CN102317332A - 具有治疗性基团的两性离子聚合物 - Google Patents
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Abstract
本发明大体上涉及两性离子的聚合物(包括两性离子的共聚物)，例如聚甲基丙烯酸结构，带有侧基的功能部分，比如治疗或生物部分。更特别的是，举例而言，本发明涉及通过自由基聚合作用和点击化学制备的磷酰胆碱取代的甲基丙烯酸聚合物，以及组合物和含该聚合物的产品，也涉及组合物的制备方法及用途，例如，作为生物或医疗试剂及其在药物输送中的用途。
Description
优先权要求和相关申请
本申请要求了2008年12月12日提交的、申请号为61/122065和2009年8月14日提交的、申请号为61/233982的美国临时申请的益处，每个临时申请的全部内容在此处都确切地被引用作为参考。
政府权利
美国政府对马萨诸塞大学的美国国家科学基金会的授权号为CTS-0553957的发明具有确实的权利。
技术领域
本发明大体上涉及两性离子的聚合物(包括两性离子的共聚物)，例如聚甲基丙烯酸结构，带有侧基官能团部分，比如治疗的或生物部分。更特别的是，举例而言，本发明涉及通过原子转移自由基聚合和点击化学制备的磷酰胆碱取代的甲基丙烯酸聚合物，以及包含这些聚合物的组合物和产品，也涉及组合物的制备方法及用途，例如，作为生物或医疗试剂的用途及其在药物传输中的用途。
背景技术
临床使用的小分子抗肿瘤试剂通常显示出较差的药物代谢动力学、有害的毒性和副作用，以及糟糕的水溶性，表现出输送困难。今天用到的许多化疗药物具有相对低的治疗指数，或治疗率，以致死剂量除以治疗剂量(LD50/ED50)来表示。本质上，治疗的益处常常被有害的副作用大大抵消。
对水溶性聚合物的共轭化疗可以大大增强它们的水溶性同时也易于给药，并且通过改变药物代谢动力学进一步降低副作用从而改善治疗效果。在体内，引起它们的有益效果的聚合物药物潜在特性是通过这种增强的渗透和滞留(enhanced permeation and retention，EPR)效果来体现，这种效果提供了一种将聚合物偶联药物被动地和选择性地摄取进入肿瘤组织的方法，并且滞留在该组织中，由于一个典型的差的淋巴引流。(Maeda等，J.Control.Release(控释杂志)，2000，65(1-2)，271-284.)
有效的聚合物疗法需要使用具备高水溶性和生物相容性的生物相容聚合物。为了增强它们的治疗效果，已将聚(乙二醇)(PEG)与多种治疗性蛋白和多肽药物相轭合，这些药物比如红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和干扰素(IFN)。聚乙二醇化明显增加了蛋白和多肽的尺寸(从而降低了肾清除率)，保护它们免受蛋白水解酶水解，而且改善了它们的药代动力学特征。(Harris等，Nat.Rev.Drug Discov.(自然评论：药物发现)，2003，2(3)，214-221.)由聚乙二醇化产生的有利条件促进了新型有效药物的发展，例如，用于治疗肝炎C的佩罗能
(聚乙二醇化干扰素α-2b)和派罗欣
(聚乙烯化干扰素α-2a)。(Veronese等，Drug Discov.Today(今日药物发现)，2005，10(21)，1451-1458.)
聚乙二醇化也用于改善小分子药物的传输，比如，用于化疗过程中。聚乙二醇化的抗癌药物候选者之一是喜树碱，其聚乙二醇化后的物质表现出适当地增加了循环时间，并减少了副作用。(Greenwald等，Bioorg.Med.Chem.(生物有机化学与医药化学)，1998，6(5)，551-562.)据Enzon公司的Prothecan报导，聚乙二醇化的喜树碱，由一条40000g/mol的聚乙二醇链组成，每一条链末端都有喜树碱，在药物的C-20-OH位置通过酯键相连。另一种化学治疗剂，阿霉素(DOX)，也通过聚乙二醇化得到改善，包括例如通过直链聚乙二醇轭合，也可以通过复杂的架构，如“蝴蝶结”树状聚合物，所得的这种DOX-聚合物疗法由于EPR效应，增加了水溶性，减小了毒性，并且增强了特异性。(Rodrigues等，Bioorg.Med.Chem.，1999，7(11)，2517-2524；Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)，美国，2006，103(45)，16649-16654.)
尽管如此，用于有效聚合物轭合的新型聚合物-药物轭合物和方法，仍然是未被满足的重大需求，并且急需通过对癌症和其他疾病更有效的治疗，来改善人体健康。
发明内容
本发明部分是基于意外发现的某些新型两性离子聚合物，以及它们的组合物和方法，和它们独特且理想的性能。这些独特的两性离子聚合物，包括共聚物，具有生物或治疗侧基。发现这些聚合物、它们的合成方法及它们的用途，都拥有广阔的、意想不到的应用，例如，在材料、诊断、治疗及药物输送等领域的应用。
比如，聚MPC共聚物适于Cu(Ⅰ)-催化的叠氮化物和炔烃的Huisgen1，3-环加成。(参见Kolb等，Angew.Chem.-Int.Edit.(德国应用化学国际版)，2001，40(11)，2004-2021；Rostovtsev等，Angew.Chem.-Int.Edit.，2002，41(14)，2596-2599；Tornoe等，J.Org.Chem.(有机化学杂志)，2002，67(9)，3057-3064；Wu等，Angew.Chem.-Int.Edit.，2004，43(30)，3928-3932；Helms等，J.Am.Chem.Soc.(美国化学会志)，2004，126(46)，15020-15021；Parrish等，Bioconjugate Chem.(生物共轭化学)，2007，18(1)，263-267.)
叠氮化物-炔烃点击反应的效率和区域选择性，及其对不同范围官能度的适应性，使得这种新型复合材料的制备成为可能。(Binder等，Macromol.Rapid Commun.(大分子研究快报)，2007，28(1)，15-54；Meldal等，Chem.Rev.(化学评论)，2008，108(8)，2952-3015.)定义明确的功能型材料也可以通过Cu(Ⅰ)-催化的ATRP与点击化学相结合来合成，如星状聚苯乙烯和葡萄糖聚合物。(Gao等，Macromolecules(大分子)，2006，39(15)，4960-4965；Ladmiral等，J.Am.Chem.Soc.，2006，128(14)，4823-4830.)
本发明在此公开了将点击化学用于生物偶联技术和聚合物疗法，包括稳定的三唑环加成、点击反应对水溶性条件和许多官能团的适应性，以及典型的在点击环加成反应中实现的高产率。
一方面，本发明大体上涉及一种共聚物，它包含结构单元：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、大约15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；并且RX是包含叠氮或碳碳叁键(炔基)的基团。在某些实施例中，RX包含叠氮基团。在其他的实施例中，RX包含碳碳叁键。在某些实施例中，两性离子部分的基团包含一个或多个磷酰胆碱和磺基甜菜碱。
另一方面，本发明大体上涉及一种共聚物，它包含结构单元：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、大约15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是约1到约12整数，如1、2、3、4、5、6)；Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；并且A是一种具有生物(例如，治疗或诊断的)活性的试剂。LA，比如可以是单键，或二价烷基、烷氧基，或芳基。在一些实施例中，A可以是一种治疗癌症的治疗剂。例如，A可选自喜树碱、伊利替康、SN-38、阿霉素和它们的衍生物，或在功能上适合点击环加成的其它药物。在其它一些实施例中，A可以是一种诊断试剂。
在另一个方面，本发明大体上涉及一种共聚物，它包含结构：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、大约15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；A是一种具有生物活性的试剂；LT是连接基团；并且T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。在某些实施例中，T选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片，或如叶酸的小分子组成的组。LT，例如，可以是酰胺基或包含酰胺键的基团。在一些实施例中，A可以是一种治疗癌症的试剂。例如，A可选自喜树碱、伊利替康、SN-38、阿霉素和它们的衍生物。在其它一些实施例中，A可以是一种诊断试剂。
在另一方面，本发明大体上涉及一种共聚物，它包含结构：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、大约15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；RX是包含叠氮或碳碳叁键的基团；LT是连接基团；并且T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。
在某些实施例中，T选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片，或如叶酸的小分子组成的组。LT，例如，可以是酰胺基或包含酰胺键的基团。
在另一方面，本发明大体上涉及一种共聚物，它包含结构：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、大约15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是一个大约1到约12整数，如1、2、3、4、5、6)；Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；A是一种具有生物活性的试剂；LT是连接基团；并且T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。在某些实施例中，T选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片，或如叶酸的小分子组成的组。LT，例如，可以是酰胺基或包含酰胺键的基团。在一些实施例中，A可以是一种治疗癌症的试剂。例如，A可选自喜树碱、伊利替康、SN-38、阿霉素和它们的衍生物。在某些实施例中，优选m大于n，A也可以是一种诊断试剂。
连接基团(例如，LT、LA、Lq)可以是任何连接部分(比如，间隔基部分(spacer moiety))，它们有助于达到特殊应用的目的，例如，可以是烷基部分、酰胺基部分、酯基部分、醚基部分、腙基部分或包含它们中一种或多种的连接部分。
在另一方面，本发明大体上涉及一种聚甲基丙烯酸酯，它包含一种或多种两性离子功能化的侧基(pedant groups)。两性离子部分和生物试剂的比例可以是大约2∶1到约10∶1或大于10∶1(例如，大约3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、12∶1、15∶1)。
在一些实施例中，本发明的共聚物中两性离子部分：A的比例可以为大约2∶1到约10∶1。在某些实施例中，此共聚物的Mn值可以为大约5kDa到约200kDa或更大(例如，大约5kDa到约100kDa，约5kDa到约50kDa，约10kDa到约30kDa，约5kDa到约100kDa)。
尽管优选实施例是共聚物，某些均聚物(其中，(Ⅰ)-(Ⅴ)的m和n有一个的值为0)对于某些应用还是有用的。
