CN102311175B

CN102311175B - 应用活性酵母菌富集处理125i医疗废水

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Publication number: CN102311175B
Application number: CN 201010215772
Authority: CN
Inventors: 何月涵; 刘枫晨
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: CN102311175A

Abstract

应用活性酵母菌富集处理¹²⁵I医疗废水，主要用于临床放射性废水处理领域。在插有注射针头和添加2％红糖液瓶中，热带、克柔假丝酵母及二者混合菌孵育48小时，菌数大于460×10⁸/mm³时，与¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄和¹²⁵I-RIA医疗废水吸附培养24小时。三种酵母菌对四种标记物的一次饱和吸附为83.0％-99.8％，54.0-410.0mg.g^-1。其中，混合菌吸附¹²⁵I-RIA的效果最佳99.8％，410mg.g^-1，经过三次洗涤，所吸附的复合物解析10.8％-12.7％。吸附处理后的放射性废水的颜色变浅，无异味，上清液CPM＜100、放射性活度＜10Bq/L，达到国家放射性废水排放标准。所富集回收的¹²⁵I医疗废物为干粉状，体积缩小100倍，利于继续放置和防止酵母菌自溶。

Description

应用活性酵母菌富集处理125I医疗废水

(一)技术领域

本发明属于临床放射性医疗废水处理技术领域。具体涉及作为生物吸附剂的热带、克柔假丝酵母菌及二者混合菌的菌株活化、增殖，与¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄、¹²⁵I-RIA(放射免疫分析)废水吸附培养以及所富集的¹²⁵I医疗废物与废水分离和回收等技术程序。

(二)背景技术

应用酵母菌作为一种生物吸附剂处理核工业放射性核素、食品工业有机废水、工业重金属污染物的基础理论及应用研究已经受到国内外学者的高度重视。有关酵母菌吸附放射性核素的同类研究以及多种酵母菌对有机废水、重金属污染物处理的相关研究已见报导。

1、同类研究：国内外应用酵母菌进行放射性核素的同类研究的关注重点主要集中在高放射性核素的处理研究方面^[1]。有关假丝酵母菌吸附²⁴¹Am的研究详尽地说明了假丝酵母菌吸附²⁴¹Am的行为以及实验条件对吸附能力的影响，指出：在培养基成份-葡萄糖浓度2％的条件下，假丝酵母菌吸附²⁴¹Am的反应在4小时达到平衡，吸附效率达97.8％^[2]。丹宝利和安琪酒精酵母菌吸附铀的对比研究，比较和分析了两种酵母菌对液体中高放射性核素铀的吸附现象和各种影响因素，两种酵母菌均能吸附溶液中99％以上的铀，吸附量大于162.5mg/g^[3]。

2、相关研究：酵母菌是工业废水处理中极为珍贵的菌种资源，多菌属酵母菌如啤酒酵母、干酵母菌、解脂耶氏酵母都被应用于食品工业高浓度有机废水、含油废水和重金属污染物处理等相关研究中^{[4][5][6][11]}。其中，在应用干酵母菌及经过化学处理的菌液吸附、富集重金属的研究以及同时采用红外光谱分析、电镜技术等手段研究酵母菌吸附机理方面获取大量实验结果。干酵母菌对铅的吸附是一个快速反应过程，当吸附反应30分钟时，酵母菌的吸附量为47.6mg.g^-1，吸附率91.6％；在90分钟时基本达到吸附平衡，吸附48.8mg.g¹，吸附效率94.0％。电镜分析发现吸附铅后部分酵母菌出现细胞壁破裂和脱离现象，提示胞内溶出物质有益于酵母菌对铅的后期吸附。丙酮处理酵母菌吸附铅的前后红外光谱分析显示：酵母菌细胞壁在吸附铅过程中，出现多糖糖环键的微弱振动和羟基、羧基吸收峰的明显位移，峰位3375cm^-1紫移至3388cm^-1，1398cm^-1红移至1384cm^-1，实验数据证实细胞壁上官能团羟基、羧基在结合铅离子时发挥了重要作用^[7][8]。

