CN102302866B

CN102302866B - 叠加式固定床变相聚焦层析柱及分离方法

Info

Publication number: CN102302866B
Application number: CN201110191736.8A
Authority: CN
Inventors: 倪宝谦; 倪成
Original assignee: 倪宝谦
Current assignee: Beijing Double Helix Biotechnology Research Institute
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2031-07-08
Also published as: CN102302866A

Abstract

本发明提供一种叠加式固定床变相聚焦层析柱，还提供采用该层析柱同时分离蚓激酶、超氧化物歧化酶和复合氨基酸的方法，变革现行生物浆料生产线单一产成品现状，在保持原生化制品的质量、产量、能耗、工时等经济核算指标原有的水准前题下，实现同一柱床内对多种药效成份集约化连续分离。

Description

叠加式固定床变相聚焦层析柱及分离方法

技术领域

本发明涉及一种叠加式固定床变相聚焦层析柱，还涉及采用该层析柱同时分离蚓激酶、超氧化物歧化酶和复合氨基酸的方法，属于生化分离介质及生化制药领域。

背景技术

现代生化技术规模化提取生物制品时，普遍遵从唯一靶物质原则，即专一的分离单一物质。比如蚯蚓体是个丰富的天然药物资源宝库，蚓激酶EK，超氧化物歧化酶SOD，复合氨基酸AA是蚯蚓体中有益人体的三种药效成份，为实现它们大规模生产要求，通常需要分头设计三条工艺过程，建设三条生产线，三套人马来完成。对每条工艺而言，收获各自的有效成份之后，其它组分不管有用无用一概作为废弃物处理。

究其原因是当代生化分离技术的局限性造就了这种无奈局面，而本质问题是现代生化工业生产过程最精细手段往往涉及色谱分离技术，其有效核心工作部多是一个由同类介质组成的连续相，它只能营造一个最适宜条件，以满足某一种生物制品的提纯要求。两组纯化环境在同一工况区内的不可兼容性早已约定成俗，所以维持这种唯一靶物质原则就在情理之中了。

目前，在工业化色谱技术生产生物制品过程中，无论离子交换、分子筛、亲和层析、分配层析，反相层析等分离技术，无一例外均不可能实现在同一床体内存在多样的柱环境，难以实现双组或多组分大规模同时分离。这种对获取有效成份唯一性限制，带来后果是浪费资源，效率低下，成本居高。

诚然，在生化试验室里，同一柱环境下，阶段洗脱和梯度洗脱措施是可以收获副产品的情况也是常见现象，但工业生产讲究的是“有限工作面，最大荷载量”，因此对层析柱的过饱和上样是惯常做法。在工艺设计之初副产物产率不是优先考虑重点，为利润最大化要求，甚至牺牲少量主产品收率在所不惜。常规柱层析技术不可能为次级产品预留或放大截流空间，面对多组份样品更多情况是用于实验室研究，工业用途局限性大。

为更有效地从复杂的生物浆料中获取药效成份，以分离材料为核心的各类技术创新研究是制药行业最热门课题之一。色谱分离过程，一柱多用，进军生产规模化的尝试已成为发展趋势。但时下鲜有普适、高效的研究成果能用于生物浆料的多元产品工业化同步分离提纯。

例如中国专利CN200380103597.2公开了一种连续模拟移动床聚焦层析方法，其有效工作部包含按一定顺序连接在一起的数个区，核心装置是每个区内均装有一个可拆卸的层析柱，将这些层析柱周期性的向上游重置一个区，通过连续的上样和层析柱反复的重置方法，从一个复杂化合物中分离和浓缩多种成分。然而其存在明显的疑惑，例如该技术所用的层析柱反复的重置措施，由于所有柱芯始终由同一种介质装填。这意味着其核心分离部是单一的、连续的固定相，则本质上是一个周期性延长柱体的变通办法。并且由于其宽泛的荷载对象，大量的柱节空间被非靶物质挤占，效率必然降低，这违背工业工艺设计的基本原则---最大限度使用工作面上的有效解析空间，且将笨重的工业用层析柱反复的重置难以在生产场地实现。

