CN102304156B - 一种苯乙醇苷类成份及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苯乙醇苷类成份及其组合物,包括鹿茸草苷、异毛蕊花苷、Parvifloroside?B等成份或其组合物。本发明同时公开了所述苯乙醇苷类成份的制备方法,主要特征在于选用鹿茸草药材,经水或含水有机溶剂提取,再经大孔树脂精制而得。所述苯乙醇苷类成份具有抗菌及抗炎活性,可作为组份或组合物之一,应用于相关功能食品、药品中。

Description

一种苯乙醇苷类成份及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种苯乙醇苷类成份及其组合物,尤其是从鹿茸草中提取获得。本发明同时涉及该苯乙醇苷类成份及其组合物的制备方法和用途。
背景技术
苯乙醇苷类成份是一类由苯乙醇与单糖或寡糖组成的苷类成份,糖基上一般还连接有苯丙烯酸等其它有机酸取代基。本类成份一般来源于植物中,如苦玄参属、马鞭草属、紫珠属、车前子、肉苁蓉植物等,并具有多种重要药理活性,是近年来的研究热点之一。
鹿茸草为玄参科鹿茸草属植物绵毛鹿茸草(MonochasmasavatieriFranch)的全草,分布于江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东等地。在中国江西省分布广泛、自南至北均有,有时在群落中占有一定优势(成片生长),资源丰富值得开发利用。具有凉血止血,清热解毒,祛湿止痛等功效,临床常用于治疗感冒心中烦热,咳嗽,吐血,风湿骨痛等疾病。中成药品种“炎宁颗粒”即是以鹿茸草为主药,并和白花蛇舌草、鸭跖草进行配伍,具有清热解毒,消炎止痢等功效,用于治疗上呼吸感染,扁桃体炎,尿路感染等,临床疗效确切。
鹿茸草的化学成分研究有关报道较少,文献报道的化合物包括环烯醚萜类,酚酸类(如4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸,3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸,绿原酸等),黄酮类,三萜类,有机酸类等,据文献报道,这些绿原酸类、倍半萜内酯类成分、黄酮类物质有抗炎、杀菌等广泛的药理活性。
由于对鹿茸草的有效成份至今尚未清楚,该药材缺乏相应生产和质量控制指标,限制了其进一步开发应用。
发明内容
本发明提供一种苯乙醇苷类成份及其组合物,该提取物中含有结构如式(I)所示的苯乙醇苷类成分,
式(I)中R1为氢或羟基,R2和R3各自独立地为氢或鼠李糖基,R1、R2和R3在各自的可选基团范围内可以自由组合。
具体地,其中含有鹿茸草苷(1),即通式(1)中R1为羟基,R2为鼠李糖基,R3为氢。
此外,该苯乙醇苷类成份还含有异毛蕊花苷(Isoverbascoside,2)、ParviflorosideB(3)中的一种以上成分。
本发明同时公开了所述苯乙醇苷类成份及其组合物的制备工艺如下:
选取鹿茸草药材,粉碎成粗粉,用水、含1-4碳的低级醇、丙酮或它们的混合物提取2-3次,每次1-3h,过滤,合并滤液,浓缩,加水至相当于0.1-1.5克生药材/毫升,离心,得澄清液;所得澄清液上预处理好的大孔吸附树脂柱,依次用水、10-15%乙醇、30-80%乙醇洗脱,收集30-80%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得所述苯乙醇苷类成份组合物;所得苯乙醇苷类成份组合物,经常规硅胶、反相硅胶柱层析,得所述苯乙醇苷类成份LR-1~3。具体制备方法见实施例。
本发明对3种化合物进行了结构鉴定如下。
化合物(1):白色无定形粉末,易溶甲醇。ESI-MS得到准分子离子峰m/z645.1[M-H2O+Na]+,推断分子式为C29H36O16(计算值640)。通过1H-和13C-NMR,结合HSQC、HMBC及1H-1HCOSY等谱图,对该化合物各碳、氢的化学位移进行了归属,见表1:
表1化合物(1)的NMR信号归属
