CN118063689A - 成纤维细胞激活蛋白-α响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种FAP‑α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物‑药物偶联物及其制备方法和应用。所述FAP‑α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物‑药物偶联物具有式(1)所示的结构。本发明提供的FAP‑α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物‑药物偶联物具有很高的抗肿瘤疗效，能够显著降低肿瘤体积。

Description

成纤维细胞激活蛋白-α响应水解致电荷翻转的聚合物-药物 偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种成纤维细胞激活蛋白-α(FAP-α)蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
随着医疗的进步发展，越来越多的治疗应用到临床，包括手术切除、化学药物疗法以及放射性疗法，其中，手术切除辅助化学治疗是唯一可以治愈癌症的方法，但并不是所有患者都适合手术切除，需要考虑到身体自身状况，并且手术切除存在术后并发症、手术切除不彻底以及切除过多造成的创伤性等缺点。对于无法进行手术切除的患者，则只能选择化学药物疗法和放射性疗法进行治疗。尽管目前临床上多种药物的综合化疗方法和不断研发的新型化疗药物延长了患者的生存期并提高了生存率，但是存在着产生毒副作用以及治疗效果并不显著等缺点，这不仅会减低患者的生存质量同时也限制了临床药物的治疗连续性，最终导致治疗效果有限、副作用过大等现状。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种具有良好抗肿瘤效果的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物。
本发明的第二目的在于提供一种FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法。
本发明的第三目的在于提供由上述方法制备得到的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物。
本发明的第四目的在于提供上述FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物在药物载体制备过程中的应用。
具体地，本发明提供的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物具有式(1)所示的结构；
R11为连接子；R12为抗肿瘤药物基团；R21为-NH-(CH2)x-、-O-(CH2)x-、-CO-(CH2)x-或-S-(CH2)x-，x为2～6；R22为两性离子基团；R31为-NH-、-O-、-OCO-、-NHCO-、-COO-、-CONH-、-S-或-(CH2)z-COO-(CH2)t-S-，q为1～5，z为0～5，t为1～5；R32为两性离子基团；m、n、p分别为三种结构单元的摩尔比例且m:n:p为(5～40％):(10～95％):(0～85％)且m+n+p＝100％。
在一种优选实施方式中，R11选自以下结构中的至少一种；
式(2)中，R13为芳环、-CO-(CH2)z-、-O-(CH2)z-、-NH-(CH2)z-、-CO-NH-(CH2)z-、-S-(CH2)z-、-CO-(CH2CH2O)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
式(3)中，R14为芳环、-CO-(CH2)z-、-O-(CH2)z-、-NH-(CH2)z-、-CO-NH-(CH2)z-、-S-(CH2)z-、-CO-(CH2CH2O)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
式(4)中，R15为芳环、-CO-(CH2)z-CO-、-O-(CH2)z-CO-、H-(CH2)z-CO-、-S-(CH2)z-CO-、-CO-(CH2CH2O)z-CO-、-O-(CH2CH2O)z-CO-、-NH-(CH2CH2O)z-CO-或-S-(CH2CH2O)z-CO-，z为1～14；R16为H或
式(5)中，R17为芳环、-CO-(CH2)z-CO-、-O-(CH2)z-CO-、H-(CH2)z-CO-、-S-(CH2)z-CO-、-CO-(CH2CH2O)z-CO-、-O-(CH2CH2O)z-CO-、-NH-(CH2CH2O)z-CO-或-S-(CH2CH2O)z-CO-，z为1～14；R18为H或
式(6)中，R19为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-NH-、-S-(CH2)z-NH-、-CO-NH-(CH2)z-或-S-(CH2)z-O-，z为1～14；
式(7)中，R20为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-O-、-S-(CH2)z-O-、-CO-NH-(CH2)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
以上各式中，linker各自独立地为具有还原、活性氧、pH以及酶响应性中至少一种的基团。
在一种优选实施方式中，R22选自以下结构中的至少一种；
以上各式中，R23和R24各自独立地为H或C1～C5的烷基，R25和R27各自独立地为C1～C5的亚烷基，R26为C1～C5的烷基。
在一种优选实施方式中，R32选自以下结构中的至少一种；
以上各式中，R33和R34各自独立地为H或C1～C5的烷基，R35和R37各自独立地为C1～C5的亚烷基，R36为C1～C5的烷基。
在一种优选实施方式中，所述聚合物-药物偶联物的数均分子量为10,000～80,000Da。
在一种优选实施方式中，m为5～40％，n为10～95％，p为0～85％。
在一种优选实施方式中，所述聚合物-药物偶联物为无规共聚物或嵌段共聚物。
本发明提供的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法包括将药物前体修饰至聚合物骨架上获得；所述聚合物骨架具有式(8)所示的结构；
R11`为连接子；R21为-NH-(CH2)x-、-O-(CH2)x-、-CO-(CH2)x-或-S-(CH2)x-，x为2～6；R22为两性离子基团；R31为-NH-、-O-、-OCO-、-NHCO-、-COO-、-CONH-、-S-或-(CH2)z-COO-(CH2)t-S-，q为1～5，z为0～5，t为1～5；R32为两性离子基团；m、n、p分别为三种结构单元的摩尔比例且m:n:p为(5～40％):(10～95％):(0～85％)且m+n+p＝100％。
在一种优选实施方式中，在FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备过程中，所述修饰的方式为聚合物骨架中的R11`与药物前体进行点击化学反应，所述点击化学反应的基团选自叠氮、反式环辛烯、四嗪、炔烃、二苯并环辛炔、双环[6,1,0]壬炔、硫辛酸和马来酰亚胺中的至少一种。
在一种优选实施方式中，在FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备过程中，R11`选自以下结构中的至少一种；
式(9)中，R12`为芳环、-CO-(CH2)z-、-O-(CH2)z-、-NH-(CH2)z-、-CO-NH-(CH2)z-、-S-(CH2)z-、-CO-(CH2CH2O)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
式(10)中，R13`为芳环、-CO-(CH2)z-CO-、-O-(CH2)z-CO-、H-(CH2)z-CO-、-S-(CH2)z-CO-、-CO-(CH2CH2O)z-CO-、-O-(CH2CH2O)z-CO-、-NH-(CH2CH2O)z-CO-或-S-(CH2CH2O)z-CO-，z为1～14；R14`为H或
式(11)中，R15`为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-NH-、-S-(CH2)z-NH-或-S-(CH2)z-O-，z为1～14；
式(12)中，R16`为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-O-、-S-(CH2)z-O-、-CO-NH-(CH2)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14。
在一种优选实施方式中，在FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备过程中，所述聚合物骨架具有以下结构中的至少一种；