看来，聚焦技术在工业柱层析上应用需要从两方面入手：放弃形成聚焦环境试剂的应用，以及不受限制的扩展可聚焦样品的有效空间。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种叠加式固定床变相聚焦层析柱及分离方法，变革现行生物浆料生产线单一产成品现状，在保持原生化制品的质量、产量、能耗、工时等经济核算指标原有的水准前题下，实现同一柱床内对多种药效成份集约化连续分离。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种叠加式固定床变相聚焦层析柱，其至少具有一个工作单元，包括依次连接的进料管7、用以进行层析的柱体10、出料管及储料罐6，其特征在于，所述工作单元由若干柱段由下至上顺次排列，每一柱段连接有一个变相器，所述变相器是由在所述柱体外的半透膜隔断构成的容器2和横向切入柱芯内的柱芯隔断板1两部分组成，还包括贯穿其中起连接作用的浆料输液管线3，其中，所述半透膜隔断构成的容器2是由半透膜构成分离的腔室，分别供待分离浆料和由输液泵4或输液泵5泵入的操作液短时间滞留和交换溶质，依赖半透膜两侧溶质的交换作用达到操作液物化参数的置换目的，所述柱芯隔断板与柱体之间采取可拆卸的卡箍密封连接方式，所述浆料输液管线3的终端是柱芯隔断板1，该柱芯隔断板的上下两侧分别设有互不导通的三通输液通道及电磁阀门组9，使得在变相器内经过调制后的料液经此分流到下一柱段。

其中，根据分离浆料的性质，多组共性的柱段共用一个变相器。

其中，柱体还包括筛板。

其中，所述的柱体是由若干模包组件层叠紧固而成，所述的模包组件包括封套以及位于所述封套内部的柱芯，所述柱芯沿轴向是由数十，上百乃至千层毫米级厚度的薄片叠加而成。

本发明的又一目的是提供一种采用柱层析连续分离蚓激酶(EK)，超氧化物歧化酶(SOD)，复合氨基酸(AA)的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下方案：

所述分离方法采用前述的叠加式固定床变相聚焦层析柱，将一个工作单元的有效工作部分割为分别对EK、SOD、AA专一性截留的三类柱段，上柱液所携带的蚯蚓制品原始浆料样品在变相器的输液泵驱动下，在各柱段被依次截留，每一靶物质对应一组变相器来保障分离效果。

其中，所述分离方法具体操作是按如下步骤进行：

1)柱床预处理：采用工作液A管线分别对分离介质进行酸，碱，水，buffer的清洗，平衡等预处理；

2)蚯蚓浆料上柱液由下至上经第一变相器，由分子筛AA柱段截流大分子蛋白质，收获AA；

3)浆料继续上行通过第二变相器，经工作液C调制后，进入弱阴离子交换剂EK柱段，EK被截留；

4)浆料继续上行通过第三变相器，经工作液D调制后，进入强阴离子交换剂SOD柱段，SOD被截留；

5)工作液B管线分别对弱阴离子交换剂EK柱段，强阴离子交换剂SOD柱段泵入洗脱液，分别收获EK，SOD；

至此完成一个工作单元对AA，EK，SOD的连续分离。

其中，所用半透膜选择截留值分别为3000，35000，50000道尔顿，分别使用于AA，EK，SOD柱段。

进一步，柱芯工作部针对不同的靶物质有相应分离柱段，每个柱段具备对应于各自靶物质的柱芯环境，这些不同的柱芯区段彼此叠加以实现工作任务集约化，按照靶物质获取的顺序设计操作液的流径，以实现多种靶物质大规模连续分离。

本发明提供的叠加式固定床变相聚焦层析柱及分离方法的有益效果包括：

1)从原理上本聚焦技术是自辟蹊径的。是在任意人为预设的柱环境中实现所谓聚焦作用，完全不需要任何梯度类的物化环境，更无须专用化学合成试剂的介入。

2)所谓聚焦只是指靶物质在特定的柱段中呈饱和状态聚集，柱段的容积可根据荷载对象浓度大小，进行人为调整，能做到最大限度的利用柱床空间，提高工效。整个工时不会因产品品种增加延长，蚓激酶分离工时反而可以缩短30-50％。

