中X是芘基或石墨，L为(CH2)n，其中n是一个1～4的整数，Y是羟基(-OH)。
【有益效果】
根据本发明，所述间隔基团用于形成受体之间的间隔，以减少蛋白质之间的位阻。因此，碳纳米管附近目标物质的可进入性可以得到改善，从而提高传感器的灵敏度。碳纳米管表面上包括连接基团和间隔基团的生物传感器的最大优点是即使使用相对较大的受体时，也可以得到传感器的所需灵敏度(最低检测限值)。因此，即使受体的尺寸较大时，也可以提高传感器的灵敏度，以检测低浓度的目标物质。
附图说明
图1是用于检测极少量目标物质的碳纳米晶体管生物传感器的概念性视图，其中连接基团和间隔基团固定在碳纳米管的表面上。
图2是显示当表面A检测到目标蛋白质人IgG时所得到的电流特性的图。
图3是显示当表面B检测到目标蛋白质人IgG时所得到的电流特性的图。
图4是显示当表面C检测到目标蛋白质人IgG时所得到的电流特性的图。
图5是显示当表面D检测到目标蛋白质人IgG时所得到的电流特性的图。
图6是显示当表面C检测到用于非特异性吸附的非目标物质BSA(牛血清抗原)时所得到的电流特性的图。
具体实施方式
在一个优选实施例中，碳纳米晶体管沟道提供的碳纳米管是由像蜘蛛网缠绕的单壁碳纳米管组成的。此外，间隔基团和连接基团被固定在沟道之间的碳纳米管的表面上，以控制受体之间的距离，以便目标物质可以轻易地接近碳纳米管的表面。间隔基团和连接基团之间的混合比例优选为1∶1、1∶3或1∶9。
在下文中，将参考附图进一步详细地描述本发明。
本发明涉及一种生物传感器，所述生物传感器是通过以合适的比例在碳纳米晶体管的碳纳米管表面上吸附连接基团和间隔基团以改性碳纳米管表面而得到的。本发明的生物传感器可以检测用于一般疾病诊断的抗原抗体反应，或者检测环境领域中即使极低浓度的病原体。
图1是显示用于检测极少量目标物质的碳纳米晶体管生物传感器的概念性视图，其中连接基团与间隔基团是以合适的比例固定在碳纳米管的表面上。
一般而言，碳纳米晶体管传感器的原理是将与目标物质相结合的物质固定在碳纳米管表面上，并且将目标物质滴在表面上以观察电信号的变化。在图1中，表面A是通过仅将间隔基团1-芘丁醇(没有连接基团)固定在碳纳米管表面上而得到的，表面B是通过将连接基团和间隔基团以1∶1的比例混合，并将该混合物固定在碳纳米管表面上而得到的，表面C是通过将连接基团和间隔基团以1∶3的比例混合，并将该混合物固定在碳纳米管表面上而得到的，表面D是通过将连接基团和间隔基团以1∶9的比例混合，并将该混合物固定在碳纳米管表面上而得到的。
图2是显示通过仅将间隔基团(没有连接基团)固定在碳纳米管表面上，并随后将目标蛋白质IgG与碳纳米管表面反应所得的电信号变化的图。鉴于CNT-FET(碳纳米管场效应晶体管)的特性，当目标蛋白质与CNT-FET相结合时，CNT-FET的电信号应减少。然而，如图2所示，只有间隔基团固定在其上的CNT-FET的电信号增加了。这表明，间隔基团在通过干涉蛋白质接近CNT-FET表面来防止非特异性吸附方面是非常有效的。
图3～5显示了当目标蛋白质分别与表面B、C和D发生反应的电信号变化。其中可以看出，CNT-FET传感器的灵敏度随连接基团与间隔基团的比例而变。当连接基团与间隔基团的比例为1∶1时，最低检测限为10ng/ml，而当比例为1∶3时，最低检测限为减少到1pg/ml。然而，当连接基团与间隔基团的比例为1∶9时，最低检测限为1pg/ml，与比例为1∶3时的情况相同，但检测范围与比例为1∶3时的情况相比变得很窄。这被认为是因为与比例为1∶3时的情况相比，受体的数量减少。
根据本发明的方法是一种能够检测飞摩尔水平的具体物质，并可以降低传统碳纳米晶体管传感器检测极限的方法。因此，本发明的方法可以检测极少量的目标物质，并因此将用于疾病的诊断。
在下文中，为了更好地理解本发明，提供了优选实施例。然而，可以理解的是，这些实例仅仅是为了说明的目的，而不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：具有连接基团与间隔基团比例为1∶1的表面上的目标物质 的检测
将1mM的连接基团1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯与1mM的间隔基团1-芘丁醇分别以1∶1、1∶3和1∶9的比例互相混合，将所述混合物固定在构成碳纳米晶体管沟道区的网络化碳纳米管的表面上，从而在碳纳米管表面上形成一个单分子层。然后，用甲醇冲洗碳纳米晶体管传感器的沟道区，并用20μg/ml的F(ab′)2型抗人IgG(Sigma，USA)对其进行固定。随后，用PBS缓冲剂冲洗碳纳米晶体管传感器几次。在用氮气对碳纳米晶体管传感器进行干燥后，使其与1～1000ng/ml的IgG(Sigma，USA)发生反应，从而测量碳纳米晶体管传感器的电流特性。
从图3中可以看出，当与1ng/ml的IgG发生反应时，电信号与对照相比略有增加，当与10ng/ml和100ng/ml的IgG发生反应时，电信号与对照相比迅速减小。这种检测灵敏度具有的最低检出浓度与仅使用连接基团而不使用间隔基团时的最低检出浓度值相同。因此，具有连接基团与间隔基团比例为1∶1的CNT-FET传感器的检测限为10ng/ml。但是，具有这种检测限的传感器不可能作为用于检测几ng/ml的目标物质的疾病诊断传感器。