R17`、R21`和R31`各自独立地为H或C1～C5的烷基；R18`、R22`和R32`各自独立地为O或NH。
在一种优选实施方式中，在FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备过程中，所述聚合物骨架由FAP-α响应的单体通过无规共聚或者嵌段共聚获得。
在一种优选实施方式中，在FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备过程中，所述药物前体具有以下结构中的至少一种；
linker为具有还原、活性氧、pH以及酶响应性中至少一种的基团；Drug为抗肿瘤药物。
在一种优选实施方式中，在FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备过程中，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、吉西他滨、顺铂、卡铂、紫杉醇、喜树碱、依喜替康、丝裂霉素C、甲氨蝶呤、7-乙基-10-羟基喜树碱、美登素、alpha-鹅膏覃碱、MMAE、MMAF、DM4、卡奇霉素、藤黄酸、大黄酸、长春新碱、秋水仙碱、艾日布林、Taltobulin、美登醇、泰兰斯他汀A、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、PiericidinA、安丝菌素P 3、尾海兔素10和β-Amanitin中的至少一种。
在一种优选实施方式中，在FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备过程中，所述药物前体具有以下结构中的至少一种；
本发明还提供了由上述方法制备得到的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物。
此外，本发明还提供了所述FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物在药物载体制备过程中的应用。
现有的抗肿瘤药物研制的理论基础之一是利用药物在肿瘤部位的穿透性，抗肿瘤药物在肿瘤组织中的渗透问题是阻碍药物发挥的关键因素。肿瘤组织内具有细胞密度高、基质致密以及瘤内压高等病理特征，因此，抗肿瘤药物的大尺寸使其在肿瘤内扩散非常困难，从血管渗出后不能扩散至远离血管的细胞完成递药，导致疗效低。
本发明的发明人经过深入且广泛研究之后发现，肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)会表达FAP-α，部分肿瘤也会表达FAP-α。基于此，本发明巧妙地利用FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的特性而合成具有式(1)所示结构的聚合物-药物偶联物用于肿瘤的治疗，利用成纤维细胞激活蛋白(FAP-α蛋白)切割多肽诱导电荷翻转，使其电荷由两性转变为正电，进而吸附并触发内皮细胞内吞、胞内传输和对侧外排(转胞吞)，由于转胞吞过程是细胞耗费能量的主动运输过程，因此肿瘤内的高渗透压和高细胞密度等阻碍传统被动扩散的因素对本主动输送过程没有作用，因此该载体具有很强的瘤内渗透能力，可将药物输送给每一个细胞，从而具有很高的抗肿瘤疗效，能够显著降低肿瘤体积。
附图说明
图1为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)和实施例1-5及实施例1-7所得两种药物偶联聚合物的4T1细胞毒性测试结果图；
图2为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)和实施例1-5及实施例1-7所得两种药物偶联聚合物的药物动力学评价结果图；
图3为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)和实施例1-5及实施例1-7所得两种药物偶联聚合物的抑瘤实验结果图；
图4为(P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT))聚合物在FAPα蛋白作用下发生电荷翻转结果图；
图5为喜树碱(CPT)和实施例2-5及实施例2-7所得两种药物偶联聚合物的细胞毒性测试结果图；
图6为喜树碱(CPT)和实施例2-5及实施例2-7所得两种药物偶联聚合物的药物动力学评价结果图；
图7为喜树碱(CPT)和实施例2-5及实施例2-7所得两种药物偶联聚合物的抑瘤实验结果图；
图8为喜树碱(CPT)和实施例3-7及实施例3-8所得两种药物偶联聚合物的细胞毒性测试结果图；
图9为喜树碱(CPT)和实施例3-7及实施例3-8所得两种药物偶联聚合物的药物动力学评价结果图；
图10为喜树碱(CPT)和实施例3-7及实施例3-8所得两种药物偶联聚合物的抑瘤实验结果图。
具体实施方式
本发明提供的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物包括载药结构单元和FAP-α蛋白响应结构单元，优选还包括亲水结构单元。所述聚合物-药物偶联物中只要包括载药结构单元和FAP-α蛋白响应结构单元便能够实现FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转，获得良好的抗肿瘤效果。当所述聚合物-药物偶联物还包括亲水结构单元时，可以有效避免聚合物-药物偶联物胶束被清除，增长药物的作用时间，达到在血液中长时间发挥作用的目的。
在本发明中，所述FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物具有式(1)所示的结构。其中，式(1)仅用于表示FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的组成及各结构单元的含量，不用于表示各结构单元之间的连接关系。所述FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物可以为无规共聚物，也可以为嵌段共聚物，没有特别的限定。此外，载药结构单元的摩尔含量用m表示，FAP-α蛋白响应结构单元的摩尔含量用n表示，亲水结构单元的摩尔含量用p表示。其中，m、n和p通过投料量确定。m:n:p为(5～40％):(10～95％):(0～85％)且m+n+p＝100％。具体地，m为5～40％，如5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、38％、40％或它们之间的任意值。n为10～95％，如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或它们之间的任意值。p为0～85％，如0、0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或它们之间的任意值。
在本发明中，所述载药结构单元具有式(1-1)所示的结构：
式(1-1)中，R11为连接子；R12为抗肿瘤药物基团。其中，R11只要能够将抗肿瘤药物键连至聚合物主链上即可，优选具有式(2)-式(7)所示的结构。式(2)-式(7)中，z为1～14，如1、2、3、4、5、6、8、10、12、14或它们之间的任意值；linker为具有还原、活性氧、pH以及酶响应性中至少一种的基团。当linker为具有还原、活性氧、pH以及酶响应性中至少一种的基团时，对应的聚合物-药物偶联物还具有还原、活性氧、pH以及酶响应中至少一种性能，普适性更强。R12为抗肿瘤药物基团。其中，抗肿瘤药物的具体实例包括但不限于：阿霉素、表阿霉素、吉西他滨、顺铂、卡铂、紫杉醇、喜树碱、依喜替康、丝裂霉素C、甲氨蝶呤、7-乙基-10-羟基喜树碱、美登素、alpha-鹅膏覃碱、MMAE、MMAF、DM4、卡奇霉素、藤黄酸、大黄酸、长春新碱、秋水仙碱、艾日布林、Taltobulin、美登醇、泰兰斯他汀A、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、Piericidin A、安丝菌素P 3、尾海兔素10和β-Amanitin中的至少一种。
在本发明中，所述FAP-α蛋白响应结构单元具有式(1-2)所示的结构：
式(1-2)中，R21为-NH-(CH2)x-、-O-(CH2)x-、-CO-(CH2)x-或-S-(CH2)x-，x为2～6(如2、3、4、5、6或它们之间的任意值)。R22为两性离子基团，也即，同时带正负电荷的基团。具体地，R22优选选自以下结构中的至少一种：
以上各式中，R23和R24各自独立地为H或C1～C5的烷基，R25和R27各自独立地为C1～C5的亚烷基，R26为C1～C5的烷基。其中，所述C1～C5的烷基的具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基或新戊基。所述C1～C5的亚烷基的具体实例包括但不限于：亚甲基、亚乙基、正亚丙基、异亚丙基、正亚丁基、仲亚丁基、异亚丁基、叔亚丁基、正亚戊基、异亚戊基、叔亚戊基或新亚戊基。
在本发明中，所述亲水结构单元具有式(1-3)所示的结构：