3)能够被柱床荷载的有效物质仅限于那些“志在必得”特定的少数种类，未被选定的浆料组分将随流动相流出柱外，最大程度抑制非特异性吸附现象发生。

4)完成了对蚯蚓制药“一柱三分”的工艺整合目标，EK质量符合药典指标：效价18000-20000u/mg，蛋白吸收峰278mú±2；SOD活力回收率80-90％；AA：18种氨基酸品种齐全。

5)在改造已经运转的生物制品流水线时，该技术可派用场。它可以完全保留原流水线工艺过程前题下，额外增加一种或多种新增靶物质的同步分离。这一点，前述任何门类工业生产型聚焦技术均无法胜任。

附图说明

图1为蚓激酶分离过程中总蛋白，EK，SOD分布图；

图2为蚯蚓浆上柱液中氨基酸的薄层层析图谱；

图3为各柱段酶活测定曲线；

图4A和4B为本发明装置变相器与柱体的工作示意图；

图5为离子交换柱装置各柱段截留相应酶活统计图；

图6为连续分离EK，SOD，AA离子交换柱的一个工作单元示意图；

图7为叠层柱各模包纯化SOD活力回收率。

附图标记说明：1-柱芯隔断板；2-半透膜隔断构成的容器；3-浆料输液管线；4-输液泵a；5-输液泵b；6-出料管及储料罐；7-进料管；8-筛板；9-电磁阀门组；10-柱体；31-分子筛；32-弱阴离子交换剂；33-强阴离子交换剂。

具体实施方式

相关专业用语

“变相”的双重含义，一个是指多种靶物质在柱床上依次分类聚集现象类似等电点聚焦，但本技术完全不依赖梯度介质的参与，无梯度概念的这种“依次分类聚集”只能称冠以“变相”二字以示区别。另外是指浆料在分离过程中需要通过不同的分离区，每到一处预先设定的区域，就需留下相应的靶物质，然后携带其它待分离溶质进入到下一个预先设定区域，这就需要在进入下一柱段之前对流动相的理化参数进行必要的调整，目的为适应下一个靶物质最适分离条件的需求，此调整过程也称之为“变相”。

“变相聚焦”，是指靶物质对分离介质预设部位积聚并依序排列的现象，拟似“等电聚焦”，但此聚焦非彼聚焦，故称“变相聚焦”。

叠加式固定床变相聚焦柱层析是一种的新技术模式。它最重要的特点是允许不更改原有生化制备工艺流程的前题下，在同一柱床内部兼容第二，甚至第三套完全不同的工艺流程，所要解决的关键问题是新引进的工艺参数与原工艺之间转换，也就是所谓“变相”问题。变相内容主要在于溶剂PH，离子强度，离子种类，解离常数，电导值等。关键问题是工艺设计，对变相速率的控制。需要专设“变相”功能构件达此目的。

本发明提供的叠加式固定床变相聚焦层析柱，在分离有效成份时，强调所有待分离组份一概在各自的被荷载区段达到饱和状态，而且这种区段的容积是根据样品浓度与介质的交换容量之间关系预先设定，为次级产品预设的截留容积可以根据需要任意增减。而且这些柱段都有各自相应的专一吸附对象。这是它可以实现规模化多组份分离的基础。

在柱芯截面积确定之后，相关柱段的交换剂用量及柱段高度由料液浓度，分离介质特性，环境温度等一系列物化参数综合运算，并考虑保险系数后进行工程设计。柱段高度的计算公式如下：

