CN102308000B - 产生2n配子或未减数配子的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及其中蛋白质OSD1失活的植物，所述蛋白质OSD1参与减数分裂I向减数分裂II的过渡。这些植物产生了第二次分裂再组(SDR)2n配子。本发明还涉及其中OSD1的失活与下述基因失活相组合的植物，所述基因即参与植物中减数分裂重组的基因以及参与减数分裂期间着丝粒单极定向的基因。这些植物产生了未减数配子。这些植物可用于植物育种。

Description

产生2N配子或未减数配子的植物
本发明涉及产生2n第二次分裂再组(Second Division Restitution，SDR)配子的植物，还涉及产生未减数配子(apomeiotic gamete)的植物，以及它们在植物育种中的用途。
2n配子(也称为二倍体配子(diplogamete))是具有体细胞染色体数目而不是配子体染色体数目的配子。已经表明它们可用于几种作物的遗传改良(有关综述，参见(例如)RAMANNA & JACOBSEN，Euphytica 133，3-18，2003)。具体地，二倍体配子的产生使得不同倍数水平的植物之间能够杂交，例如四倍体作物植物与其二倍体野生型亲缘植物之间的杂交，从而在植物育种项目中使用它们的遗传多样性。
2n配子的形成来源于减数分裂期间的异常(有关综述，参见VEILLEUX，Plant Breeding Reviews 3，252-288，1985或BRETAGNOLLE & THOMPSON，New Phytologist 129，1-22，1995)。
在正常减数分裂中，染色体首先复制，从而产生了姐妹染色单体对。在该轮复制之后是两轮分裂：称作减数分裂I和减数分裂II。减数分裂I期间，同源染色体重组并分离进入两个细胞，它们的每一个包含一套单倍体容量的染色体。在减数分裂II中，从减数分裂I中产生的两个细胞进一步分裂，姐妹染色单体分离。因此，由该分裂产生的孢子为单倍体并且带有重组的遗传信息。
导致2n配子形成的异常特别地包括异常胞质分裂、跳过(skip)减数第一次或第二次分裂或者异常的纺锤体几何形状(有关综述，参见VEILLEUX，Plant Breeding Reviews 3，252-288，1985或BRETAGNOLLE & THOMPSON，New Phytologist 129，1-22，1995)。这些异常导致产生了不同类型的未减数配子。例如，减数第一次分裂的失败导致第一次分裂再组(Firtst Division Restitution，FDR)配子，而减数第二次分裂的失败导致第二次分裂再组(SDR)配子。
尽管已经在多种植物物种中报道了能够产生2n配子的多种突变体，但是到目前为止，仅仅在分子水平上鉴定并表征了一个与2n花粉形成有关的基因。命名为AtPS1(Arabidopsis thaliana parallel spindles)的该基因的失活产生了二倍体雄性孢子，从而导致产生了有活力的二倍体花粉颗粒并且在子代中产生了自发的三倍体植物。在2008年7月8日提交的欧洲专利申请08490672中和D′ERFURTH等人(PLoS Genet.2008 Nov；4(11)：e1000274.Epub 2008 Nov 28)的出版物中公开了该基因及其在产生2n花粉中的用途。
目前，本发明人已在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定了与植物中2n配子形成有关的另一个基因。本发明人已发现该基因的失活导致跳过减数第二次分裂。这产生了二倍体雄性和雌性孢子，从而导致产生了有活力的二倍体雄性和雌性配子，即SDR配子。该基因在下文中将命名为OSD1(omission of second division)。拟南芥(Arabidopsisthaliana)的OSD1基因序列可在TAIR数据库中以登记号At3g57860获得，或者在GenBank数据库中以登记号NM_115648获得。该基因编码243个氨基酸的蛋白质(GenBank NP_191345)，其序列也在所附序列表中以SEQ ID NO：1表示。
之前在HASE等人(Plant J，46，317-26，2006)的出版物中已经将拟南芥(Arabidopsis thaliana)的OSD1基因描述为“UVI4矿基因(UVI4-L)，该出版物描述了名为UVI4的其旁系同源基因。根据HASE等人，UVI4起到核内复制(endo-reduplication)抑制子的作用，并且其是维持有丝分裂状态所必需的，而OSD1(UVI4-L)似乎不是该过程所需要的。相反，如本文所示，OSD1似乎是使减数分裂I能够向减数分裂II过渡所必需的。
本发明人还在水稻(Oryza sativa)中鉴定了拟南芥(Arabidopsisthaliana)OSD1基因的直系同源基因。水稻(Oryza sativa)OSD1基因的序列可在OryGenes或TAIR数据库中以登记号Os02g37850获得。它编码了234个氨基酸的蛋白质，其序列在所附序列表中以SEQ ID NO：35表示。拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)的OSD1蛋白在它们的序列全长上有23.6％的同一性和35％的相似性。
因此，本发明提供了获得产生第二次分裂再组2n配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下文中称作OSD1蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO：1的AtOSD1蛋白或者与SEQ ID NO：35的OsOSD1蛋白有至少20％，以及按照优先性提高的顺序，至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列同一性，或者有至少29％，以及按照优先性提高的顺序，至少35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列相似性。
