CN102295608B - 新型hept类hiv-1逆转录酶抑制剂的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及以非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂1-〔(2-羟基乙氧基)-甲基〕-6-(苯硫代)胸腺嘧啶(HEPT)为先导物，结合进入临床实验的药物MKC-442和TNK-651，根据生物电子等排原理和氢键作用等理论，设计出一类相关结构的新分子。见通式I，式中各个基团的定义如权利要求书所述。同时还涉及对化合物的逆转录酶活性评价及此类化合物作为HIV-1逆转录酶抑制剂的应用。使合成出的新化合物的构象更有利于与HIV-1逆转录酶结合，从而更有利于其抑制逆转录酶的活性，而成为新一类高活性、低毒性的HIV-1逆转录酶抑制剂。
Description
1.技术领域
本申请涉及以非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂1-〔(2-羟基乙氧基)-甲基〕-6-(苯硫代)胸腺嘧啶(HEPT)为先导物，结合进入临床实验的药物MKC-442和TNK-651，根据生物电子等排原理和氢键作用等理论，设计出一类相关结构的新分子。使合成出的新化合物的构象更有利于与HIV-1逆转录酶结合，从而更有利于其抑制逆转录酶的活性，而成为新一类高活性、低毒性的HIV-1逆转录酶抑制剂。其中，化合物4位氨基可以通过互变异构形成更多数目的氢键，使与逆转录酶的作用力增强；增大5位取代基的体积更有利于发挥它的立体位阻作用使得化合物6位芳环转位，同时改变其电性效应，从而更好地与HIV-1逆转录酶的疏水性口袋上部的芳香族氨基酸的芳环相互作用，形成更强的作用力，影响酶的构象而更好地产生对酶的抑制作用。进一步涉及对化合物的逆转录酶活性评价及此类化合物作为HIV-1逆转录酶抑制剂的应用。
2.背景技术
获得性免疫缺陷综合征又称艾滋病(AIDS)，是由于感染人类免疫缺陷病毒(HIV)所导致的。HIV是一种逆转录病毒，主要感染有CD4表达的细胞，见于辅助T淋巴细胞和单核/巨噬细胞，患者常于感染后10-15年因并发各种机会性感染或恶性肿瘤而死亡。自1981年6月5日在传染病史上美国疾病控制中心(CDC)发现了首批病毒以来，HIV/AIDS以惊人的速度蔓延到了世界各地，直接威胁着人类的生命和健康，是当今最危险的流行病之一。我国自1985年发现首例艾滋病感染病例以来，感染人数增加迅速。据卫生部通报，截至2008年9月30日，我国累计报告艾滋病病例264302例。到目前为止，还没有能治愈艾滋病的药物。而且，国内临床上所用的抗艾滋病药物几乎全部是进口药，价格十分昂贵。因此，研发具有自主产权的高效低毒的价格便宜的抗HIV药物是摆在我国政府和科学家面前的一个十分迫切和重要的课题。
目前发现的HIV的两种类型中，HIV-1是艾滋病的主要致病原，而HIV-2主要见于西非和印度。现有的药物主要是针对HIV-1，按其作用机制分为五类：核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂、非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂以及融合酶抑制剂。现在临床应用的药物可以在一定程度上延缓病人病情的恶化，但不能彻底清除患者体内的病毒，大部分病人一直生活在病毒低水平复制的状态中，长期用药患者易产生耐药性，而且一旦停止用药，病人体内的病毒水平很快又恢复到甚至超过用药前的水平。同时这些药物在杀伤病毒的同时，也破坏了身体内正常的生理机能，使病人产生很大的药物反应。且这些药物 价格不菲，很多患者没有能力负担。目前，抗病毒组合疗法(又称鸡尾酒疗法)是临床上较为有效的疗法。该疗法是让病人同时服用作用于不同靶点的多种药物，主要组合为HIV-1逆转录酶抑制剂和蛋白水解酶抑制剂，从而对病毒的复制产生多重抑制。其疗效明显优于单药处方，并能延缓药物抗药性的产生。但它用药剂量大，药物与药物之间相互作用而产生的副作用往往使病人难以忍受；更重要的是昂贵的价格使得病人特别是发展中国家的病人难以忍受。