在某些实施例中，本发明的共聚物是交联的。交联可以通过本技术领域中能得到该想要结果的任何已知方法来实现。
附图说明
图1表示聚MPC-药物轭合物的一种示例性的合成方法。
图2表示肽靶向的聚合物-药物轭合物的示例性合成路线。
图3表示示例性的(a)ATRP引发剂(1、2和3)的合成方法和通过ATRP合成CPT末端的聚MPC聚合物的方法，以及(b)CPT末端的聚MPC HP2的水GPC跟踪。
图4表示示例性的(a)CPT-聚MPC轭合物一锅法合成方法；(b)共聚物CP5的水GPC跟踪；(c)CP5不同浓度下的光散射强度的点状图，并且插入的是聚合物粒径的分布。
图5表示示例性的(a)UV/V是浓度为1mg/mL的CPT-聚MPC轭合物的DMSO-MeOH(1∶1)溶液中的吸光率；(b)CP1在CD3OD中的1H-NMR图谱。
图6表示示例性的(a)在37℃下，用细胞培养基培养的CP4在不同时间点的SEC-HPLC跟踪；(b)CP4在pH 7.4条件下的PBS中培养72小时的RP-HPLC跟踪。
图7表示在37℃下，不同的培养基中，示例性的轭合物(CP4和CP5)随时间的降解。
图8表示CPT-聚MPC轭合物在人类乳房(MCF-7)、卵巢(OVCAR3)和结肠(COLO 205)腺癌细胞的细胞培养中的示例性体外细胞毒性。
图9表示CPT-聚MPC在CD3OD中示例性的1H-NMR图谱数据。
图10表示CD3OD中100mg/mL CPT-聚MPC(CP3)的示例性的13C-NMR图谱数据。
图11表示通过UV和RI通道对CPT-聚MPC轭合物(CP3)的示例性的水GPC跟踪。
图12表示CPTs从聚合物脱离之前和脱离之后，CP3在D2O中的示例性的1H-NMR图谱数据和GPC跟踪。
图13表示示例性的包含聚MPC聚合物CP6的亲水性叠氮化物的合成路线(a)；表明叠氮基团进入聚合物的CP6的红外特征(b)；CP6的水GPC跟踪(c)。
图14表示示例性的CPT-炔烃化合物14合成(a)；将CPT炔烃化合物与含聚MPC的叠氮化物进行轭合的Cu-催化的炔烃叠氮化物环加成过程(b)；CPT-聚MPC CP7的红外光谱特征(插入的是表示CPT部分的质子的NMR图谱)(c)；在RI通道(暗)和UV 370nm通道(亮)中显示的CP7的GPC跟踪。
具体实施方式
本发明的聚合物，例如磷酰胆碱取代的甲基丙烯酸酯，即，聚(甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)，和它们的共聚物组合物和方法，具有独特且理想的性能，而且可应用于许多方面，比如，可应用于材料和治疗及诊断试剂的输送方面。
聚合物疗法，特别是聚合物作为药物载体方面的用途，已经表明其有希望改善注射药物的效果。同时，临床上最先进的聚合物治疗剂是聚合物改性的蛋白质药物，小分子抗癌药物的输送也得益于聚合物轭合物。抗癌药物的聚乙二醇化，通过将聚(乙二醇)(PEG)共价连接到药物分子上，特别地改善了药物分子的水溶性，并极大地增加了它们的有效尺寸。抗癌药物改善的水溶性对于更有效地给药和给药剂量是很重要的。增加抗癌药物的流体力学半径(或循环过程中的有效尺寸)可以使它们在血流中的循环使用期(也就是清除速度更低)更长，相对于健康组织优先摄入癌组织的更开放的脉管系统(open vasculature)，而且由于差的淋巴引流，随后滞留在癌组织内。这种被动的摄入机制，被称为增强的渗透和滞留(EPR)有助于癌组织的局部化疗，因此减少了对健康组织有毒害的副作用。聚合物官能化的抗癌药物相对于比如脂质体制剂(需要在特定的浓度范围及特定的温度下溶液储存)的输送系统还具有保质期和储存方面的优势(例如，为干燥粉末)。
作为一个实施例，此处公开的聚合物轭合物可以使喜树碱及其衍生物(例如SN-38)的水溶性和药物负载水平得以改善，这是通过它们与脂肪族聚酯和磷酰胆碱基聚合物的共价连接实现的。所选择的合成方法提供了在聚合物骨架上的药物高负载的路线，远远超过报导的聚合物喜树碱药物输送系统。通过细胞培养实验，这些轭合物相对于未修饰药物的毒性评价，可以给异种移植动物模型和生物分布研究提供指引。
一些报导过的使用聚乙二醇化的喜树碱的方法，只允许每个轭合物种仅结合非常少的药物分子，结果得到较低的有效负荷量，而且需要大量的注射材料用于改善治疗效果。聚合物基疗法可用于增加药物的有效负荷量，和引入药物混合物用于克服抗药性，也可以引入特定功能团比如组织特定靶向基团。靶向部分比如抗体、小分子和低聚肽通过减少系统毒性和使得有效治疗剂量能够更低，增加了对治疗载体的益处。
包含磷酰胆碱的聚合物，例如聚(甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(聚MPC)，是已知的生物相容的聚合物。聚MPC广泛用于大量接触镜片和血液接触设备的材料和涂层，这些都要求高度生物相容性和对蛋白质吸收的抗性。(Ishihara等，J.Biomater.Appl.(生物材料应用杂志)，1998，13(2)，111-127；Ishihara等，J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)，1998，39(2)，323-330；IshiharaFront.Med.Biol.Eng.(医药与生物工程)，2000，10(2)，83-95；Lewis Colloid Surf.B-Biointerfaces(路易斯胶体与表面，B辑：生物界面)，2000，18(3-4)，261-275；Nakabayashi等，Biomaterials(生物材料)，2003，24(13)，2431-2435；Iwasaki等，Anal.Bioanal.Chem.(分析和生物分析化学)，2005，381(3)，534-546；Ishihara等，J.R.Soc.Interface(英国皇家学会界面杂志)，2009，6，S279-S291.)
由于聚MPC的商业效用明显低于功能化的PEG基衍生物(尽管MPC单体不易购得)，它在共轭化学上用于聚合物疗法方面的应用仅限于几个实施例中。使用通过原子转移自由基聚合反应(ATRP)制备的端基功能化衍生物，已经将聚MPC与如促红细胞生成素(EPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的治疗蛋白共轭结合。(Samanta等，Biomacromolecules(生物大分子)，2008，9(10)，2891-2897.)这些结构显示出的体内药代动力学特性优于聚乙二醇化的蛋白质。(Lewis等，Bioconjugate Chem.，2008，19(11)，2144-2155.)活性原子转移自由基聚合技术，例如ATRP和RAFT，可使得限定明确的、具有不同结构的聚MPC药物轭合物的制备成为可能，这是通过常规的聚乙二醇化技术所实现不了的。(Lobb等，J.Am.Chem.Soc.，2001，123(32)，7913-7914；Ma等，Macromolecules，2002，35(25)，9306-9314；Ma等，Macromolecules，2003，36(10)，3475-3484；Licciardi等，Biomacromolecules，2005，6(2)，1085-1096；Yusa等，Biomacromolecules，2005，6(2)，663-670；Yu等，Biomacromolecules，2009，10(4)，950-958.)特别地，通过共价移植至聚MPC共聚物，可以想象高的药物负载量，而聚乙二醇化限制了共价药物连接至聚合物链端。
使用聚MPC基的胶束对药物进行物理封装也有过报导。MPC共聚物可以在水中自组装形成胶束，并被制备成用以负载隔离在疏水核心内部的药物。(Licciardi等，Biomacromolecules，2005，6(2)，1085-1096；Yusa等，Biomacromolecules，2005，6(2)，663-670；Yu等，Biomacromolecules，2009，10(4)，950-958；Konno等，J.Biomed.Mater.Res.Part A(生物医学材料研究杂志A部分)，2003，65A(2)，209-214；Du等，J.Am.Chem.Soc.，2005，127(51)，17982-17983.)胶束用于药物传输的例子是胆固醇-聚MPC亲水脂分子，它被合成并试验作为一种新型药物传输系统，其中将阿霉素(ADR)治疗剂合并至该胶束核内。(Xu等，J.Control.Release，2005，107(3)，502-512.)这些胶束经历几天来释放药物，而且释放可以通过聚MPC分子重量和药物的浓度进行调节。
喜树碱及其衍生物存在的两个问题，特别是水溶性差和结构不稳定的问题，必须通过优化它们在癌症治疗方面的用途以及降低由这些用途带来的严重副作用(例如威胁生命的脱水)来解决。如本文所讨论的，聚合物很适合改善水溶性，尤其通过使用生物相容的水溶性聚合物(如聚(乙二醇))和磷酰胆碱基结构的共轭方法。在生理学条件下，喜树碱的内酯环容易开环，而开环形式对于癌细胞是没有活性的。喜树碱的衍生物，例如SN-38(在10位上为羟基)，具有相同的问题。最好通过将喜树碱衍生物20位上的-OH酰化来实现其内酯环的稳定。若酰化作用是通过与羧酸端基的PEG完成，那么得到的聚合物药物轭合物比单独的药物更易溶解且更稳定。此轭合物的每个聚合物链可包含，例如1、2、3或4个喜树碱分子。尽管这种链末端功能化途径代表喜树碱衍生物的聚合物疗法的现有技术水平，但其不能解决在优化的聚合物-药物分子中希望的高的药物负载量或靶向的需求问题。
本发明大体上涉及使用连接药物的聚合物载体的聚合物疗法，其可用于某些方面的治疗，比如某些癌症，以及诊断应用。举例而言，生物活性试剂，如喜树碱和SN-38，可以通过一定方式连接至合成的聚合物骨架，以能够同时提供好的药物溶解性、高负载量、结构稳定性且针对于一个单独的聚合物链。本发明可用于制备大分子，这些大分子具有多个连接至聚合物骨架的药物，并且用其它所需基团(也就是用于药物溶解和靶向)以确定好的比例将药物包围。这种途径产生的高药物负载量是聚合物疗法所需要的，但是通过常规的方法是达不到的，比如通过聚乙二醇化。
一方面，本发明大体上涉及一种包含以下结构的共聚物：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；并且RX是包含叠氮或碳碳叁键的基团。在某些实施例中，RX包含叠氮基团。在其他的实施例中，RX包含碳碳叁键。两性离子部分包含一个或多个磷酰胆碱和磺基甜菜碱。在某些实施例中，可优选m大于n。
磷酰胆碱的结构式如下：
磺基甜菜碱的结构式如下：
其中k是约1到约15的整数。
另一方面，本发明大体上涉及一种包含以下结构的共聚物：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是一个大约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；并且A是一种具有生物活性的试剂(例如一种蛋白质、抗体、酶或小分子，或聚合剂，或它们的碎片)。LA，比如可以是单键，或二价烷基、烷氧基，或芳基。在一些实施例中，A可以是一种治疗癌症的试剂。例如，A可选自喜树碱、伊利替康(irinotecin)、SN-38、阿霉素和它们的衍生物。在某些实施例中，可优选m大于n。
在另一个方面，本发明大体上涉及一种包含以下结构的共聚物：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是大约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；A是一种具有生物活性的试剂；LT是连接基团；并且T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。在某些实施例中，T是选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片，或如叶酸这样的小分子组成的基团。LT，例如，可以是酰胺基或含酰胺键的基团。在一些实施例中，A可以是一种治疗癌症的治疗剂。例如，A可选自喜树碱、伊利替康、SN-38、阿霉素和它们的衍生物。在某些实施例中，可优选m大于n。
