CN102304478B - 一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的方法及其应用，可用于白僵菌孢子制剂制备、保藏和田间应用等领域，是将甘露醇或甘露醇与葡萄糖和乳糖的混合物添加于球孢白僵菌的孢子悬浮液。球孢白僵菌孢子可用于防治茶叶小绿叶蝉，其孢子抗热性的提高，降低了孢子在制剂制备和保藏过程中的热损伤，也增加了球孢白僵菌孢子在田间应用时对环境中高温的抵抗能力，从而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，进而提高其生物防治的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的方法及其应用，可用于白僵菌孢子制剂制备、保藏和田间应用等领域。
背景技术
随着人类对环境保护和自身健康的日益关注，大力推广生物农药已成为全球农药产业发展的新趋势。白僵菌作为一种广谱性病原真菌，因其具有易于生产、寄主范围广、侵染期长、不伤害人和其他脊椎动物及可贵的流行潜力等优点而成为目前世界上研究和应用最多的为微生物农药之一。
本发明中所用的菌株(球孢白僵菌CCTCC No：M209238)对目前茶树头号害虫——“假眼单胞小绿叶蝉”有显著防治效果。然而，白僵菌孢子制剂在制备、保藏和使用过程中，都会因受到热损伤而导致孢子活性降低甚至死亡。其中，制备过程中的热来自干燥，保藏过程中的热来自保藏环境，使用(田间应用)过程中的热来自阳光照射或寄主的行为发热。因此，提高白僵菌孢子的抗热性，对提高其杀虫率和生物防治效果至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的方法。
为解决上述技术问题，提供如下技术方案：
将0.1-0.65g/mL甘露醇添加于球孢白僵菌的孢子悬浮液。
所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M209238，该菌株信息已在中国专利200910264664.8中公开，公布日2010年6月9日，公布号CN101724571A。
优选添加甘露醇与葡萄糖和乳糖组成的混合物于球孢白僵菌的孢子悬液，其中0.15-0.35g/mL甘露醇、0.15-0.35g/mL葡萄糖和0.15-0.35g/mL乳糖。
甘露醇及含甘露醇的混合物添加方法为：取适量的甘露醇或甘露醇与葡萄糖和乳糖组成的混合物于25mL试管中，加入9.5mL 0.05％的吐温-80溶液，沸水浴并搅拌至糖类完全溶解，冰水浴冷却后，加入0.5mL 2×109孢子/mL的孢子悬浮液，并用振荡器将其混匀。
孢子抗热性的检测方法：1)将添加了甘露醇或甘露醇混合物的孢子悬浮液均匀混合液置于45℃恒温水浴锅中，水浴10min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却；2)将冷却后的混合液转移到250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5％麸皮浸出液，混匀，置于25℃，180r/min摇床中培养12h；3)用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。
本发明还提供了一种提高球孢白僵菌孢子抗热性方法的应用，是将甘露醇或甘露醇、葡萄糖、乳糖的混合物添加于球孢白僵菌的孢子悬液后进行干燥处理或田间喷洒，有利于提高白僵菌孢子的存活率或杀虫率。
本发明的有益效果如下：球孢白僵菌孢子可用于防治茶叶小绿叶蝉，其孢子抗热性的提高，降低了孢子在制剂制备和保藏过程中的热损伤，也增加了球孢白僵菌孢子在田间应用时对环境中高温的抵抗能力，从而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，进而提高其生物防治的效果。
具体实施方式
实施例1：孢子悬浮液以及营养液的制备
孢子悬浮液的制备：
1)洗脱。本发明所用的菌种为球孢白僵菌Beauveria bassiana(保藏编号为CCTCC No：M209238)，取适量新鲜发酵培养物于250mL的三角瓶中，加入适量0.05％的吐温-80溶液和适量玻璃珠，用玻璃棒将培养物捣碎，用振荡器高速振荡至少10min。
2)过滤。振荡后，用2-4层纱布过滤，收集滤液。
3)离心。将滤液离心，条件为：8000r/min、5min、4℃，弃去上清。
4)复溶。将离心后的沉淀物转移到一50mL离心管中，加入20-40mL 0.05％的吐温-80溶液和10颗玻璃珠，用振荡器高速震荡至少20min。
5)计数。取1mL上述复溶后的孢子悬浮液，用0.05％的吐温-80溶液稀释50-100倍后，用血球计数板计数。
6)稀释。计数后，将原孢子悬浮液用0.05％的吐温-80溶液稀释到2×109孢子/mL，待用。
麸皮浸出液(营养液)的制备：
称取25g麸皮于锅中，添加1000mL蒸馏水中，煮沸并搅拌，维持沸腾30min(以上)，冷却后用2-4层纱布过滤，收集滤液，再用蒸馏水将滤液补足至1000mL，所得溶液即为浓度为2.5％的麸皮浸出液，也是培养孢子悬浮液所用的营养液。115℃，15min灭菌，待用。
对比例：
对照1：将10mL 1×108孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5％麸皮浸出液，混匀，置于25℃，180r/min摇床中培养12h；用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。
对照2：将10mL 1×108孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5％麸皮浸出液并将3g甘露醇溶解于混合液中，混匀，置于25℃，180r/min摇床中培养12h；用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。
对照3：将10mL 1×108孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5％麸皮浸出液并将1.5g甘露醇、1.5g葡萄糖和1.5g乳糖溶解于混合液中，混匀，置于25℃，180r/min摇床中培养12h；用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。
结果见表1
表1
表1中的数据表明：甘露醇及甘露醇、葡萄糖和乳糖的混合物对白僵菌孢子的萌发并没有明显的促进的作用。
实施例2：
取适量的甘露醇于25mL试管中，加入9.5mL 0.05％的吐温-80溶液，沸水浴并搅拌至糖类完全溶解，冰水浴冷却后，加入0.5mL 2×109孢子/mL的孢子悬浮液，并用振荡器将其混匀。
将上述孢子悬浮液均匀混合液置于45℃恒温水浴锅中，水浴10min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却；将冷却后的混合液转移到250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5％麸皮浸出液，混匀，置于25℃，180r/min摇床中培养12h；用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)，结果如表2所示。
表2
实施例3：
取适量甘露醇与葡萄糖和乳糖组成的混合物于25mL试管中，加入9.5mL 0.05％的吐温-80溶液，沸水浴并搅拌至糖类完全溶解，冰水浴冷却后，加入0.5mL 2×109孢子/mL的孢子悬浮液，并用振荡器将其混匀。
将上述孢子悬浮液均匀混合液置于45℃恒温水浴锅中，水浴10min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却；将冷却后的混合液转移到250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5％麸皮浸出液，混匀，置于25℃，180r/min摇床中培养12h；用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)，结果如表3所示。
表3
Claims (1)
1.一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的方法，其特征在于，方法如下：取适量的甘露醇与葡萄糖和乳糖组成的混合物于25mL试管中，加入9.5mL 0.05%的吐温-80溶液，沸水浴并搅拌至糖类完全溶解，冰水浴冷却后，加入0.5mL 2×109孢子/mL的孢子悬浮液，并用振荡器将其混匀，所述甘露醇与葡萄糖和乳糖质量比为1：1：1，所述甘露醇、葡萄糖、乳糖终浓度均为0.15-0.35g/mL。
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