CN1481919A - 薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱 - Google Patents
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Abstract
本发明主题名称为“薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱”,可在生物工程技术中用作酶、蛋白质等生物大分子分离、提纯的核心装备。它的特征是:柱芯是由数百乃至上千层毫米级厚度的薄片叠加而成。柱体横剖面装填物质在占位上保持传统理论所强调的细致、均一和连续性;但从纵剖面看却是层层重叠、疏密相间、循环重复的分离介质。独特的柱体结构使柱体沿横断面可任意拆装,重新组合;有着比传统层析柱更多的可变通性。专用的可插入式清洗模片,可多位点的从横向切入待回收柱芯内,使片层柱被分割为若干柱节;清洗剂由清洗片导入柱芯,可从内部同时对各柱节进行清洗回收,既省时又省工,可使层析柱获得最大限度的利用效率。
Description
一技术领域
本发明主题名称为″薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱″。它在生化研究、基因工程技术中,可用作酶、蛋白质,核酸等生物大分子分离提纯的核心装备。学术上应属于色谱分析技术领域的分离材料或分离工具范畴。
二背景技术
层析柱作为色谱技术家族的最重要成员,具备该家族共有的三项标志:分离有效物质的场所---固定相和在固定相里运动的液体或气体---流动相,以及后者必须能平稳的携带着被分离的有效物质并使其在固定相里经过千百次的固,液相反复分配过程,最终达到分离纯化目的。
没有色谱分离技术就不会有今日的生命科学;分离材料科技一直在其母学科---生命科学的带领下飞速发展。所有的色谱材料的开发和应用技术的改进,都集中在固定相和流动相质材品质改良和两者间相互最佳匹配状态选择上。理想状态的层析柱按数学公式推导的要求,须要操作者把将近二十项相互关联的变量参数调整到最佳协同状态。与数学模型完全吻合的柱层析技术是可接近而不可企及的。它像所有科学技术一样,将永远向勤奋的科学家开放一方可开垦的处女地。层析柱作为一类重要的研究和生产工具,紧密伴随生命科学蓬勃发展的要求而不断更新换代。现代生命科学发展要求分离材料技术不断创新,令诸多分离材料专门家折腰。
本专利发明《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》(简称片层柱)即是在这样大技术背景下补缺而生。它的设计思想和实物结构与传统理念有很大差异。
近些年来,市场上有多种予装柱供应,性能堪佳,使用方便;缺憾之处是回收再生依然费时费工,比起散装柱并无改观。究其根源,这似乎与设计者脑子里一直存在的″要求有一个臻于完美的固定相和一个几乎不受干扰的流动相″理念不无关系。
中国专利92111328.5《工业生产用固定化阴(阳)离子交换纤维素柱》是本文作者早年工作。实施过程中发现有明显缺陷,尽管采取多种措施,柱体间参数离散性大的弊病仍是长期困扰人心的难题。长期摸索过后,意识到一味追求柱芯的细密,均匀和连续性来保证能有一个″几乎不受干扰的流动相″可能不是最佳的选择。或许彻底打破这种″细密,均匀,连续性″传统格局,采取″于最纷乱之中求均匀,最断续中求连续″的做法可能是另一个出口。这种设想指导下的具体实践是:改革传统的柱芯结构,沿柱芯纵轴方向垂直对柱芯做结构上的等份分割,分割间距为1或数毫米。使这种柱芯由数百乃至上千层毫米级厚度的薄片叠加而成。
这就要对柱体内流动相的流体力学特性作出新的解释:在此新的分离系统中,流动相除受重力或泵压的驱动之外,还随时受到沿途各薄层片内部毛细效应的浸润和片层间隙的阻滞。由于每片薄层都与柱芯的中心线垂直,使这种浸润和阻滞效应可随时随地对流动相的扩散起到矫正和限制作用。这样,流动相就可以携带着被分离溶质沿经向以狭窄的区带循序渐进。狭窄的区带意味着良好的分离效果。
叠层柱柱体以模块为单位任意拆装、重组会带来独到的应用特点。另外,通过特制的清洗片可实现对整个柱芯从内部进行同步分段回收和再生。
数年实验下来,实践证明了上述构想不谬。有今日中国发明专利《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》的申报。
三发明内容