式(1-3)中，R31为-NH-、-O-、-OCO-、-NHCO-、-COO-、-CONH-、-S-或-(CH2)z-COO-(CH2)t-S-；q为1～5，如1、2、3、4、5或它们之间的任意值；z为0～5，如0、1、2、3、4、5或它们之间的任意值；t为1～5，如1、2、3、4、5或它们之间的任意值。R32为两性离子基团，也即，同时带正负电荷的基团。具体地，R32优选选自以下结构中的至少一种：
以上各式中，R33和R34各自独立地为H或C1～C5的烷基，R35和R37各自独立地为C1～C5的亚烷基，R36为C1～C5的烷基。其中，所述C1～C5的烷基的具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基或新戊基。所述C1～C5的亚烷基的具体实例包括但不限于：亚甲基、亚乙基、正亚丙基、异亚丙基、正亚丁基、仲亚丁基、异亚丁基、叔亚丁基、正亚戊基、异亚戊基、叔亚戊基或新亚戊基。
在本发明中，所述FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的主链可以选自聚(甲基)丙烯酸酯、聚(甲基)丙烯酰胺、聚氨基酸、聚碳酸酯等中的至少一种，没有特别的限定。
本发明提供的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法包括将药物前体修饰至聚合物骨架上获得。其中，所述聚合物骨架通过将各单体进行共聚反应获得。这种先通过聚合后修饰引入药物的方式可以避免很多药物单体不能直接聚合而导致无法顺利接入聚合物中的问题。其中，所述修饰的方式为聚合物骨架中的R11`与药物前体进行点击化学反应，所述点击化学反应的基团选自叠氮、反式环辛烯、四嗪、炔烃、二苯并环辛炔、双环[6,1,0]壬炔、硫辛酸和马来酰亚胺中的至少一种。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行具体描述，但本发明不限于这些实施例或应用例。本领域技术人员在本发明核心指导思想下所做的改变、替换、组合简化等均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1-1：单体AzMA的合成
将氯丙胺盐酸盐(1.2g，9.2mmol)溶于30mL去离子水中，待其完全溶解过后，取叠氮化钠(2.25g，34.6mmol)加于上述溶液中，在100℃下避光反应24h，反应完毕后，先慢慢冷却至室温，加入氢氧化钾直到见到氢氧化钾固体为止，此时也可以看到液面上有油滴产生，之后使用乙醚萃取3次，无水MgSO4除水，旋蒸得到中间产物。
取中间产物(0.94g，9.1mmol)、1.89mL三乙胺(1.38g，13.7mmol)和4-叔丁基邻苯二酚(3.32mg，0.002mmol)溶于20mL DCM中，取1.94mL甲基丙烯酰氯(1.18g，10mmol)在0℃下加入，室温反应过夜，低温抽排，纯水洗三次，然后使用MgSO4除水，通过硅胶柱(流动相为二氯甲烷:甲醇＝100:1(V:V))分离得到产物AzMA。
实施例1-2：药物前体DBCO-Val-Cit-PABC-MMAE的合成
将MMAE(0.011g，0.014mmol)、DBCO-Val-Cit-PABC-PNP(0.023g，0.027mmol)和N-羟基苯并三唑(HOBt)(0.004g，0.030mmol)溶于DMF(0.3mL)中，加入二异丙基乙胺(DIEA)(0.011mL)，在室温下搅拌16小时，之后减压除去DMF，粗反应产物通过硅胶柱(流动相为二氯甲烷:甲醇＝13:1(V:V))分离得到白色固体(DBCO-Val-Cit-PABC-MMAE，9.2mg，产率49％)。
DBCO-Val-Cit-PABC-MMAE的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.9-1.1(CH2CH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CCH2CH2C,COCCH2CH3,CHCH2,CHCH2CH2)；2.8-3.0(NCH3)；3.2-3.6(NCH2CH3,OCH3)；3.7-4.2(COCH2NH,COOCH2,COOCH2)；4.2-4.6(OCOOCH2,NHCOCH)；5.2-5.9(NCH2C,COOCH2C)；6.0-7.0,7.5-8.0(NHCO)；7.0-7.7(ph)。
实施例1-3：FAP-α蛋白响应的单体MA-N-GP的合成
在通氩气的条件下，往烧瓶中加入Boc-甘氨酸-L-脯氨酸(Boc-GP，2.50g，4.6mmol)和羰基二咪唑(CDI，1.50g，4.6mmol)，加入25mL无水二氯甲烷，充分搅拌使其溶解，室温搅拌活化2小时；在另一个烧瓶中加入2-氨基乙基甲基丙烯酰胺盐酸盐(MA-N-NH2-HCl，0.92g，5.5mmol)和三乙胺(TEA，4.7mL，16.6mmol)，加入30mL无水二氯甲烷，室温充分搅拌2小时，得到MA-N-NH2反应液；将第一个烧瓶中活化后的反应液用恒压漏斗滴加进MA-N-NH2反应液中，室温搅拌反应24小时，反应结束后，用0.5M的HCl洗三次，洗过的产物溶液用无水硫酸镁干燥，抽滤，最后旋蒸浓缩，用乙酸乙酯作流动相进行硅胶柱层析分离纯化，收集第二个点，旋蒸除去流动相，得到白色固体粉末(单体MA-N-GP，1.6g，收率47％)。
实施例1-4：FAP-α蛋白响应聚合物的合成
(1)采用RAFT聚合法，将干净的Schlenk管置于120℃烘箱中干燥。干燥完毕后取出反应管冷却至室温，用滤纸卷一个纸漏斗，架于管口，将单体MA-N-GP(500mg，1.28mmol)、AzMA(70mg，0.42mmol)、引发剂偶氮二异丁腈(AIBN，1.6mg，0.01mmol)通过纸漏斗加进反应管底部；称取二硫酯链转移剂(CTA-OH，6.2mg，0.02mmol)，加入800μL超干二甲基亚砜(DMSO)溶解，将溶液加入至Schlenk管底部，搅拌溶解；然后利用抽排装置“液氮冷冻-抽真空10分钟-通氩气-解冻”循环3次，之后将充满氩气的反应管置于70℃油浴中，反应48小时；反应结束后，将反应液滴加进15mL乙酸乙酯沉淀出橘黄色固体产物，离心倒出上清液，重复沉淀两次以除去未反应完的单体及DMSO溶剂，干燥24小时获得预聚物。
(2)将80mg预聚物采用2mL的二氯甲烷溶解，待完全溶解后，在冰浴条件下加入400μL三氟乙酸，冰浴搅拌反应1小时，以脱去Boc保护基。反应完毕后旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸，之后在常温真空烘箱干燥4小时。在干燥后的烧瓶里加入4mL超纯水搅拌溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至8.0。称取50mg 2-乙氧基-2-氧化物-1,3,2-二氧磷杂环戊烷溶于1mL超纯水，加入反应液中，26℃水浴条件下搅拌反应36小时。反应完毕后，把反应液转移进透析袋(MWCO＝1000Da)，用超纯水透析24小时，每隔6小时换一次水，全程避光操作，透析所得聚合物溶液即为FAP-α蛋白响应聚合物，将其直接保存在4℃冰箱。
FAP-α蛋白响应聚合物的化学位移：1H-NMR(MeOD),δ(ppm)：0.7-1.0(CH2CH3)；1.6-2.1(CCH2CH2C,CH2CH3)；2.8-3.2(N(CH2)2,N3CH2)；3.2-3.4(N(CH3)3)；3.6-3.8(CH2N(CH3)3)；4.0-4.4((NCH2CH2)2,COOCH2CH2O,POCH2)；6.0-7.0(NHCO)。
实施例1-5：包含MMAE药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(MA-N-GPP)-co-P(AzMA-MMAE)的合成
称取实施例1-4所得FAP-α蛋白响应聚合物(67mg，6.67mmol)、DBCO-Val-Cit-PABC-MMAE(110mg，66.7mmol)和PMEDTA(1.772μg，20μL，0.001mmol)溶于0.3mLDMF和水的混合溶剂(DMF:水＝7:3(V:V))，氩气保护下抽排二次后加入五水硫酸铜和维生素C(五水硫酸铜:维生素C＝1:5(w:w))，然后再抽排三次，45℃下反应48h，反应完毕后使用冰乙醚沉淀3次，DMSO透析过后再用去离子水透析，冻干得到产物，即为包含MMAE药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(MA-N-GPP)-co-P(AzMA-MMAE)。
包含MMAE药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.9-1.1(CH2CH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CCH2CH2C,COCCH2CH3,CHCH2,CHCH2CH2)；2.8-3.0(NCH3)；3.2-3.6(NCH2CH3,OCH3)；3.7-4.2(COC H2NH,COOCH2)；4.2-4.6(OCOOCH2,NHCOCH,POCH2)；5.2-5.9(NCH2C)；6.0-7.0,7.5-8.0(NHCO)；7.0-7.7(ph)。