1H-NMR中δ6.72(1H,d,J=1.0Hz),δ6.63(1H,d,J=8.0Hz),δ6.58(1H,dd,J=8.0,1.0Hz)3个芳氢信号构成1个ABX系统信号,另外还有3个芳氢δ6.96(1H,d,J=1.0Hz),δ6.69(1H,d,J=8.0Hz)及δ6.86(1H,dd,J=8.0,1.0Hz)构成另1个ABX系统信号,说明在化合物YN-1的结构中存在两个1,3,4三取代苯环;δ4.47(1H,d,J=3.5Hz),δ3.86(2H,dd,J=11.5,3.5Hz)及δ3.52(1H,t,J=11.5Hz)3个连氧碳上氢信号构成又一个ABX系统;δ6.21(1H,d,J=16.0Hz),δ7.49(1H,d,J=16.0Hz)显示两个相互偶合的反式烯氢信号;δ4.39(1H,d,J=8.0Hz)及δ5.10(1H,brs)显示两个糖端基质子的信号,δ1.15(3H,d,J=6.0Hz)可能为甲基五碳糖的甲基氢信号。
13C-NMR中δ114.9~150.0共显示了14个碳信号,结合1H-NMR推测其中含有两个苯环信号及两个烯碳信号,且苯环均为1,3,4三取代。δ99.4和δ102.2显示为两个糖的端基碳信号,δ18.2为鼠李糖的甲基信号,δ64.8为六碳糖的亚甲氧基信号,在δ70.2~82.2之间的信号除去两个糖中应有的信号外,仍有两个含氧碳信号。δ169.3为羰基信号。根据以上波谱数据,推测该化合物可能为苯乙醇苷类衍生物。
在HSQC谱中,δH6.72(1H,d,J=1.0Hz),δH6.63(1H,d,J=8.0Hz),δH6.58(1H,dd,J=8.0,1.0Hz),δH6.69(1H,d,J=8.0Hz),δH6.96(1H,d,J=1.0Hz)及δH6.86(1H,dd,J=8.0,1.0Hz)这六个氢分别和δC114.9,δC116.5,δC119.3,δC116.9,δC115.5和δC123.3六个碳相关,此六个碳即是两个芳环上未被取代的碳,而在谱图上没有氢与之相关的碳δC130.3,δC146.7,δC146.7,δC128.1,δC150.0,δC147.1即为芳环上的季碳,且δC146.7,δC146.7,δC150.0,δC147.1为含氧取代。δH6.21(1H,d,J=16.0Hz),δH7.49(1H,d,J=16.0Hz)对应δC115.1,δC147.6,此两个碳为反式烯碳。δH3.86(2H,dd,J=11.5,3.5Hz),δH3.52(1H,t,J=11.5Hz)与δC73.3相关,δH4.47(1H,d,J=3.5Hz)与δC78.7相关;δH4.39(1H,d,J=8.0Hz),δH5.10(1H,s)分别与δC99.4和δC102.2相关,为两个糖的端基氢及碳信号,δH1.15(3H,d,J=6.0Hz)对应δC18.2为鼠李糖的甲基氢及碳信号,δH4.27(1H,dd,J=12.0,5.5Hz),δH4.45(1H,t,J=3.0Hz)与δC64.8有相关信号,为六碳糖上亚甲氧基上的氢及碳信号。δH3.25(1H,m),δH3.75(1H,d,J=8.0Hz),δH3.45(1H,t,J=9.0Hz),δH3.67(1H,dd,J=4.5,8.5Hz),δH3.73(1H,m),δH3.60(1H,dd,J=9.5,3.0Hz),δH3.25(1H,m),δH3.92(1H,m)分别对应δC82.2,δC79.2,δC70.2,δC77.6,δC72.5,δC72.4,δC74.3,δC70.6为两个糖上的连氧次甲基中的氢和碳信号。
1H-1HCOSY中可以观察到以下相关信息,δ6.63(d,J=8.0Hz)与δ6.58(dd,J=8.0,1.0Hz)相关,二者处于同一个ABX系统中,δ6.86(dd,J=8.0,1.0Hz)与δ6.69(d,J=8.0Hz)相关,二者处于同一ABX系统中;δ6.21(d,J=16.0Hz)与δ7.49(d,J=16.0Hz)相关,为烯氢之间的相互偶合,δ4.47(d,J=3.5Hz)与δ3.86(dd,J=11.5,3.5Hz)相关,说明二者亦处于同一ABX系统中。