本发明的核心是改革传统柱芯的固定相,使它由均一的连续结构改为疏密相间、层层叠加的片层。要点如下:1)从结构上看,保持柱芯横切面方向的物质分布尽可能均匀,细密和连续性。沿纵轴方向对柱芯做结构上垂直的等份分割,分割间距为1或数毫米。由此制成的″薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱″是一种新的固定床色谱柱,它的柱芯是由数百乃至上千层毫米级厚度的薄片叠加而成。2)这一种有勃于传统的色谱柱芯柱芯,装填物质沿径向是非均一的,不连续的固定相。柱体横向剖面装填物质保持传统理论所强调的细致,均一和连续性;但纵向剖面在物质占位上是疏密相间和有规律的循环重复。3)柱身的基本构件是模包组件,它是由若干层上述柱芯薄片叠加后,固定在塑料或有机玻璃预制的封套里。若干模包组件再叠加,机械固定组成完整的《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》。4)整个柱体可以以模包为单位随意拆散和组装,同等尺寸规格的模包组件可任意替换和重组。5)专用的可插入式清洗模片可多位点的从横向切入待回收柱芯内,使得片层柱被分割为若干柱节。清洗模片在垂直柱芯的轴向设有隔膜,同时可以从横向往上,下方向输入或输出液体的预制件。清洗剂由清洗片导入柱芯,从内部同时进行清洗回收。既省时又省工,从而可获得最大限度的利用效率。6)组成柱芯的片层材料由环氧树脂,丙稀酸树脂,硅橡胶等共聚物与阴(阳)离子交换材料胶合,固化成型。7)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》可以胜任两种常规装填柱不可能具备的工作方式:
A:足够长度的片层柱,充分展层后,将整个柱芯视为一个″部分收集器″找出携带欲分离物质集中的模包单独回收。
B:多根柱床平行操作,按上法收集分离物质集中的模包重新组装成柱,集中回收或进一步分离纯化。
四说明书附图说明
(图1)300*1毫米*30毫米阴离子交换纤维素片层柱。PH7.5,磷酸缓冲液,0---500毫摩氯化钠直线梯度,鸡卵清分离图谱。该柱可将鸡卵清分离为三个独立的蛋白峰。
(图2)300*1毫米*30毫米阴离子交换纤维素叠层柱。PH7.5,磷酸缓冲液,500毫摩氯化钠对卵清蛋白洗脱图谱。
(图3)300*1毫米*30毫米阴离子交换纤维素叠层柱。PH7.5,磷酸缓冲液300毫摩尔氯化钠分离鸡卵清蛋白图谱。
(图4)300*1毫米*30毫米阴离子交换纤维素叠层柱。PH7.5,磷酸缓冲液,蚯蚓抽提液分离图谱:峰1为流出杂蛋白,峰2为0-300毫摩尔氯化钠线性洗脱图谱。可以看出:线性洗脱不能对蚯蚓浆组分进行有效分离,只是显4有4-5个组分混合在一起。
(图5)300*1毫米*30毫米阴离子交换纤维素叠层柱。PH7.5,磷酸缓冲液,蚯蚓抽提液分离图谱:峰1为流出杂蛋白,-------为予设的洗脱液离子强度变化曲线,依次递增的氯化钠浓度为:50、90、130、140、200、250、300、350、410毫摩尔,在每个浓度间隔里插入一个柱体积的5毫摩尔氯化钠作为过度。
从图中可以看出(图4)里的峰2在(图5)条件下被分解为8个独立的蛋白峰。
(图6)实验用《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》(A2工作柱 B2加装清洗片的回收柱)
①进料管 ②紧固螺栓 ③模包组件 ④清洗片 ⑤封头 ⑥出料管(图7)生产用《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》(A1工作柱 B1加装清洗片的回收柱)
①紧固螺杠 ②把手 ③压板 ④清洗片 ⑤模包组件 ⑥封头 ⑦基座 ⑧龙门架
五具体实施方式:
(一)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》的制作方法。
阴离子交换柱芯芯料配方:
1二乙氨基乙基离子交换纤维素 55.25%
2环氧树脂 7%
3丙稀酸甲脂 8.5%
4偶氮2异庚氰 0.3%
5硅橡胶予聚体 3.5%
6邻苯2甲酸2甲脂 1%
7去离子水 4%
8氯化钠 21%
芯料制备;
按配方要求将物料2,3,4,6依次投入反应釜中,升温至75摄氏度,保温90分钟,待物料黏度变稠至可扯起丝时立即降温至15摄氏度以下,使反应暂时停止。将物料5,8依序加进上述反应釜中,搅拌均匀。物料1与7预先拌匀后一并加进反应釜。始终保持釜内15摄氏度,直至全部物料被下步工序用完。