除非另外指明，否则本文所提供的蛋白序列同一性和相似性值是以缺省参数使用BLASTP程序或者使用尼德尔曼-文施(Needleman-Wunsch)全局比对算法(使用缺省参数的EMBOSS成对比对Needle工具)对序列全长计算的。相似性计算是使用得分矩阵BLOSUM62进行的。
根据本发明产生的SDR 2n配子在2n配子的所有常规应用中是有用的，例如，用于产生多倍体植物或使不同倍数性水平的植物间能够杂交。它们还可用于基因作图方法，例如，美国专利申请20080057583中公开的“逆向子代基因作图(Reverse progeny mapping)”法。
本发明人还发现通过将OSD1的失活与两个其它基因的失活相结合导致减数分裂完全被有丝分裂所取代但不影响随后的有性过程的基因型，所述两个其它基因中的一个基因(SPO11-1)编码了植物中有效减数分裂重组所必需的蛋白质以及对其的抑制消除了重组和配对(GRELON等人，Embo J，20，589-600，2001)，而其中的另一个基因(REC8，At2g47980)编码减数分裂期间着丝粒单极定向所必需的蛋白质(CHELYSHEVA等人，JCell Sci，118，4621-32，2005)以及对其的抑制改变了染色单体的分离。这种基因型在下文中被称作MiMe(有丝分裂代替减数分裂，mitosis insteadof meiosis)。有丝分裂对减数分裂的这种代替导致未减数配子，其保留了所有的亲代遗传信息(BICKNELL & KOLTUNOW，Plant Cell，16 Suppl，S228-45，2004)。
图1提供了下列项之机制之间比较的示意图：有丝分裂、正常减数分裂、osd1突变体中的减数分裂、缺少SPO11-1活性的突变体(Atspo11-1)中的减数分裂、缺少SPO11-1和REC8活性的双突变体(Atspo11-1/Atrec8)中的减数分裂以及MiMe突变体中的减数分裂。
在二倍体细胞的有丝分裂期间，染色体复制并且姐妹染色单体分离以产生子细胞，所述子细胞是二倍体的并且在遗传上与初始细胞相同。在正常减数分裂期间，一轮复制后是两轮染色体分离。在第一次分裂时，同源染色体重组并分离。减数分裂II更类似于有丝分裂，其导致姐妹染色单体平均分配。因此，所获得的孢子是单倍体且带有重组的遗传信息。在osd1突变体(本研究)中，减数分裂II被跳过，从而产生了二倍体孢子和具有重组遗传信息的SDR配子。
Atspo11-1突变体经历了不平衡的第一次分裂，随后经历了第二次分裂，其导致不平衡孢子和不育。
Atspo11-1/Atrec8双突变体经历了有丝分裂样的分裂而不是正常的减数第一次分裂，随后经历了不平衡的第二次分裂，其导致不平衡孢子和不育。
在osd1/Atspo11-1/Atrec8三突变体(MiMe)中，Atspo11-1和Atrec8突变的存在导致了有丝分裂样的减数第一次分裂，而osd1突变的存在防止发生减数第二次分裂。因此，有丝分裂样分裂取代了减数分裂。所获得的孢子和配子在遗传上与初始细胞是相同的。
可将MiMe突变体所产生的未减数配子以与SDR 2n配子相同的方式用于产生多倍体植物或者用于不同倍数性水平植物的杂交。对于无融合生殖(apomictic)植物(即下述植物：能够从胚珠的母系组织中形成种子，产生的子代是母系亲代的遗传克隆)的产生来说，它们也是受到关注的。尽管在超过400种被子植物中存在，但是极少有作物物种是无融合生殖的，并且通过杂交引入该特性的尝试也失败了(SAVIDAN，The Floweringof Apomixis：From Mechanisms to GeneticEngineering 2001；SPILLANE等人，Sexual Plant Reproduction，14，2001)。
因此，本发明的另一个目标是用于获得产生未减数配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下列蛋白质：
a)如上所定义的OSD1蛋白；
b)在植物中参与减数分裂重组起始的蛋白质，所述蛋白质选自：
i)在下文中称作SPO11-1蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQID NO：2所示的SPO11-1蛋白有至少40％，以及按照优先性提高的顺序，有至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列同一性，或者有至少60％，以及按照优先性提高的顺序，有至少65、70、75、80、85、90、95或98％的序列相似性；
ii)下文中称作SPO11-2蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ IDNO：3所示的SPO11-2蛋白有至少40％，以及按照优先性提高的顺序，有至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列同一性，或者有至少60％，以及按照优先性提高的顺序，有至少65、70、75、80、85、90、95或98％的序列相似性；