在HIV的复制循环中，逆转录酶(RT)在完成RNA指导的DNA合成、RNA水解反应和DNA指导的DNA合成过程中起着十分重要的作用。因此，HIV逆转录酶是抗艾滋病药物发展中的一个重要生物靶点。逆转录酶抑制剂分为核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂两类。核苷类逆转录酶抑制剂是合成DNA的天然底物的衍生物，通过阻断病毒RNA的逆转录，即阻止病毒双链DNA形成，病毒失去复制的模板而起作用。它们首先进入被感染的细胞，然后磷酸化，形成具有活性的三磷酸化合物。这些三磷酸化合物是HIV逆转录酶的竞争抑制剂，当插入长的DNA链时，可导致病毒DNA合成受阻，从而抑制病毒复制，长期大剂量使用可使CD4+细胞计数升高。属于NRTIs的抗人免疫缺陷综合征病毒药物共有9个品种，即齐多夫定(AZT)、去羟肌苷(ddI)、扎西他滨(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韦(abacavir)、泰诺福韦(tenofovir)及复合制剂双肽芝-combivir(AZT+3TC)和三协维-trivizir(AZT+3TC+ABC)。它们作用于逆转录酶与天然底物核苷结合的活性部位，但这些核苷类药物也抑制宿主细胞DNA的多聚酶活性，因此具有依赖剂量的特异毒性。
非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)是一组与核苷无关、化学结构完全不同的特异性抑制HIV-1逆转录酶的化合物，但对HIV-2无活性。这组化合物的共同特点是：可高度抑制HIV-1，但并不抑制HIV-2和其他逆转录病毒；不是HIV-1逆转录酶底物竞争抑制剂，而是通过与酶活性点附近的p66疏水区结合，并取代聚合酶结合位点的具有催化作用的天门冬氨酸残基，而达到抑制HIV-1复制的作用；不抑制其他的DNA聚合酶，故毒性很小，有很高的抗病毒选择指数，缺点是体内外使用迅速产生耐药毒株。这类药物多半与核苷类药物联合应用。属于NNRTIs的抗人免疫缺陷综合征毒药物共有3个，即奈韦拉平(Neviapine)、地拉韦啶(Delavirdine)及依非韦伦(Efavirenz)，它们抑制HIV-1的作用很强，但对HIV-2和猴艾滋病毒(SIV)均无抑制活性。这类药物易产生耐药性，只需一个核苷酸变异，即产生耐药，且与其他NNRTIs产生交叉耐性。由于抑制HIV-1作用强，依非韦伦被选为一线药物，与其他NRTIs联合用药。
非核苷类逆转录酶抑制剂具有结构多样、高效、低毒以及与其他药物的协同作用等特性，加之药物作用位点明确，酶的结构清楚，因而一直是寻找新的抗艾滋病毒药物的重要方向之 一。1-〔(2-羟基乙氧基)-甲基〕-6-(苯硫代)胸腺嘧啶(HEPT)类化合物作为NNRTIs的典型代表，显示出较强的抗交叉耐药性，已成为国内外药物研究的重点。发明人以非核苷类逆转录酶抑制剂HEPT为先导化合物，结合进入临床实验的药物MKC-442和TNK-651，根据生物电子等排原理和氢键作用等理论，设计出了一类相关结构的新分子。使化合物的嘧啶环5位取代基的体积增大同时改变其电性效应，从而更好地与HIV-1逆转录酶的疏水性口袋上部的芳香族氨基酸Tyr181、Tyr188、Trp229等的芳环相互作用，影响酶的构象而产生对酶的抑制作用，而使合成的化合物抗HIV-1逆转录酶的活性更高。
3.发明内容
发明人以非核苷类逆转录酶抑制剂HEPT为先导化合物，按照药物合理设计中先导化合物优化的方法，根据生物电子等排原理和氢键作用理论等设计了一类新型化合物，从而得到一类生物活性更好的HIV-1逆转录酶抑制剂。
本发明涉及以非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂HEPT为先导物，设计出了一类新型结构化合物，并对其进行结构修饰，使新化合物的构象与HIV-1逆转录酶结合后，更有利于其抑制HIV-1逆转录酶的活性，从而成为活性更好的新一类HIV-1逆转录酶抑制剂。化合物4位氨基可以通过互变异构形成更多数目的氢键，使与逆转录酶的作用力增强；增大5位取代基的体积更有利于发挥它的立体位阻作用使得化合物6位芳环转位，同时改变其电性效应，从而更好地与HIV-1逆转录酶的疏水性口袋上部的芳香族氨基酸的芳环相互作用，形成更强的作用力，影响酶的构象而更好地产生对酶的抑制作用。进一步涉及对化合物的逆转录酶活性评价及此类化合物作为HIV-1逆转录酶抑制剂的应用。