轧辊间隙1毫米,将反应釜中物料扎制成薄板,随即切割成规定尺寸的圆片。
105摄氏度固化12小时后,冷却到室温,包装备用。模包组件装配:
模包组件的外皮是塑料预制件,将上述的柱芯薄片叠层安装在中心孔中,胶料粘接即成。整柱的装配:
模包组件叠加,配上,下封头,(或清洗片)螺栓紧固。
(二)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》实用举例1---流动相的抗干扰性能。
对片层柱而言,最严重的隐患莫过于因柱芯被切割和片层叠加给流动相可能造成的层层″涡流″。沿途存在涡流必然使行进中的流动相倍受搅扰,如果是这种情况,样品分离工作将无法进行。如果叠层层析柱抗逆性能强,可避免出现上述不良情况。
如下做法可考验叠层层析柱抗逆性能。
一种惯常的生化现象是:成分复杂的蛋白质样品,单凭一根层析柱很难获得单纯分离产物。每个洗脱峰里包含的只能是一组电性相近的蛋白质,这些蛋白质会随洗脱液离子强度改变而发生组分迁移现象。组分迁移意味样品在流动相里进行了重新分配。介质颗粒阻滞会造成流动相形成“涡流”,被扰动的流动相将会使这一分配过程变得乱无章法。
依据上述原理,比较叠层柱对鸡卵清蛋白的三次分离实践过程,从分离图谱的分辨率、主峰区带宽度、实验塔板数就可判断柱芯内形成“涡流”对流动相的干扰情况。
(图1)、(图2)、(图3)为三次分离卵清蛋白实践过程的紫外监测仪记录图谱,分离条件见各图的文字说明。
结果见下表:
(图1),(图2),(图3)各图谱相关分离参数变化对照表
从上表可以看出:1)洗脱条件不同,分辨率无明显劣化改变。各洗脱峰的位置,宽度变化不大。主峰的高度有明显差异,存在主峰间塔板数转移的现象。这意味着样品在流 动相里进行了重新分配。2)每组实验图谱的主峰都仍保持了很高的实验塔板数。可以看出,由于离子强度等实验条件的影响,在各组实验的流动相内,被分离组分浓度变化很大;尽管流动相内部各组分间存在明显的交叉混合,但都保持着一个十分锐利的主峰;
分辨率 | 峰高(毫米) | 峰宽(毫米) | 实验塔板数 | ||||||||
峰1*2 | 峰2*3 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | |
图一 | 0.9 | 1.4 | 130 | 78 | 10 | 8 | 28 | 10 | 40.9 | 1024 | 77 |
图二 | 0.9 | 1.3 | 32 | 240 | 22 | 20 | 30 | 10 | 4425 | 124 | 16 |
图三 | 0.7 | 1.4 | 110 | 118 | 12 | 13 | 30 | 10 | 1145 | 247 | 23 |
以上现象意味着在柱芯已经被分割为300片*1毫米/片的不连续的固定相里,流动相并不因此被扰动。这样就验证了“利用片层内部的毛细浸润和片层间隙的阻滞作用,持续不断的抑制和矫正顽固的区带扩散倾向”″于最纷乱之中求均匀,最断续中求连续″的总体设想的合理性。这些实验表明,对于《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》而言″涡流″现象不足为患。(三)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》实用举例2----解析能力。
对一组线性梯度不能分开的混合蛋白质(见图4,峰2),按照予先设定的洗脱液离子强度变化曲线进行阶段洗脱。可操作性良好的层析柱应对原本难以分离的复杂样品有令人满意的进一步解析能力。(图4),(图5)为实际操作过程的紫外检测图谱,工作条件见各图说明。对照(图4),(图5)可以看出:
两图的峰1是未被吸附的蛋白峰,在两次实验中保持着相同的形状和位置。而(图4)里的峰2是一组线性梯度不能分开的混合蛋白质。但在(图5)的实验条件下,这组蛋白质已被分割成8个互相独立的蛋白峰。显示了″薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱″的解析能力良好。(四)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》实用举例3----再生效率。