3、具体比较：如上所述，应用酵母菌吸附放射性核素的同类研究全部集中在高放射性核素的处理研究方面。²⁴¹Am是超铀放射性元素，因其半衰期较长、对人体危害较大，人们对²⁴¹Am的重视像铀一样投入了大量经费和精力。而对于普遍用于临床化验的低放射性¹²⁵I标记物的处理研究尚不多见，应用活性热带、克柔假丝酵母菌富集处理¹²⁵I医疗废水的研究结果未见发表。与同类和相关研究比较，本专利应用的是活性有氧型热带、克柔假丝酵母菌和二者混合菌，该类活性微生物作为生物吸附剂吸附¹²⁵I时具有吸附反应时间长、吸附牢固等结合特点。本专利吸附¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄及¹²⁵I-RIA医疗废物的效果开始出现在菌龄≥48小时、吸附反应时间≥2小时以及24小时达吸附反应平衡的菌液中，该生物吸附规律与快速反应达吸附平衡的同类和相关研究结果不同。在氧气充足和添加2％红糖液中，菌龄≥48小时的活性热带、克柔假丝酵母及二者混合菌菌吸附以上四种标记物在24小时达吸附高峰，这一反应过程包括菌壁迅速静电吸附¹²⁵I医疗废物，随后将吸附物转运进入菌体内，该主动运输过程消耗能量，需要较长时间。主动运输多为不可逆的吸附反应过程，不仅吸附效率高和吸附量大，而且与¹²⁵I医疗废物结合较为牢固，所形成的复合物解析度低。主动转运¹²⁵I医疗废物的吸附效果明显好于瞬间、暂时性的静电吸附反应。

4、问题：从以上具体比较中可以看出，同类和相关研究对²⁴¹Am、铀和重金属离子等物质的快速吸附反应多为被动、可逆性静电吸附反应，菌体与铀、重金属等废物结合不牢固，极易解析出原污染物。因此，快速吸附反应形成的复合物需要立即与液体分离。否则，复合物将迅速解离。此外，由于快速吸附反应形成复合物的时间短暂，操作者难以掌握即时分离的最适时间。本实验菌为活性有氧型酵母菌，在菌种活化、增殖和吸附反应的72小时全过程中，氧气浓度和能量供给都将影响菌体吸附效果。除此之外，酵母菌容易出现自溶现象，菌体需要及时同收，否则，酵母菌将溶解造成二次污染^[9]。

5、发明动机：¹²⁵I是RIA最常见的放射性核素标记物。目前，应用¹²⁵I标记的RIA检测项目多于300 余种，处理RIA医疗废水已经成为迫切需要解决的难题。传统处理方法有两种：(1)稀释法：将RIA废水用水稀释至¹²⁵I放射性核素活度＜10Bq/l时将稀释废水排入生活下水^[10]。(2)放置法：放置RIA废水10个半衰期后排除。关于传统处理方法稀释法，由于未能从根本上处理放射性核素，临床上不情愿接受。已知 ¹²⁵I半衰期59.6天，实施放置法需要放置RIA废水近两年时间。在医疗废水的放置期间，废水容量的累积增加和废水中蛋白质变质的恶臭气味均为采用放置法增加实际困难。多年来，建立实用、有效地处理RIA废水的方法为本专利的努力目标。尽管未见酵母菌处理¹²⁵IRIA废水的文献报导，但是酵母菌对某些污染物具有较强吸附功能的有关研究结果，可以借鉴并用于¹²⁵IRIA废水的处理研究。本研究以同类和相关研究的静电吸附机制为基础，努力提供有氧型酵母充足的代谢需氧量和能量供给，促进酵母菌对¹²⁵I吸附向消耗能量、吸附进入菌体内的主动运输方向运行。通过静电吸附和主动转运作用，活性热带、克柔假丝酵母菌和二者混合菌凝聚、沉淀¹²⁵I放射性核素、蛋白质及其它有形成份而富集废水中¹²⁵I医疗废物的理论是成立的。此外，富集¹²⁵I医疗废物的效果能够通过γ--放射免疫计数器的测量、红外光谱分析以及透射电子显微镜的观察加以证实和说明。¹²⁵I是释放γ和X射线的放射性核素，能量在30kev左右，应用γ--放射免疫计数器能够准确测量到γ射线的存在。即使痕量存在，也能精确检测其存在浓度。因此，本实验菌对 ¹²⁵I医疗废物的一次饱和吸附以及解析度均能测得准确数据。透射电子显微镜镜检的放大倍率300万倍、分辨率约为0.3纳米，电镜能够清晰地观察到酵母菌在吸附反应前后其细胞结构的细微变化。红外吸收光谱分析通过物质分子间相互作用引起分子振动能级的跃迁，呈现波数范围4000-400cm^-1吸收光谱的峰位、峰强和峰形方面的变化，进而推测参与吸附反应的某种官能团的存在，推断吸附反应的机制。因此，应用活性热带、克柔假丝酵母及二者混合菌富集处理¹²⁵IRIA医疗废水的研究是完全可行的，富集¹²⁵I医疗废物的效果是能够加以证实的。