连接基团(如LT、LA、Lq)可以是提供特定应用目的的任何连接部分(如间隔基部分)，例如，可以是烃基部分、氨基部分、酯基部分、醚基部分，或包含它们当中的一种或多种的连接部分。例如，连接基团可包含羰基、氨基、氨基酸、烷氧基或它们的组合。
本发明的聚合物可以是任意的或非任意的共聚物(包括统计学上的)，也可以是嵌段共聚物。为了简化分子式且不受限制，将此处使用的结构式描述成嵌段共聚物。然而，应该明白，该分子式包括任意共聚物和(多)嵌段共聚物。另外，应该明白，某些分子式(如分子式Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)包括这样的共聚物，其中末端的T基团(A基团)连接至含RZ基团的单体或含A或RX基团(或T基团)的单体。
在另一方面，本发明大体上涉及一种包含以下结构的共聚物：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是大约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；RX是包含叠氮或碳碳叁键的基团；LT是连接基团；并且T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。在某些实施例中，可优选m大于n。
在某些实施例中，T是选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片，或如叶酸这样的小分子组成的基团。LT，例如，可以是酰胺基或包含酰胺键的基团。
在另一方面，本发明大体上涉及一种包含以下结构的共聚物：
其中，每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；RZ是包含两性离子部分的基团；m是约0到约500(例如，大约1-约500、大约10-约500、15-约300、大约20-约200、大约25-约150)的整数；n是约0到约100(例如，大约1-约100、大约2-约50、大约5-约40、大约10-约30)的整数，m和n不同时为0；Lq是连接基团(例如，-(CH2)q-，其中q是约1到约12的整数，如1、2、3、4、5、6)；Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；A是一种具有生物活性的试剂；LT是连接基团；并且T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。在某些实施例中，T是选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片，或如叶酸这样的小分子组成的基团。LT，例如，可以是酰胺基或包含酰胺键的基团。在一些实施例中，A可以是一种治疗癌症的试剂。例如，A可选自喜树碱、伊利替康、SN-38、阿霉素和它们的衍生物。在某些实施例中，可优选m大于n。
在聚合物(Ⅰ)的某些实施例中，-Lq-RX可以是-(Lq′)n-RX′，其中(n′)是0或1-10；Lq′是一个双功能连接基团；RX′是氢、含叠氮化物的部分、含炔烃的部分、-Rx-y-La-A或-Rx-y-LT-T；当该共聚物包括一个或多个选自由含叠氮化物的部分、含炔烃的部分、-Rx-y-La-A和-Rx-y-LT-T组成的组的基团时，其他变量和上述限定的相同。
在另一方面，本发明大体上涉及一种聚甲基丙烯酸酯，它包含两性离子功能化的侧基和生物试剂-耦合的侧基。两性离子部分与生物试剂的比值可以为大约2∶1到约10∶1。
在一些实施例中，本发明的共聚物可具有两性离子部分：A的比值为大约2∶1到约10∶1(例如，约2∶1到约5∶1，约5∶1到约10∶1)。在某些实施例中，该共聚物的Mn为大约5-200约kDa或更大(例如，大约5kDa-约100kDa，大约5kDa-约50kDa，约10kDa-约30kDa)。
在某些实施例中，本发明的共聚物是交联的。交联可以通过本领域中能实现所需效果的任何已知的方法实现。
在本发明的一个实施例中，喜树碱和SN-38以一定方式应用于聚合物疗法或诊断，其能够同时提供药物溶解性、负载量、稳定性且针对一个单独的聚合物链。一条途径是使多个药物连接至高分子链，它包含其它确定比例的所需基团。制备了一种叠氮化物修饰的酰化的喜树碱，环加成(“点击”)化学过程是用于将其连接至含炔烃的聚合物。因此聚合物结构中，含炔烃单体的百分比决定了负载到聚合物上的喜树碱。通过水解或酶解作用，喜树碱从骨架上以活性内酯的形式脱离。聚合物疗法的这种原理有望使药物在脱离骨架之前位于肿瘤区域。
因此，本发明使新的适用广泛的聚合物药物结构的制备能够作为化学疗法中现有选择的可选方案。为此，设计该合成方法以提供不同于那些现有商业可购得的或文献报导的独特结构，但足够简单以放大规模到生产水平。
聚合物-喜树碱和聚合物-SN-38轭合物的合成
喜树碱/SN-38引发剂
20(S)-喜树碱(CPT)，一种天然的生物碱，于20世纪60年代首次从中国树-喜树中提取出来。(Wall等，J.Am.Chem.Soc.，1966，88(16)，3888-3890.)CPT表现出潜在的对大范围的癌症细胞的抗癌活性，但是其水溶性差且毒性强，也因此限制了它在临床上的使用。(Slichenmyer等，J.Natl.Cancer Inst.(美国国家癌症研究所杂志)，1993，85(4)，271-291；Muggia等，Conference on the Camptothecins-From Discovery to the Patient(在关于喜树碱的会议上-从发现到病人)；Pantazis，P.，Giovanella，B.C.，Rothenberg，M.L.，Eds.；New York Acad Sciences：Bethesda，Md(纽约科学院：贝塞斯达，美国马里兰州)，1996，p213-223.)水溶性更强的CPT衍生物，拓扑替康和伊利替康，在1997年被美国食品药品管理局(FDA)批准为用于治疗一些种类的卵巢癌和结肠癌。然而，和CPT一样，这些衍生物由于在生理pH值条件下，其结构的内酯环(E环)开环变成相应的羧酸，因此其效果受到影响。(Herben等，Clin.Pharmacokinet.(临床药物动力学)，1996，31(2)，85-102；Mathijssen等，Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)，2001，7(8)，2182-2194.)羧酸结合至血清白蛋白会促成药物毒性。为了帮助CPT溶解，开发出它与水溶性聚合物的轭合物，尤其是通过20号位上-OH的酰化作用；这有助于稳定药物的闭环形式。(Zhao等，J.Org.Chem.，2000，65(15)，4601-4606.)水溶性聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酸胺(HPMA)、聚-L-谷氨酸(PG)、环糊精基的聚合物和PEG-接枝的聚酯，被用于与CPT轭合；这些聚合-CPT轭合物不同程度上表现出超过CPT的增加的效果。(Greenwald等，J.Med.Chem.(药物化学杂志)，1996，39(10)，1938-1940；Zamai等，Mol.Cancer Ther.(肿瘤分子治疗学)，2003，2(1)，29-40；Caiolfa等，in 9thInternational Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems(在关于给药系统研究进展的第九届国际研讨会上)；Elsevier Science Bv：SaltLake City，Utah(埃尔塞维尔科学Bv：盐湖城，美国犹他州)，1999，p105-119；Singer等，in International Symposium on Recent Advances inDrug Delivery Systems(在关于给药系统最新研究进展的国际研讨会上)；Elsevier Science Bv：Bethesda，Maryland(埃尔塞维尔科学Bv：贝塞斯达，美国马里兰州)，2000，p 243-247；Zou等，Int.J.Oncol.(国际肿瘤学杂志)，2001，18(2)，331-336；Bhatt等，J.Med.Chem.，2003，46(1)，190-193；Cheng等，Bioconjugate Chem.，2003，14(5)，1007-1017；Cheng等，Mol.Pharm.(分子药物动力学)，2004，1(3)，183-193；Parrish等，Bioconjugate Chem.，2007，18(1)，263-267.)
图1描述了用2-溴丙酰溴或2-溴异丁酰溴对CPT和SN-38的20位-OH进行酰化，得到用于使MPC聚合的原子转移自由基聚合(ATRP)引发剂。这些化合物是合适的用于MPC的ATRP的引发剂，ATRP是一种可控的自由基聚合作用，可得到具有低的聚合度分布的MPC药物轭合物，这对于制备可被作为药物输送的注射剂的规整大分子来说是一个理想的特征。MPC-药物轭合物的水凝胶渗透色谱(GPC)特征表明它们是易受控制的聚合作用产物，其中分子重量为约5-约25kDa，且得到的PDI值约为1.2。轭合物的质子NMR谱中，通过水溶剂中近基线处变宽的疏水药物峰，以及通过极性有机溶剂中出现的峰，表明形成了胶囊状的药物。这些和其它轭合物的在溶液中的临界胶束浓度是通过光散射测量的。
具有侧基的CPT/SN-38的MPC。尽管CPT或SN38引发MPC聚合的用途为MPC-喜树碱/SN-38轭合物的第一个实施例提供了分析，这些轭合物每条链只含一个药物，期望得到更高的药物载荷。通过合适的ATRP引发剂(一种常规的引发剂或一种靶向基团衍生物)，将MPC和三甲基硅烷(TMS)保护的甲基丙烯酸丙炔基酯的进行共聚，可以合成聚MPC-药物轭合物从而获得高的药物负载量。图1(底部)也表示出了这一合成过程。该MPC-炔甲基丙烯酸酯共聚反应之后，用氟化四正丁基铵移除TMS基团，并且释放的炔烃与喜树碱/SN-38叠氮化物轭合。在起始聚合反应中使用的共聚用单体的比例决定了可用于与叠氮标记的药物进行反应的炔烃限度。
药物释放的测量。聚合物治疗方案依靠EPR效果用于被动的肿瘤定位；然而，它们的成功很大程度地取决于在肿瘤微环境和细胞中药物从聚合物骨架的有效释放。肿瘤，包括胰腺肿瘤，处于酸性环境中(～pH 6.0)，因此需要设计对pH敏感的聚合物药物轭合物。下面的事实进一步支持了这一推论，即大多数的聚合物药物轭合物进入细胞之后，沿着核内体溶酶体路径通行，其中它们在早期和后期的核内体内接触的pH为6.5-5.0，在溶酶体内甚至接触酸性更强的区域。
聚合物-喜树碱/SN38轭合物在不同时间点随时间变化的稳定性是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测定，也可以是在含血清和不含血清的细胞培养基中测定。血清蛋白包括不同的酯酶，在生理pH值为7.4时对聚合物药物轭合物稳定性的影响与在无血清细胞培养基和PBS中的影响相比较。使用连接有C18反相柱(250×4.6mm)的Waters(沃特世)AllianceHPLC system(高效液相色谱系统)。20分钟内，在约5％-约95％乙腈的梯度系统下，流速为1mL/min，在保留时间分别为8.0和10.6时，开环和闭环的喜树碱得到很好地分离、洗脱。这些轭合物溶解在不同pH值的PBS中，如pH 7.4和pH 5.5的PBS中，以达到37℃下模拟生理的以及核内体/溶酶体的pH值。在不同的时间间隔除去等分试样，并且加入等量的二甲基亚砜以溶解从聚合物释放的游离药物，这些样品通过HPLC进行分析，测定从轭合物中释放的药物浓度。释放药物的百分比是在样品不同时间点处的样品峰值面积的基础上计算的。