本发明的部分化合物可按照以下合成路线制备，通过下列反应式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
4.具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。如无特殊说明，下述实施例中“减压旋干溶剂”一般指“水泵减压条件下用旋转蒸发仪蒸干溶剂”。
实施例13-氧代-4-(3，5-二甲基)-苯基丁酸乙酯的制备(化合物1)
将活化后的锌粉(依次用3N的盐酸、蒸馏水、无水乙醇、无水乙醚洗涤，后真空干燥)混悬于干燥的THF(125ml)中加热回流，滴入20滴溴代乙酸乙酯，当浑浊溶液呈现灰绿色(约45分钟)时，一次性加入3，5-二甲基苄腈(1.305g，9.0mmol)，再在大约1小时的时间里慢慢地滴加溴代乙酸乙酯(4.95ml，45mmol)，滴加完毕后再回流10分钟。用THF(125ml×3)稀释，加入碳酸钾水溶液(50％，54ml)快速搅拌45分钟，静置分层，形成两相。倒出上层THF相，剩下的部分用THF(2x100ml)洗涤，合并THF相加入盐酸(10％，50ml)在室温下搅拌45分钟。然后加入NaHCO3粉末调节PH≈7，静置分层，取上层有机层，用旋转蒸发仪减压旋干THF的暗红色物质。加入二氯甲烷(300ml)稀释，用饱和NaHCO3溶液(200ml)洗涤，然后无水NaSO4干燥。用旋转蒸发仪减压旋干二氯甲烷，得到红色油状产物3-氧代-4-(3，5-二甲基)苯基丁酸乙酯。
MS(ESI+)m/z：235.1[M+H]+，257.1[M+Na]+
实施例22-硫代-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物2)
将4.54g(197.5mmol)金属钠溶于无水乙醇108ml中，加入10.54g(136mmol)硫脲和2.10g(9.0mmol)化合物1，反应混合物加热回流6小时。在40～50℃减压旋至几乎全干，剩余物溶于水(80ml)中。加入浓盐酸(20ml)析出沉淀，加冰醋酸调节pH≈4，用抽滤漏斗过滤出沉淀，用10％EtOH溶液洗涤，干燥后得白色固体2-硫代-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶2.098g(化合物2)，两步总产率94.7％，mp 253～255℃。
MS(ESI+)m/z：247.1[M+H]+，269.1[M+Na]+
实施例36-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物3)
将2-硫代-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶(2.098g，8.53mmol)溶于10％的氯乙酸(150ml)中，加热回流24小时。冷却至室温，析出白色针状固体，用抽滤漏斗过滤出此固体，依次用冷乙醇和冷乙醚洗涤，干燥，最后得到白色固体6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶1.258g，产率64.2％，mp 288～290℃。
MS(ESI+)m/z：231.1[M+H]+，253.1[M+Na]+
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：11.69(s，1H，N3-H)，10.93(s，1H，N1-H)，6.92～6.90(m，3H，Ph-H)，5.22(s，1H，C5-H)，3.54(s，2H，CH2)，2.25(s，6H，Ph-CH3).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ：21.31(CH2Ph)，37.90(CH2Ph)，99.24(C-5)，156.18(C-6)，152.07(C-2)，164.57(C-4)，138.00，136.38，128.84，127.19(Carom).