实施例1-6：含亲水单体的FAP-α蛋白响应聚合物的合成
(1)采用RAFT聚合法，将干净的Schlenk管置于120℃烘箱中干燥。干燥完毕后取出反应管冷却至室温，用滤纸卷一个纸漏斗，架于管口。称取单体MA-N-GP(500mg，1.28mmol)、AzMA(70mg，0.42mmol)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA，294mg，1.28mmol)、引发剂偶氮二异丁腈(AIBN，1.6mg，0.01mmol)，通过纸漏斗加进反应管底部；称取链转移剂(CTA-OH，6.2mg，0.02mmol)，加入800μL超干二甲基亚砜(DMSO)溶解，将溶解液加入至Schlenk管底部，搅拌溶解；然后利用抽排装置“液氮冷冻-抽真空10分钟-通氩气-解冻”循环3次，之后将充满氩气的反应管置于70℃油浴中，反应48小时；反应结束后，将反应液滴加进15mL乙酸乙酯沉淀出橘黄色固体产物，离心倒出上清液，重复沉淀两次以除去未反应完的单体及DMSO溶剂，干燥24小时获得预聚物。
(2)将80mg预聚物采用2mL的二氯甲烷溶解，待完全溶解后，在冰浴条件下加入400μL三氟乙酸，冰浴搅拌反应1小时，以脱去Boc保护基。反应完毕后旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸，之后在常温真空烘箱干燥4小时。在干燥后的烧瓶里加入4mL超纯水搅拌溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至8.0。称取50mg 2-乙氧基-2-氧化物-1,3,2-二氧磷杂环戊烷溶于1mL超纯水，加入反应液中，26℃水浴条件下搅拌反应36小时。反应完毕后，把反应液转移进透析袋(MWCO＝1000Da)，用超纯水透析24小时，每隔6小时换一次水，全程避光操作，透析所得聚合物溶液即为两亲性FAP-α蛋白响应聚合物，将其直接保存在4℃冰箱。
实施例1-7：包含MMAE药物连接子和亲水单体的FAP-α蛋白响应聚合物P(DP)-co-P(MA-N-GPP)-co-P(AzMA-MMAE)的合成
称取实施例1-6所得含亲水单体的FAP-α蛋白响应聚合物(100mg，6.67mmol)、DBCO-Val-Cit-PABC-MMAE(110mg，66.7mmol)和PMEDTA(1.772μg，20μL，0.001mmol)溶于0.3mL DMF和水的混合溶剂(DMF:水＝7:3(V:V))，氩气保护下抽排二次后加入五水硫酸铜和维生素C(五水硫酸铜:维生素C＝1:5(w:w))，然后再抽排三次，45℃下反应48h，反应完毕后使用冰乙醚沉淀3次，DMSO透析过后再用去离子水透析，冻干得到产物，即为包含MMAE药物连接子和亲水单体的FAP-α蛋白响应聚合物P(DP)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-MMAE)。
应用例1-1
(1)聚合物注射液配制
将P(MA-N-GPP)-co-P(AzMA-MMAE)及P(DP)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-MMAE)分别溶解于生理盐水中，按照0.2mg/kg体重MMAE等效浓度配制聚合物注射液，得到均相澄清透明的聚合物注射液。
(2)细胞毒性实验
将一甲基澳瑞他汀E(MMAE)和两种聚合物注射液进行4T1细胞毒性测试，所得结果见图1。从图1可以看出，含亲水单体的药物偶联聚合物(P(DP)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-MMAE))对4T1细胞有较强的细胞毒性，但由于其具有抗蛋白吸附的作用，不易进入细胞膜，所以相比于不含亲水单体的聚合物(P(MA-N-GPP)-co-P(AzMA-MMAE))和游离药(一甲基澳瑞他汀E)具有相对较低的细胞毒性。细胞毒性实验结果表明，所合成的两种聚合物药物偶联物都对4T1具有杀伤作用，有明显的细胞毒性。
(3)药代动力学评价
分别取2mL实施例1-5及实施例1-7所得两种药物偶联聚合物溶液，加入1mg/mL的Cy5.5-alykne溶液200μL，氩气保护下抽排二次后加入五水硫酸铜和维生素C(五水硫酸铜:维生素C＝1:5(w:w))，室温搅拌反应24小时。反应结束后，先用甲醇透析3小时，后用超纯水透析24小时，即可得到Cy5.5荧光标记的聚合物溶液。
待小鼠适应好环境过后，取6只小鼠分成两组，每组三只小鼠，分别将Cy5.5荧光标记的聚合物溶液注射到小鼠的尾巴静脉血管中，给药浓度为5mg/kg；血清清除率半衰期t1/2后从小鼠的眼睛周围的毛细血管中取血，取血20μL左右，测定其荧光值的大小，结果如图2所示。从图2可以看出，P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-MMAE)的t1/2为3.6h，P(DP)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)的t1/2为5.6h，通过聚合上亲水单体可以有效的避免胶束被清除，达到增加血液循环时间的目的，保证了足够的血液长循环。
(4)抑瘤实验
研究MMAE药物偶联聚合物对小鼠乳腺癌细胞4T1荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用，待肿瘤大约长到100mm3开始实验。准备MMAE游离药和两种药物偶联聚合物注射液，PBS缓冲液作为空白组，采用尾静脉注射方式给药，给药剂量为MMAE当量0.2mg/kg，每只小鼠每次注射100μL。第1、4、7、10、13天给药，共给药五次，第1、3、5、7、9、11、13、15天称量小鼠体重，测量小鼠肿瘤体积。所得结果见图3。从图3可以看出，相对于空白组，游离药物MMAE治疗可以一定程度抑制肿瘤生长，但其抑制效果明显弱于聚合物药物偶联物；由于具有更长的血液循环时间，含有亲水单体的药物偶联聚合物抑制肿瘤效果更占优势。
实施例2-1：单体AzMA的合成
同实施例1-1，得到单体AzMA。
实施例2-2：FAP-α蛋白响应的单体MA-N-GP的合成
同实施例1-3，得到单体MA-N-GP。
实施例2-3：药物前体DBCO-SS-CPT的合成
(1)称取(2-羟乙基)二硫烷(0.72mL，6mmol)、DBCO-COOH(2g，6mmol)加入圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷40mL冰浴搅拌溶解，再将EDC(1g，6mmol)溶于10mL无水二氯甲烷后加入到恒压漏斗，在氮气保护下滴加进圆底烧瓶，控制滴速4s/滴，室温搅拌反应24小时。待反应结束后，抽滤不溶物，旋蒸浓缩滤液，用二氯甲烷:甲醇＝20:1(V:V)流动相进行硅胶柱层析分离纯化，收集产物点，旋蒸除去流动相，得到固体DBCO-SS-OH。
(2)在通氩气的条件下，往喜树碱(CPT，1.00g，2.87mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，1.05g，8.62mmol)中加入30mL无水二氯甲烷充分搅拌以使其分散均匀；在通风橱中称取三光气(BTC，0.28g，0.96mmol)于圆底烧瓶中溶于10mL无水二氯甲烷，滴加进CPT的二氯甲烷溶液中，搅拌反应30分钟，观察到溶液变为黄绿色后，称取上一步产物DBCO-SS-OH(1.39g，3.16mmol)溶于15mL无水二氯甲烷，缓慢滴加进圆底烧瓶，室温搅拌反应48小时。反应完毕后，溶液变为橙黄色，抽滤除去不溶的副产物盐，旋蒸浓缩，采用二氯甲烷/甲醇40:1(V:V)作为流动相，柱层析分离纯化，收集第二点，即为产物点，旋蒸除去流动相，得到淡黄色固体粉末DBCO-SS-CPT(1.45g，收率73％)。
DBCO-SS-CPT的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.9-1.1(CH2CH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CCH2CH2C,COCCH2CH3,CHCH2,CHCH2CH2)；2.8-3.0(SCH3)；3.2-3.6(NCH2CH3,OCH3)；3.7-4.2(COCH2NH,COOCH2,COOCH2)；4.2-4.6(OCOOCH2,NHCOCH)；5.2-5.9(NCH2C,COOCH2C)；6.0-7.0,7.5-8.0(NHCO)；7.0-7.7(ph)。
实施例2-4：FAP-α蛋白响应聚合物P(MA-N-GP)-co-P(AzMA)的合成