实施例2：具有连接基团与间隔基团比例为1∶3的表面上的目标物质 的检测
根据实施例1的方法，以连接基团与间隔基团的比例为1∶3的这种方式在碳纳米管表面上形成一个单分子层，以增加受体之间的距离(与实施例1相比)。如图4所示，使目标物质人IgG在100fg/ml～1000pg/ml的浓度与CNT-FET传感器发生反应，在该CNT-FET传感器表面上，以1∶3的比例固定有连接基团和间隔基团。此时，对源极和漏极之间的电流变化进行测量。因此，当与100fg/ml的人IgG发生反应时，电流与对照相比略有增加，当与1pg/ml或1pg/ml以上的人IgG发生反应时，电流随着人IgG浓度的增加而逐渐减少。然而，当与1000pg/ml的人IgG发生反应时，电流与100pg/ml的人IgG发生反应的情况相比没有降低。
实施例1的方法中的抗原抗体免疫反应显示了利用碳纳米晶体管传感器诊断疾病的严重限制。例如，对于正常人来说，PSA(前列腺特异抗原)蛋白质(对前列腺癌而言，其水平增加)具有4ng/ml或4ng/ml以下的值，而PSA蛋白质水平超过4ng/ml可被诊断为前列腺癌。
如果本方法的PSA蛋白质检测限为10ng/ml，则即使癌症已经发展了，也不会检出癌症。因为对正常人而言，另一种癌症指示剂具有10ng/ml或10ng/ml以下的值，所以为了利用生物传感器诊断疾病，碳纳米晶体管生物传感器的检测限应进一步降低。对于实施例2而言，其中碳纳米管表面上连接基团与间隔基团的比例为1∶3，当在碳纳米管的表面上检测到目标物质人IgG时，所述检测限与实施例1(其中连接基团与间隔基团以1∶1的比例固定)的情况相比显著降低至1pg/ml。因此，所述传感器的灵敏度可以显著地降低，这取决于碳纳米管表面的设计情况。
实施例3：具有连接基团与间隔基团比例为1∶9的表面上的目标物质 的检测
根据实施例1的方法，以连接基团与间隔基团的比例为1∶9的这种方式在碳纳米管表面上形成一个单分子层，以增加受体之间的距离(与实施例1相比)。此外，使人IgG在100fg/ml～1ng/ml的浓度与碳纳米晶体管传感器发生反应。此时，对源极和漏极之间的电流变化进行测量。因此，当与100fg/ml的人IgG发生反应时，电流与对照相比略有增加，这表明不能检出这种浓度的IgG，当与1pg/ml或1pg/ml以上的人IgG发生反应时，电流随着人IgG浓度的增加而逐渐减少。然而，当人IgG的浓度为100pg/ml或100pg/ml以上时，电流的消耗降低而不是增加。这被认为是因为固定在具有连接-间隔基团比例为1∶9的表面上的受体数量与固定在具有连接-间隔基团比例为1∶3的表面上的受体数量相比降低了约3倍。此外，电流的曲线迅速减少，而随后又增加。这被认为是因为带电蛋白质，所述带电蛋白质接近碳纳米管间隔基团部分，并且随后被冲洗掉而不与受体结合。因此，具有连接基团与间隔基团比例为1∶3的表面的检测范围为1～100pg/ml，而具有连接基团与间隔基团比例为1∶9的表面的检测范围显著变窄至1～10pg/ml。
【工业实用性】
如上所述，根据本发明，CNT-FET生物传感器的检测限可通过利用连接基团与间隔基团改性碳纳米管表面降低至1pg/ml。本发明的包括连接基团和间隔基团的碳纳米管基生物传感器，可以检测即使极少量的目标物质，因此其是一种能够代替用于诊断疾病的传统医用传感器或环境传感器的非常有用的传感器。

Claims (30)

1.一种碳纳米管基生物传感器，所述传感器包括：
连接基团和间隔基团，所述连接基团和所述间隔基团固定在碳纳米晶体管的碳纳米管的表面上；以及
生物受体，所述生物受体固定在所述连接基团上；
其中所述连接基团的一端是芘基或石墨，所述间隔基团是一种具有由以下通式1所表示的结构的化合物：
[通式1]
X-L-Y
其中X是芘基或石墨，L是(CH2)n，其中n是一个1～4的整数，Y是羟基(-OH)。
2.根据权利要求1所述的碳纳米管基生物传感器，其中通式1的所述间隔基团中的X是芘基。
3.根据权利要求1所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述连接基团是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯。
4.根据权利要求1所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述生物受体是抗体、酶、蛋白质、肽、氨基酸、核酸适体、脂、辅因子或碳水化合物。
5.根据权利要求1所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述碳纳米晶体管的沟道区具有相互缠绕的单壁和多壁碳纳米管的结构。
6.根据权利要求5所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述单壁碳纳米管是具有直径为2～4nm的碳纳米管，所述多壁碳纳米管是具有直径为50nm或50nm以下的碳纳米管。
7.根据权利要求1所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述间隔基团是1-芘丁醇。