W = \frac{c * V_{3} * a}{q}

L = \frac{W * V_{2}}{S}

= \frac{c * V_{3} * V_{2} * a}{q * S}

c样品浓度 g/ml q交换容量 g/g

L柱体高度 cm a保险系数％

S柱芯截面积 cm² V₃样品体积 ml

V₂溶胀体积 ml/g W交换剂用量 g

以下结合实施例和附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

试验一蚓激酶分离工艺流程参数确立

分离介质：市售抗纤溶阴离子交换纤维素(弱碱性阴离子型)，圆片状纤维板，5mm厚度，10片叠加成一组EK专用柱节。

柱环境：PH6.8，PBS buffer 20mM平衡备用。

上柱液：3倍缓冲液抽提蚯蚓浆料，超速离心取上清液，超滤膜澄清液，调PH6.8备用。

制备蚓激酶：按体积比值为浆料∶柱床＝2.5∶1上柱，淋洗杂蛋白，500mM Nacl/PH6.8 PBS buffer 20mM洗脱蚓激酶，紫外检测仪检测试验过程。

试验结果：获得典型离子交换法分离蚓激酶过的紫外检测图谱，显示有杂蛋白峰和蚓激酶峰。

试验二蚓浆被分离过程中EK/SOD/AA分布状态试验

样品来源：蚯蚓浆上柱液

分离介质：同上EK专用柱节。四组叠加，依次通过上柱液，洗脱样品后分别检测柱床所荷载的样品。

检测项目及方法：

蛋白质浓度值：紫外吸收法

EK活力：标准平板法

SOD活力：邻苯三酚自氧化法

试验结果：EK活力分布在500mM Nacl洗脱液中(表1)。SOD活力位于EK吸收柱段的流出液中，混杂有蚓激酶及氨基酸(见图1)。蚯蚓浆中富含全价氨基酸。

表1三批次柱段分离EK/SOD过程中，不同类蛋白质含量统计表

同时参见图1，得出结论：1SOD中残留有EK活力。2工作重点SOD分离纯化。

另外叠层柱分离EK/SOD过程中活力分布测定图谱显示，部分蚀斑为SOD分部样品，表明其中其为SOD/EK混合物；另一部分蚀斑为EK分部样品。

试验三生物大分子与复合氨基酸的分离

样品来源：蚯蚓浆料上柱液

操作方法：3000道尔顿截留量分子筛柱床，截流大分子蛋白质，释放AA。

试验结果：纸上层析法18种AA显色斑。参见图2。

试验四SOD的上柱液技术参数的调整

试验目的：消除SOD制备过程的失活因素，使sod上柱液与柱环境协调一致。

试验方法：纯水2倍稀释蚓激酶柱段流出液以降低离子强度，稀盐酸调整批酸碱度为PH7.6。

分离介质：市售抗纤溶阴离子交换纤维素(TEAE强碱性阴离子型)

PH7.6强碱性阴离子交换纤维素分离SOD/EK效果检测胶版，EK，SOD各柱段截留酶蛋白品种分明，活力交叉现象消除。

图3为各柱段酶活测定曲线：SOD中残留EK活力被清除，酶蛋白活力交叉现象消除。

试验结果：高pH环境导致SOD失活问题解决，SOD与EK两者彻底分离目的实现。

试验五SOD的上柱液技术参数的动态调整

试验目的：连续对SOD的上柱液技术参数的动态调整，为实现连续分离目的。

装置：如图4A和4B所示。包括依次连接的进料管7、用以进行层析的柱体10、出料管及储料罐6，其特征在于，所述工作单元由若干柱段由下至上顺次排列，每一柱段连接有一个变相器，所述变相器是由在所述柱体外的半透膜隔断构成的容器2和横向切入柱芯内的柱芯隔断板1两部分组成，还包括贯穿其中起连接作用的浆料输液管线3，其中，所述半透膜隔断构成的容器2是由半透膜构成分离的腔室，分别供待分离浆料和由输液泵4或输液泵5泵入的操作液短时间滞留和交换溶质，依赖半透膜两侧溶质的交换作用达到操作液物化参数的置换目的，所述柱芯隔断板与柱体之间采取可拆卸的卡箍密封连接方式，所述浆料输液管线3的终端是柱芯隔断板1，该柱芯隔断板的上下两侧分别设有互不导通的三通输液通道及电磁阀门组9，使得在变相器内经过调制后的料液经此分流到下一柱段。