实施例45-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物7)
将92mg(0.4mmol)6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于3ml冰醋酸中，后加入52.6mg(0.22mmol)PbO2，55.8mg(0.22mmol)I2，50℃加热反应12小时，后向反应液中加入8ml冰醋酸，使反应物全溶，用抽滤漏斗过滤出不溶物质，并用少量冰醋酸及水洗涤。滤渣用甲醇溶解，滤出黑色物体后旋干甲醇得目标化合物；滤液中加入120ml H2O，立即有白色棉絮状物质出现，用抽滤漏斗过滤出白色物质，并用H2O洗涤数次，最后用冷的乙醚洗涤，使之干燥置于真空干燥器中保存。最后共得标题化合物125mg，产率88％，mp 281～282℃。
MS(ESI+)m/z：357.2[M+H]+，379.2[M+Na]+
实施例55-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物8)
将92mg(0.4mmol)6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于3ml冰醋酸中，后加入52.6mg(0.22mmol)PbO2，40μl液体Br2。室温反应2小时后向反应液中加入8ml冰醋酸，使反应物全溶，用抽滤漏斗过滤出不溶物质，并用少量冰醋酸及水洗涤。滤渣用甲醇溶解，滤出黑色物体后旋干甲醇得目标化合物；滤液中加入120ml H2O，立即有白色棉絮状物质出现，用抽滤漏斗过滤出白色物质，并用H2O洗涤数次，最后用冷的乙醚洗涤，使之干燥，置于真空干燥器中保存。最后共得标题化合物104.6mg，产率84.9％，mp 278～281℃。
MS(ESI+)m/z：309.2[M+H]+，331.1[M+Na]+
实施例61-乙氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物9)
将71.2mg(0.2mmol)5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于5ml无水CHCl3中，后加入0.206ml(0.7mmol)BSA中，室温反应60分钟后加入23.4μl(0.24mmol)ClCH2OCH2CH3和26.8mg(0.2mmol)LiI，室温再反应120分钟后向反应液中加入12ml饱和NaHCO3溶液终止反应，后加入25ml CH2Cl2进行萃取，H2O层再用2×25ml CH2Cl2进行萃取，合并有机层，以无水Na2SO4干燥过夜。过滤除去Na2SO4，旋干溶剂，得白色固体。常压柱层析分离产物，乙酸乙酯/石油醚洗脱(1∶5)，最后共得标题化合物56mg，产率67.6％，mp 177～178℃。
MS(ESI+)m/z：415.1[M+H]+，437.7[M+Na]+
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：9.29(s，1H，N3-H)，6.96(s，1H，C6-Ar-H4)，6.79(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.25(s，2H，NCH2O)，4.51(s，2H，CH2Ar)，3.65(q，2H，J＝7Hz，OCH2CH3)，2.325(s，6H，CH3Ph)，1.23(t，3H，J＝7Hz，OCH2CH3).
13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：15.06(OCH2 CH 3 )，21.35(CH 3 Ar-C6)，41.92(CH 2 Ar-C6)，65.39(C-5)，74.05(OCH 2 CH3)，79.07(NCH 2 O)，151.52(C-2)，156.33(C-6)，160.13(C-4)，139.08，133.30，129.33，125.13(Carom).
