CN102316721A - 使用了苹果潜隐球形病毒载体的蔷薇科果树的开花促进方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供将从被表达拟南芥FT基因的重组苹果潜隐球形病毒(FT-ALSV)感染的增殖宿主提取浓缩的病毒RNA，用基因枪法接种于刚扎根后的蔷薇科果树实生株的子叶，加速苹果、梨等蔷薇科果树的开花周期的新技术。

Description

使用了苹果潜隐球形病毒载体的蔷薇科果树的开花促进方法

技术领域

本申请发明涉及基于借助ALSV载体导入拟南芥FT基因的蔷薇科果树的开花促进方法。

背景技术

植物由于是固定的生物，所以必须从周围获取多种信息在最适的环境下发芽、生长。尤其是花芽的形成是由茎顶分裂组织的营养生长转变为生殖生长这样的意味着发生剧烈变化的程序过程之一，在使基于有性生殖的繁殖成功方面，决定该变化的时机特别重要。例如苹果中，种子从发芽开始，经过6～12年这样非常长的营养成长期，直至首次开花。由于这些由遗传决定，其详细机理尚不明确，对于苹果的品种改良等是非常大的障碍。

花芽形成开始的时机已知的是受到营养状态、昼夜节律或植物的生育阶段等内因，以及基于温度、光周期等环境的外因控制(非专利文献1)。近年来，通过利用模型植物的长日植物的Arabidopsis thaliana(以下称为拟南芥)，进行了深入研究，提出了光周期(photoperiodic)、春化(vernalization)、赤霉素(GA)以及自律的(autonomous)花芽形成促进这4个通路决定花芽形成的理论(非专利文献2-4)。由于这些通路的各信号根据需要互相补充起作用，即使其中哪一个机能丧失，花芽形成也不会完全受到阻碍。另外，花芽形成的信号受FLOWERING LOCUS T(FT)基因和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1(SOC1)基因综合控制，促进诱导花的形态形成的APETALA1(AP1)基因和LEAFY(LFY)基因的表达，促进开花(非专利文献5-7)。作为通路整合基因的FT基因是通过光周期花芽促进通路而大量表达的基因，该基因的转录控制是调节花芽形成方面最重要的步骤。

FT基因是1991年根据花芽形成延迟变异体的解析而阐明的(非专利文献8)。已知通过昼夜节律(日文：概日時計)和受光体的相互作用感受日长的变化的位置是叶，在叶的韧皮部组织诱导CONSTANS(CO)基因的表达(非专利文献6、9)，进而，CO基因的表达促进FT基因的表达(非专利文献10-14)。已知的是，叶中表达的FT基因以FT蛋白质的形式转移至茎顶分裂组织(非专利文献15)。另外，确认茎顶中特异性表达的FD基因对bZIP型转录因子进行编码，FD蛋白质集中在核中(非专利文献16、17)。FD蛋白质的控制靶标是作为花芽分裂调节基因的AP1基因，FT蛋白质通过与该FD蛋白质结合来促进AP1基因的转录活性，促进花芽形成(非专利文献16、18)。

另一方面，已知表现出与FT基因有高相同性的拟南芥的TERMINALFLOWER 1(TFL1)基因，与FT基因相反，抑制花芽形成(非专利文献19，20)。TFL1基因由于其高相同性而对FT基因进行拮抗，这是因为其通过与FD蛋白质结合，而阻碍AP1基因的转录活性(非专利文献21)。通过制作将TFL1基因失活了的变异体的转化体，已经证实了抑制该TFL1基因的表达会促进花芽形成(非专利文献22)。另外，最近报告了导入了苹果的TFL1(MdTFL1)基因的反义链的变异体实际上在苹果中促进花芽形成的例子，这被推测为是基于TFL1基因的沉默的原因(非专利文献23)。基于RNA沉默的基因的表达调节也许是今后作为阐明该花芽形成调节机构的遗传学的研究方法的有效方法。