表2物料溶液相性质的装置----变相器导致的sod上柱液参数变化表

表3连续分离EK，SOD，离子交换柱装置各柱段截留相应酶活统计表

图5为离子交换柱装置各柱段截留相应酶活统计图。试验结果：变相器功效明显。两工艺兼容问题解决，SOD、EK彻底分离。

试验六变相的工业型聚焦技术分离蚯蚓浆过程重复试验

试验目的：“一柱三分”的工艺路线，连续分离EK/SOD/AA

试验装置：参见图6，为连续分离EK，SOD，AA离子交换柱的一个工作单元。

操作程序：

1)柱床预处理：工作液A管线分别对分离介质进行酸，碱，水，buffer---清洗，平衡等预处理。

2)蚯蚓浆料上柱液经“31分子筛”柱段截流大分子蛋白质，收获AA。(凡是第一个靶物质是大分子为对象的柱段前，可不设变相器。预设第一变相器效果会更好，以祛除小分子非靶物质，以减轻后续柱床的负荷)

3)浆料继续上行通过变相器，经工作液C调制后，进入“32弱阴离子交换剂”柱段，EK被截留。

4)浆料继续上行通过变相器，经工作液D调制后，进入“33强阴离子交换剂”柱段，SOD被截留。

5)工作液B管线分别对“32”，“33”柱段泵入洗脱液，分别收获EK，SOD。

至此完成一个工作单元对AA，EK，SOD的连续分离。

而多工作单元可将上述一个工作单元有序叠加，构成多单元叠加装置，可实现“集约化工作模式”，实现一柱三分。

以蚓激酶制备过程为例，各相关工段工艺过程电磁阀门组工作状态操作说明：

EK制备过程操作如下：

*介质回收处理：

1)启动输液泵，连通酸液管路，EK床顶端左阀EK床顶端右阀

实施酸液对AA柱床清洗操作，时间控制50分钟。

2)启动输液泵，连通贮罐纯水管路，EK床顶端左阀

EK床顶端右阀

实施对AA柱床酸性清洗操作，至PH6终止。

3)启动输液泵，连通碱液管路，EK床顶端左阀

EK床顶端右阀实施酸液对AA柱床清洗操作，时间控制50分钟。

4)启动输液泵，连通贮罐纯水管路，EK床顶端左阀

EK床顶端右阀

实施对AA柱床酸性清洗操作，至PH6--7终止。

5)启动输液泵，连通贮操作液管路，EK床顶端左阀

EK床顶端右阀

实施对AA柱床酸性平衡操作，流出液至操作液PH与操作液相等为止。至此EK床处于备用状态。

*浆料上柱：

1)输液泵连通上柱液管线，EK床顶端右阀EK床顶端左阀

实施对EK床的上柱操作。计量泵控制上柱液进入量。

2)输液泵连通液管线，EK床顶端右阀

EK床顶端左阀

实施对EK床的上柱操作。计量泵控制上柱液进入量。

*回收EK

1)EK床顶端右阀EK床顶端左阀

输液泵连通洗脱液管线。实施对EK床的上柱操作。计量泵控制上柱液进入量。紫外检测记录仪在线常规操作。

2)收集洗脱液，转后续工段精制脱水，质量检测。

同理，同法可以实现对SOD，AA的分离。

进一步，允许在同一层析柱上实现多工序交叉同步操作，采用多单元叠加装置。例如采用三单元叠加柱层析交叉操作工序。

试验结果：

表4：变相的工业型聚焦技术分离蚯蚓浆过程重复试验汇总表

试验七变相的工业型聚焦技术过程对SOD活力回收率试验

表5叠层柱各模包纯化SOD活力回收率统计表，见图7

样品号	稀释1	A0	AS	稀释2	点样	SODu/ml	活力回收％
								4/8 O1	4	0.071	0.033	222.2222	13.6ul	209886.8	100
I(1)	4	0.071	0.031	222.2222	13.6ul	220933.4	105.2631
								I(2)	4	0.071	0.031	222.2222	13.6ul	220933.4	105.2631
I(3)	4	0.071	0.033	222.2222	13.6ul	209886.8	100
								I(4)	4	0.071	0.0366	222.2222	13.6ul	190002.7	90.5263