类似地，在37℃下，在不同的时间间隔，将该聚MPC-药物轭合物用细胞培养基和小鼠血清/血浆培养，接着用1∶1的乙腈/甲醇混合物终止反应。在进行漩涡和通过一个0.2μm滤膜之后，通过HPLC对样品进行分析。
高分子-喜树碱/SN-38轭合物的细胞培养研究
高分子-喜树碱/SN-38轭合物的细胞毒性。初期的细胞培养实验是使用聚MPC-药物轭合物和聚乙二醇化-聚酯-药物轭合物，使用重量百分比的喜树碱，在人乳房腺癌细胞(MCF7)(美国标准菌种收藏所，ATCC)上进行的。不像游离的药物，这些轭合物在释放药物之前不会对这些细胞引起任何显著的细胞毒性。这不仅表明这些聚MPC和聚乙二醇化的聚酯结构的生物相容特性，而且表明药物与聚合物的共价轭合可在其释放之前掩饰药物的毒性。紧接着对水解实验(见上述)中的聚合物药物备选物的成功鉴定，细胞培养试验可用于进一步表征轭合物的特征。人胰腺癌细胞株BxPC-3和AsPC-1(都是来自ATCC)在RPMI-1640培养基中培养，该培养基中补增了10％的胎牛血清(FBS)；人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2(ATCC)在杜尔贝科等人在MEM培养基的基础上研制而成的培养基(DMEM)上培养的，该培养基中增补了10％的FBS和2.5％的马血清，然后在37℃下培养。在细胞聚集约70％时，将细胞在不同的药物当量浓度下培养24、48和72小时。
这提供了有价值的与下面相关的数据，(1)聚合物药物轭合物作为时间的函数的稳定性和(2)喜树碱/SN38释放的pH敏感性。处理后的细胞存活通过使用CellTiter-Glo
发光法细胞活力检测试剂盒(普洛麦格，Promega)，在FLUOstar OPTIMA酶标仪(BMG LABTECH)上测定。然后，计算相对于用作对照样品的未处理的细胞，喜树碱或SN38-介导的毒性百分比。
用于治疗癌症的用途
此处用到的方法主要涉及癌症治疗。制备具有高药物负载量、水溶性、规整的溶液结构和组织特异性肽用于靶向药物传输的聚合物结构的能力，使得能够设计用于治疗不同类型癌症的新型聚合物疗法。该聚合物疗法途径有几个突出的特点，包括：(1)大的药物有效载荷，从而减少了对病人的给药剂量，并且通过EPR效果和对癌症细胞的靶向传输策略进行摄入，(2)使用生物可降解的或生物惰性聚合物用于药物轭合物，在循环过程中它能掩饰药物；和(3)特别在肿瘤微环境中以及细胞内部，释放连接的药物的固有能力。
聚MPC共聚物的新型点击化学
此处介绍的是适合Cu(Ⅰ)-催化的Huisgen 1，3-环加成叠氮化物和炔烃的聚MPC共聚物的制备。(参见Kolb等，Angew.Chem.-Int.Edit.，2001，40(11)，2004-2021；Rostovtsev等，Angew.Chem.-Int.Edit.，2002，41(14)，2596-2599；Tornoe等，J.Org.Chem.，2002，67(9)，3057-3064；Wu等，Angew.Chem.-Int.Edit.2004，43(30)，3928-3932；Helms等，J.Am.Chem.Soc.，2004，126(46)，15020-15021；Parrish等，Bioconjugate Chem.，2007，18(1)，263-267.)叠氮化物-炔烃点击反应的效果和区位选择性，结合它对不同范围的官能度的适应性，使得新的复合材料的制备成为可能。(Binder等，Macromol.Rapid Commun.，2007，28(1)，15-54；Meldal等，Chem.Rev.，2008，108(8)，2952-3015.)也可以通过结合Cu(Ⅰ)-催化的ATRP与点击化学合成制得确定的功能材料，例如星形的聚苯乙烯和含糖共聚物。(Gao等，Macromolecules，2006，39(15)，4960-4965；Ladmiral等，J.Am.Chem.Soc.，2006，128(14)，4823-4830.)这里开发的是点击化学对于生物轭合和聚合物疗法的优势，包括强大的三唑环加成、点击反应对含水条件和许多官能团的适应度，以及尤其在点击加成反应中实现的高产率。
此处公开的本发明使得点击化学应用于聚MPC骨架成为可能，使用酰化的和叠氮化物修饰的CPT，得到的聚MPC-CPT轭合物具有高药物负载量以及有潜力未来用于结合到CPT基的可注射的癌症疗法。为了首先证明CPT和ATRP化学的相容性，将CPT用丙酰溴和异丁酰溴功能化，得到用于MPC聚合的CPT-ATRP引发剂(图3)。这一途径得到CPT-聚MPC轭合物(每条链有一个药物)。然后，制备聚MPC共聚物，其中CPT作为侧基被整合进入该结构(图4)。后面的方法允许控制药物负载量，这是因为通过改变炔烃单体的进料比例改变了CPT的结合。通过在CPT与MPC聚合物之间结合不同的连接基团实现了不同的药物释放速率。最后，进行细胞培养实验以测试轭合物的体外活性。
实施例
CPT-末端的聚MPC的合成。CPT-ATRP引发剂1和2的合成如图3所示。CPT的20-OH基用2-溴丙酰溴及2-溴异丁酰溴进行酰化，该反应是在N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)和4-N，N-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)存在的情况下，在二氯甲烷中进行的。这些反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌1小时，得到1和2的收率分别为78％和89％。除了这两种酯连接的CPT引发剂以外，还制备了甘氨酸连接的引发剂，该引发剂是在N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在的情况下，通过与含有CPT的BocGly(叔丁氧羰基甘氨酸)-OH反应制得。用三氟乙酸(TFA)去除叔丁氧羰基并且将释放的胺和2-溴异丁酰溴反应制得引发剂3。
使用这些CPT-ATRP引发剂的MPC聚合是用Cu(Ⅰ)Br/二吡啶催化剂/配体系统，在DMSO-MeOH混合液中，在室温下进行的。单体转化率通过1H NMR图谱监视，MPC的乙烯基质子结合变成聚合物骨架上的甲基和亚甲基，使用5.6ppm(单体上的CH2＝C)、6.1ppm(单体上的CH2＝C)、1.4-2.1ppm(聚合物骨架上的CH2)和0.5-1.2ppm(聚合物骨架上的CH3)处的信号。该CPT-聚MPC轭合物(共聚物)通过沉淀入四氢呋喃(THF)中得以分离，并通过一个短硅胶柱纯化，从而去除残留的铜。选择DMSO-MeOH混合液从而为整个反应过程(引发剂溶解在DMSO中，聚合物溶解在MeOH中)提供均一性的溶液。引发剂好的溶解性对于提供低PDI聚合物的完全的聚合反应动力学是非常重要的。受控制的聚合反应特性，得到的聚MPC结构表现出窄范围的PDI值(～1.2，如图3所示)，分子重量的范围约6-17约kDa(表1)，而且数均分子重量(Mn)与单体和引发剂的比值相一致(这是通过水凝胶渗透色谱(GPC)，参考PEO标准判断的)。与1和2相比，引发剂3具有低的引发效果，需要长的反应时间(大约48小时)，并且得到高于目标值的分子重量以及更高的PDI值(1.34)。这一观察发现与含酰胺的ATRP引发剂的相关文献报导相一致。(Li等，Langmuir(朗缪尔)，2005，21(22)，9946-9954；Adams等，J.Polym.Sci.Pol.Chem.(高分子科学杂志-高分子化学)，2008，46(18)，6082-6090.)
表1.由CPT基的引发剂制备的CPT-末端的聚MPC
NMPC：每条聚合物链MPC单体单元的目标数目；直径：通过DLS测定的尺寸
CPT-末端的聚MPC的水溶性很好，这是因为亲水的两性离子结构很容易克服CPT末端部分的疏水性能。最初的动态光散射(DLS)结果表明，CPT-末端的聚MPC的稀溶液(＜20mg/mL)未表现出显著的聚合效果(也就是，实质上是分子溶解的)，估计溶液的直径尺寸范围是约5-约8nm(表1)。CD3OD中CPT-聚MPC的1H-NMR分析显示有宽的、微弱的芳香族CPT信号，在大约7-9ppm的范围内(图9)。轭合物的疏水CPT组分较差的甲醇溶解能力似乎可用于解释峰宽，这通过NMR波谱的末端基分析排除了一种可靠的分子量估计。
CPT-聚MPC轭合物的合成。在证实了CPT可有效地结合ATRP条件的情况下，以及考虑到先前工作表明的CPT对于点击化学的顺从，CPT-聚MPC通过结合这些合成方法制得。(参见Parrish等，Bioconjugate Chem.，2007，18(1)，263-267.)MPC的共聚选择使用三甲基硅烷基(TMS)保护的甲基丙烯酸炔丙酯(TMS-PgMA)，由3-TMS-炔丙醇和甲基丙烯酰氯制得。(Gao等，Macromolecules，2006，39(15)，4960-4965.)然而，这种方法被证明是令人不满意的，因为乙基2-溴代异丁酸酯引发的MPC的ATRP共聚以及TMS-PgMA得到的共聚物具有高PDI(接近2)，而且GPC通常有多种洗脱峰。此外，这些共聚物的1H-NMR图谱表明失去了TMS保护基，结果似乎是在聚合作用过程中形成了铜(Ⅰ)乙炔化物。类似的TMS去保护和铜(Ⅰ)乙炔化物的形成也在其它极性有机溶剂中被观察到过。(Ito等，Tetrahedron Lett.(四面体通讯)，1997，38(22)，3977-3980.)这种不希望的副反应可促进链之间的耦合或甚至是轻微的交联，而且对照试验表明，典型的ATRP条件下，当在溶液中搅拌TMS-PgMA时，TMS的保护基团完全丢失。
考虑到铜(Ⅰ)乙炔化物在Cu(Ⅰ)催化的Huisgen叠氮化物-炔烃点击加成反应中作为一种中间产物，通过在聚合作用开始时引入CPT-叠氮化物，使ATRP和点击环加成同时进行。这种一锅法ATRP/点击反应，如图4(a)所示，使用的反应条件类似于用于制备CPT-末端的聚MPC轭合物的条件。通过1H-NMR图谱监测单体的转化，并且通过在FTIR图谱中，在～2100cm-1处的CPT-叠氮化物N＝N＝N的伸展信号的消失，表明随后进行环加成。将以这种方式的制备得到的CPT-聚MPC轭合物通过沉淀到FHF中来纯化，紧接着在混合溶剂中通过一短硅胶塞。
如图4所示，用水GPC表征所述CPT-聚MPC共聚物，以及如图5所示的1H和13C-NMR图谱。通过一锅法得到的共聚物的PDI值在约1.25-约1.36的范围内，与CPT-末端的聚MPC轭合物的几乎相当。通过附上由GPC特征得到的UV和RI跟踪(图11)，确认了聚合物分子重量分布中的CPT官能度的均匀分布。这些结构的水溶液尺寸也使用动态光散射法(DLS)进行表征，其中，共聚物大量形成单聚体，期望其中的亲水性共聚物掩盖了疏水CPT基团的一个坍塌的核心。CPT-聚MPC轭合物没有显示出高达20mg/mL(试验的最高浓度)的临界胶束浓度(CMC)，以及这些结构的平均直径平均约为6.8nm，如图4(c)所示。
负载到聚MPC骨架上的CPT可通过调整MPC:TMS-PgMA/CPT的比值而改变，如列于表2中的样品所示例的，包括不同水平的CPT载荷。重要的是，在CPT载荷达到14重量％(wt％)(相比于包含3.7wt％CPT的SN-38-PEG-4-臂星(arm star))时实现了PDI的控制，而且该高药物载荷的聚MPC结构的水溶性非常好(＞250mg/mL，或＞35mgCPT/mL)。单独的内酯形式的CPT的溶解度为2.5μg/mL。因此，聚MPC的框架提供了数量级更高的溶解度。(Zhao等，Bioconjugate Chem.，2008，19(4)，849-859.)这些轭合物的水溶液表现出来的粘度在品质上像纯净水，与聚乙二醇化的药物明显不同，聚乙二醇化的药物经常显现出不希望得到的高溶液粘度。该高度水合的两性离子基团影响了许多性能，从水溶性到滑动摩擦(sliding friction)，使得这些结构适用于许多生物应用，包括治癌药物的传输。(Chen等，Science(科学)，2009，323(5922)，1698-1701.)