采用RAFT聚合方法，称取MA-N-GP(300mg，0.78mmol)、AzMA(40.6mg，0.26mmol)、引发剂偶氮二异丁腈(AIBN，2mg，0.01mmol)加入到Schlenk反应管底部；称取二硫酯链转移剂(CTA-OH，3.5mg，0.01mmol)加入800μL超干二甲基亚砜(DMSO)中溶解，将溶解液加入至Schlenk管底部，充分搅拌溶解所有原料；然后利用抽排装置“液氮冷冻-抽真空15分钟-通氩气-解冻”循环3次后，将充满氩气的反应管置于70℃油浴中连续反应48小时；反应结束后，将反应液滴加进15mL乙酸乙酯沉淀出白色固体产物，离心倒出上清液，重复沉淀两次以除去未反应完的单体及DMSO溶剂，干燥24小时获得聚合物。
将40mg聚合物用2mL的二氯甲烷溶解，待完全溶解后，在冰浴条件下加入200μL三氟乙酸，冰浴搅拌反应1小时，以脱去Boc保护基。反应完毕后旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸，用二氯甲烷夹带两次，之后在常温真空烘箱干燥4小时，加入4mL超纯水搅拌溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至8.0后，加入25mg丙磺酸内酯与1mL超纯水，26℃水浴条件下搅拌反应24小时。待反应完毕后，把反应液转移进透析袋(MWCO＝1000Da)，用超纯水透析24小时，以除去未反应的丙磺酸内酯，每隔6小时换一次水，冻干得到固体粉末，即为FAP-α蛋白响应聚合物P(MA-N-GP)-co-P(AzMA)。
P(MA-N-GP)-co-P(AzMA)聚合物的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.7-1.0(CH2CH3)；1.6-2.1(CCH2CH2C,CH2CH3)；2.8-3.2(N3CH2)；3.2-3.4(N(CH3)3)；3.6-3.8(CH2N(CH3)3)；4.0-4.6((SCH2CH2)2,NCOCH,NHCOCH2)；6.0-7.0(NHCO)。
实施例2-5：CPT药物偶联FAP-α蛋白响应聚合物P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)的合成
称取实施例2-4所得FAP-α蛋白响应聚合物(100mg，0.01mmol)、DBCO-SS-CPT(73mg，0.1mmol)和PMEDTA(1.772μg，20μL，0.001mmol)溶于0.3mL DMF和水混合溶剂(DMF:水＝7:3(V:V))，氩气保护下抽排二次后加入五水硫酸铜和维生素C(五水硫酸铜:维生素C＝1:5(w:w))，然后再抽排三次，45℃下反应48h，反应完毕后使用冰乙醚沉淀3次，DMSO透析过后再用去离子水透析，冻干得到产物，即为CPT药物偶联FAP-α蛋白响应聚合物P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)。
P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)聚合物的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.7-1.1(CH2CH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CCH2CH2C,COCCH2CH3,CHCH2,CHCH2CH2)；2.8-3.2((SCH2)2,N3CH2)；3.7-4.2(COCH2NH,COOCH2)；4.2-4.6((SCH2CH2)2,OCOOCH2,NHCOCH)；5.2-5.9(NCH2,C OOCH2C)。
实施例2-6：聚合物P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA)的合成
称取DMAEMA盐(129mg，0.82mmol)、MA-N-GP(209mg，0.54mmol)、AzMA(42mg，0.27mmol)、引发剂偶氮二异丁腈(AIBN，2mg，0.01mmol)加入到Schlenk反应管底部；称取链转移剂(CTA-COOH，3.5mg，0.01mmol)加入1000μL超干二甲基亚砜(DMSO)溶解，将溶解液加入至Schlenk管底部，充分搅拌溶解所有原料；然后利用抽排装置“液氮冷冻-抽真空15分钟-通氩气-解冻”循环3次后，将充满氩气的反应管置于70℃油浴中，连续反应48小时；反应结束后，将反应液加甲醇稀释之后用冰乙醚沉淀，离心倒出上清液，重复沉淀两次以除去未反应完的单体及DMSO溶剂，干燥24小时之后获得聚合物。
将40mg聚合物用2mL的二氯甲烷溶解，待完全溶解后，在冰浴条件下加入200μL三氟乙酸，冰浴搅拌反应1小时，以脱去Boc保护基。反应完毕后旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸，用二氯甲烷夹带两次，之后在常温真空烘箱干燥4小时，加入4mL超纯水搅拌溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至8.0后，加入25mg丙磺酸内酯与1mL超纯水，26℃水浴条件下搅拌反应24小时。待反应完毕后，把反应液转移进透析袋(MWCO＝1000Da)，用超纯水透析24小时，以除去未反应的丙磺酸内酯，每隔6小时换一次水，冻干得到固体粉末，即为FAP-α蛋白响应聚合物P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA)。
P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA)聚合物的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.6-1.2(CH2CH3,CCH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CHCH2,CHCH2CH2,CH2CH3,CCH2CH2CCH2C)；2.8-3.2(NH(CH3)2,N3CH2)；3.3-3.6(CONHCH2,(CH3)2NHCH2,CHNCH2)；3.8-4.1(NCOCH2)；4.3-4.6((SCH2CH2)2,COOCH2CH2NH,NH(CH3)2,(COOCH2CH2S)2,CHN)；5.2-5.5(NCH2C)；5.6-5.8(COOCH2C)。
实施例2-7：CPT药物偶联FAP-α蛋白响应聚合物P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)的合成
称取实施例2-6所得聚合物(150mg，0.01mmol)、DBCO-SS-CPT(73mg，0.1mmol)和PMEDTA(1.772μg，20μL，0.001mmol)溶于0.3mL DMF和水混合溶剂(DMF:水＝7:3(V:V))，氩气保护下抽排二次后加入五水硫酸铜和维生素C(五水硫酸铜:维生素C＝1:5(w:w))，然后再抽排三次，45℃下反应48h，反应完毕后使用冰乙醚沉淀3次，DMSO透析过后再用去离子水透析，冻干得到CPT药物偶联FAP-α蛋白响应聚合物P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)。
P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)聚合物的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.6-1.2(CH2CH3,CCH3,)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CHCH2,CHCH2CH2,CH2CH3,CCH2CH2CCH2C)；2.8-3.2(NH(CH3)2,S(CH2)2,N3CH2)；3.3-3.6(CONHCH2,(CH3)2NHCH2,CHNCH2)；3.8-4.1(NCOCH2)；4.3-4.6((SCH2CH2)2,COOCH2CH2NH,COOCH2CH2NH(CH3)2,(COOCH2CH2S)2,CHN)；5.2-5.5(NCH2C)；5.6-5.8(COOCH2C)。
应用例2-1
(1)聚合物注射液配制
将P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)及P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)分别溶解于生理盐水中，按照10mg/kg体重CPT等效浓度配制聚合物注射液，得到均相澄清透明的聚合物注射液。
(2)FAP-α蛋白响应的P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)电荷翻转实验
用PBS缓冲液配制浓度为50ng/mL的FAP-α溶液，将5mg聚合物(P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT))溶解于5mL超纯水中，FAP-α溶液与聚合物溶液按体积比4:1混合，将反应液置于37℃、100rpm转速的摇床进行反应。分别于0，0.25，0.5，1，2，4，6小时取200μL反应液，过0.45μm滤膜后，采用DLS检测不同时间点的Zeta电位变化。从图4中可以看出，聚合物与FAP-α蛋白混合后，在很快的时间内完成电荷反转，Zeta点位转变为正电。