								II(1)	4	0.071	0.0385	222.2222	13.6ul	179508.4	85.5263
II(2)	4	0.071	0.0356	222.2222	13.6ul	195526.1	93.1579
								II(3)	4	0.071	0.036	222.2222	13.6ul	193316.7	92.1052
II(4)	4	0.071	0.04	222.2222	13.6ul	171223.4	81.5789

III(1)	4	0.071	0.04	222.2222	13.6ul	171223.4	81.5789
								III(2)	4	0.071	0.036	222.2222	13.6ul	193316.7	92.1052
III(3)	4	0.071	0.038	222.2222	13.6ul	182270.1	86.8421
								III(4)	4	0.071	0.0386	222.2222	13.6ul	178956.1	85.2632

								均值						192258.0833	91.6％

试验八本发明分离方法与传统填充柱流程所消耗工时进行对比

表6工艺流程所消耗工时进行对比

试验九对药品级蚓激酶产品质量测定试验

表7蚓激酶标准品曲线试验记录表

表8采用本发明分离方法制备药品级蚓激酶产品质量测定表

表9采用本发明分离方法制备药品级蚓激酶各批EK紫外光谱扫描结果一览表

表10北京市理化分析测试中心对采用本发明分离方法制备复合氨基酸的含量分析报告单

Claims

1.一种叠加式固定床变相聚焦层析柱，其至少具有一个工作单元，包括依次连接的进料管、用以进行层析的柱体、出料管及储料罐，其特征在于，所述工作单元由若干柱段由下至上顺次排列，每一柱段连接有一个变相器，所述变相器是由在所述柱体外的半透膜隔断构成的容器和横向切入柱芯内的柱芯隔断板两部分组成，还包括贯穿其中起连接作用的浆料输液管线，其中，所述半透膜隔断构成的容器是由半透膜构成分离的腔室，分别供待分离浆料和由第一输液泵或第二输液泵泵入的操作液短时间滞留和交换溶质，依赖半透膜两侧溶质的交换作用达到操作液物化参数的置换目的，所述柱芯隔断板与柱体之间采取可拆卸的卡箍密封连接方式，所述浆料输液管线的终端是柱芯隔断板，该柱芯隔断板的上下两侧分别设有互不导通的三通输液通道及电磁阀门组，使得在变相器内经过调制后的料液经此分流到下一柱段。

2.根据权利要求1所述的叠加式固定床变相聚焦层析柱，其特征在于，根据分离浆料的性质，多组共性的柱段共用一个变相器。

3.根据权利要求1所述的叠加式固定床变相聚焦层析柱，其特征在于，所述柱体还包括筛板。

4.根据权利要求1所述的叠加式固定床变相聚焦层析柱，其特征在于多工作单元是将所述至少一个工作单元有序叠加，构成多单元叠加装置。

5.一种采用柱层析连续分离蚓激酶、超氧化物歧化酶、复合氨基酸的方法，其特征在于采用权利要求1-4任一项所述的叠加式固定床变相聚焦层析柱，将一个工作单元的有效工作部分割为分别对蚓激酶、超氧化物歧化酶、复合氨基酸专一性截留的三类柱段，上柱液所携带的蚯蚓制品原始浆料样品在变相器的输液泵驱动下，在各柱段被依次截留或卸载，每一靶物质对应一组变相器来保障分离效果。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于柱芯工作部针对不同的靶物质有相应分离柱段，每个柱段具备对应于各自靶物质的柱芯环境，这些不同的柱芯区段彼此叠加以实现工作任务集约化，按照靶物质获取的顺序设计操作液的流径，以实现多种靶物质大规模连续分离。