iii)下文中称作PRD1蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ IDNO：4所示的PRD1蛋白有至少25％，以及按照优先性提高的顺序，有至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列同一性，或者有至少35％，以及按照优先性提高的顺序，有至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列相似性；
iv)下文中称作PAIR1蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ IDNO：5所示的PAIR1蛋白有至少30％，以及按照优先性提高的顺序，有至少35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列同一性，或者有至少40％，以及按照优先性提高的顺序，有至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列相似性；
c)下文中称作Rec8蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO：6所示的Rec8蛋白有至少40％，以及按照优先性提高的顺序，有至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列同一性，或者有至少45％，以及按照优先性提高的顺序，有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％的序列相似性。
SEQ ID NO：2表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)SPO11-1蛋白的序列。该序列可在Swissprot数据库中以登记号Q9M4A2获得。
SEQ ID NO：3表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)SPO11-2蛋白的序列。该序列可在Swissprot数据库中以登记号Q9M4A1获得。
SEQ ID NO：4表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)PRD1蛋白的序列。该序列可在GenBank数据库中以登记号ABQ12642获得。
SEQ ID NO：5表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)PAIR1蛋白的序列。该序列可在GenBank数据库中以登记号NP_171675获得。
SEQ ID NO：6表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)Rec8蛋白的序列。该序列可在GenBank数据库中以登记号NP_196168获得。
SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1和Rec8蛋白在高等植物、单子叶植物和双子叶植物中是保守的。非限制性地例如单子叶植物中的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1和Rec8蛋白的直系同源物，可引用水稻(Oryza sativa)的SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1和Rec8蛋白。水稻(Oryza sativa)SPO11-1蛋白的序列可在GenBank中以登记号AAP68363获得；水稻(Oryza sativa)SPO11-2蛋白的序列可在GenBank中以登记号NP_001061027获得；水稻(Oryzasativa)PRD1蛋白的序列可在GenBank中以登记号EAZ30311获得；水稻(Oryza sativa)PAIR1蛋白的序列可在SwissProt中以登记号Q75RY2获得；水稻(Oryza sativa)Rec8蛋白的序列可在GenBank中以登记号AAQ75095获得。
可通过消除、阻断或降低它们的功能，或者有利地通过阻止或下调相应基因的表达，来获得上述OSD1、SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1或Rec8蛋白的抑制。
举例来说，可通过诱变相应基因或其启动子，以及选择部分地或完全地丧失所述蛋白质活性的突变体，来获得所述蛋白质的抑制。例如，根据突变的性质，编码序列内的突变可诱导失活蛋白质或活性受损蛋白质的表达；同样地，启动子序列内的突变可引起所述蛋白质表达缺乏或减少。
例如，可通过编码序列或者编码所述蛋白质之基因的启动子或其部分的靶向缺失来进行突变，或者可通过外源序列靶向插入到所述编码序列或者所述启动子中来进行突变。还可通过诱导随机突变来进行，例如，通过EMS诱变或随机插入诱变，接着筛选所需基因中的突变体。高通量诱变和筛选的方法在本领域中是可用的。举例来说，可参见TILLING(定向诱导基因组局部突变，如McCallum等人，2000中所述)。
在OSD1基因内的突变中，可根据该突变纯合的植物的表型特征来鉴定导致产生SDR 2n配子能力的那些突变：这些植物可形成至少5％，优选地至少10％，更优选地至少20％，更优选地至少50％和最高100％的二分体形式的减数分裂产物。
在参与植物中减数分裂重组起始之蛋白质的编码基因内的突变中，如SPO11-1基因或SPO11-2、PRD1或PAIR1基因，可根据该突变纯合的植物的表型特征(特别地，减数分裂I中存在单价染色体而不是二价染色体，和植物不育)来鉴定可用于获得产生未减数配子之植物的那些突变。
在具有REC8基因内突变的突变体中，可根据该突变纯合的植物的表型特征(特别地，减数分裂中染色体断裂，和植物不育)来鉴定可用于获得产生未减数配子之植物的那些突变。