苹果潜隐球形病毒(Apple latent spherical virus：ALSV)是由2段单链RNA基因组(RNA1和RNA2)和3种外被蛋白质(Vp25，Vp20，Vp24)构成的直径25nm的病毒，已知除了对苹果以外，还对5种的茄科植物[Nicotiana tabacum cv.Xanthi nc(以下称为称烟草)、Nicotiana glutinosa(以下称为称粘液烟草)，Nicotiana occidentalis(以下称为称西方烟)、烟草本赛姆氏、矮牵牛]、拟南芥等有潜在感染性(非专利文献24)。ALSV对于实验植物Chenopodium quinoa(以下称为称黎麦)全身感染，引发叶脉透过、退绿斑纹的症状(非专利文献25、26)，对于大豆，在感染初期引发退绿斑纹症状。至今已制作出ALSV-RNA2编码的细胞间转移蛋白质(MP)和Vp25之间反复有蛋白酶剪切位点且附加了外来基因导入位点的感染性cDNA克隆(非专利文献27-30)，进而，已经报告了利用其的感染植物中的外来基因的表达(专利文献2，非专利文献27，31，32)。ALSV作为对于以苹果为首的大部分宿主具有潜在感染性的病毒载体具有非常有利的特征，期待能够在各种有用基因的导入和表达、进而利用VIGS的后基因组解析、基于原宿主的苹果的育种中的多种应用等。

【专利文献1】日本特开2008-211993号公报

【专利文献2】日本特开2004-65009号公报(苹果中外来基因的表达)

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【非专利文献24】五十岚亚纪.2007.リンゴ小球形潜在ウイルスベクタ一を利用した植物内在性遺伝子のRNAサイレンシングの誘導(利用苹果潜隐球形病毒载体的植物内在性基因的RNA沉默的诱导).岩手大学大学院农学研究科修士论文.

【非专利文献25】伊藤传，小金泽硕城，吉田浩二.1992.リンゴ輪状さび果Aウイルス(仮称)のリンゴ実生ヘの戻し接種(苹果轮状锈果A病毒(假称)针对苹果实生株的回交接种).日植病报58，617.

【非专利文献26】伊藤传.1997.リンゴ輪状さび果病の病原ウイルスについて(关于苹果轮状锈果病的病原病毒).日植病报63，487.

【非专利文献27】Li C，Sasaki N，I sogai M，YoshikawaN.2004.Stable  expression of foreign proteins  in herbaceous  andapple plants using Apple latent spherical virus RNA2vectors.ArchVirol 149，1541-1558.

【非专利文献28】Li C，Yoshikawa N，Takahashi T，Ito T，YoshidaK，Koganezawa H.2000.Nucleotide sequence and genome organizationof apple latent spherical virus：a new virus classified into thefamily Comoviridae.Journal of General Virology 81，541-547.

【非专利文献29】李春江.1999.リンゴから分離された小球形ウイルスの分類学的研究(从苹果分离的小球形病毒的分类学的研究).岩手大学大学院农学研究科修士论文.

【非专利文献30】李春江.2003.リンゴ小球形潜在ウイルス槽造のゲノムとウイルスベクタ一ヘの改变に関する研究(关于苹果潜隐球形病毒结构的基因组和对病毒载体的改变的研究).岩手大学大学院连合农学研究科博士论文.

【非专利文献31】佐佐木伸浩.2003.ALSVベクタ一による抗菌性ペプチドの植物体での発現(基于ALSV载体的抗菌性肽在植物体中的表达).岩手大学农学部应用生物学科卒业论文.

【非专利文献32】佐佐木伸浩.2005.GFPでタグしたリンゴ小球形潜在ウイルスの細胞間および長距離移行の解析(用GFP标记的苹果潜隐球形病毒的细胞间和长距离转移的解析).岩手大学大学院农学研究科修士论文.

发明内容

【发明要解决的课题】

我国的主要果树苹果和梨等蔷薇科果树从播种到开花通常要6～12年，这是苹果和梨的育种(品种改良)困难最大的原因之一。

近年对于苹果也一直在阐明关系花芽形成的基因机构，如上所述，已经报道了抑制花芽形成的苹果TFL1基因的表达抑制可促进苹果的花芽形成。即，对于苹果(品种：王林)，使用叶盘法导入TFL1基因的反义链，进行组织培养和茎叶(shoot)再生后得到的转化苹果的茎叶嫁接于矮性砧木，随后，相对于在同条件下培养的非转化苹果搬入温室后至开花需要约6年(69个月)，搬入温室进行培养的转化苹果，在搬入温室后8～25个月开花(非专利文献23)。然而，现状是苹果的转化需要很多劳动力，并且组织培养和茎叶再生需要很长时间，而且转化效率也低(非专利文献23中的苹果的转化效率为0.15％)，进而，能转化的苹果品种也受到限制。另外，为了使转化苹果的导入基因能在下一代继承，现在的趋势是对于转化植物的限制很严，即使得到早期开花的转化苹果，从该转化苹果得到的下一代个体也不能直接作为育种材料使用。