(3)细胞毒性实验
将喜树碱(CPT)和两者聚合物注射液进行4T1细胞毒性测试，所得结果见图5。从图5可以看出，含亲水单体的药物偶联聚合物P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)对4T1细胞具有较强的细胞毒性，但由于其具有抗蛋白吸附的作用，不易进入细胞膜，所以相比于不含亲水单体的聚合物P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)和游离药(喜树碱)具有相对较低的细胞毒性。细胞毒性实验结果表明，所合成的两种聚合物药物偶联物都对4T1具有杀伤作用，有明显的细胞毒性。
(4)药代动力学评价
分别取2mL实施例2-5所得P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)和及实施例2-7所得P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)溶液，分别滴加1mg/mL的Cy5.5-alykne溶液200μL，室温搅拌反应24小时。反应结束后，先用甲醇透析3小时，后用超纯水透析24小时，即可得到Cy5.5荧光标记的聚合物溶液，分别记为P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)Cy5.5、P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)Cy5.5。
待小鼠适应好环境过后，取6只小鼠分成两组，每组三只小鼠，分别将Cy5.5荧光标记的聚合物溶液注射到小鼠的尾巴静脉血管中，给药浓度为5mg/kg；血清清除率半衰期t1/2后从小鼠的眼睛周围的毛细血管中取血，取血50μL左右，并在血液凝固之前放入活体进行检测，测定其荧光值的大小，结果如图6所示。从图6可以看出，P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)的t1/2为4.6h，P(DS)-co-P(MA-N-GP)-co-P(AzMA-CPT)的t1/2为7.5h，通过聚合上亲水单体可以有效的避免胶束被清除，达到增加血液循环时间的目的，保证了足够的血液长循环。
(5)抑瘤实验
研究CPT药物偶联聚合物对小鼠乳腺癌细胞4T1荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用，待肿瘤大约长到100mm3开始实验。准备CPT游离药和两种药物偶联聚合物注射液，PBS缓冲液作为空白组，采用尾静脉注射方式给药，给药剂量为CPT当量5mg/kg，每只小鼠每次注射100μL。第1、4、7、10、13天给药，共给药五次，第1、3、5、7、9、11、13、15天称量小鼠体重，测量小鼠肿瘤体积。所得结果见图7。从图7可以看出，相对于空白组，游离药物CPT治疗可以一定程度抑制肿瘤生长，但其抑制效果明显弱于聚合物药物偶联物；由于具有更长的血液循环时间，含有亲水单体的药物偶联聚合物抑制肿瘤效果更占优势。
实施例3-1：叠氮单体的合成
将(4S)-4-(4-氯丁基)-2,5-恶唑烷二酮(1.59g，9.2mmol)溶于30mL去离子水中，待其完全溶解过后，取叠氮化钠(2.25g，34.6mmol)加于上述溶液中，在100℃下避光反应24h，反应完毕后，先慢慢冷却至室温，加入氢氧化钾直到见到氢氧化钾固体为止，此时也可以看到液面上有油滴产生，之后使用乙醚萃取3次，无水MgSO4除水，旋蒸得到产物，接着通过硅胶柱(流动相为二氯甲烷:甲醇＝100:1(V:V))分离得到叠氮单体。
实施例3-2：FAP-α蛋白响应的单体的合成
在通氩气的条件下，往烧瓶中加入Boc-甘氨酸-L-脯氨酸(Boc-GP，2.50g，4.6mmol)和羰基二咪唑(CDI，1.50g，4.6mmol)，加入25mL无水二氯甲烷，充分搅拌使其溶解，室温搅拌活化2小时；在另一个烧瓶中加入(4S)-4-(4-氨基丁基)-2,5-恶唑烷二酮(0.95g，5.5mmol)和三乙胺(TEA，4.7mL，16.6mmol)，加入30mL无水二氯甲烷，室温充分搅拌2小时后，将第一个烧瓶中活化后的反应液用恒压漏斗滴加进反应液中，室温搅拌反应24小时，反应结束后，过滤未反应完全的盐，用0.5M的HCl洗三次，洗过的产物溶液用无水硫酸镁干燥，抽滤，最后旋蒸浓缩，用乙酸乙酯作流动相进行硅胶柱层析分离纯化，旋蒸除去流动相，得到白色固体粉末(1.6g，收率47％)。
实施例3-3：亲水单体的合成
将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-α-叔丁醇酯(5.8g，0.029mol)和烯丙醇(30mL，0.442mol)在圆底烧瓶(250mL)中混合，然后往所得混合液中通过注射器加入三甲基氯硅烷(4mL，0.031mol)，将所得悬浮液加热至80℃并搅拌直至其变得均匀，在60℃真空下除去溶剂，加入乙醚(300mL)沉淀，得到白色固体，过滤收集，通过在乙醇/乙醚中重结晶进行进一步纯化，得到白色固体产物。
将上述白色固体产物溶解于10mL二氯甲烷中，待完全溶解后，在冰浴条件下加入3mL三氟乙酸并搅拌反应12小时，以脱去叔丁酯保护基，反应完毕后旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸，用二氯甲烷夹带两次，之后在常温真空烘箱干燥4小时，得到谷氨酸烯丙酯。
在氮气保护下，向圆底烧瓶(250mL)中加入烯丙基-L-谷氨酸酯(2.5g，13mmol)、三光气(1.9g，6.4mmol)和无水四氢呋喃(40mL)，将所得混合物在室温下搅拌24小时，在此期间谷氨酸烯丙酯逐渐溶解，在真空下除去溶剂，得到油状液体，然后将其溶解在乙酸乙酯(20mL)中，并用冷的饱和NaHCO3/H2O溶液洗涤。分离有机层并在0℃下用无水MgSO4干燥，抽滤旋蒸后，得到得到恶唑烷二酮丙酸烯丙酯。
将恶唑烷二酮丙酸烯丙酯(3g，0.014mol)与氨基硫醇(1.47g，0.014mol)溶解于20mL四氢呋喃中，在50℃下搅拌反应2小时，旋蒸除去溶剂，真空干燥后得到NCA-DS单体。
实施例3-4：药物前体DBCO-SS-CPT的合成
同实施例2-3，得到药物前体DBCO-SS-CPT。
实施例3-5：FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)的合成
将FAP-α蛋白响应单体(146mg，0.685mmol)、叠氮单体(73mg，0.685mmol)溶解于反应管中的DMF(5mL)中，随后用注射器加入正丁胺/DMF储备溶液(CI＝0.253M，136mL，34.4mmol)，将反应混合物在室温下搅拌48小时，之后旋蒸浓缩，之后加入三氯甲烷溶解，用冷乙醚或甲醇沉淀，通过离心和透析纯化聚合物，真空干燥后得到聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GP)。
将40mg聚合物用2mL的二氯甲烷溶解，待完全溶解后，在冰浴条件下加入200μL三氟乙酸，冰浴搅拌反应1小时，以脱去Boc保护基。反应完毕后旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸，用二氯甲烷夹带两次，之后在常温真空烘箱干燥4小时，加入4mL超纯水搅拌溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至8.0后，加入25mg丙磺酸内酯与1mL超纯水，26℃水浴条件下搅拌反应24小时。待反应完毕后，把反应液转移进透析袋(MWCO＝1000Da)，用超纯水透析24小时，以除去未反应的丙磺酸内酯，每隔6小时换一次水，冻干得到固体粉末，即为FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)。
FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.7-1.0(CH2CH3)；1.6-2.1(CCH2CH2C,CH2CH3)；2.8-3.2(,N(CH2)2,N3CH2)；3.2-3.4(N(CH3)3)；3.6-3.8(CH2N(CH3)3)；4.0-4.4((SCH2CH2)2,NCOCH2,NHCOCH2,COOCH2CH2O,POCH2)；6.0-7.0(NHCO)。
实施例3-6：FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)的合成
将亲水单体(82mg，0.685mmol)、叠氮单体(73mg，0.685mmol)、FAP-α蛋白响应单体(146mg，0.685mmol)溶解于反应管中的DMF(5mL)中，随后用注射器加入正丁胺/DMF储备溶液(CI＝0.253M，136mL，34.4mmol)，将反应混合物在室温下搅拌48小时，之后旋蒸浓缩，将所得浓缩液溶于三氯甲烷中，用冷乙醚或甲醇沉淀，通过离心和透析纯化聚合物，将所得纯化液真空干燥后得到聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GP)-co-P(DS)。