根据用于获得能够产生SDR 2n配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案，所述方法包括：
a)提供在OSD1基因之等位基因内具有突变的植物，所述突变导致该等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；
b)使步骤a)中的所述植物自交，以获得所述突变纯合的植物。
根据用于获得能够产生未减数配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案，所述方法包括：
a)提供在OSD1基因之等位基因内具有突变的植物，所述突变导致该等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；
b)提供在选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1或PAIR1之基因的等位基因内具有突变的植物，所述突变导致所述等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；
c)提供在REC8基因的等位基因内具有突变的植物，所述突变导致所述等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；
e)将步骤a)、b)和c)中的植物杂交，以获得在OSD1基因之等位基因内具有突变、在选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1或PAIR1的基因之等位基因内具有突变以及在REC8基因之等位基因内具有突变的植物，所述植物对每个突变是杂合的；
f)将步骤e)中的植物自交，以获得以下突变纯合的植物，即OSD1基因内的突变、选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1或PAIR1的基因内的突变和REC8基因内的突变。
作为替代，通过沉默相应基因来获得靶标蛋白质的抑制。用于植物中基因沉默的方法本身是本领域已知的。例如，可提及反义抑制或共抑制，例如美国专利5190065和5283323中所述的。还可使用靶向所述蛋白质mRNA的核酶。
一些优选的方法是通过RNA干扰(RNAi)诱导基因沉默的那些方法，其使用靶向待沉默基因的沉默RNA。在本领域中，有多种用于递送沉默RNA的方法和DNA构建体是可用的。
在本文中，“沉默RNA”定义为可以序列特异性的方式通过与互补mRNA分子碱基配对使靶标基因沉默的小RNA。特别地，沉默RNA包括小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。
起初，用于在植物中递送沉默RNA的DNA构建体包含靶基因cDNA的300bp或以上(一般为300-800bp，尽管有时较短的序列也可诱导有效的沉默)的片段，其处于在所述植物中具有活性的启动子的转录控制之下。当前，更广泛使用的沉默RNA构建体是可产生发夹RNA(hpRNA)转录本的那些。在这些构建体中，靶基因的片段是反向重复的，一般在所述重复之间具有间隔区(有关综述，参见WATSON等人，2005)。还可使用针对待沉默基因的人工微小RNA(amiRNA)(有关植物中沉默RNA特别是包括amiRNA的设计和应用的综述，参见例如OSSOWSKI等人(Plant J.，53，674-90，2008))。
本发明提供了用于沉默选自OSD1、SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1和REC8的一个或更多个靶基因的工具，特别地，其包括靶向所述基因的hpRNA或amiRNA的表达盒。
本发明的表达盒可包含，例如：
-在植物细胞中有功能的启动子；
-200至1000bp，优选300至900bp的一个或更多个DNA构建体，每个构建体包含选自OSD1、SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1和REC8的靶基因的cDNA片段或其互补片段，或者与所述片段有至少95％的同一性，以及按照优先性提高的顺序，有至少96％、97％、98％或99％的同一性的片段，所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。
根据本发明的一个优选实施方案，hpRNA的表达盒包含：
-在植物细胞中有功能的启动子，
-一个或更多个发夹DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自OSD1、SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1和REC8的基因的发夹RNA；
所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。
一般地，所述发夹DNA构建体包括：i)200至1000bp，优选300至900bp的第一DNA序列，其由靶基因的cDNA片段组成，或者与所述片段有至少95％的同一性，以及按照优先性提高的顺序，有至少96％、97％、98％或99％的同一性；ii)与所述第一DNA互补的第二DNA序列，所述第一和第二序列方向相反以及ii)分隔所述第一和第二序列的间隔序列，从而这些第一和第二DNA序列在转录时能够形成单个双链RNA分子。所述间隔序列可以是随机的DNA片段。然而，优选地，使用可由靶标植物细胞剪接的内含子。它的大小一般为400至2000个核苷酸长。
根据本发明的另一个优选实施方案，amiRNA的表达盒包含：
-在植物细胞中有功能的启动子，