实施例71-苄氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物10)
将95mg(0.27mmol)5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于5ml无水CHCl3中，后加入0.275ml(0.945mmol)BSA中，室温反应60分钟后加入83μl(0.405mmol)ClCH2OCH2Ph和35.8mg(0.27mmol)LiI，室温再反应180分钟后向反应液中加入15ml饱和NaHCO3溶液终止反应，后加入30ml CH2Cl2进行萃取，H2O层再用2×30ml CH2Cl2进行萃取，合并有机层，以无水Na2SO4干燥过夜。过滤除去Na2SO4，旋干溶剂，得微黄固体。常压柱层析分离产物，乙酸乙酯/石油醚洗脱(1∶4)，最后共得标题化合物108mg，产率85.0％，mp 166～167℃。
MS(ESI+)m/z：477.3[M+H]+
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：9.11(s，1H，N3-H)，7.41～7.29(m，5H，N1-Ph-H)，6.94(s，1H，C6-Ar-H4)，6.72(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.33(s，2H，NCH2O)，4.68(s，2H，OCH2Ph)，4.49(s，2H，CH2Ar)，2.31(s，6H，CH3Ph).
13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：21.35(CH3Ph)，41.99(CH2Ar-C6)，72.07(C-5)，74.00(OCH2Ph)，79.14(NCH2O)，151.41(C-2)，156.11(C-6)，159.93(C-4)，139.08，136.97，133.21，129.36，128.58，128.23，127.88，127.69，127.03，125.11(Carom).
实施例81-乙氧甲基-5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物11)
将92.4mg(0.2mmol)5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于5ml无水CHCl3中，后加入0.309ml(1.05mmol)BSA中，室温反应60分钟后加入35.1μl(0.36mmol)ClCH2OCH2CH3和40mg(0.3mmol)LiI，室温再反应60分钟后向反应液中加入20ml饱和NaHCO3溶液终止反应，后加入30ml CH2Cl2进行萃取，H2O层再用2×30ml CH2Cl2进行萃取，合并有机层，以无水Na2SO4干燥过夜。过滤除去Na2SO4，旋干溶剂，得白色固体。常压柱层析分离产物，乙酸乙酯/石油醚洗脱(1∶5)，最后共得标题化合物90mg，产率81.9％，mp 192～193℃。
MS(ESI+)m/z：367.1[M+H]+，389.1[M+Na]+
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：9.30(s，1H，N3-H)，6.95(s，1H，C6-Ar-H4)，6.80(s，2H，C6-Ar -H2，5)，5.23(s，2H，NCH2O)，4.41(s，2H，CH2Ar)，3.66(q，2H，J＝7Hz，OCH2CH3)，2.32(s，6H，CH3Ph)，1.24(t，3H，J＝7Hz，OCH2CH3).
13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：15.05(OCH2 CH 3 )，21.33(CH 3 Ar-C6)，37.33(CH 2 Ar-C6)，65.40(OCH 2 CH3)，73.74(NCH 2 O)，101.83(C-5)，151.07(C-6)，153.44(C-2)，158.91(C-4)，139.08，133.35，129.33，125.21(Carom).
实施例91-苄氧甲基-5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物12)
将61.6mg(0.2mmol)5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于5ml无水CHCl3中，后加入0.204ml(0.7mmol)BSA中，室温反应60分钟后加入50μl(0.24mmol)ClCH2OCH2Ph和26.5mg(0.2mmol)LiI，室温再反应120分钟后向反应液中加入12ml饱和NaHCO3溶液终止反应，后加入25mlCH2Cl2进行萃取，H2O层再用2×25ml CH2Cl2进行萃取，合并有机层，以无水Na2SO4干燥过夜。过滤除去Na2SO4，旋干溶剂，得微黄固体。常压柱层析分离产物，乙酸乙酯/石油醚洗脱(1∶4)，最后共得标题化合物96mg，产率75.9％，mp 155～159.5℃。MS(ESI+)m/z：429.3[M+H]+，451.3[M+Na]+
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：9.39(s，1H，N3-H)，7.41～7.29(m，5H，N1-Ph-H)，6.94(s，1H，C6-Ar-H4)，6.72(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.31(s，2H，NCH2O)，4.69(s，2H，OCH2Ph)，4.39(s，2H，CH2Ar)，2.30(s，6H，CH3Ph).