另一方面，基于病毒载体的对植物进行的外来基因导入，是通过使重组了外来基因的病毒感染植物并增殖来实现的，因此与转化法比较，富有简便性和迅速性。作为有效发挥功能的病毒载体的条件，可举出对感染植物不引起剧烈的病征或在感染植物中稳定增殖等，ALSV载体是满足这些条件的病毒载体。即，ALSV载体可以不引起苹果发病地进行无病征感染，稳定地维持全身感染。已知有使用ALSV载体的外来基因的导入技术(例如，专利文献2)，但是使用了该ALSV载体技术的蔷薇科果树的开花促进完全是未知的。另外，通常对果树类进行稳定的病毒接种是困难的，对于ALSV也没有确立对以苹果为主的蔷薇科果树的有效的接种法，这对于蔷薇科果树中的使用ALSV载体的外来基因导入技术的利用形成巨大障碍。然而，如上所述，ALSV载体具有作为苹果为主的蔷薇科果树的病毒载体的优良的特性。另外，ALSV虽然进行种子传染但其种子传染率低，因此有可能从使用ALSV载体技术进行了开花促进的苹果的下一代选取没有病毒的个体，该选取的没有病毒个体与未进行基因导入的苹果没有区别，可以直接用作育种材料。因此，如果能够确立基于ALSV载体技术的以苹果为主的蔷薇科果树的开花促进法，即可以期待其成为有用的实用技术。

本申请发明是鉴于以上所述情况而研发的，其课题在于提供用于促进以苹果为主的蔷薇科果树的开花的新技术。

解决课题的技术

作为为了解决上述的课题的发明，本申请提供一种蔷薇科果树的开花促进方法，其特征在于，包括使用基因枪法将从被表达拟南芥FT基因的重组苹果潜隐球形病毒(FT-ALSV)所感染的增殖宿主中浓缩的病毒RNA，接种于刚扎根的蔷薇科果树实生株的子叶的工序。

本申请还提供利用上述任一种方法实施了开花促进的从蔷薇科果树的下一代个体分选的没有病毒的个体或其种子。

【发明的效果】

根据本申请发明，可将通常需要6～12年的苹果、梨的开花大幅短缩为1.5～3个月。由此，可以有效进行苹果、梨等蔷薇科果树的品种改良。

另外，从利用上述任一的方法实施了开花促进的蔷薇科果树的下一代个体中分选出的没有病毒的个体，与未进行基因导入的苹果个体没有区别，该分选个体和其种子可以直接作为育种材料使用。

附图说明

图1是FT-ALSV接种后约1.5个月开花的实生株苹果的照片。

图2是从FT-ALSV感染苹果开花个体采取的花粉的发芽的形态。该个体的花粉发芽率约为80％。

具体实施方式

本申请发明中的蔷薇科果树特指属于蔷薇科梨亚科(Maloideae)的苹果、梨、枇杷等。

拟南芥FT基因基于公知的序列信息(GenBank/AB027504)，可以通过以拟南芥的总RNA为模版的RT-PCR、或拟南芥cDNA文库的噬斑杂交法等公知的方法取得。具体而言，可以通过后记的实施例中所述的顺序容易地取得。

表达FT基因的重组ALSV载体(FT-ALSV)的制作基本上可以根据专利文献2公开的方法进行。即，在作为ALSV RNA2的感染性cDNA克隆的pEALSR2L5R5的外来基因导入位点插入FT基因cDNA，由此构建pEALSR2L5R5FT，与作为ALSV RNA1的感染性cDNA克隆的pEALSR1一同在增殖宿主中接种，进行病毒化，由此得到FT-ALSV。

从由此得到的FT-ALSV感染黎麦用浓缩FT-ALSV，将从浓缩试样提取的RNA用基因枪法接种于蔷薇科果树实生株的子叶，能以大致100％的效率制作出FT-ALSV感染实生株苗，可以大幅加速苹果等蔷薇科果树的开花。本申请发明中的FT-ALSV的基因枪接种可以按照以下的顺序进行。