这些CPT-聚MPC轭合物的GPC-估计的分子量(针对线性PEO标准校准的)低于期望的理论值，表明一个可能的影响，即在水溶液中疏水的侧基CPT基团的分子内坍塌，干扰了相对于均一标准的溶液尺寸。若CPT基团在1N的NaOH溶液中从CPT-聚MPC轭合物上脱离，那么实际上能观察到GPC-估计的分子重量增加了(表2)。这一发现可通过CPT自由的聚MPC产物相对于由具有侧基疏水药物部分的亲水骨架组成的CPT接枝的结构的均一亲水性能进行合理的解释。
表2.使用一锅法制备CPT-聚MPC轭合物
NCPT：每条聚合物链的CPT数目；CPT-Z-N3：改变连接基团Z的CPT叠氮化合物；转化率：两个单体的平均转化率；Mn′：CPT通过水解作用脱离聚合物之后的聚合物平均分子重量；PDI′：CPT通过水解作用脱离聚合物之后的聚合物PDI。
CD3OD中的这些CPT-聚MPC轭合物的1H-NMR图谱分析再一次呈现出量化CPT的结合的困难，显示在～7-9ppm范围内只有弱的芳香族的CPT信号(图5)。这一化学位移区域也与期望的由点击环加成作用产生的三唑的质子共振相一致。对MPC-CPT共聚物的光散射研究表明了高分子单聚物的形成，其直径在约5-约10nm的范围内(表2)，其中单链上的疏水CPT部分坍塌且受到亲水MPC骨架的保护。MPC-CPT共聚物上也进行了TEM试验，而且可看见小的胶束型结构。CPT的受保护和去溶剂化使得这些高分子-聚MPC轭合物在1H NMR图谱中的CPT质子特征峰(尤其在溶液中)变宽。该CPT在7～9ppm区域内的峰强度可以通过改变NMR溶剂调整。所述CPT和MPC质子在1∶1d6-DMSO/CD3OD混合液中最容易被观察到(图9)。
发现UV图谱对于估算CPT载荷是有用的。记录负载CTP的聚合物在370nm下(图5(a))的UV吸光率，用于计算CPT在各种聚合物中的重量百分比，使用已知浓度的CPT-叠氮化合物和它们的摩尔消光系数。每种样品的CPT载荷以CPT重量百分比列于表2中。正如所期望的，CPT在370nm处的相对吸光率随结合的CPT的量的增加而增大，实验值与理论CPT的结合非常接近。
如方案1所述，在CPT和聚合物骨架之间具有不同的连接基团的CPT-聚MPC轭合物共聚物，其合成是为了研究与不同的邻近的亲水性酯键相关的药物释放。举例而言，为了与6-叠氮己酸连接情况相比较，合成了2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]醋酸。该合成是通过使用琼斯试剂，在室温下，将2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇氧化成相应的羧酸，接着通过在80℃下与NaN3反应将氯取代完成，得到叠氮化物5，总产率为53％。叠氮化物基团的存在是通过它的红外光谱在～2100cm-1处的特征信号，以及在13C NMR图谱中该α-叠氮亚甲基(CH2N3)在50.6ppm处的共振得以证实。CPT叠氮化合物是通过CPT和连接物4-6在EDC和DMAP存在的情况下发生酰化作用得到的。
幸运的是，发现这些连接物对聚合反应和环加成反应几乎没有影响，正如相对低的PDI值所表明的那样，以及在药物负载方面从理论到实验的相一致。因此，该一锅法点击/ATRP方法提供了一个简单的一步过程，将喜树碱引入亲水的、生物相容的MPC聚合物，同时很好的控制药物载荷。尽管报导了与一锅法同时发生的Cu(Ⅰ)催化的ATRP和“点击”，用于甲基丙烯酸炔丙酯和不同的有机叠氮化合物，包括1-辛基叠氮化物、甲氧基叠氮化三乙二醇和2′-叠氮乙基-α-吡喃甘露糖苷，根据我们的知识可知，此点击环加成反应没有使用TMS保护的炔烃，不用事先的去保护步骤。(Geng等，Angew.Chem.-Int.Edit.2008，47(22)，4180-4183.)易做到的去保护，和快速跟上的点击反应，使得聚合作用和点击轭合作用干净利落地同时进行，在炔烃存在的情况下，没有发生与自由基聚合相关的反应。
聚MPC-CPT轭合物的合成得到更高分子重量的结构，以及结合进聚合物骨架的更高的药物重量百分比。已经合成的聚合物-药物轭合物的一个具有代表性的范围总结在表3中。对应于突出显示的P5/EiBB的项中表示一个高分子量聚合物的实例。而对应于突出显示的P4/EiBB的项中表示一个高药物载荷的实例。分子重量的上限(通过GPC测量的)，举例而言，是～50kDa，并且药物载荷的上限大约是18重量％。
表3.一锅法聚合反应/点击法生成的聚MPC-CPT轭合物
M2：单体2；NMPC：MPC聚合的靶向程度；NM2：单体2聚合的靶向程度；NCPT：每一聚合物的CPT化合物靶向数量；CPT-Z：喜树碱化合物；转化率％：单体转化率的平均百分比；轭合率％：喜树碱接枝于聚合物的百分比；UV CPT wt％：通过紫外光谱测定的喜树碱负载重量百分比。
使用NHS ATRP引发剂的一锅法生成的聚合物
除了使用乙基异丁酰溴(EiBB)作为ATRP引发部分以外，还发现N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)也对后聚合改性有用，例如为了靶向目的轭合至蛋白质或抗体(方案2)。
合成带有NHS链终端的聚合物-药物轭合物，并且将数据总结在表4中。这些聚合物表现出好的分子重量控制能力、多分散性和药物载荷。
表4.使用NHS ATRP引发剂的一锅法生成的聚合物
M2：单体2；NMPC：MPC聚合的靶向程度；NM2：单体2聚合的靶向程度；NCPT：每一聚合物的CPT化合物的靶向数量；CPT-Z：喜树碱化合物；转化率％：单体转化率的平均百分比；轭合率％：喜树碱接枝于聚合物的百分比；UV CPT wt％：通过紫外光谱测定的喜树碱负载重量百分比。
作为一实例，用蛋白溶菌酶进行通过NHS终端-基团的聚MPC-CPT结构的轭合，而且该聚合物-蛋白轭合物使用装有阳离子交换柱的快速蛋白质液相色谱进行纯化。轭合物的载荷是使用在280和370nm处的UV吸光率计算的。其结果总结在表5中。
表5.轭合反应，每个轭合物的药物(DPC)
和每个轭合物分析的聚合物
这里的C1-C5指的是轭合物
聚MPC-阿霉素轭合物的合成。阿霉素(DOX)-聚MPC轭合物是通过一锅法ATRP/点击方法合成的。这些聚合物-药物轭合物是设计用于改变阿霉素的药物动力学的，并且通过减小与游离药物(没有轭合的)相关的副作用来增加它的治疗指数。阿霉素被6-叠氮正己烷酰肼作为连接物修饰，如方案3所示。酰肼基通过羰基与DOX反应，形成对pH敏感的腙键。DOX与聚合物之间的该新的连接键不同于能提供一些优势的聚MPC-CPT轭合物中的酯键。期望在肿瘤环境中的聚合物累积之后，该DOX从聚合物骨架中在低pH条件下得以释放，而在循环过程中生理学pH环境下，该轭合物主要保持其完整性。
6-溴己酸甲酯与叠氮化钠反应生成甲基6-叠氮己酸甲酯，然后使用水合肼转变成相应的酰肼。该连接化合物6-叠氮己烷酰肼在无水甲醇中与DOX盐酸盐轭合，加入一滴醋酸，形成所需的DOX-叠氮化合物。此流程图中显示的一锅法聚合/点击法用于合成新的DOX-聚MPC共聚物。该聚合物的用NMR图谱和GPC进行表征，药物重量百分比使用UV方法侧得。
药物从聚MPC-CPT轭合物的释放。对聚MPC-CPT轭合物进行体外药物释放试验，测定它们的相对释放速率和在传输应用方面的潜在用途。开始，将CPT-末端的聚MPC材料在不同的缓冲pH值(5.5、7.4和9.1)的PBS中培养，来测定来自聚合物骨架的CPT水解半衰期。由CPT引发剂1(一个甲基)制备的聚合物表现出缓慢的CPT释放，释放速率随pH的增加而增大。在pH 5.5时没有CPT释放，并且在pH 7.4、时间为30天时只释放了4.5％。在人体血浆中，包含了不同的酶，它们有助于药物裂解，10天的时间释放了50％的药物。有趣的是，对于由CPT引发剂2(两个甲基)制备的聚合物，没有发现CPT的释放，表明关键酯键周围局部空间环境的重要性。在聚合物和CPT之间结合了甘氨酸连接键对于加速酯键脱离和药物释放没有多少作用。
对于聚MPC-CPT轭合物，骨架到药物连接键的选择使得酯键脱离和药物释放发生显著的改变。疏水的6-叠氮己酸连接物首先被选用于CPT的轭合，得到共聚物CP1、CP2和CP3。这些结构在几种不同的溶液条件下4天的时间很少水解，表明这一连接物很可能对于未来的体内使用来说亲水性太强。为了加快酯键水解，用亲水性连接物2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]醋酸制备共聚物CP4和CP5。这些结构在不同的介质中水解实验的结果见图7和表6。举例而言，在细胞培养基中培养的CP4的SEC-HPLC跟踪见图6(a)，其中聚合物-药物轭合物在9.4分钟时流出，并且游离CPT在16.9分钟时流出。在96小时的过程中，正如所预期的，当CPT从聚合物骨架中水解时，观察到轭合物峰减弱而CPT峰增加。培养之后的共聚物反相HPLC分析见图6(b)，这证实了CPT的释放。这些共聚物，在PBS(pH 7.4)条件下半衰期为210-220h，表现出比由6-叠氮己酸连接物制备得到的CPT-聚MPC均聚物和CPT-聚MPC共聚物更快的释放曲线。这些聚合物在小鼠血清(～80h)、细胞培养基(～40h)和人体血浆(～8-9h)中表现出明显短的半衰期。烷氧基α对羧酸的亲水性和吸电子效应有助于加快酯键脱离。
表6.具有亲水性连接的CPT-聚MPC轭合物
在不同介质中的半衰期
使用聚MPC-CPT轭合物的细胞培养试验
CPT-聚MPC轭合物释放的CPT的HPLC特征证实了合适的连接键的重要性，并且对于轭合物在体外细胞培养中对不同细胞株的毒性评价提供了借鉴。以CP4和CP5为例，它们都包含7个连接键、一个酯键(9)和另一个甘氨酸连接键(10)，与PBS中的CPT释放速率相比，在人体血清中观察到一个更快的CPT释放曲线。然而，这些CPT水解半衰期慢于那些报导的聚乙二醇化-SN38轭合物，导致预期的体内更长的血液循环时间。(Zhao等，Bioconjugate Chem.，2008，19(4)，849-859.)针对不同的癌细胞株对这些聚MPC轭合物(CP4和CP5)的抗癌活性进行测试，包括人体乳腺癌细胞(MCF-7)、卵巢腺癌细胞(OVCAR 3)和结肠腺癌细胞(COLON 205)。过程是将CPT浓度相当的CP4和CP5与这些细胞培养72小时，接着使用发光酶标仪对细胞的生存能力进行测定(见实验部分)。对照包括CPT的DMSO溶液，和无菌蒸馏水中的聚MPC。剂量响应曲线表明CP4和CP5能有效的对抗此处测试的癌细胞株。重要的是，只有CPT有细胞毒性，因为聚MPC本身是无毒的(图8)。表7中的IC50值表明CP4和CP5诱发细胞毒性的IC50值高于单独的纯CPT，这是因为，CPT随着时间的变化慢慢地从聚合物链中释放出来。由表7还可以看出结肠癌细胞对CPT-聚MPC共聚物最敏感(CP4的IC50为3.9，和CP5为2.3μM)。
表7.CPT-聚MPC轭合物对不同癌细胞株的IC50值(μM)
包含聚MPC的叠氮化物的合成
在本发明的另一方面，提供了一种将CPT引入聚MPC的可供选择的方式(图13)。首先通过甲基丙烯酰氯11和2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙醇10反应合成含叠氮化物的单体12，其中2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙醇10通过2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇9和叠氮化钠合成，如图13(a)所示。使用如前所述的类似的ATRP方法，使MPC和单体12与作为ATRP引发剂的EBiB在甲醇中发生共聚。该共聚物CP6是通过硅胶柱纯化得到，接着用1H NMR、FT-IR和液相GPC进行表征。由于没有炔基，因而排除了如图13所示的低PDI值(1.21)显示出的侧链耦合的可能性。叠氮基团的进入通过2100cm-1处的IR信号得以证实，而结合1H NMR图谱表明进入大约22mol％的叠氮化物，十分接近单体的进料比例(25mol％叠氮化物)。通过液相GPC估算的聚合物分子重量与单体-引发剂的比值相吻合。该含聚MPC共聚物的新型叠氮化物为点击化学提供了一个更高摩尔百分比的官能度，这可使用点击化学用于轭合不同的含炔化合物，包括炔基取代的药物。
CPT炔烃通过点击化学与聚MPC的轭合
如图14所示，在DCM中，使用EDC/DMAP将CPT-甘氨酸与4-戊炔酸进行耦合，得到喜树碱修饰成炔烃衍生物，产率为74％，并且将该疏水的CPT炔烃化合物14与含聚MPC的叠氮化物共聚物CP6进行轭合，该过程在CuBr/bpy作为催化体系的DMSO/MeOH混合溶剂中进行。该模糊的反应混合物渐渐变得清晰，表示CPT-炔烃14和可溶性CP6进行了轭合。未轭合的14通过沉淀入THF中得以去除，并且轭合物CP7通过柱层析法去除催化剂，从而实现进一步纯化。纯化后的轭合物的IR表征表明了一些残留的叠氮化物的存在，如图14(c)所示。这些未反应的叠氮基团为进一步结合靶向基团或其它抗癌药物提供了机会。CP7的1HNMR图谱还表明在低场区(8ppm附近)有一个宽的CPT单峰，如对于由一锅法制得的轭合物所出现的一样。通过RI和UV370nm检测器的液相GPC跟踪曲线图非常吻合，这进一步证实了轭合的成功，如图14(d)所示。由UV图谱校准的CPT载荷(13.8wt％)与目标值(14wt％)非常一致。