13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：21.32(CH3Ph)，37.37(CH2Ar-C6)，72.07(OCH2Ph)，73.68(NCH2O)，101.92(C-5)，151.04(C-6)，153.20(C-2)，158.83(C-4)，139.07，136.94，133.28，129.36，128.58，128.46，127.90，127.82，127.77，125.19(Carom).
实施例101-乙氧甲基-5-N，N-二甲基氨基6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物13)
将82.8mg(0.2mmol)1-乙氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于2.4ml 1，4-二氧六环中，后加入2.4ml 33％NH(CH3)2水溶液，将高压反应釜置于80℃烘箱中。加热反应72小时后，取出反应釜。反应液旋干，加入25ml CH2Cl2溶解，然后以10ml水进行萃取，水层以25ml×2CH2Cl2进行再次萃取。CH2Cl2层合并，旋干，薄层层析分离，得目标化合物18mg，产率27.2％，mp 171～173℃。
MS(ESI+)m/z：332.4[M+H]+，354.4[M+Na]+
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：8.77(s，1H，N3-H)，6.90(s，1H，C6-Ar-H4)，6.74(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.11(s，2H，NCH2O)，4.36(s，2H，CH2Ar)，3.42(q，2H，J＝7.05Hz，OCH2CH3)，2.74 (s，6H，CH3N-C5)，2.31(s，6H，CH3Ph)，1.22(t，3H，J＝7.05Hz，OCH2CH3).
13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：15.06(OCH2 CH 3 )，21.29(CH 3 Ar-C6)，32.10(CH 2 Ar-C6)，43.66(CH3N-C5)，65.02(OCH 2 CH3)，73.17(NCH 2 O)，126.52(C-5)，151.47(C-6)，153.16(C-2)，161.11(C-4)，138.66，136.18，128.53，125.20(Carom)
实施例111-苄氧甲基-5-N，N-二甲基氨基-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物14)
将95.2mg(0.2mmol)1-苄氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶溶于2ml 1，4-二氧六环中，后加入2ml 33％NH(CH3)2水溶液，将高压反应釜置于80℃烘箱中。加热反应40小时后，取出反应釜。反应液旋干，加入20ml CH2Cl2溶解，然后以10ml水进行萃取，水层以20ml×2CH2Cl2进行再次萃取。CH2Cl2层合并，旋干，薄层层析分离，得目标化合物20mg，产率25.4％，mp 152～153℃。
MS(ESI+)m/z：394.5[M+H]+，416.5[M+Na]+
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.97(s，1H，N3-H)，7.40～7.31(m，5H，N1-Ph-H)，6.88(s，1H，C6-Ar-H4)，6.66(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.20(s，2H，NCH2O)，4.67(s，2H，OCH2Ph)，4.34(s，2H，CH2Ar)，2.72(s，6H，CH3N-C5)，2.28(s，6H，CH3Ph).