其HMBC谱中可以观察到以下相关信号,δH6.72(d,J=1.0Hz)与δC78.7相关,说明δC78.7直接与苯环相连且与含有两个H的δ73.3相邻,即化合物结构中含有苯乙二醇的片段,δC73.3为含有两个H的连氧C,与糖相连时,受苷化位移的影响,其向低场位移至δ73.3。同时,δ5.10(s)与δC82.2相关,可以推测鼠李糖是与葡萄糖的2位相连。δ7.49(d,16.0)与δ169.3,δ128.1,δ123.3,δ115.5相关,说明δ7.49(d,16.0)所对应的烯碳δ147.6是与苯环相连,且所连的苯环上的碳为δ128.1,结合前面所述分析,可以推出化合物结构中含有咖啡酰基的片段,δ4.27(dd,J=12.0Hz,5.5Hz)与δ169.3有相关,说明葡萄糖中的亚甲氧基与咖啡酰基与葡萄糖成酯。
与已知化合物parviflorosideB比较,咖啡酰基片段及葡萄糖鼠李糖的化学位移值均基本相同,只有C-7及H-7的化学位移均向低场位移,结合上述论述,鉴定该化合物为新化合物,命名为鹿茸草苷。
化合物(2):淡棕色无定形粉末(甲醇),UV254、UV365下有蓝色荧光,10%硫酸乙醇显色呈紫红色,FeCl3-K3[Fe(CN)6]和Molish反应阳性,显示含有酚羟基和糖存在。1H-NMR(500MHz,MeOD)δ:6.665(1H,d,J=1.5Hz,H-2),6627(1H,d,J=8.0Hz,H-5),6.525(1H,dd,J=2.0,2.0Hz,H-6),2.769(2H,t,J=7.3Hz,H-7),4.322(1H,d,J=7.5Hz,H-1′),4.490(1H,d,J=12.0Hz,H-6′a),4.486(1H,d,J=12.0Hz,H-6′b),5.169(1H,s,H-1″),3.941(1H,s,H-2″),4.352(1H,m,H-5″),1.241(3H,d,J=6.5Hz,H-6″),6.278(1H,d,J=16.0Hz,H-2″′),7.552(1H,d,J=16.0Hz,H-3″′),7.027(1H,d,J=1.5Hz,H-2″″),6.761(1H,d,J=8.0Hz,H-5″″),6.882(1H,dd,J=1.5Hz,2.0Hz,H-6″″).13C-NMR(500MHz,MeOD)δ:169.44(C-1″′),149.91(C-4″″),147.54(C-3″′),147.07(C-3″″),146.42(C-4),144.95(C-3),131.71(C-1),128.00(C-1″″),123.44(C-6″″),121.57(C-6),117.38(C-5),116.85(C-5″″),116.66(C-2),115.40(C-2″″),115.15(C-2″′),104.69(C-1′),103.01(C-1″);84.27(C-2′),75.98(C-5′),75.71(C-3′),74.30(C-4″),72.70(C-8),72.65(C-3″),72.56(C-2″),70.69(C-5″),70.34(C-4′),64.93(C-6′),36.98(C-7),18.17(C-6″)。以上数据与文献报道的ParviflorosideB数据基本一致,故确定此化合物为ParviflorosideB。
化合物3:淡棕色无定形粉末(甲醇),UV254、UV365下有蓝色荧光,10%硫酸乙醇显色呈紫红色,FeCl3-K3[Fe(CN)6]和Molish反应阳性,显示含有酚羟基和糖存在。1H-NMR(500MHz,MeOD)δ:7.615(1H,d,J=15.5Hz,H-3″′),7.081(1H,s,H-2″″),6.974(1H,d,J=7.5Hz,H-6″″),6.805(1H,d,J=8.0Hz,H-5″″),6.723(1H,s,H-2),6.703(1H,d,J=8.0Hz,H-5),6.585(1H,d,J=8.0Hz,H-6),6.295(1H,d,J=16Hz,H-2″′),5.211(1H,s,H-1″),4.396(1H,d,J=8.0Hz,H-1′),4.046(1H,m,H-8a),3.949(