-一个或更多个DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自OSD1、SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1和REC8的基因的amiRNA；
所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。
有利地，本发明的表达盒包含靶向OSD1基因的DNA构建体。根据一个特别优选的实施方案，它包含：靶向OSD1基因的DNA构建体、靶向选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1和PAIR1的基因的DNA构建体和靶向REC8的DNA构建体。
在本领域中，有许多适于在植物中表达异源基因的启动子选择是可用的。
例如，它们可获得自植物、植物病毒或细菌如农杆菌(Agrobacterium)。它们包括组成型启动子，即在大多数组织和细胞中以及大多数环境条件下具有活性的启动子，以及组织特异性或细胞特异性启动子，它们仅在或主要在某些组织或某些细胞类型中具有活性，和可诱导型启动子，它们被物理或化学刺激所激活，如来自线虫感染的刺激。
植物细胞中常用的组成型启动子的非限制性实例有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Nos启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶启动子(rubiseo promoter)、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子。
可在本发明中使用的器官或组织特异性启动子特别地包括能够导致减数分裂相关表达的启动子，如DMC1启动子(KLIMYUK & JONES，Plant J，11，1-14，1997)；还可使用基因OSD1、SPO11-1、SPO11-2、PRD1、PAIR1或REC8的任何内源启动子。
本发明的DNA构建体一般还包括转录终止子(例如，35S转录终止子或胭脂碱合酶(Nos)转录终止子)。
本发明还包括含有本发明嵌合DNA构建体的重组载体。通常，所述重组载体还包含一个或更多个标记基因，其使得能够对转化宿主进行选择。
对于本领域的一般技术人员来说，适合载体的选择以及将DNA构建体插入其中的方法是熟知的。载体的选择取决于预期宿主和所述宿主转化的预期方法。在本领域中，对于多种植物物种、双子叶植物或单子叶植物来说，植物细胞或植物的多种遗传转化方法是可用的。非限制性地例如，可提及病毒介导的转化、通过微量注射、通过电穿孔的转化、微弹轰击(microprojectile)介导的转化、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化等。
本发明还提供了包含本发明的重组DNA构建体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核细胞，例如农杆菌(Agrobacterium)细胞，或者真核细胞，例如用本发明的DNA构建体遗传转化的植物细胞。所述构建体可瞬时表达；还可将它掺入到稳定的染色体外复制子中，或整合到染色体中。
根据用于提供能够产生SDR 2n配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案，所述植物是转基因植物，以及所述方法包括：
a)用含有靶向OSD1基因的本发明DNA构建体的载体转化至少一个植物细胞；
b)培养所述转化的植物细胞，以使得再生出植物，所述植物的基因组中具有包含所述DNA构建体的转基因。
根据用于获得能够产生未减数配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案，所述植物是转基因植物，以及所述方法包括：
a)用含有靶向OSD1基因的本发明DNA构建体的载体，含有靶向选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1和PAIR1的基因的本发明DNA构建体的载体和含有靶向REC8基因的本发明DNA构建体的载体转化至少一个植物细胞；
b)培养所述转化的植物细胞，以使得再生出植物，所述植物的基因组中具有包含所述DNA构建体的转基因。
根据用于获得能够产生未减数配子之植物的本发明方法的另一个优选实施方案，所述植物是转基因植物，以及所述方法包括：
a)用含有靶向OSD1基因的本发明DNA构建体、靶向选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1和PAIR1的基因的本发明DNA构建体的载体和含有靶向REC8基因的本发明DNA构建体的载体转化至少一个植物细胞；
b)培养所述转化的植物细胞，以使得再生出植物，所述植物的基因组中具有包含所述DNA构建体的转基因。
本发明还涵盖了能够产生SDR 2n配子或未减数配子的植物，它们可通过本发明的方法获得。
特别地，这包括包含下列的植物：
-OSD1基因内的突变，其中由于该突变，OSD1蛋白被抑制；和
-选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1或PAIR1基因之基因内的突变，其中由于该突变，所述基因编码的SPO11-1、SPO11-2、PRD1或PAIR1蛋白被抑制；和
-REC8基因内的突变，其中由于该突变，Rec8蛋白被抑制。
这还包括被本发明的一个或更多个DNA构建体遗传转化的植物。优选地，所述植物是转基因植物，其中所述构建体包含在整合到植物基因组中的转基因中，从而使其在连续植物世代中传递。