工序(1)：将FT-ALSV接种于增殖宿主(例如，黎麦)。

工序(2)：从增殖宿主的感染叶提取FT-ALSV，通过离心分离等处理进行浓缩。

工序(3)：从该浓缩的FT-ALSV中分离RNA。

工序(4)：用基因枪法对刚扎根后的蔷薇科果树植物实生株的子叶接种上述RNA。

这些具体的操作，详细地记载于后记实施例中，根据实施例的记载就可以实施，特别需要说明的是，作为该方法的特征之一是接种上述工序(3)中从FT-ALSV分离的RNA，以及上述工序(4)中对蔷薇科果树实生株的子叶进行接种。

另外，工序(4)中的“刚扎根后的蔷薇科果树植物实生株的子叶”如以下方法制备。首先，将休眠结束后的没有扎根期间的实生株苗的种子的种皮用手术刀除去，露出子叶。然后，使用基因枪将涂布有RNA的微载体接种于子叶。这样，接种的FT-ALSV以100％的效率将蔷薇科果树实生株感染。

接种了RNA的种子在遮光保持湿度的状态静置2～3日之后，慢慢适应了外部空气，随后移植于培养土中，以通常的生长温度(约25℃)进行培养。

由此培养的蔷薇科果树，为后记的实施例所示苹果时，约40％的个体在1.5～3个月开花。

以下，示出实施例，对本申请发明进一步详细且具体地说明，但是本申请发明并不限于以下的例子。

【实施例1】

1.材料和方法

(1)FT-ALSV的感染性cDNA克隆的构建

将拟南芥FT基因(864bp，accession number：AB027504)的FT蛋白质表达区域的525bp(碱基编号70～594号)用如下方法扩增。DNA扩增时，模版使用在pBlue script II SK(+)的XbaI/SacI位点重组了FT mRNA的碱基编号29～709号序列的质粒(pBSAtFT-19)，另外，正链引物使用了10μM FT-Xho(+)[5’-CCGCTCGAGATGTCTATAAATATAAGAGA-3’](序列编号1)，反链引物使用了10μM FT-Sma(-)[5’-TCCCCCGGGAAGTCTTCTTCCTCCGCAGC-3’](序列编号2)。将模版DNA溶液(10ng/μl)1μl、正链引物和反链引物各2μl、1.6μl 2.5mM dNTPmixture(TaKaRa)、2μl 10×Ex Taq Buffer(TaKaRa)、11.2l灭菌水、0.2μl TaKaRa Ex Taq混合，使用GeneAmp PCR System2400(Perkin Elmer)，94℃进行5分钟处理后，将[94℃，30秒→55℃，30秒→72℃，60秒]的反应重复35个循环，接着在72℃进行7分钟处理后，最后在4℃进行5分钟处理，结束PCR。向得到的PCR产物1μl加入Loading Buffer[0.25％溴酚蓝，1mM EDTA(pH8.0)，40％蔗糖]1μl，上样于用琼脂糖S(Nippongene制)0.15g、TAE[40mM Tris，20mM乙酸，1mM EDTA(pH8.0)]15ml、溴化乙锭(ethidium bromide)0.6μl制备的1％琼脂糖凝胶的样孔中，进行电泳，确认扩增的DNA为所需要的FT基因的尺寸。