该两步法对于炔烃取代的聚MPC方法而言，提供了一个可供选择的、值得称赞的方法。聚合物中的叠氮基团的部分反应留下了残余的叠氮化物，它们可与其它药物、靶向基团等进行轭合。
实验
材料。叠氮化钠、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)、N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2-溴丙酰溴、2-溴异丁酰溴、溴化铜(Ⅰ)、2，2′-二吡啶(bpy)、6-溴己酸、2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇、2-溴代异丁酸乙酯、3-(三甲基硅烷基)炔丙醇、甲基丙烯酰氯、小鼠血清和人体血浆，这些均购自奥德里奇(Aldrich)。20(S)-喜树碱(CPT)购自比利时(Acros)。三氧化铬购自阿法埃莎(Alfa Aesar)。TFA购自飞世尔科技(Fisher Scientific)。Boc-Gly-OH购自现代科技化工(Advanced ChemTech)。MPC单体在内部合成。经CaH2蒸馏的二氯甲烷(DCM)。所有其它材料的使用都没有额外的纯化步骤。人体结肠腺细胞(COLON 205)、卵巢腺细胞(OVCAR3)和乳腺细胞(MCF-7)购自美国标准菌种收藏所(ATCC)，RPMI 1640和MEM细胞培养基分别购自英杰公司(Invitrogen)和联发科技(Mediatech)。胎牛血清(FBS)购自亚特兰大生物公司(atlanta biologicals)，牛胰岛素购自奥德里奇。细胞生存能力是通过使用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒(普洛麦格)进行测定的。
使用仪器。NMR图谱是记录在布鲁克DPX300波谱仪上(ω13C＝0.25ω1H)。高分辨率的质谱(HRMS)数据在JEOL JMS 700 MSation上得到。UV/Vis吸光率测定在珀金-埃尔默公司(Perkin-Elmer)的Lambda25UV/Vis光谱仪上进行。IR吸光率数据在装有通用衰减全反射附件(universal ATR sampling accessory)的珀金-埃尔默公司的Spectrum One系列傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)上得到。动态光散射是在MalvernZetasizer Nano-ZS上进行，透射电子显微镜法(TEM)是在JEOL 2000 FXMARK Ⅱ 200keV投射电子显微镜上进行。分子重量和聚合物分散指数(PDIs)根据聚(环氧乙烷)标准，通过在硝酸钠(0.1M含0.02W％的NaN3)水溶液中的凝胶渗透色谱(GPC)来估算，在1.0mL/min的HP系列1050泵、HP 1047A折光率检测器和三个Waters Ultrahydrogel Linear水溶性凝胶柱(300×7.8mm)上操作。HPLC系统是由具有2996光二极管阵列检测器的Waters Alliance系统组成。样品的分析使用尺寸排阻柱Shodex KW-803，以1mL/min的速率用含10％乙醇的PBS缓冲液(pH 7.4)洗脱，并且用反相C18柱(250×4.6mm)，以1mL/min的速率用含5-95％乙腈的0.05％TFA溶液梯度洗脱。
CPT-聚MPC均聚物的合成
引发剂1的合成。CPT(600mg，1.72mmol)和DIPEA(445mg，3.45mmol)悬浮在30mL无水DCM中。在加入DMAP(440mg，3.45mmol)之后，将该悬浮液冷却至0℃。将20mL含2-溴丙酰溴(745mg，3.45mmol)的无水DCM逐滴加入到该悬浮液中。反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌1小时。在用1N HCl(50mL×3)、1％NaHCO3(50mL×3)和盐水(50mL×1)洗涤之后，有机相通过MgSO4干燥，然后过滤。使用旋转蒸发的方法将溶剂蒸发得到粗制品，用MeOH/CH2Cl2(95∶5)对其进行重结晶，得到浅黄色的固体化合物1(650mg，产率为78％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.44(s，1H)、8.29(d，J＝8.7Hz，1H)、7.97(d，J＝8.1Hz，1H)、7.86(t，J＝7.5Hz，1H)、7.70(t，J＝7.2Hz，1H)、7.52(s，1H)、5.73(d，J＝17.4Hz，1H)、5.43(d，J＝17.4Hz，1H)、5.32(s，2H)、4.62(q，J＝6.9Hz，1H)、2.16～2.41(m，2H)、1.86(d，J＝6.9Hz，3H)、1.03(t，J＝7.5Hz，3H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ169.0、167.1、157.3、152.2、148.8、146.4、145.0、131.2、130.7、129.8、128.4、128.1(2C)、120.2、96.2、76.9、67.2、50.0、38.7、31.8、21.1、7.6。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C23H20BrN2O5的计算值：483.0556，实测值：483.0587。
引发剂2的合成。CPT(300mg，0.86mmol)和DIPEA(222mg，1.72mmol)加入到20mL无水DCM中。在加入DMAP(210mg，1.72mmol)之后，将悬浮液冷却至0℃。将10mL含2-溴异丁酰溴(594mg，2.58mmol)的无水DCM逐滴加入到该悬浮液中。反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌1小时。在用1N HCl(40mL×3)、1％NaHCO3(40mL×3)和盐水(40mL×1)洗涤之后，有机相通过MgSO4干燥。减压条件下将溶剂去除得到粗制品，用MeOH/CH2Cl2(95∶5)对其进行重结晶，得到纯的浅黄色固体化合物2(300mg，产率为89％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.40(s，1H)、8.24(d，J＝8.3Hz，1H)、7.95(d，J＝7.9Hz，1H)、7.84(t，J＝7.1Hz，1H)、7.67(t，J＝7.5Hz，1H)、7.45(s，1H)、5.74(d，J＝17.0Hz，1H)、5.44(d，J＝17.0Hz，1H)、5.30(s，2H)、2.15～2.41(m，2H)、2.12(s，3H)、1.95(s，3H)、1.65(t，J＝7.5Hz，3H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ170.3、167.0、157.4、152.4、149.0、146.5、145.5、131.0、130.5、130.0、128.4、128.2、128.1、128.0、120.0、96.0、76.8、67.1、54.7、50.0、31.7、30.5、30.4、7.7。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C24H22O5N2Br的计算值：497.0712，实测值：497.0669。
引发剂3的合成。将CPT(1g，2.87mmol)和1g叔丁氧羰基保护的甘氨酸(Boc-protected glycine)(5.74mmol)加入到50mL的无水DCM中。在该悬浮液的温度降至0℃之后，向其中加入DMAP(0.7g，5.74mmol)和EDC·HCL(1.1g，5.74mmol)。该反应混合物在0℃下搅拌20分钟，然后在室温下搅拌1小时。在用1N HCl(100mL×3)、1％NaHCO3(100mL×3)和盐水(100mL×1)洗涤之后，有机相通过MgSO4干燥。减压条件下将溶剂蒸发得到化合物CPT-Gly-Boc(1.23g，产率为86％)，它将不经过进一步纯化而用于下一步骤。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.42(s，1H)、8.26(d，J＝7.6Hz，1H)、7.96(d，J＝7.5Hz，1H)、7.86(t，J＝7.5Hz，1H)、7.69(t，J＝7.5Hz，1H)、7.30(s，1H)、5.71(d，J＝17.5Hz，1H)、5.42(d，J＝17.5Hz，1H)、5.31(s，2H)、4.99(b，1H)、4.14(m，2H)、2.13～2.38(m，2H)、1.42(s，9H)、1.00(t，J＝6.9Hz，3H)。
往30mL含化合物CPT-Gly-Boc(1.3g，2.57mmol)的DCM溶液中加入4mL TFA。该反应混合物在室温下搅拌1小时，然后真空环境下去除溶剂。产品在二乙醚中沉淀出来，真空下过滤、干燥得到化合物CPT-Gly(1.2g，产率为90％)。1H NMR(DMSO，300MHz)：δ8.74(s，1H)、8.37(b，3H)、8.16(d，J＝8.2Hz，2H)、7.89(t，J＝7.6Hz，1H)、7.74(t，J＝7.6Hz，1H)、7.30(s，1H)、5.56(s，2H)、5.34(s，2H)、4.36(d，J＝18.0Hz，1H)、4.11(d，J＝18.0Hz，1H)、2.19(m，2H)、0.96(t，J＝7.4Hz，3H)。13C NMR(DMSO，75MHz)：δ167.4、167.3、156.9、152.8、148.3、146.5、145.1、132.2、131.0、130.3、129.2、129.1、128.5、128.3、119.35、96.0、77.9、66.8、50.7、40.2、30.6、8.0。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C22H20O5N3的计算值：406.1403，实测值：406.1401。
在-20℃条件下，向10mL含化合物CPT-Gly(280mg，0.69mmol)和DIPEA(267mg，2.07mmol)的DCM溶液中逐滴加入5mL含2-溴异丁酰溴(318mg，1.38mmol)的DCM。该反应混合物在-20℃下搅拌20分钟，然后在室温下搅拌2小时。在用1N HCl(30mL×3)、1％NaHCO3(30mL×3)和盐水(30mL×1)洗涤之后，有机相通过MgSO4干燥。在经过滤去除MgSO4之后，减压条件下将溶剂蒸发得到黄色固态的粗制品，用MeOH/CH2Cl2(95∶5)对其进行重结晶得到浅黄色的固态引发剂3(135mg，产率为35％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.42(s，1H)、8.25(d，J＝8.6Hz，1H)、7.90(d，J＝8.1Hz，1H)、7.86(t，J＝7.5Hz，1H)、7.69(t，J＝7.5Hz，1H)、7.15(s，1H)、5.72(d，J＝17.3Hz，1H)、5.42(d，J＝17.3Hz，1H)、5.30(s，2H)、4.20-4.40(m，2H)、2.13-2.39(m，2H)、1.97(s，3H)、1.92(s，3H)、1.01(t，J＝7.4Hz，3H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ172.2、168.7、167.1、157.3、152.2、148.9、146.6、145.2、131.2、130.8、129.7、128.4、128.2、128.1、120.1、96.0、87.2、77.2、67.2、61.6、50.0、42.1、32.4、32.3、31.9、7.6。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C26H24O6N3Br的计算值：554.0927，实测值：554.0927。
由CPT-引发剂制得MPC的ATRP的总的过程。将CPT-引发剂(29.0mg，0.06mmol)装进10mL双颈圆底烧瓶中并且使用三次循环真空氮。将鼓入氮气的DMSO(1.5mL)通过注射器注射。引发剂完全溶解之后，在氮气环境下迅速加入CuBr(8.6mg，0.06mmol)和二吡啶(18.7mg，0.12mmol)。然后向混合物中加入不同量的溶解在MeOH(0.5mL)中的MPC。该反应混合物接着进行4次冷冻-泵-溶解循环。该反应混合物在室温下搅拌，通过NMR监控聚合转化。通过将反应混合物沉淀入THF(100mL)中终止该聚合反应，并且粗制品经过滤分离。该聚合物在硅胶柱层析，用MeOH-CH2Cl2(95∶5)作为洗脱液，纯化得到浅黄色的固态聚合物。用1H NMR和水GPC对该聚合物进行表征。
CPT-聚MPC轭合物的合成