靶向OSD1基因的嵌合DNA构建体的表达导致了OSD1蛋白的下调，这为所述转基因植物提供了产生2n SDR配子的能力。靶向OSD1基因的嵌合DNA构建体，靶向选自SPO11-1、SPO11-2、PRD1和PAIR1之基因的嵌合DNA构建体和靶向REC8基因的嵌合DNA构建体的共表达导致由这三个基因所编码的蛋白质的下调，并且为所述转基因植物提供了产生未减数配子的能力。
本发明还涵盖了产生SDR 2n配子的方法，其中所述方法包括培养可通过本发明方法获得的植物，和回收由所述植物产生的配子。优选地，所述配子包含至少10％、更优选地至少20％，以及按照优先性提高的顺序，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的有活力的2n配子。
本发明还涵盖了产生未减数配子的方法，其中所述方法包括培养可通过本发明方法获得的植物，和回收由所述植物产生的配子。优选地，所述配子包含至少10％、更优选地至少20％，并且按照优先性提高的顺序，至少30％、40％、50％、或60％、70％、80％或90％的有活力的未减数配子。
本发明适用于农艺学所关心的广泛的单子叶植物或双子叶植物。非限制性地例如，可提及马铃薯、水稻、小麦、玉米、番茄、黄瓜、紫苜蓿、甘蔗、甘薯、木薯、苜蓿、大豆、麦草、香蕉、甜瓜、西瓜、棉花或观赏植物，如玫瑰、百合、郁金香和水仙。
通过以下详细说明和附图，本发明的上述和其它目的和优势将变得显而易见。然而，应理解上述详细说明仅是示例性的，而不是对本发明的限制。
实施例：
实验步骤
植物材料和生长条件
如VIGNARD等人(PLoS Genet，3，1894-906，2007)中所述，培养拟南芥(Arabidopsis)植物。对于萌发测定和细胞计数实验，将拟南芥(Arabidopsis)在拟南芥培养基(ESTELLE & SOMERVILLE，Mo1.Gen.Genet.，206，200-06，1987)上，在21℃，以16h光/8h暗的光周期和70％的湿度进行体外培养。
遗传分析
使用两个引物对，通过PCR(30个循环的94℃30s、56℃30s和72℃1min)对植物进行基因分型。对于每个基因型，表I中示出了引物对，并且在表II中示出了对插入片段特异性的引物对。
表I
表I
表II
表III中列出了用于对osd1-1(No-0)/osd1-2(Ler)×Col-0 F1群体和osd1-1(No-0)/spo11-1(Col-0)/rec8(Col-0)三突变体×Ler F1群体进行基因分型的遗传标记。PCR条件为40个循环的94℃30s、Tm 30s和72℃30s。
表III
用指明的引物扩增这些标记(40个循环的94℃30s、58℃30s和72℃30s)，并且在3％琼脂糖凝胶上迁移后进行观察。
在Eco47III/HpaII双重消化后，观察CAPS K410355。将对osd1-1和osd1-2插入片段边界特异性的两个引物对用作染色体3上的标记。
细胞学和流式细胞术：
如AZUMI等人(Embo J，21，3081-95，2002)中所述的，观察了最终减数分裂产物，并且用具有40X干物镜的常规光学显微镜查看。使用MERCIER等人(Biochimie，83，1023-28，2001)中所述的技术进行染色体分散和观察。使用open LAB 4.0.4软件对花粉雄核的DNA荧光进行定量。对于每个核，计算周围背景并从所述核的总荧光中扣除。除DNA是用DAPI复染的以外，根据MERCIER等人(Genes Dev，15，1859-71，2001)中所述的方案观察了减数分裂纺锤体。使用SP2 Leica共聚焦显微镜进行观察。用63X水物镜在xyz方向上采集图像并使用Leica软件进行三维重建。显示了投影。用AlexaFluor488和DAPI分别在488nm和405nm激发波长下对细胞成像。如MARIE & BROWN(Biol Cell，78，41-51，1993)中所述的，使用番茄(Lycopersicon esculentum)变种“Montfavet”作为标准品测量拟南芥(Arabidopsis)基因组的大小(2C＝1.99pg，％GC＝40.0％)。
实施例1：通过osd1突变体产生二倍体配子
作为减数分裂基因表达谱筛选的一部分，使用具有AtGenExpress组织库(SCHMID等人，Nat Genet，37，501-6，2005)表达攫取工具(Expression Angler tool)(TOUFIGHI等人，Plant J，43，153-63，2005)，将At3g57860选择作为良好的候选，这是因为它与几种已知的减数分裂基因共调控。At3g57860对应于UVI4样基因(UVI4-L)，该基因在其旁系同源基因(UVI4基因)的研究中有简要说明(HASE等人，Plant J，46，317-26，2006)。由于它在减数分裂中的作用(见下文)，我们将At3g57860基因改名为OSD1(omission of second division)。OSD1和UVI4蛋白在整个植物界中都是保守的，但是它们不包含任何明显的已知保守功能结构域。在植物界以外，未鉴定到同源物。
通过分离和表征两个突变体，我们研究了OSD1基因的作用。osd1-1(pst15307)和osd1-2(GT21481)Ds插入突变体分别处于Nooseen(No-0)和Landsberg(Ler)背景下，在这两种情况中，插入位于OSD1基因的第二外显子中。
图2中显示了OSD1基因的内含子/外显子结构以及两个不同Ds插入的位置。OSD1基因含有3个外显子和2个内含子并且编码了243个氨基酸的蛋白质。用三角形指示两个Ds插入的位置。
图3表示野生型植物中的减数分裂，图4表示osd1突变体中的减数分裂。