接着，将扩增了的FT基因在XhoI和SmaI中按照以下方式剪切。首先，将10μl用PCR扩增了的FT基因的溶液、10μl 10×K Buffer(TaKaRa)、78μl灭菌水、2μl XhoI(TaKaRa)混合，在37℃静置2小时。在该反应液中依次加入100μl的灭菌水、100μl的TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA(pH8.0)]饱和苯酚、100μl的氯仿，用涡旋振荡器搅拌30秒钟，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。在上清200μl中加入等量的氯仿，用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌后，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离，将该上清200μl转移至另外的1.5ml离心管中。在该上清中加入20μl的3M乙酸钠(pH5.2)、600μl的99％乙醇，充分地搅拌后，在-80℃进行30分钟静置。在以14000rpm进行10分钟(4℃)离心分离得到的沉淀中加入70％乙醇1ml，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。舍去上清，将沉淀减压干燥，混悬于50μl的灭菌水中。接着在该溶液中混合10μl 10×T Buffer(TaKaRa)、10μl 0.1％BSA(TaKaRa)、28μl灭菌水、2μl SmaI(TaKaRa)，在25℃进行2小时静置。在实施了限制酶处理的反应液中加入100μl的灭菌水、100μl的TE饱和苯酚、100μl的氯仿，利用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。在上清200μl中加入等量的氯仿，利用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌后，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。离心分离后，在该上清200μl中加入20μl的3M乙酸钠(pH5.2)和600μl的99％乙醇，充分地搅拌后，在-80℃进行30分钟静置。在以14000rpm进行10分钟(4℃)离心分离得到的沉淀中加入70％乙醇1ml，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。舍去上清，将沉淀减压干燥，将其混悬于20μl的灭菌水中。也与上述相同地对在ALSV-RNA2附加了外来基因导入位点的感染性cDNA克隆的pEALSR2L5R5(100ng/μl)10μl进行基于XhoI和SmaI的酶处理。

接下来，使用QIA quick Gel Extraction Kit(QIAGEN)回收经限制酶处理了的FT基因和pEALSR2L5R5。在FT基因的溶液18μl中加入10×Loading Buffer 2μl，将其上样于1％琼脂糖凝胶的样孔中，进行电泳，然后用手术刀从琼脂糖凝胶切出目的DNA片断，加入1.5ml离心管中测定凝胶的重量。在1.5ml离心管中加入凝胶的3倍体积的Buffer QG，加温至50℃，将凝胶完全溶解，确认溶液的色为黄色。加入与凝胶等量的异丙醇，在2ml离心管中设置色谱柱，在其中加入溶解有凝胶的溶液，以10000rpm进行1分钟(室温)离心分离。弃去留在2ml离心管的溶液，对色谱柱加入750μl的Buffer PE进行清洗，以10000rpm进行1分钟(室温)离心分离后，再次将留在2ml离心管的溶液舍去。以10000rpm进行1分钟(室温)离心分离，将色谱柱安放在新的1.5ml离心管中，在色谱柱的中央加入用于DNA溶出的30μl的Buffer EB[10mM Tris-HCl(pH8.5)]，静置1分钟后，以13000rpm进行1分钟(室温)离心分离。

将凝胶回收后的FT基因作为插入DNA，将pEALSR2L5R5作为质粒载体，进行连接反应。将插入DNA溶液4μl和质粒载体溶液1μl混合，加入DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa)的I液5μl，在16℃静置2小时后，加入1.1μl的III液作为连接反应溶液。

转化是通过热冲击(Heat Shock)法进行的。在-80℃条件下保存的100μl的感应细胞在冰水中缓慢解冻，向其中加入连接反应溶液5μl，用5秒钟缓慢混合，在冰水中静置30分钟。接着，使用水浴，在42℃进行45秒钟加温，结束后在冰中冷却2分钟。在超净台内，将预热了的SOC[2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.058％NaCl，0.019％KCl，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，20mM葡萄糖]900μl加盖用封口膜卷裹，使用震荡培养器，在37℃进行1小时震荡。将该培养液200μl滴加于LMA板[1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.058％NaCl，10mM MgSO₄，1.5％琼脂，40mg/ml氨苄西林]上，用刮涂器涂布于培养基的表面，以打开培养皿的盖子的状态进行10分钟干燥。将剩余培养液800μl以14000rpm进行30秒钟离心分离，舍去上清600μl，在剩余200μl的溶液中将沉淀混悬。将该溶液中的100μl同样地滴加在LMA板上，用刮涂器涂布于培养基的表面，进而，在打开盖子的状态，干燥10分钟。培养基干燥后，将各板移入培养箱，在37℃进行12～16小时培养。