使用后的层析柱必须回收、再生才能再次使用,尤其是工业生产用柱,几乎一半的工时都耗费在回收车间里。片层柱有独特的清洗和回收方法,清洗模片可多位点的从横向切入待回收柱芯内,使得片层柱被分割为若干柱节。清洗剂由清洗片导入柱芯,从内部同时进行清洗回收。
利用专用的清洗片对《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》进行回收再生处理。从下边的耗时统计表里可以看到,不加装清洗片时,回收时间没有改进。一旦加装了清洗片后,回收再生所消耗的时间就大大缩短。它的再生效率比传统的填充柱可提高数倍,实际效果与当时使用清洗片的数量成正比。
不同条件下回收、清洗层析柱的耗时统计表(小时)
800ml填充柱 | 800ml《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》 | |||
0*清洗片 | 2*清洗片 | 4*清洗片 | ||
盐水清洗 | 2 | 2 | 0.5 | 0.25 |
酸化处理 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 0.25 |
除 酸 | 1.5 | 1.5 | 0.8 | 0.5 |
碱化处理 | 5 | 5 | 0.5 | 0.25 |
除 碱 | 24 | 24 | 5 | 3 |
缓冲平衡 | 10 | 10 | 2 | 1 |
累计耗时 | 44 | 44 | 10.3 | 5.25 |
耗时比 | 1 | 1 | 1/4 | 1/8 |
从上表可看出由于清洗剂由清洗片导入柱芯,从内部同时进行清洗回收,使回收时间缩短了4---8倍。使用的清洗片越多越节省时间。
由此看来,《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》用于工业生产可节省很多时间。
Claims (7)
1)本发明《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》的核心在于改革传统层析柱的柱芯结构。彻底打破了那种旨在保持“细密,均匀,连续性”固定相的传统设计格局。创造出一种新理念的实验或工业生产用柱。其特征是:对柱芯沿横断面最大限度的进行机械性等份分割,把柱芯制作成薄层叠加,疏密相间的结构。分割间距为1或数毫米。使这种柱芯由数百乃至上千层毫米级厚度的薄片叠加而成。
2)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》柱身的基本构件为模包组件,该模包组件是由若干层上述柱芯薄片叠加后,固定在塑料或有机玻璃预制的封套里。若干模包组件再叠加,机械固定组成完整的柱体。
3)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》整个柱体可以以模包为单位随意拆散和组装。同等尺寸规格的模包组件可任意替换和重组。
4)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》,借助可插入式清洗模片使片层柱再生。清洗模片的垂直柱芯的轴向设有隔膜和输液管道。清洗剂由清洗片导入柱芯,同时可以从横向往上,下方向输入或输出液体,构成片层柱独特的清洗和回收方法。
其特点是:清洗模片可多位点的从横向切入待回收柱芯内,使得片层柱被分割为若干柱节。清洗剂由清洗片导入柱芯,从内部对各柱节同时进行清洗回收。省工省时,插入的清洗片越多越省回收时间。
5)《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》可以胜任的两种常规装填柱不可能具备的工作方式:
A:足够长度的片层柱,充分展层后,将整个柱芯视为一个″部分收集器″找到并抽出携带欲分离物质集中的模包单独回收。
B:多根柱床平行操作,按上法收集分离物质集中的模包重新组装成柱,集中回收或进一步分离纯化。
6)组成柱芯的片层材料的化学原料组成。由环氧树脂,丙稀酸树脂,硅橡胶予聚物为固化成型原料。凡不与这些原料在本专利说明书限定条件下起化学反应的分离介质:如离子交换树脂,离子交换纤维素,分子筛及各种生化亲和试剂均可依本专利阐明的原理和工艺制作出各种薄层叠加式层析柱。
7)适合工业生产的大型《薄层叠加式固定化阴(阳)离子交换层析柱》借助螺栓和龙门架式的机械装置固定。
其特点是拆卸方便,清洗回收节省工时,比传统柱利用率高。
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