图3的图例：(A)粗线期。同源染色体完全联会。(B)终变期。观察到通过交叉连接的五对同源染色体(二价)。(C)中期I。五个二价染色体在赤道板上排列。(D)后期I。同源染色体分离。(E)末期I。(F)中期II。姐妹染色单体对在赤道板上排列。(G)后期II。姐妹染色单体分离。(H和I)末期II。形成四个单倍体孢子(四分体)。比例尺＝10μm。
图4的图例：(A和B)用甲苯胺蓝染色的雄性减数分裂产物。(A)野生型四分体。(B)osd1-1突变体中的二分体。(C至D)直至末期I，osd1中的雄性减数分裂与野生型无法区分(与图3相比)，但是未观察到具有第二次分裂特征的图。(C)粗线期。(D)终变期。(E)中期I。(F)后期I。(G)末期I。(H)osd1中雌性减数分裂的中期I。
在两个独立的osd1突变体中，雄性减数分裂的产物都是二分体(osd1-1：714/714；osd1-2：334/334)而不是四分体(图4A和B)。osd1-1和osd1-2之间的互补试验确认这些突变是等位的(osd1-1/osd1-2：369个二分体/369)，因此证明了所观察到的二分体是由于OSD1基因的破坏所造成的。osd1突变体未表现出任何体细胞发育缺陷、雄性和雌性配子体致死或生育力降低(野生型38±11个种子/果实，osd1 35±6)。
接着，我们测量了二倍体osd1突变体后代中的倍数性水平。在自交后代中，存在四倍体(84％)和三倍体(16％)，但是不存在二倍体植物(osd1-1：n＝56；osd1-2：n＝24)。当使用突变体花粉使野生型植株受精时，所有得到的子代均是三倍体(osd1-1：n＝75)。当用野生型花粉颗粒使突变体胚珠受精时，我们分离到12％的二倍体和88％的三倍体植物(n＝25)。这表明osd1突变体产生了高水平的雄性(100％)和雌性(约85％)二倍体孢子，其导致产生了功能性配子。
为了阐明osd1中导致产生二分体的机制，我们研究了减数分裂期间染色体的表现。雄性和雌性减数分裂I都与野生型无法区分(比较图4和图3)。值得注意地，观察到了交叉(其为交换(crossover)的细胞学表现)和二价染色体。然而，我们未能发现任何减数分裂II的图(在超过500个从前期到孢子形成的雄性性母细胞中)，显著地表明二分体的产生是由于减数第二次分裂的缺失所造成的。如果不发生该第二次分裂，那么着丝粒处的任何杂合都将在二倍体配子中丢失，这是由于第一次分裂期间姐妹染色单体的共分离和同源物分开所造成的。由于重组，未与着丝粒连锁的任何位点都将分离。通过利用osd1-1(No-0)和osd1-2突变体(Ler)的两种不同遗传背景，我们测试了我们的设想。将具有两个突变的F1植株-osd1的突变体并且对任何No-0/Ler多态性是杂合的-作为雄性或雌性与第三遗传背景Columbia(Col-0)杂交。将所获得的植株对三分子标记进行核型分析和基因分型，从而提供了由该突变体所产生的花粉颗粒和雌配子体的遗传构成的直接信息。测试的所有二倍体配子均具有预测的遗传特性。它们在着丝粒处是系统性(systematically)纯合的并且由于重组-它们在其它位点分离(对于雄性二倍体配子n＝48，而对于雌性二倍体配子n＝41)。这些结果确认减数第二次分裂的缺失的确是在osd1中产生2n配子的原因。该机制还表明减数分裂I中不平衡的染色体分离将在osd1中产生不平衡的二分体；通过分析Atspo11-1/osd1-1双重突变体，对此进行了确认(数据未示出)。
由于不存在第二次减数分裂，因此osd1突变体产生了高频率的有活力的二倍体雄性和雌性配子体，其在受精后产生了有活力的四倍体植物。然而，这种现象不同于未减数孢子生殖(apomeiosis)，在未减数孢子生殖中所产生的配子在遗传上不同于母本植物。
实施例2：通过osd1/Atrec8/Atspo11-1三突变体生产未减数配子
在Atspo11-1/Atrec8双突变体中，减数第一次分裂被有丝分裂样分裂代替，接着是不平衡第二次分裂，其导致产生不平衡孢子和不育(CHELYSHEVA等人，J Cell Sci，118，4621-32，2005)。
我们产生了osd1/Atrec8/Atspo11-1突变体。通过将对每个突变杂合的植物杂交，获得了Atspo11-1和Atrec8突变均杂合的植物，并将其与osd1杂合的植物杂交。将鉴定到的三杂合植物自交并分析这三个突变纯合的植物。
图5中显示了在这些突变体的雄性和雌性减数分裂期间对染色体表现的观察结果。
图5的图例：(A)雄性中期I。(B)雄性后期I。小插图显示了MiMe中的二分体。(C)雌性中期I。(D)雌性后期I。比例尺＝10μm。
这些观察结果显示了有丝分裂样分裂：10个单价染色体在赤道板上排列并且姐妹染色单体在后期分离(图5)。
Atspo11-1和Atrec8突变导致有丝分裂样减数第一次分裂，以及osd1突变防止减数第二次分裂发生。这导致有丝分裂样分裂代替了减数分裂，以及导致未减数孢子生殖。
我们将这种基因型称为MiMe(有丝分裂代替减数分裂，mitosisinstead of meiosis)。MiMe植物产生二分体(408/408)并且是可育的(25±6个种子/果实)。因此，osd1突变抑制Atspo11-1/Atrec8双重突变体的不育表型。
MiMe植株的自交后代是系统性(systematically)四倍体的(n＝24)并且无论使用雄性(n＝24)或雌性(n＝67)MiMe配子，二倍体MiMe植株和野生型植株之间的回交均产生三倍体植株，这表明该有丝分裂样分裂导致了功能性二倍体配子。与上述内容类似地进行测试，所有配子(雄性和雌性)均系统性地保留了母本植物对每个所测试的遗传标记的杂合性，因此在遗传上与母本植物是相同的。这些结果确认MiMe植物在不影响随后的有性过程的情况下经历了有丝分裂样分裂而不是正常的减数分裂。
当减数分裂被有丝分裂代替时，预计每过一代倍数性将加倍。如图6所示，在MiMe植株中观察到这一现象。