(三)发明内容

发明目的：将活性热带、克柔假丝酵母及二者混合菌作为一种生物吸附剂应用于¹²⁵I RIA医疗废水的处理技术领域。本发明将通过在培养瓶瓶口插有注射针头、添加2％红糖液，解决有氧型酵母菌在吸附过程中的氧气和能量不足，促进菌体由菌壁静电吸附到进入菌体内的主动转运式牢固结合。此外，通过吸附反应完成后即时分离、所吸附的复合物自然干燥等技术方案，达到利用活性热带、克柔假丝酵母和混合菌最大吸附效率地富集处理¹²⁵IRIA医疗废水和抑制酵母菌自溶的有益效果。

1、技术方案：

1.1材料

热带和克柔假丝酵母菌和二者混合菌菌种由海口市沃特生物有限公司提供，哈尔滨医科大学附属第二医院微生物实验室鉴定。傅立叶红外光谱仪IRPrestige-21日本岛津公司。透射电子显微镜1220日本电子公司。γ放射免疫计数器GC-2010中国科大创新股份有限公司。培养基成份：硫酸铵3克、磷酸二氢钾1克、乙酸钠0.3克、氯化钠0.5克、硫酸锰0.5毫升、酵母膏1克、蛋白胨1.5克、红糖20克、葡萄糖5克/1升水。培养瓶：瓶口插有5号注射针头。¹²⁵I-DNA(8ng/ml)由京原原子高科股份有限公司提供。¹²⁵I-T₃、 ¹²⁵I-T₄北京科美东雅生物技术有限公司。¹²⁵I-RIA废水来源于本实验室。

1.2实验步骤：

1.2.1菌种活化分别取热带、克柔假丝酵母菌和二者混合菌的菌种置于培养瓶中，37℃条件下活化培养48小时，每间隔12小时混匀一次。

1.2.2吸附培养实验组(四组)经过以上活化培养、细菌数量达460×10⁹/mm³以上的活性热带、克柔假丝酵母和二者混合菌分别与四种标记物¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T3、¹²⁵I-T4及¹²⁵I-RIA废水混合，继续吸附培养24小时，每4小时混合一次。对照组热带、克柔假丝酵母和混合菌连续培养72小时。

1.2.3分离处理以上实验组和对照各组菌液分别取1ml，在4000转/分钟和4℃条件下离心20分钟一次，分离后沉淀物以备干燥秤重、放射性计数测量，电镜观察和红外光谱分析。观察吸附物解析度的实验各管均用培养液洗涤、离心三次。

1.2.4检测实验组和对照组秤重。应用γ-放射免疫计数器测量沉淀物与上清液每分钟放射性计数(CPM)，计算热带、克柔假丝酵母菌和二者混合菌吸附¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄及¹²⁵I-RIA医疗废物的吸附效率、吸附量和解析度。电镜观察在吸附前后各组酵母菌细胞结构的细微变化。红外光谱分析。

1.2.5富集回收¹²⁵I医疗废物收集以上各CPM＜100离心管沉＞淀物，置专用储存盒内自然风干，待其放置衰变。以上各管的上清液CPM＜100和＜10Bq/L时弃掉。CPM＞100和＞10Bq/L时重复进行1.2.2和1.2.3步骤一次，直至达到临床RIA废水＜10Bq/L的放射性废水排放标准。

2、有益效果

本专利通过应用2％红糖培养液和在培养瓶瓶口插入5号注射针头，为实验菌提供了充足氧气和代谢能量，有效地促进了酵母菌对¹²⁵I医疗废物的静电吸附和主动转运入胞内的牢固结合，使热带、克柔假丝酵母及二者混合菌作为生物吸附剂获得富集¹²⁵I医疗废物的显著效果。