化合物5的合成。将三氧化铬(25g，164mmol)溶解在300mL 1.5M的H2SO4中，并且将溶液冷却至0℃。往琼斯试剂中逐滴加入150mL含化合物2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(8.3g，49mmol)的丙酮，然后在室温下搅拌反应混合物6小时。丙酮通过真空环境蒸发去除，使用DCM(3×100mL)萃取水溶液相。在合并的有机相通过MgSO4干燥之后，通过旋转蒸发的方法去除溶剂，得到2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙酸(6.3g，产率为70％)。IR：(cm-1)1734(C＝O)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ10.49(b，1H)、4.23(s，2H)、3.80(t，J＝5.8Hz，4H)、3.74(t，J＝5.7Hz，2H)、3.66(t，J＝5.8Hz，2H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ174.4、71.4、71.1、70.4、68.5、42.6。
将2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙酸(6.3g，34.4mmol)和NaN3(9g，138mmol)溶解在20mL水中。该反应混合物在80℃下回流48小时。冷却至室温之后，用HCl溶液将反应混合物酸化，并且用DCM(4×50mL)萃取。合并的有机相通过MgSO4干燥，接着过滤去除MgSO4。在减压的环境下去除溶剂，得到清澈的油状化合物5(5.0g，产率为77％)。IR：(cm-1)2097(N＝N＝N)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ10.80(b，1H)、4.22(s，2H)、3.79(t，J＝5.7Hz，2H)、3.69～3.74(m，4H)、3.43(t，J＝5.3Hz，2H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ174.7、71.2、70.5、70.1、68.4、50.6。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C6H12O4N3的计算值：190.0828，实测值：190.0816。
化合物6的合成。根据文献合成化合物4。室温下，6-溴己酸(5g，25.6mmol)和叠氮化钠(8.4g，129mmol)在50mL DMSO中反应生成化合物4，然后6-叠氮己酸与CPT在DCM中反应得到化合物6，其中使用EDC/DMAP作为耦合剂。IR：(cm-1)2094(N＝N＝N)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.43(s，1H)、8.24(d，J＝8.3Hz，1H)、7.97(d，J＝8.0Hz，1H)、7.87(t，J＝7.0Hz，1H)、7.70(t，J＝7.1Hz，1H)、7.23(s，1H)、5.71(d，J＝17.6Hz，1H)、5.43(d，J＝17.6Hz，1H)、5.31(s，2H)、3.25(t，J＝6.8Hz，2H)、2.45～2.63(m，2H)、2.11～2.37(m，2H)、1.71(qp，J＝7.6Hz，2H)、1.63(m，2H)、1.42(m，2H)、1.00(t，J＝7.3Hz，3H)。
化合物7的合成。0℃下，将化合物5(327mg，1.72mmol)和EDC盐酸盐(330mg，1.72mmol)溶解在20mL DCM中。加入CPT(300mg，0.86mmol)和DMAP(210mg，1.72mmol)。该反应混合物在室温下搅拌直至悬浮液变清为止。在用1N HCl(50mL×3)、1％NaHCO3(50mL×3)和盐水(50mL×1)洗涤之后，有机相通过MgSO4干燥。过滤之后，蒸发去除溶剂，得到黄色固体，用MeOH/CH2Cl2(95∶5)对其进行重结晶，得到纯的浅黄色固态化合物7(389mg，产率为87％)。IR：(cm-1)2104(N＝N＝N)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.43(s，1H)、8.42(d，J＝8.0Hz，1H)、7.97(d，J＝8.0Hz，1H)、7.87(t，J＝7.5Hz，1H)、7.70(t，J＝7.5Hz，1H)、7.23(s，1H)、5.73(d，J＝17.4Hz，1H)、5.44(d，J＝17.4Hz，1H)、5.31(s，2H)、4.39(d，J＝5.0Hz，2H)、3.77(t，J＝5.5Hz，2H)、3.66～3.70(m，4H)、3.40(t，J＝5.1Hz，2H)、2.13～2.39(m，2H)、1.00(t，J＝7.4Hz，3H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ169.7、167.3、157.3、152.2、148.9、146.4、145.4、131.2、130.7、129.6、128.4、128.2、128.2、128.1、120.3、95.9、76.4、71.1、70.6、70.0、68.2、67.2、50.6、50.0、31.8、7.6。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C26H26O7N5的计算值：520.1832，实测值：520.1821。
化合物8的合成。0℃下，将化合物5(304mg，1.60mmol)和EDC盐酸盐(461mg，2.40mmol)溶解在20mL DCM中。加入CPT-Gly TFA盐(415mg，0.8mmol)和DMAP(293mg，2.40mmol)。该反应混合物在室温下搅拌5小时，然后用1N HCl(30mL×3)、1％NaHCO3(30mL×3)和盐水(30mL×1)洗涤，有机相通过MgSO4干燥。过滤之后，旋转蒸发去除溶剂，得到粗制品，用MeOH对其进行重结晶，得到纯的化合物8(374mg，产率为81％)。IR：(cm-1)2113(N＝N＝N)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.41(s，1H)、8.26(d，J＝8.5Hz，1H)、7.95(d，J＝7.7Hz，1H)、7.85(t，J＝7.0Hz，1H)、7.68(t，J＝7.7Hz，1H)、7.37(t，J＝5.3Hz，1H)、7.27(s，1H)、5.71(d，J＝17.2Hz，1H)、5.43(d，J＝17.2Hz，1H)、5.29(s，2H)、4.46～4.54(dd，J1＝18.6Hz，J2＝6.5Hz，1H)、4.18～4.26(dd，J1＝18.6Hz，J2＝4.7Hz，1H)、4.02(q，J＝8.2Hz，1H)、3.66～3.70(m，2H)、3.62(t，J＝5.0Hz，4H)、3.34(t，J＝4.9Hz，2H)、2.14～2.40(m，2H)、1.00(t，J＝7.5Hz，3H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ170.3、169.0、167.1、157.3、152.2、148.9、146.6、145.3、131.2、130.7、129.8、128.4、128.2(2C部分重叠)、182.1、120.2、96.0、76.9、71.1、70.3、70.2、70.0、67.2、50.6、50.0、40.4、31.9、7.6。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C28H29N6O8的计算值：577.2047，实测值：577.2021。
TMS-PgMA的合成。根据文献合成TMS保护的炔烃单体。将20mL含3-(三甲基硅烷基)炔丙醇(2g，15.6mmol)和三乙胺(2g，20.3mmol)的无水乙醚降温至-20℃。逐滴加入10mL含甲基丙烯酰氯(2g，18.7mmol)的无水乙醚溶液30分钟以上。该反应混合物在-20℃的条件下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌过夜。沉淀物经过滤去除，且旋转蒸发去除溶剂。在硅胶柱色谱上用己烷-乙醚(100∶1)洗脱，对粗制品进一步纯化，得到纯的清澈油状TMS-PgMA单体(4.0g，产率为58％)。IR：(cm-1)2961(C-H)，1723(C＝O)，1638(C＝C)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ6.16(m，1H)、5.61(m，1H)、4.75(s，2H)、1.95(m，3H)、0.18(s，9H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ166.6、135.7、126.4、99.1、91.9、53.0、18.3、0.3。HRMS-FAB(m/z)：[M]+C10H16O2Si的计算值：196.0920，实测值：196.0891。
表8.CPTs从聚合物脱离前后CPT-聚MPC轭合物的Mn和PDI值
ATRP和点击化学一锅法的总的过程。CPT叠氮化合物被装入10mL双颈圆底烧瓶中，且使用三次循环真空氮。鼓入氮气的DMSO(2mL)通过注射器注射。CPT叠氮化合物完全溶解之后，注入0.7mL含2-溴代异丁酸乙酯(11.7mg，0.06mmol)、MPC和炔烃单体的甲醇溶液。在氮气环境下迅速加入CuBr(17mg，0.12mmol)和二吡啶(37.4mg，0.24mmol)。该反应混合物接着进行4次冷冻-泵-溶解循环。该反应混合物在室温下搅拌20小时，通过1H NMR监控聚合转化。该聚合反应的终止是通过将反应混合物沉淀入THF(100mL)中实现的，经过滤分离得粗制品。该粗制品通过硅胶柱层析，使用MeOH-CH2Cl2(95∶5)作为洗脱液，进一步纯化得到浅黄色的固态CPT-聚MPC轭合物。用NMR和水GPC对该聚合物进行表征。
TEM。TEM图像使用JEOL 2000FX投射式电子显微镜在200kV的加速电压下操作得到。样品是通过向碳涂层的铜格子布上滴入2μL聚合物溶液制得。样品干燥之后，使用1wt％磷钨酸溶液(PTA)对样品进行染色。
DLS测量。DLS是在莫尔文纳米级粒径分析仪(Malvern ZetasizerNano-ZS)(4mW He-Ne laser，633nm)上进行，使用一个探测器收集173度角的背散射光。光散射密度用固定测量位置和不同浓度的衰减器记录。尺寸测量是对浓度为1mg/mL的聚合物进行的，且选择最佳的位置和自动衰减器收集系统，得到最优的相关曲线。测量前一天，将样品溶解在水中，并通过0.45μm的滤膜过滤。每次测量都在25℃条件下平衡样品10分钟后进行。
聚合物中CPT载荷的校准。将化合物6、7和8均以0.01mg/mL的浓度溶解在DMSO-MeOH(1∶1)中，且共聚物(CP1-5)以0.1mg/mL的浓度也溶解在DMSO-MeOH(1∶1)中。每个聚合物上CPT的负载是基于370nm处的UV吸光率值及其相应CPT叠氮化合物的已知浓度计算得到。
药物释放试验
含聚合物的CPT以3mg/mL的浓度溶解在不同的培养基中。混合物在37℃下培养，且在不同的时间点取出部分混合物(100μL)。PBS和细胞培养基中的20μL样品通过SEC-HPLC进行分析。从小鼠血清和人体血浆中取出的样品与200μL的PBS混合，然后通过0.45μm的滤膜过滤；通过SEC-HPLC对60μL的滤液进行分析。通过标绘随着时间的变化残留在聚合物上的CPT百分比，生成稳定曲线。百分比是基于370nm处UV吸收峰面积计算的。该样品还用反相HPLC分析，基于保留时间评价释放的CPT的完整性。
细胞培养
将COLO 205和OVCAR 3癌细胞在RPMI-1640培养基中培养，该培养基中补增了10％的胎牛血清(FBS)或20％FBS和0.01mg/mL的牛胰岛素，而MCF 7细胞在补增了10％FBS和0.01mg/mL的牛胰岛素的MEM培养基中培养。所有的细胞都是在37℃下，5％CO2的细胞培养箱中培养。对于体外细胞毒性试验，细胞接种在96孔板上，且在细胞密度达到40％以后，与不同喜树碱等浓度的聚合物药物轭合物以及聚合物对照(也就是没有连接药物)一起培养72-96小时。根据FLUOstar OPTIMA酶标仪制造商(BMG LABTECH)的说明，使用CellTiter-Glo
发光法细胞活力检测试剂盒(Promega)测定处理后的细胞生存能力。喜树碱介导的毒性百分比是相对于未处理的细胞计算的，并且绘图得出剂量响应曲线。随后使用GraphPad Prism4统计分析软件计算每次处理的IC50值。
含聚MPC的叠氮化物的合成
化合物10的合成
将叠氮化钠(7.8g，120mmol)和2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(5.1g，30mmol)溶解在15mL水中，加入碘化钠作催化剂。反应混合物加热到60℃历经72小时。用4×50mL DCM萃取后，合并的有机相通过MgSO4进行干燥。溶剂通过降温条件下的旋转蒸发得以去除，残留物在真空下进一步干燥得到清澈油状化合物10(4.5g，产率为86％)。IR：(cm-1)2097(N＝N＝N)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ3.74(t，J＝4.9Hz，2H)、3.68(m，6H)、3.61(t，J＝4.6Hz，2H)、3.40(t，J＝5.0Hz，2H)、2.54(b，1H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ72.5、70.6、70.4、70.0、61.7、50.6。