图6的图例：左列：有丝分裂中期，比例尺＝10μm。右列：相应的4周龄植物(比例尺＝2cm)和花(比例尺＝1mm)。
在随后的世代中，我们获得了四倍体(4N，20个染色体，n＝26)和八倍体(8N，40个染色体，n＝33)。
实施例3：拟南芥(Arabidopsis)OSD1基因的水稻直系同源基因的鉴定
水稻(Oriza sativa)基因组中含有两个OSD1/UVI4同源候选(Os02g37850和Os04g39670)。在其中一个该推定同源基因(Os02g37850)中，我们分离了两个T-DNA插入突变体。通过PCR对AMBA12和AMQF10这两个株系进行基因分型以选择纯合子。在这两个株系中，我们在二倍体突变体植物的后代中观察到了自发四倍体植物，表明了功能性雄性和雌性2n配子的产生(AMBA 12：100％的四倍体，n＝30；AMQF10：37％的四倍体，n＝27)。然后，我们研究了AMB12突变体中的减数分裂产物(n＞400)，并且观察到产生了100％的二分体而不是四分体，如图7所示。
图7的图例：A：野生型中孢子的四分体；B：AMB12中孢子的二分体。
该表型与拟南芥(Arabidopsis)osd1突变体相同。为了阐明导致在AMBA12纯合子突变体中产生二分体的机制，我们研究了减数分裂期间染色体的表现。减数分裂I无法与野生型相区别。值得注意地，观察到了交叉(其为交换(crossover)的细胞学表现)和二价染色体。然而，我们未能发现任何减数分裂II的图，显著表明2N孢子的生产是由于减数第二次分裂的缺失所引起的，这与拟南芥(Arabidopsis)osd1中的相同。总而言之，这些结果显示Os02g37850是拟南芥(Arabidopsis)OSD1的功能性同源物，并因此称之为OsOSD1。OSD1和OsOSD1蛋白在覆盖序列全长的比对中有23.6％的同一性和35％的相似性(EMBOSS成对序列比对Needle工具)。

Claims (12)

1.用于获得产生第二次分裂再组2n配子之拟南芥(Arabidopsis thaliana)或水稻(Oryza sativa)植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中使下文称作OSD1蛋白的蛋白质失活，其中所述蛋白质是使减数分裂I向减数分裂II过渡所必需的，并且是SEQ ID NO：1的AtOSD1蛋白或SEQ ID NO：35的OsOSD1蛋白。 
2.根据权利要求1的方法，其中OSD1蛋白失活是通过诱变OSD1基因或其启动子而获得的，并且选择丧失了OSD1蛋白活性的突变体。 
3.根据权利要求1的方法，其中OSD1蛋白的失活是通过在所述植物中表达靶向编码所述蛋白质之基因的沉默RNA而获得的。 
4.用于获得产生未减数配子之拟南芥(Arabidopsis thaliana)或水稻(Oryza sativa)植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中使下列蛋白质失活： 
a)如权利要求1中所定义的OSD1蛋白； 
b)参与植物中减数分裂重组起始的蛋白质，所述蛋白质为SEQ ID NO：2的拟南芥(Arabidopsis thaliana)SPO11-1蛋白或可在GenBank中以登记号AAP68363获得其序列的水稻(Oryza sativa)SPO11-1蛋白；
c)SEQ ID NO：6的拟南芥(Arabidopsis thaliana)Rec8蛋白或可在GenBank中以登记号AAQ75095获得其序列的水稻(Oryza sativa)Rec8蛋白。 
5.根据权利要求4的方法，其中OSD1、SPO11-1或Rec8蛋白中至少之一的失活是通过诱变编码所述蛋白质之基因或其启动子而获得的，并且选择丧失了所述蛋白质活性的突变体。 
6.根据权利要求4的方法，其中OSD1、SPO11-1或Rec8蛋白中至少之一的失活是通过在所述植物中表达靶向编码所述蛋白质之基因的沉默RNA而获得的。 
7.表达盒，其包含： 
-在植物细胞中有功能的启动子； 
-至少一个选自下列的DNA构建体： 
a)200至1000bp的一个或更多个DNA构建体，每个所述构建体包含选自OSD1、SPO11-1和REC8之靶基因的cDNA的片段，或其互补片段，所述DNA序列处于所述启动子的转录控制之下； 
b)一个或更多个发夹DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自OSD1、SPO11-1和REC8之基因的发夹RNA； 
c)一个或更多个DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自OSD1、SPO11-1和REC8之基因的amiRNA； 
所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。 
8.根据权利要求7的表达盒，其包含靶向OSD1基因的DNA构建体。 
9.根据权利要求7的表达盒，其包含：靶向所述OSD1基因的DNA构建体，靶向所述SPO11-1基因的DNA构建体以及靶向所述REC8基因的DNA构建体。 
10.重组载体，其包含根据权利要求7至9中任一项的表达盒。 
11.产生第二次分裂再组2n配子的方法，其中所述方法包括培养可通过根据权利要求1至3中任一项的方法获得的植物，以及回收由所述植物产生的配子。 
12.产生未减数配子的方法，其中所述方法包括培养可通过根据权利要求4至6中任一项的方法获得的植物，以及回收由所述植物产生的配子。 
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