1H,s,H-2″),3.838(1H,t,J=9.2Hz,H-3′),3.743(1H,m,H-3″),3.425(1H,d,J=8.5Hz,H-8b),3.399(1H,s,H-2′),2.806(2H,m,H-7),1.114(3H,d,J=6.0Hz,H-6″).13C-NMR(500MHz,MeOD)δ:168.6(C-1″′),150.02(C-4″″),148.30(C-3″′),147.06(C-3″″),146.35(C-3),144.89(C-4),131.78(C-1),127.93(C-1″″),123.51(C-6″″),121.56(C-6),117.41(C-2),116.82(C-5″″),116.61(C-5),115.54(C-2″′),114.97(C-2″″),104.43(C-1′),103.27(C-1″),81.93(C-3′),76.45(C-2′),76.24(C-5′),74.06(C-4″),72.60(C-3″),72.51(C-2″),72.32(C-4′),70.85(C-8),70.67(C-5″),62.60(C-6′),36.80(C-7),18.72(C-6″)。以上数据与文献报道的异毛蕊花苷数据基本一致,故确定此化合物为异毛蕊花苷。
本发明还提供所述苯乙醇苷类成份及其组合物在制备抗菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)、抗炎等疾病药物中的应用。
本发明的突出特点在于通过大量深入研究,首次分离鉴定了鹿茸草提取物中的苯乙醇苷类成分,其中化合物(1)为新化合物。本发明同时建立了所述提取物的大孔树脂精制工艺,可应用于工业化生产中。本发明并首次对主要成分进行了活性筛选,结果表明所述苯乙醇苷类成份及其组合物具有抗菌、抗炎等活性,可作为组份或组合物之一应用于相关食品或药物领域。
本发明内容是通过大量实验研究和创造性劳动完成的,现以下述具体实施例进行说明。
附图说明
附图1为化合物(1)的1H-NMR图谱。
附图2为化合物(1)的13C-NMR图谱。
附图3为化合物(1)的1H-1HCOSY图谱。
附图4为化合物(1)的HSQC图谱。
附图5为化合物(1)的HMBC图谱。
具体实施方式
以下所给出的实施例,旨在进一步阐明本发明的化合物、制备方法,而并非限定所举例的化合物的范围。对本发明的互换或改动,以及使用类似的溶剂,对于本专业的普通技术人员是公知的。以下实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。
实施例1称取鹿茸草药材10kg,切碎,用26倍水量分3次加热煎煮(10倍、8倍、8倍),每次煎煮2小时,过滤,滤液合并,浓缩至每1ml相当于含1g生药材的量(浓缩温度65-70℃);滤液上预处理好的D101型大孔树脂(柱床体积约5L),上样后依次用6倍量蒸馏水、10%乙醇洗脱,30%乙醇洗脱,收集30%乙醇洗脱部分,蒸干得鹿茸草提取物浸膏110g,即为苯乙醇苷类成份组合物(后同)。
实施例2称取鹿茸草药材10kg,切碎,用20倍量50%乙醇分3次加热回流提取(8倍、6倍、6倍),每次提取1.5小时,过滤,滤液合并,浓缩至每1ml相当于含1g生药材的量(浓缩温度65-70℃)。上AB-8型大孔树脂(柱床体积约5L),上样后依次用3倍量蒸馏水、15%乙醇洗脱,60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱部分,蒸干即得鹿茸草提取物浸膏96g。
实施例3称取鹿茸草药材20kg,切碎,用20倍量70%乙醇分3次加热提取(8倍、6倍、6倍),每次提取1小时,过滤,滤液合并,浓缩至每1ml相当于含1g生药材的量(浓缩温度65-70℃)。上BS-16型大孔树脂(柱床体积约8L),上样后依次用5倍量蒸馏水、15%乙醇洗脱,50%乙醇洗脱,收集50%乙醇洗脱部分,蒸干即得鹿茸草提取物浸膏约210g。