为了小规模培养转化了的菌落，准备16根加入了2ml的LB培养液[1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl]的试管，高压反应釜处理后，在各试管中添加40μl10倍稀释了的氨苄西林[25mg/ml]。用灭菌了的牙签的尖端挑取菌落，接触于LMA板，由此接种了大肠杆菌的一部分而制成主板，牙签直接投入装有LB培养液的试管中。主板中，对每个菌落进行编号来区别，37℃进行一夜静置培养后，用聚乙烯带进行密闭，在4℃保存。在装入了LB培养液的试管中，标注与主板对应的编号，倾斜在37℃进行一夜震荡培养后，将各试管的全部转移至标注相同的编号的16根1.5ml离心管中，以14000rpm进行1分钟(室温)离心分离。以下，示出对于16根各1.5ml离心管进行的操作。用吸引器除去上清，加入STET[0.1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)、5％TritonX-100]350μl并混和，使沉淀悬浮。在10mM Tris-HCl(pH8.0)中加入配制为10mg/ml的溶菌酶溶液25μl进行3秒钟搅拌，40秒钟煮沸后，在冰中进行5分钟冷却。以14000rpm进行10分钟(室温)离心分离，用灭菌的牙签除去沉淀，向剩余上清中加入3M乙酸钠(pH5.2)40μl和异丙醇420μl，进行搅拌后，室温下静置5分钟。将其以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离，小心去除上清。在得到的沉淀中加入500μl的70％乙醇，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离后，除去上清，将沉淀减压干燥。在其中加入50μl调整为RNase20μg/ml的TE添加，使其混悬，37℃进行30分钟静置，制成质粒溶液。

用限制酶处理来确认通过小规模培养得到的质粒中是否导入了FT基因。将质粒溶液2μl，10×K Buffer(TaKaRa)1μl，灭菌水6.8μl，XhoI(TaKaRa)0.2μl移入新的1.5ml离心管，进行混合，在37℃进行2小时静置。随后，按顺序加入90μl的灭菌水、50μl的TE饱和苯酚、50μl的氯仿，利用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。在上清100μl中加入等量的氯仿，利用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌后，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离，将该上清100μl移至其他1.5ml离心管中。在该上清中，加入10μl的3M乙酸钠(pH5.2)、300μl的99％乙醇，充分地搅拌后，-80℃进行30分钟静置。静置后，以14000rpm进行10分钟(4℃)离心分离，在得到的沉淀中，加入70％乙醇500μl，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。舍去上清，将沉淀减压干燥，将其在10μl的灭菌水混悬。接着在该溶液中混合10×T Buffer(TaKaRa)2μl、0.1％BSA(TaKaRa)2μl、灭菌水5.6μl、SmaI(TaKaRa)0.4μl，25℃条件下静置2小时。静置后，在用XhoI和SmaI处理了的质粒溶液9μl中加入10×Loading buffer 1μl，在1％琼脂糖凝胶的样孔中上样，进行电泳。泳动的结果，将通过PCR得到的FT基因和相同的尺寸的片断从质粒切出，记录样品的编号，接下来的大规模培养中使用记录有该编号的菌落。

在大规模培养中使用加入200μl的氨苄西林的100ml的LB培养液和QIAGEN Plasmid Midi Kit(100)(QIAGEN)来进行。用牙签从主板采取单一菌落，将其加入装入有LB培养液的坂口烧瓶中，在37℃振荡培养12～16小时，培养后在离心试管(Falcon^TM)中移入培养液50ml，在7500rpm，进行15分钟(4℃)离心分离。舍去上清，剩余的50ml也同样地进行离心分离，随后，将片状沉淀物(pellet)在加入了RNase的4ml的Buffer P1中混悬，添加4ml的Buffer P2后，进行4～6次转倒使其充分地混和，在室温静置5分钟。添加4ml冷却的Buffer P3，倒转4～6次，进行混和后，冰上培养15分钟。接着，将溶液移至50ml的离心管，以13000rpm(日立RPR16离心机)进行30分钟(4℃)离心分离，回收含有质粒DNA的上清。将该上清再度以13000rpm进行15分钟(4℃)离心分离。在色谱柱上添加4ml的Buffer QBT，使其自然落下直至色谱柱变为空白，进行平衡化，将离心分离得到的上清添加于该色谱柱，使其浸透在树脂中。将色谱柱用10ml的Buffer QC清洗2次，用5ml的Buffer QF，将DNA溶出于新的离心试管(Falcon^TM)中。在溶出的DNA溶液中添加异丙醇3.5mL并混和后，加入COREX管中，直接用11000rpm进行30分钟(4℃)离心分离(日立RPR16离心机)，迅速倾析除去上清。将沉淀的DNA用70％乙醇2ml进行清洗，以11000rpm进行10分钟(4℃)离心分离，除去上清，将沉淀的DNA减压干燥后，溶解于TE100μl中。使用分光光度计(ND-1000v3.1.2)，调制DNA的浓度至1μg/μl，得到在pEALSR2L5R5中导入了FT基因的感染性cDNA克隆pEALSR2L5R5FT。