2.1饱和吸附¹²⁵I医疗废物

作为生物吸附剂的热带、克柔假丝酵母及二者混合菌三种酵母菌一次饱和吸附四种标记物¹²⁵I-DNA、 ¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄和¹²⁵I-RIA医疗废物的吸附效率和吸附量范围83.0％-99.8％，54.0-410.0mg.g^-1(表1)。其中，混合菌吸附效果最佳，尤其能够一次饱和吸附¹²⁵I-RIA医疗废物99.8％，410mg.g^-1。其次克柔假丝酵母菌和热带假丝酵母菌一次饱和吸附¹²⁵I-RIA废物，分别为95.0％、290.0mg.g^-1和94.7％、350.0mg.g^-1。以上三种实验菌吸附四种¹²⁵I医疗废物所形成的复合物经三次洗涤，解析度为10.8％--25.3％(表2)。其中，热带、克柔假丝酵母及混合菌吸附¹²⁵I-RIA废物所形成的复合物的解析度依次为11.5％、12.7％和10.8％。

经过上述试验步骤所富集处理的¹²⁵I医疗废水的上清液的颜色变浅、无异味、无放射性，放射性检测cpm＜100，放射性比活度＜10Bq/L，上清液达到国家放射性废水排放标准。经过本专利所富集的放射性沉淀物的体积明显缩小近100倍，即由原来每反应标本1ml浓缩到10ul。该小体积的沉淀物容易在室温条件下自然干燥、同时利于收集、储存和采用放置法，待其物理衰变，直至达到排放标准。已经富集干燥的¹²⁵I收集物能够明显地抑制医疗废物中蛋白质类的腐烂和酵母菌自溶现象的发生，有效地防止了腐败气体的产生和酵母菌自融的二次污染。

与同类和相关研究酵母菌的吸附效率、吸附量的效果比较，本专利的有益效果尤其是混合菌一次饱和吸附¹²⁵I-RIA医疗废物99.8％，410mg.g^-1和10.8％-12.7％低解析度的有益效果明显好于在葡萄糖培养基条件下，假丝酵母菌静电吸附²⁴¹Am 4小时达到平衡，吸附效率达97.8％^[2]和吸附铀99％，吸附量162.5mg/g^[3]的同类和相关研究的研究成果。该比较结果提示：应用2％红糖培养液和通过瓶口针头，有效地为实验菌提供充足氧气和代谢能量，明显地促进了三种酵母菌对¹²⁵I四种标记物、尤其是混合菌对¹²⁵I-RIA废物的牢固结合。该结果表明热带、克柔假丝酵母及二者混合菌对¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄和¹²⁵I-RIA医疗废物具有较好的吸附能力，富集处理¹²⁵I-RIA医疗废水已经显示了明显的有益效果。因此，将活性热带、克柔假丝酵母菌尤其是二者混合菌作为一种生物吸附剂应用于临床富集处理¹²⁵I医疗废水是切实可行的。

三种酵母菌一次饱和吸附¹²⁵I四种标记物

表1

表1显示热带、克柔假丝酵母及二者混合菌三种酵母菌一次饱和吸附四种标记物¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、 ¹²⁵I-T₄和¹²⁵I-RIA医疗废物的吸附效率和吸附量，其中，混合菌吸附¹²⁵I-RIA废物的效果最佳，其次为克柔假丝酵母菌和热带假丝酵母菌

三种酵母菌吸附后的解析度

表2

表2显示三种酵母菌吸附四种标记物所形成的复合物经过三次洗涤后的解析程度，其中，混合菌对¹²⁵I-RIA废物的吸附较为牢固

2.2透射电子显微镜镜检结果

对照组：电镜下，热带、克柔假丝酵母及二者混合菌之间无形态学差异。细胞大部分呈圆形，大小在2nm左右，细胞壁、细胞膜、胞质内细胞器结构清晰、菌壁厚度均匀，菌壁细胞膜呈线性波纹状，胞质内线粒体脊清晰可见(图1)。

实验组：吸附反应后，三种实验菌的部分菌壁变薄，外侧有絮状物质沉积，菌体大部分呈变性状态，少量菌壁灶状溶解，形成厚度不均、密度不一的不规则形态，部分菌体内可见脂滴颗粒、游离核蛋白体溶解、线粒体空泡变性以及细胞核固缩(图2、3、4)。