将所得聚合物用3mL的二氯甲烷溶解，待完全溶解后，在冰浴条件下加入300μL三氟乙酸，冰浴搅拌反应1小时，以脱去Boc保护基。反应完毕后旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸，用二氯甲烷夹带两次，之后在常温真空烘箱干燥4小时，将所得产物在干燥后的烧瓶里加入4mL超纯水搅拌溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至8.0，得到反应液。加入25mg丙磺酸内酯与1mL超纯水，26℃水浴条件下搅拌反应24小时。待反应完毕后，把反应液转移进透析袋(MWCO＝1000Da)，用超纯水透析24小时，以除去未反应的丙磺酸内酯，每隔6小时换一次水。冻干得到固体粉末，即为FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)。
FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.6-1.2(CH2CH3,CCH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CHCH2,CHCH2CH2,CH2CH3,CCH2CH2CCH2C)；2.8-3.2(S(CH2)2,NH(CH3)2,N3CH2)；3.3-3.6(CONHCH2,(CH3)2NHCH2,CHNCH2)；3.8-4.2(NCOCH2)；4.2-4.6((S CH2CH2)2,COOCH2CH2NH,COOCH2CH2NH(CH3)2,(COOCH2CH2S)2,CHN)；5.2-5.5(NCH2C)；5.6-5.8(COOC H2C)。
实施例3-7：包含CPT药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)的合成
称取聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)(100mg，0.01mmol)、DBCO-SS-CPT(73mg，0.1mmol)和PMEDTA(1.772μg，20μL，0.001mmol)溶于0.3mLDMF和水混合溶剂(DMF:水＝7:3(V:V))，氩气保护下抽排二次后加入五水硫酸铜和维生素C(五水硫酸铜:维生素C＝1:5(w:w))，然后再抽排三次，45℃下反应48h，反应完毕后使用冰乙醚沉淀3次，DMSO透析过后再用去离子水透析，冻干得到产物，即为包含CPT药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)。
包含CPT药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.7-1.1(CH2CH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CCH2CH2C,COCCH2CH3,CHCH2,CHCH2CH2)；2.8-3.2((SCH2)2,N3CH2)；3.7-4.2(COCH2NH,COOCH2,COOCH2)；4.2-4.6((SCH2CH2)2,OCOOCH2,NCOCH2,NHCOC H2)；5.2-5.9(NCH2C,COOCH2C)。
实施例3-8：包含CPT药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)的合成
称取聚合物P(AzAA)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)(150mg，0.01mmol)、DBCO-SS-CPT(73mg，0.1mmol)和PMEDTA(1.772μg，20μL，0.001mmol)溶于0.3mL DMF和水混合溶剂(DMF:水＝7:3(V:V))，氩气保护下抽排二次后加入五水硫酸铜和维生素C(五水硫酸铜:维生素C＝1:5(w:w))，然后再抽排三次，45℃下反应48h，反应完毕后使用冰乙醚沉淀3次，DMSO透析过后再用去离子水透析，冻干得到产物，即为包含CPT药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)。
包含CPT药物连接子的FAP-α蛋白响应聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)的化学位移：1H-NMR(CDCl3),δ(ppm)：0.6-1.2(CH2CH3,CCH3,CCH3,CCH3)；1.3-1.5(C(CH3)3)；1.7-2.4(CHCH2,CHCH2CH2,CH2CH3,CCH2CH2CCH2C)；2.8-3.2(S(CH2)2,NH(CH3)2,S(CH2)2,N3CH2)；3.3-3.6(CONHCH2,(CH3)2NHCH2,CHNCH2)；3.8-4.1(NCOCH2)；4.3-4.6((SCH2CH2)2,COOCH2CH2NH,NHCOCH2,COOCH2CH2,N(CH3)2,(COOCH2CH2S)2,CHN)；5.2-5.5(NCH2C)；5.6-5.8(COOCH2C)。
应用例3-1：
(1)聚合物注射液配制
将P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)及P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)分别溶解于生理盐水中，按照5mg/kg体重CPT等效浓度配制聚合物注射液，得到均相澄清透明的聚合物注射液。
(2)细胞毒性实验
将喜树碱(CPT)和两种聚合物注射液进行4T1细胞毒性测试，所得结果见图8。从图8可以看出，包含两亲性单体的药物偶联聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)对4T1细胞具有较强的细胞毒性，但由于其具有抗蛋白吸附的作用，不易进入细胞膜，所以相比于不含亲水单体的嵌段聚合物P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)和游离药(喜树碱)具有相对较低的细胞毒性。细胞毒性实验结果表明，所合成的两种聚合物药物偶联物都对4T1具有杀伤作用，有明显的细胞毒性。
(3)药代动力学评价
分别取2mL实施例3-7以及实施例3-8所得聚合物配置成溶液，分别滴加1mg/mL的Cy5.5-alykne溶液200μL，室温搅拌反应24小时。反应结束后，先用甲醇透析3小时，后用超纯水透析24小时，即可得到Cy5.5荧光标记的聚合物溶液。
待小鼠适应好环境过后，取6只小鼠分成两组，每组三只小鼠，分别将Cy5.5荧光标记的聚合物溶液注射到小鼠的尾巴静脉血管中，给药浓度为5mg/kg；血清清除率半衰期t1/2后从小鼠的眼睛周围的毛细血管中取血，取血50μL左右，并在血液凝固之前放入活体进行检测，测定其荧光值的大小，结果如图9所示。从图9可以看出，P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)的t1/2为4h，P(AzAA-CPT)-co-P(AA-N-GPS)-co-P(DS)的t1/2为6.7h，通过聚合上亲水单体可以有效的避免胶束被清除，达到增加血液循环时间的目的，保证了足够的血液长循环。
(4)抑瘤实验
研究CPT药物偶联聚合物对小鼠乳腺癌细胞4T1荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用，待肿瘤大约长到70mm3开始实验。准备CPT游离药和两种药物偶联聚合物注射液，PBS缓冲液作为空白组，采用尾静脉注射方式给药，给药剂量为CPT当量5mg/kg，每只小鼠每次注射100μL。第1、4、7、10、13天给药，共给药五次，第1、3、5、7、9、11、13、15天称量小鼠体重，测量小鼠肿瘤体积。所得结果见图10。从图10可以看出，相对于空白组，游离药物CPT治疗可以一定程度抑制肿瘤生长，但其抑制效果明显弱于聚合物药物偶联物；由于具有更长的血液循环时间，含有亲水单体的药物偶联聚合物抑制肿瘤效果更占优势。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (15)

1.一种FAP-α响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物，其特征在于，所述FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物具有式(1)所示的结构；
R11为连接子；R12为抗肿瘤药物基团；R21为-NH-(CH2)x-、-O-(CH2)x-、-CO-(CH2)x-或-S-(CH2)x-，x为2～6；R22为两性离子基团；R31为-NH-、-O-、-OCO-、-NHCO-、-COO-、-CONH-、-S-或-(CH2)z-COO-(CH2)t-S-，q为1～5，z为0～5，t为1～5；R32为两性离子基团；m、n、p分别为三种结构单元的摩尔比例且m:n:p为(5～40％):(10～95％):(0～85％)且m+n+p＝100％。