(2)感染性cDNA克隆的病毒化

根据(1)的方法，将作为从大规模培养精制的ALSV RNA1的感染性cDNA克隆的pEALSR1调制成1μg/μl。在增殖宿主的Chenopodium quinoa(以下称为黎麦)的叶上撒上碳化硅，将pEALSR1(1μg/μl)和pEALSR2L5R5FT(1μg/μl)等量混合的DNA溶液在这些叶上以每叶8μl的方式进行接种，进行病毒化，由此得到表达FT基因的ALSV载体(FT-ALSV)。将通过FT-ALSV感染而表现退绿症状的黎麦叶取样，用于以后的操作。

(3)病毒的浓缩

连接了FT基因的ALSV(FT-ALSV)的浓缩按照以下的顺序进行。首先，将FT-ALSV接种Chenopodium quinoa(以下称为黎麦)后，取样7～10日的接种叶和显现病征的顶叶。对于该感染叶100g，加入300ml的提取缓冲液[0.1M Tris-HCl(pH7.8)、0.1M NaCl、5mM MgCl₂]和3ml的巯基乙醇，用高速组织捣碎机磨碎。磨碎液用2层纱布过滤，用9000rpm进行10分钟(4℃)离心分离(日立RPR12-2离心机)。在得到的溶液中，一边搅拌(40mg/ml)一边慢慢加膨润土溶液，9000rpm进行10分钟(4℃)离心分离。重复该操作直到上清变为透明黄色为止，进行澄清化。接着，在上清中加入8％聚乙二醇，在冰中进行1小时搅拌。用9000rpm进行10分钟(4℃)离心分离后，将沉淀溶解于20ml的提取缓冲液中。接着，加入10ml的氯仿进行15分钟(4℃)搅拌。用9000rpm进行10分钟(4℃)离心分离(日立RPR16离心机)后，将上清用45000rpm进行1.5小时(4℃)离心分离(日立RP65离心机)。在沉淀中加入1ml的提取缓冲液，使其充分地混悬后，用9000rpm进行10分钟(4℃)离心分离，浓缩该上清制得FT-ALSV。

(4)RNA的提取

从浓缩FT-ALSV提取RNA，用于微载体的制备。从浓缩FT-ALSV提取RNA按照以下的顺序进行。在浓缩FT-ALSV 50μl中加入灭菌水150μl，搅拌后，加入水饱和苯酚和氯仿各100μl，利用涡旋振荡器进行充分地搅拌。以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离后，将上清200μl移至新的1.5ml离心管中，加入20μl的3M乙酸钠(pH5.2)，500μl的99％乙醇，充分地搅拌后，在-80℃进行15分钟静置。以14000rpm进行15分钟(4℃)离心分离，在得到的沉淀中加入70％乙醇1ml，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。舍去上清，将沉淀在15μl的灭菌水中混悬。用分光光度计(ND-1000v3.1.2)将得到的溶液配制为1μg/μl，将其作为RNA溶液。

(5)基因枪接种(Biolistic PDS-1000/He Particle Delively System(Bio-Rad))

微载体(RNA；3μg/金粒子；0.4mg/shot)的制备按照以下的顺序进行。首先，在1.5ml离心管中量取金粒子(0.6μm)2.4mg，加入灭菌水100μl，利用涡旋振荡器进行充分地混和。在超声波清洗机中加入离心管，进行5分钟超声破裂。在涡旋振荡器安装试管，一边搅拌一边慢慢加入18μl的RNA溶液(1μg/μl)。同样地，加入5M乙酸铵11.8μl，再慢慢加入异丙醇259.6μl。经过一段时间搅拌后，在-20℃静置1小时以上。去除上清，利用涡旋振荡器对金粒子的沉淀进行一瞬间的搅拌。在金粒子的沉淀中加入1ml的100％乙醇，以不崩解沉淀的方式静静振荡，随后去除上清。重复4次该操作后，在60μl的100％乙醇中混悬金粒子。将混悬液10μl在微载体的中心涂开约1cm，使其十分干燥，然后，使用基因枪进行向植物的导入。在使用了基因枪的接种试验中，将刚扎根后的苹果的种子4～6个体作为1个试验区，进行供试。用手术刀去除种皮，在培养皿排列为同心圆状，在其子叶上，以氦压1100psi的条件使用BiolisticPDS-1000/He Particle Delively System(Bio-Rad)，对每1个试验区进行4次射击。