2.3红外光谱分析图：

热带、克柔假丝酵母及二者混合菌吸附¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄和¹²⁵I-RIA医疗废物的吸收光谱基本相似，与对照组比较，各实验组均出现碳水化合物的羟基特征峰3444^cm-1峰位的20-22^cm-1明显红移，即峰位移位至3422-3424^cm-1(图5、6、7)。结果说明，三种实验菌对四种¹²⁵I标记物的吸附反应的反应模式基本相同。同时，热带假丝酵母菌吸附¹²⁵I-DNA时单独出现胺基官能团1078cm^-1峰位篮移到1092^cm-1的移位变化。除此之外，吸附前后的其它峰位、峰强和峰形无明显差异。红外光谱分析的实验结果表明在酵母菌富集¹²⁵I医疗废物的过程中，热带、克柔假丝酵母及二者混合菌菌体上的碳水化合物中的羟基在吸附反应中发挥了重要作用。在吸附¹²⁵I-DNA时，热带假丝酵母菌菌体上的胺基也发挥了主要作用。

(四)附图说明

图1.对照组：显示吸附前实验菌在电镜下的正常形态结构，热带、克柔假丝酵母及二者混合菌之间无形态学差异，菌壁厚度均匀，细胞壁、细胞膜、胞质内的细胞器结构清晰，胞质内线粒体脊清晰可见

图2.实验组：显示吸附后实验菌的细胞结构变化，吸附后菌壁变薄、厚度不均，菌体内可见脂滴颗粒、，另一细胞部分菌壁外侧有絮状物质沉积

图3.实验组：显示吸附后酵母菌的菌壁灶状溶解，菌体呈变性状态，游离核蛋白体溶解、线粒体空泡变性以及细胞

图4.实验组：显示吸附后菌壁外周有均匀絮状物质沉积

图5.热带假丝酵母菌酵母菌吸附¹²⁵I-DNA与对照组红外吸收光谱比较。吸附后出现碳水化合物的羟基特征峰3444^cm1明显红移到3424^cm1和胺基官能团1078cm^-1峰位篮移到1092^cm-1的移位变化。

图6.显示克柔假丝酵母菌吸附¹²⁵I-T₄、¹²⁵I-T₃与对照组红外吸收光谱比较。吸附¹²⁵I-T₄和吸附、¹²⁵I-T₃的吸收光谱相同，均出现碳水化合物的羟基特征峰3444^cm-1明显红移20^cm-1的移位现象。

图7.混合酵母菌吸附¹²⁵I-RIA医疗废物与对照组红外吸收光谱比较图显示，除外出现碳水化合物的羟基特征峰3444^cm-1峰位移位21^cm-1，较其它实验菌的对照组2373^cm-1峰位显示较高的峰强。

(五)具体实施方式

1.、在瓶口插有5号注射针头和添加2％红糖培养液的培养瓶中，热带、克柔假丝酵母菌和二者混合菌分别在37℃条件下活化培养48小时，每间隔12小时混匀一次。

2、实验组：细菌数量达460×10⁰/mm³以上的活性热带、克柔假丝酵母和二者混合酵母菌分别与四种标记物¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T3、¹²⁵I-T4及¹²⁵I-RIA废液混合，继续吸附培养24小时。每4小时混合培养瓶一次。对照组的热带、克柔假丝酵母和混合酵母菌连续培养72小时。

3、实验组和对照各组菌液分别取1ml，在4000转/分钟和4℃条件下离心一次，20分钟，分离沉淀物与上清液。实验各管均用培养液洗涤、离心三次。沉淀物为实验菌所富集的¹²⁵I医疗废物。

4、收集以上各离心管沉淀物，置专用储存盒内自然风干，待其放置衰变。以上各管的上清液CPM＜100和＜10B q/L时弃掉。CPM＞100和＞10B q/L时重复进行1.2.2和1.2.3步骤一次，直至达到临床RIA废水＜10B q/L的放射性废液排放标准

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Claims

1.应用活性酵母菌富集处理¹²⁵I医疗废水，其特征是：在添加红糖的培养液及插有5号注射针头的培养瓶中，热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌和二者混合菌活化孵育48小时，其中培养液成分为每1升水中加入硫酸铵3克、磷酸二氢钾1克、乙酸钠0.3克、氯化钠0.5克、硫酸锰0.5毫升、酵母膏1克、蛋白胨1.5克、红糖20克、葡萄糖5克，菌数达460×10⁹/mm³以上的上述三种酵母菌再分别与¹²⁵I-DNA、¹²⁵I-T₃、¹²⁵I-T₄及¹²⁵I-RIA医疗废水吸附培养24小时，离心，放置沉淀物自然干燥，回收所富集处理的干品状¹²⁵I放射性医疗废物。