8.根据权利要求1所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述连接基团是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯，所述间隔基团是1-芘丁醇，所述生物受体是抗人IgG F(ab′)2。
9.根据权利要求1～8中任一所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述连接基团与所述间隔基团的混合比例为1∶1～1∶9。
10.根据权利要求1～8中任一所述的碳纳米管基生物传感器，其中所述连接基团与所述间隔基团的混合比例为1∶3。
11.一种利用碳纳米管基生物传感器检测目标物质的方法，所述方法包括：
(i)将连接基团和间隔基团固定在碳纳米晶体管沟道区的碳纳米管上；
(ii)将能够与所述目标物质结合的生物受体固定在所述连接基团上；
(iii)对所述碳纳米晶体管的电导率变化进行测量；以及
(iv)根据所述电导率变化的数据对所述目标物质进行检测或量化，
其中所述连接基团的一端是芘基或石墨，所述间隔基团是一种具有由通式1所表示的结构的化合物：
[通式1]
X-L-Y
其中X是芘基或石墨，L是(CH2)n，其中n是一个1～4的整数，Y是羟基(-OH)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中通式1的所述间隔基团中的X是芘基。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述连接基团是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物受体是抗体、酶、蛋白质、肽、氨基酸、核酸适体、脂、辅因子或碳水化合物。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述碳纳米晶体管的沟道区具有相互缠绕的单壁和多壁碳纳米管的结构。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述单壁碳纳米管结构是具有直径为2～4nm的碳纳米管，所述多壁碳纳米管结构是具有直径为50nm或50nm以下的碳纳米管。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述间隔基团是1-芘丁醇。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述连接基团是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯，所述间隔基团是1-芘丁醇，所述生物受体是抗人IgG F(ab′)2。
19.根据权利要求11～18中任一所述的方法，其中所述连接基团与所述间隔基团的混合比例为1∶1～1∶9。
20.根据权利要求11～18中任一所述的方法，其中所述连接基团与所述间隔基团的混合比例为1∶3。
21.一种用于制造碳纳米管基生物传感器的方法，所述方法包括：
(i)将连接基团和间隔基团固定在碳纳米晶体管沟道区的碳纳米管上；以及
(ii)将能够与目标物质结合的生物受体固定在所述连接基团上；
其中所述连接基团的一端是芘基或石墨，所述间隔基团是一种具有由通式1所表示的结构的化合物：
[通式1]
X-L-Y
其中X是芘基或石墨，L是(CH2)n，其中n是一个1～4的整数，Y是羟基(-OH)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中通式1的所述间隔基团中的X是芘基。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述连接基团是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物受体是抗体、酶、蛋白质、肽、氨基酸、核酸适体、脂、辅因子或碳水化合物。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述碳纳米晶体管的沟道区具有相互缠绕的单壁和多壁碳纳米管的结构。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述单壁碳纳米管结构是具有直径为2～4nm的碳纳米管，所述多壁碳纳米管结构是具有直径为50nm或50nm以下的碳纳米管。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述间隔基团是1-芘丁醇。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述连接基团是1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯，所述间隔基团是1-芘丁醇，所述生物受体是抗人IgG F(ab′)2。
29.根据权利要求21～28中任一所述的方法，其中所述连接基团与所述间隔基团的混合比例为1∶1～1∶9。
30.根据权利要求21～28中任一所述的方法，其中所述连接基团与所述间隔基团的混合比例为1∶3。
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