实施例4称取鹿茸草药材10kg,切碎,用18倍量60%乙醇超声提取二次(10倍、8倍),每次提取1小时,过滤,滤液合并,上HPD-450型大孔树脂(柱床体积约5L),上样后依次用6倍量蒸馏水、10%乙醇洗脱,40%乙醇洗脱,收集40%乙醇洗脱部分,蒸干即得鹿茸草提取物浸膏约82g。
实施例5称取鹿茸草药材500g,切碎,用26倍量水超声提取(12倍、8倍、6倍),每次超声1小时,过滤,滤液合并,浓缩至每1ml相当于含1g药材的量(浓缩温度65-70℃)。上LX-11型大孔树脂(柱床体积约300ml),上样后依次用3倍量蒸馏水、15%乙醇洗脱,60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱部分,蒸干即得鹿茸草提取物浸膏5.2g。
实施例6称取鹿茸草药材500g,切碎,用18倍量80%甲醇回流提取二次(10倍、8倍),每次提取1小时,过滤,滤液合并浓缩至500ml,加水至3000ml。离心、取上清液上AB-8型大孔树脂(柱床体积约300ml),上样后依次用6-12倍量蒸馏水、15%乙醇洗脱,60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱部分,蒸干即得鹿茸草提取物浸膏约4.8g。
实施例7称取鹿茸草药材500g,切碎,用18倍量60%丙酮回流提取二次(10倍、8倍),每次提取1小时,过滤,滤液合并浓缩至500ml,加水至3000ml。离心、取上清液上AB-8型大孔树脂(柱床体积约300ml),上样后依次用6-12倍量蒸馏水、15%乙醇洗脱,60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱部分,蒸干即得鹿茸草提取物约浸膏4.3g。
实施例8称取鹿茸草药材500g,切碎,用18倍量50%异丙醇回流提取二次(10倍、8倍),每次提取1小时,过滤,滤液合并浓缩至500ml,加水至3000ml。离心、取上清液上AB-8型大孔树脂(柱床体积约300ml),上样后依次用6倍量蒸馏水、15%乙醇洗脱,60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱部分,蒸干即得鹿茸草提取物约浸膏4.7g。
实施例9:化合物(1)-(3)的分离纯化
取实施例1中所得鹿茸草提取物浸膏60g,进行减压柱层析(薄层层析硅胶H,250g),依次用氯仿4000ml、氯仿-甲醇(3∶1)1500ml、甲醇1500ml、收集各比例段洗脱部分,蒸干后得氯仿洗脱部分3.9g(T3-1)、氯仿-甲醇(3∶1)洗脱部分42.8g(T3-2)和甲醇洗脱部分4.6g(T3-3)。T3-2上中压柱层析(49mm×230mm,薄层层析硅胶H约200g),氯仿-甲醇梯度洗脱(99∶1-65∶35),得流份T3-2-1~T3-2-5,其中T3-2-4(35.6g)。取T3-2-4(500mg)经半制备高效液相制备,C18半制备色谱柱(10mm×250mm,5μm,kromasil公司),用甲醇-水梯度洗脱得到化合物(1)-(3)。
实施例10:鹿茸草提取物的抗菌抗炎活性
(1)体外抑菌实验
采用平皿打孔法。在超净工作台上将灭菌后的琼脂肉汤固体培养基倒入无菌培养皿中,每皿20ml左右,待冷却凝固后,加入制备好的浓度约为1.5×108菌悬液各0.1ml,用涂布棒将菌液涂布均匀。在平板内挖取直径4mm圆形小坑,将不同浓度的鹿茸草提取物注入孔中,每个浓度注3个复孔,以青霉素(0.5mg/ml)为阳性对照,于37℃培养24h,观察并测量抑菌圈直径。
实验结果见表2。鹿茸草提取物对耐药大肠杆菌和耐药金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,其还能抑制铜绿假单胞菌的生长。
表2鹿茸草提取物对二种耐药菌的抑制作用(n=3)
(2)体内抗菌实验