2.根据权利要求1所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物，其特征在于，R11选自以下结构中的至少一种；
式(2)中，R13为芳环、-CO-(CH2)z-、-O-(CH2)z-、-NH-(CH2)z-、-CO-NH-(CH2)z-、-S-(CH2)z-、-CO-(CH2CH2O)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
式(3)中，R14为芳环、-CO-(CH2)z-、-O-(CH2)z-、-NH-(CH2)z-、-CO-NH-(CH2)z-、-S-(CH2)z-、-CO-(CH2CH2O)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
式(4)中，R15为芳环、-CO-(CH2)z-CO-、-O-(CH2)z-CO-、H-(CH2)z-CO-、-S-(CH2)z-CO-、-CO-(CH2CH2O)z-CO-、-O-(CH2CH2O)z-CO-、-NH-(CH2CH2O)z-CO-或-S-(CH2CH2O)z-CO-，z为1～14；R16为H或
式(5)中，R17为芳环、-CO-(CH2)z-CO-、-O-(CH2)z-CO-、H-(CH2)z-CO-、-S-(CH2)z-CO-、-CO-(CH2CH2O)z-CO-、-O-(CH2CH2O)z-CO-、-NH-(CH2CH2O)z-CO-或-S-(CH2CH2O)z-CO-，z为1～14；R18为H或
式(6)中，R19为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-NH-、-S-(CH2)z-NH-、-CO-NH-(CH2)z-或-S-(CH2)z-O-，z为1～14；
式(7)中，R20为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-O-、-S-(CH2)z-O-、-CO-NH-(CH2)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
以上各式中，linker各自独立地为具有还原、活性氧、pH以及酶响应性中至少一种的基团。
3.根据权利要求1所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物，其特征在于，R22选自以下结构中的至少一种；
以上各式中，R23和R24各自独立地为H或C1～C5的烷基，R25和R27各自独立地为C1～C5的亚烷基，R26为C1～C5的烷基。
4.根据权利要求1所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物，其特征在于，R32选自以下结构中的至少一种；
以上各式中，R33和R34各自独立地为H或C1～C5的烷基，R35和R37各自独立地为C1～C5的亚烷基，R36为C1～C5的烷基。
5.根据权利要求1所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物，其特征在于，所述聚合物-药物偶联物的数均分子量为10,000～80,000Da；m为5～40％，n为10～95％，p为0～85％；所述聚合物-药物偶联物为无规共聚物或嵌段共聚物。
6.一种FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，该方法包括将药物前体修饰至聚合物骨架上获得；所述聚合物骨架具有式(8)所示的结构；
R11`为连接子；R21为-NH-(CH2)x-、-O-(CH2)x-、-CO-(CH2)x-或-S-(CH2)x-，x为2～6；R22为两性离子基团；R31为-NH-、-O-、-OCO-、-NHCO-、-COO-、-CONH-、-S-或-(CH2)z-COO-(CH2)t-S-，q为1～5，z为0～5，t为1～5；R32为两性离子基团；m、n、p分别为三种结构单元的摩尔比例且m:n:p为(5～40％):(10～95％):(0～85％)且m+n+p＝100％。
7.根据权利要求6所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述修饰的方式为聚合物骨架中的R11`与药物前体进行点击化学反应，所述点击化学反应的基团选自叠氮、反式环辛烯、四嗪、炔烃、二苯并环辛炔、双环[6,1,0]壬炔、硫辛酸和马来酰亚胺中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，R11`选自以下结构中的至少一种；
式(9)中，R12`为芳环、-CO-(CH2)z-、-O-(CH2)z-、-NH-(CH2)z-、-CO-NH-(CH2)z-、-S-(CH2)z-、-CO-(CH2CH2O)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14；
式(10)中，R13`为芳环、-CO-(CH2)z-CO-、-O-(CH2)z-CO-、H-(CH2)z-CO-、-S-(CH2)z-CO-、-CO-(CH2CH2O)z-CO-、-O-(CH2CH2O)z-CO-、-NH-(CH2CH2O)z-CO-或-S-(CH2CH2O)z-CO-，z为1～14；R14`为H或
式(11)中，R15`为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-NH-、-S-(CH2)z-NH-或-S-(CH2)z-O-，z为1～14；
式(12)中，R16`为芳环、-O-(CH2)z-O-、-NH-(CH2)z-O-、-S-(CH2)z-O-、-CO-NH-(CH2)z-、-O-(CH2CH2O)z-、-NH-(CH2CH2O)z-或-S-(CH2CH2O)z-，z为1～14。
9.根据权利要求6所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述聚合物骨架具有以下结构中的至少一种；
R17`、R21`和R31`各自独立地为H或C1～C5的烷基；R18`、R22`和R32`各自独立地为O或NH。
10.根据权利要求6所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述聚合物骨架由FAP-α响应的单体通过无规共聚或者嵌段共聚获得。
11.根据权利要求6所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述药物前体具有以下结构中的至少一种；
linker为具有还原、活性氧、pH以及酶响应性中至少一种的基团；Drug为抗肿瘤药物。
12.根据权利要求11所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、吉西他滨、顺铂、卡铂、紫杉醇、喜树碱、依喜替康、丝裂霉素C、甲氨蝶呤、7-乙基-10-羟基喜树碱、美登素、alpha-鹅膏覃碱、MMAE、MMAF、DM4、卡奇霉素、藤黄酸、大黄酸、长春新碱、秋水仙碱、艾日布林、Taltobulin、美登醇、泰兰斯他汀A、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、PiericidinA、安丝菌素P 3、尾海兔素10和β-Amanitin中的至少一种。
13.根据权利要求6所述的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述药物前体具有以下结构中的至少一种；
14.由权利要求6～13中任意一项所述的方法制备得到的FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物。
15.权利要求1～5和14中任意一项所述FAP-α蛋白响应水解致电荷翻转的聚合物-药物偶联物在抗肿瘤中的应用。
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CN106749951A (zh) * 2016-11-25 2017-05-31 西北师范大学 具有还原响应抗肿瘤活性的两性离子聚合物及其合成和作为药物载体的应用
CN109593158A (zh) * 2017-09-30 2019-04-09 浙江大学 一种γ-谷氨酰转肽酶催化水解致电荷翻转的聚合物及其在药物输送领域的应用
CN111511408A (zh) * 2017-10-23 2020-08-07 约翰霍普金斯大学 靶向成纤维细胞活化蛋白-α(FAP-α)的成像剂及放射治疗剂
CN116082546A (zh) * 2022-12-27 2023-05-09 浙江大学 氨肽酶催化水解致电荷翻转聚合物及其应用

Patent Citations (4)

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