化合物12的合成
在-20℃下，对40mL含化合物10(4.4g，25mmol)和三乙胺(5.5g，50mmol)的无水乙醚溶液进行搅拌。逐滴加入20mL含甲基丙烯酰氯(5.35g，50mmol)的无水乙醚。该反应混合物在-20℃下保存1小时，接着在室温下过夜。过滤将盐去除，通过降温条件下的旋转蒸发将滤液浓缩。残留物通过硅胶柱层析，使用己烷-乙醚(10∶1-1∶1)作为洗脱液梯度洗脱，进一步纯化得到纯的清澈油状化合物12(3.5g，产率为57％)。IR：(cm-1)2097(N＝N＝N)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ6.15(s，1H)、5.59(t，J＝1.4Hz，1H)、4.32(d，J＝4.8Hz，2H)、3.77(t，J＝4.9Hz，2H)、3.69(m，6H)、3.40(t，J＝4.9Hz，2H)、1.97(t，3H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ167.4、136.2、125.8、70.7(重叠)、70.1、69.2、63.9、50.7、18.3。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C10H18O4N3的计算值：244.1297，实测值：244.1291。
共聚物CP6的合成
将EBiB(11.7mg，0.06mmol)、MPC(530mg，1.8mmol)和化合物12(146mg，0.6mmol)加入10mL的双颈圆底烧瓶中，并使用三循环的真空氮。用脱气注射器注入脱气的MeOH(2mL)。在氮气环境下，快速加入CuBr(8.5mg，0.06mmol)和二吡啶(18.8mg，0.12mmol)。然后使反应混合物进行3次冷冻-泵-溶解循环。将反应混合物在室温下搅拌20小时，通过1H-NMR测得转化率为88％。通过暴露至空气终止聚合反应，通过硅胶柱层析进一步纯化粗产品，得到白色固体的共聚物CP6(426mg，产率为62％)。用FT-IR、NMR和水GPC表征聚合物。
化合物14的合成
向20mL含4-戊炔酸(78mg，0.8mmol)和DMAP(147mg，1.2mmol)的无水DCM溶液中加入CPT-Gly TFA盐(207mg，0.4mmol)。将悬浮液冷却至0℃，然后加入固态EDC盐酸盐(208mg，1.2mmol)。该反应混合物在0℃下再搅拌30分钟，然后在室温下过夜。最终的褐色清澈溶液用1％NaHCO3(20mL×3)、1N HCl(20mL×3)和盐水(20mL×1)洗涤，有机相通过MgSO4进行干燥。过滤之后，蒸发去除溶剂，得到黄色固体，用MeOH/CH2Cl2(95∶5)对其进行重结晶，得到纯的黄色固态化合物14(140mg，产率为74％)。1H NMR(DMSO，300MHz)：δ8.69(s，1H)、8.51(t，J＝5.6Hz，1H)、8.19(d，J＝8.5Hz，1H)、8.13(d，J＝8.2Hz，1H)、7.88(t，J＝7.1Hz，1H)、7.72(d，J＝7.3Hz，1H)、7.16(s，1H)、5.50(s，2H)、5.28(s，2H)、3.99～4.25(m，2H)、2.77(s，1H)、2.37(m，4H)、2.17(q，J＝7.3Hz，2H)、0.92(t，J＝7.2Hz，3H)。13C NMR(DMSO，75MHz)：δ171.3、169.5、167.5、156.9、152.8、148.3、146.4、145.5、132.0、130.9、130.2、129.4、129.0、128.4、128.2、119.4、95.7、84.1、76.7、71.9、66.8、50.7、34.3、30.8、14.5、8.0。HRMS-FAB(m/z)：[M+H]+C27H24O6N3的计算值：486.1665，实测值：486.1674。
轭合物CP7的合成
共聚物CP6(200mg)和化合物14(43mg，0.09mmol)在脱气的MeOH(0.5mL)和DMSO(1.5mL)中搅拌。在氮气环境下迅速加入CuBr(12.8mg，0.09mmol)和二吡啶(28.1mg，0.18mmol)。该反应混合物接着经受3次冷冻-泵-溶解循环。22小时之后，反应悬浮物变成澄清液，将反应混合物在室温下再搅拌26小时。通过沉淀入无水THF中得到粗制品，接着进行过滤。粗制品在硅胶柱中进一步纯化，得到纯的褐色固态轭合物CP7(121mg，产率为50％)。用1H NMR、FT-IR和GPC对该轭合物进行表征。负载在聚合物中的CPT的UV校准以上述相同的方式进行的。
通过引用方式的合并
参考和引用的其它文件，例如专利、专利申请、专利出版、杂志、书籍、报刊、网页内容，已在此说明书中注明。将所有这些文件用于所有目的的全部内容以参考引用的方式并入本文。
等同物
采用的典型实施例是用于帮助解释本发明的，而不是为了，也不应不解释为，限制本发明的范围。事实上，本发明的各种修改及其许多其它的实施方案，除了此处介绍的以外，对于本领域的技术人员来说，能够从本文件的所有内容，包括采用的实施例和此处引文作为参考的科学文献和专利文献变得显而易见。后面的实施例包括重要的额外信息、范例和指导，它们适应于本发明在它的不同的实施方案和等同物中的实践。
Claims (49)
1.一种共聚物，它包含结构单元：
其中，
每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；
每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；
RZ是包含两性离子部分的基团；
m是约1到约500的整数；
n是约1到约100的整数；并且
RX是含叠氮或碳碳叁键的基团。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其中RX包含叠氮基团。
3.根据权利要求1所述的共聚物，其中RX包含碳碳叁键。
4.根据权利要求1所述的共聚物，其中两性离子部分包含一个或多个磷酰胆碱和磺基甜菜碱。
5.根据权利要求1所述的共聚物，其中RZ包含共价连接至酯基的连接基团LZ和两性离子部分
-LZ-两性离子。
6.根据权利要求5所述的共聚物，其中LZ是单键、二价烷基、烷氧基或芳基。
7.根据权利要求6所述的共聚物，其中LZ是单键，或二价的(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基，或(C3-C10)芳基。
8.根据权利要求7所述的共聚物，其中LZ包含苯基。
9.根据权利要求7所述的共聚物，其中LZ是(C1-C6)烷基。
10.根据权利要求4所述的共聚物，其中两性离子部分包含磷酰胆碱。
11.根据权利要求1所述的共聚物，其中每个R1、R2、R3和R4均独立地选自由氢、甲基、乙基和氟组成的基团。
12.根据权利要求1所述的共聚物，其中Lq是-(CH2)q-，其中q是约1到约12的整数。
13.一种共聚物，它包含结构单元：
其中，
每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；
每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；
RZ是包含两性离子部分的基团；
m是约1到约500的整数；
n是约1到约100的整数；
Lq是连接基团；
Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；并且
A是具有生物活性的试剂。
14.根据权利要求13所述的共聚物，其中LA是单键，或二价烷基、烷氧基，或芳基。
15.根据权利要求13所述的共聚物，其中LA是单键，或二价的(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基，或(C3-C10)芳基。
16.根据权利要求15所述的共聚物，其中LA包含苯基。
17.根据权利要求15所述的共聚物，其中LA是(C1-C6)烷基。
18.根据权利要求13所述的共聚物，其中LA包含下列部分：
其中RAL选自H、-OH、卤素、烷基和烷氧基。
19.根据权利要求13所述的共聚物，其中A是阿霉素或它的衍生物：
20.一种共聚物，它包含结构：
其中，
每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；
每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；
RZ是包含两性离子部分的基团；
m是约1到500的整数；
n是约1到100的整数；
Lq是连接基团；
Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；
A是具有生物活性的试剂；
LT是连接基团；并且
T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。
21.根据权利要求20所述的共聚物，其中，T是选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片、或小分子组成的组。
22.根据权利要求20所述的共聚物，其中，LT包含酰胺基。
23.根据权利要求20所述的共聚物，其中RX包含叠氮基团。
24.根据权利要求20所述的共聚物，其中RX包含碳碳叁键。
25.根据权利要求20所述的共聚物，其中两性离子部分包含一个或多个磷酰胆碱和磺基甜菜碱。
26.根据权利要求20所述的共聚物，其中RZ包含一个共价连接至酯基的连接基团LZ和两性离子部分
-LZ-两性离子。
27.根据权利要求26所述的共聚物，其中LZ是单键、二价烷基、烷氧基或芳基。
28.根据权利要求27所述的共聚物，其中LZ是单键，或二价的(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基，或(C3-C10)芳基。
29.根据权利要求28所述的共聚物，其中LZ包含苯基。
30.根据权利要求28所述的共聚物，其中LZ是(C1-C6)烷基。
31.根据权利要求25所述的共聚物，其中两性离子部分包含磷酰胆碱。
32.根据权利要求20所述的共聚物，其中每个R1、R2、R3和R4均独立选自由氢、甲基、乙基和氟组成的基团。
33.一种共聚物，包含结构：
其中，
每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；
每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；
RZ是包含两性离子部分的基团；
m是约1到约500的整数；
n是约1到约100的整数；
Lq是连接基团；
RX是包含叠氮或碳碳叁键的基团；
LT是连接基团；并且
T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。
34.根据权利要求33所述的共聚物，其中，T是选自由抗体、蛋白质、核酸识体或它们的碎片、或如叶酸的小分子组成的组。
35.根据权利要求33所述的共聚物，其中，LT包含酰胺基。
36.根据权利要求20或33中任何一项所述的共聚物，其中A是一种治疗癌症的治疗剂。
37.根据权利要求36所述的共聚物，其中A选自喜树碱、伊利替康、SN-38和它们的衍生物。
38.根据权利要求13和20中任何一项所述的共聚物，其中两性离子部分：A的比例是约2∶1到10∶1。
39.根据权利要求1、13、20和33中任何一项所述的共聚物，其中所述共聚物的Mn为约5kDa到约100kDa。
40.根据权利要求39所述的共聚物，其中该共聚物的Mn为约5kDa到约50kDa。
41.一种包含两性离子官能团的侧基和生物试剂耦合的侧基的聚甲基丙烯酸酯。
42.根据权利要求41所述的聚合物，其中两性离子部分和生物试剂的比例大于约2∶1。
43.根据权利要求41所述的聚合物，其中所述聚合物的Mn为约5kDa到约100kDa。
44.一种均聚物或共聚物，包含结构：
其中，
每个R1和R3独立地为氢、烷基、卤素；
每个R2和R4独立地为氢、(C1-C15)烷基、(C1-C15)烷氧基、卤素；
RZ是包含两性离子部分的基团；
m是约0到约500的整数；
n是约0到约100的整数，m和n不同时为0；
Lq是连接基团；
Rx-y选自由下式组成的基团：
LA是连接基团；
A是具有生物活性的试剂；
LT是连接基团；并且
T是对生物靶标具有靶向作用的部分，其中A对该生物靶标具有生物活性。
45.根据权利要求1-44中任何一项所述的聚合物，其中所述聚合物是交联的。
46.根据权利要求45所述的聚合物，其中所述聚合物是嵌段共聚物。
47.一种制备根据权利要求1-44中任何一项所述的聚合物的方法，其中所述方法包含原子转移自由基聚合和点击化学过程。
48.根据权利要求47所述的方法，其中该方法包含使用ATRP引发基团。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述ATRP是乙基异丁酰溴。
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