(6)基因枪接种(Helios Gene Gun System(Bio-Rad))

微载体(RNA；3μg/金粒子；0.4mg/shot)的制备如以下的顺序进行。首先，在1.5ml离心管中量取金粒子(1.0μm)7.2mg，加入灭菌水100μl利用涡旋振荡器进行充分地混和。在超声波清洗机中加入试管，进行5分钟超声破裂。在涡旋振荡器中安装试管，一边搅拌一边慢加54μl的RNA溶液(1μg/μl)。同样地，缓慢加入5M乙酸铵15.4μl，接着缓慢加入异丙醇338.8μl。搅拌一段时间后，以-20℃进行1小时以上静置。去除上清利用涡旋振荡器对金粒子的沉淀进行一瞬间搅拌。在金粒子的沉淀中加入1ml的100％乙醇，以沉淀不崩坏的方式慢慢振荡，随后去除上清。将该操作重复4次后，在1080μl的100％乙醇中使金粒子混悬，在涂金管的制备中使用。在制管装置(Tubing Prep Station)(BIO-RAD)中安装涂金管(BIO-RAD)，通20分钟纯氮气，使涂金管的内部完全干燥。接着，将金粒子的混悬液均匀地填充于涂金管内，放置5分钟，使金粒子在涂金管中沉降后，将上清的99.5％乙醇从涂金管内去除。接着使制管装置旋转，一边使金粒子在涂金管内部均匀扩散，一边向涂金管内通入纯氮气，使金粒子完全干燥。接着，将涂金管使用切管器(BIO-RAD)裁断为18个，使用基因枪进行向植物的导入。用手术刀去除刚扎根后的苹果种子的种皮，对其子叶进行接种。接种在氦压220psi条件下使用Helios Gene GunSystem(Bio-Rad)，对每一个体进行4次射击。

(7)接种个体的培养

接种个体在保持湿度，遮光条件下静置2～3日后，慢慢适应外部空气后，移植于培养土中，在培养室(25℃，明期16小时-暗期8小时)进行培养。

(8)花粉发芽试验

在含蔗糖17％的1％琼脂培养基上散布花粉，在培养室中进行12小时以上静置后，对于一朵花在光学显微镜下观察120粒以上花粉，求出花粉管伸长的花粉的比例，从而求出花粉的发芽率。

2.结果

用基因枪法将从浓缩FT-ALSV中提取的RNA接种于刚扎根后的苹果实生株的子叶中，由此，在接种的20个体中，有20个个体可以确认FT-ALSV的全身感染。由此可知，通过使用本法，能以非常高的效率使苹果被ALSV载体感染。另外，确认FT-ALSV的感染的20个体中8个体中，在接种后从1.5个月至3个月期间，如图1所示可以确认开花。从开花的各个体采取花粉进行发芽试验，结果发现，任意个体的花粉都有发芽能力，在比例高的样品中，如图2所示，发芽率近于80％。即可以认为，通过利用FT-ALSV，可以将通常需要6年至12年的苹果的开花的时间大幅短缩，而且可以将通过FT-ALSV感染而早期开花的苹果用于花粉亲本。

【产业上的利用可能性】

如以上详细说明，通过本申请发明，苹果、梨等蔷薇科果树的开花周期得以大幅加速。这对于苹果、梨等蔷薇科果树的品种改良大有益处。

Claims (2)

1.一种蔷薇科果树的开花促进方法，其特征在于，包括以下工序：将病毒RNA用基因枪法接种于刚扎根后的蔷薇科果树实生株的子叶，所述病毒RNA是从被表达拟南芥FT基因的重组苹果潜隐球形病毒(FT-ALSV)所感染的增殖宿主中浓缩而得的。

2.从用权利要求1或2的方法实施了开花促进的蔷薇科果树的下一代个体中分选的没有病毒的个体或其种子。

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