将保存完好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌(由苏州市娄葑医院细菌室提供),接种于培养基上,于37℃烘箱内培养16-18h。将不同浓度的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌菌悬液分别腹腔注射于小鼠体内,每浓度组5只,每只注射菌液0.5ml,观察动物在4d内死亡情况,选定使小鼠80-90%死亡的金黄色葡萄球菌10-3、大肠杆菌10-3、耐药金黄色葡萄球菌10-5和耐药大肠杆菌菌液浓度进行动物感染。将小鼠随机分为5组:空白组,鹿茸草提取物(45,90,180mg/kg)组,头孢拉定组。每组提前1d给药,第2天,各组给药1h后,按0.5ml/只腹腔注射金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌,连续4天给药。观察小鼠的一般情况和统计4天内各组动物死亡率。
实验结果见表3。实验结果表明,在四天内,感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌的小鼠死亡率分别是90%,90%,90%和80%。头孢拉定对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的小鼠的保护作用高达80%,但对耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌感染的小鼠保护率仅为30%。但鹿茸草提取物高剂量组对耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌均在70%左右,提示鹿茸草提取物对耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌有明显的保护作用。
表3鹿茸草提取物对金色葡萄球菌、大肠杆菌、耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌感染小鼠的影响(n=10)
(3)对巴豆油致小鼠耳廓肿胀实验
取小鼠60只,雌雄各半,分为鹿茸草提取物(180、90、45mg·kg-1)组、吲哚美辛对照组、空白对照组共5组,每组12只。鹿茸草提取物组灌胃给药,连续给药5天。空白对照组给予等量的蒸馏水,阳性对照组给予0.2ml/10g吲哚美辛,连续给药2次。末次给药30分钟后,于每鼠右耳前后两面涂50μl二甲苯致炎,30分钟后处死动物,剪切两耳,用直径7mm的打孔器在各鼠右耳相同部位打下圆形耳片,称重,计算肿胀度(=右耳重量-左耳重量)和抑制率。抑制率=(空白对照组肿胀度均值-用药组肿胀度均值)/空白对照组肿胀度均值×100%。
实验结果见表4。
表4鹿茸草提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响
*P<0.05,与空白组比较
结果表明,与空白对照组比较,吲哚美辛组(20mg·kg-1)与鹿茸草提取物组(90,180mg·kg-1)耳廓肿胀度明显降低;鹿茸草提取物(180mg·kg-1)对小鼠耳廓肿胀抑制率为21.90%。

Claims (3)

1.一种苯乙醇苷类成份的制备方法,其特征在于该成份结构如式(I)所示,
该成份为鹿茸草苷,即式(I)中R1为羟基,R2为鼠李糖基,R3为氢;
其采用如下步骤获得:
(1)取鹿茸草药材,粉碎成粗粉,用水、含1-4碳的低级醇、丙酮或它们的混合物提取2-3次,每次1-3h,过滤,合并滤液,浓缩,加水至相当于0.1-1.5克生药材/毫升,离心,得澄清液;
(2)由(1)所得澄清液上预处理好的大孔吸附树脂柱,依次用水、10-15%乙醇、30-80%乙醇洗脱,收集30-80%乙醇洗脱液,浓缩,干燥,得苯乙醇苷类成份组合物;
(3)由(2)所得苯乙醇苷类成份组合物,经常规硅胶、反相硅胶柱层析,得所述苯乙醇苷类成份。
2.一种权利要求1所述苯乙醇苷类成份的制备方法,其特征在于步骤(1)中选用水、含1-4碳的低级醇、丙酮或它们的混合物加热回流提取或浸泡提取,提取溶剂总用量为药材干重的10-30倍。
3.一种权利要求1所述苯乙醇苷类成份的制备方法,其特征在于步骤(2)中所用树脂为苯乙烯型树脂,所述洗脱液优选30-60%乙醇洗脱。
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