13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：21.29(CH3Ph)，32.07(CH 2 Ar-C6)，43.62(CH 3 N-C5)，71.90(OCH 2 CH3)，73.31(NCH 2 O)，126.61(C-5)，151.55(C-6)，152.91(C-2)，161.12(C-4)，138.65，137.44，136.07，128.49，128.00，127.74，125.19(Carom)
实施例121-乙氧甲基-4-氨基-5-碘6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物15)
将1，2，4-1H-三氮唑69mg(1mmol)溶于2.0ml无水CH3CN中，冰浴条件下加入重蒸的POCl3 45μl(0.5mmol)。十分钟后，加入1-乙氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶20.7mg(0.05mmol)和无水三乙胺液体0.45ml(1.48mmol)，撤掉冰浴，室温反应。60分钟后溶液呈现暗红色浑浊，加入1ml浓氨水(25％-28％)。180分钟后，溶液中加入10ml EtOAc，然后加入5ml蒸馏水进行萃取，水层以10ml×2EtOAc再次萃取。合并乙酸乙酯层，旋干，薄层层析板分离，得白色固体16.2mg，产率78％，mp 113-115℃。
MS(ESI)m/z：414.3[M+1]+，436.3[M+Na]+
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：8.48(br，2H，NH2-C4)，6.89(s，1H，C6-Ar-H4)，6.73(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.17(s，2H，NCH2O)，4.31(s，2H，CH2Ar)，3.49(q，2H，J＝7Hz，OCH2CH3)，2.24(s，6H，CH3Ph)，1.04(t，3H，J＝7Hz，OCH2CH3).
13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ：15.32(OCH2 CH 3 )，21.37(CH 3 Ar-C6)，41.66(CH 2 Ar-C6)，64.34(OCH 2 CH3)，67.55(C-5)，74.26(NCH 2 O)，156.28(C-6)，157.05(C-2)，164.75(C-4)，138.48，135.01，128.86，125.44(Carom).
实施例131-苄氧甲基-4-氨基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物16)
将1，2，4-1H-三氮唑69mg(1mmol)溶于2.0ml无水CH3CN中，冰浴条件下加入重蒸的POCl3 45μl(0.5mmol)。十分钟后，加入1-苄氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶23.8mg(0.05mmol)和无水三乙胺液体0.45ml(1.48mmol)，撤掉冰浴，室温反应。60分钟后溶液呈现暗红色浑浊，加入1ml浓氨水(25％-28％)。120分钟后，溶液中加入10ml EtOAc，然后加入5ml蒸馏水进行萃取，水层以10ml×2EtOAc再次萃取。合并乙酸乙酯层，旋干，薄层层析板分离，得白色固体13.5mg，产率56.8％，mp 129-129.5℃。
MS(ESI)m/z：476.4[M+1]+，498.3[M+Na]+
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：8.59(br，2H，NH2-C4)，7.36～7.28(m，5H，N1-Ph-H)，6.88(s，1H，C6-Ar-H4)，6.65(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.23(s，2H，NCH2O)，4.55(s，2H，OCH2Ph)，4.29(s，2H，CH2Ar)，2.21(s，6H，CH3Ph).
实施例141-乙氧甲基-4-氨基-5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶的制备(化合物17)
将1，2，4-1H-三氮唑69mg(1mmol)溶于2.0ml无水CH3CN中，冰浴条件下加入重蒸的POCl345μl(0.5mmol)。十分钟后，加入1-乙氧甲基-5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶18.3mg(0.05mmol)和无水三乙胺液体0.45ml(1.48mmol)，撤掉冰浴，室温反应。5小时后溶液呈现暗红色浑浊，加入1ml浓氨水(25％-28％)。4小时后，溶液中加入10ml EtOAc，然后加入5ml蒸馏水进行萃取，水层以10ml×2EtOAc再次萃取。合并乙酸乙酯层，旋干，薄层层析板分离，得白色固体17.7mg，产率91％，mp 111-112℃。
MS(ESI)m/z：366.3[M+1]+，388.3[M+Na]+
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：8.56(br，2H，NH2-C4)，6.89(s，1H，C6-Ar-H4)，6.75(s，2H，C6-Ar-H2，5)，5.15(s，2H，NCH2O)，4.22(s，2H，CH2Ar)，3.50(q，2H，J＝7.05Hz，OCH2CH3)，2.24(s，6H，CH3Ph)，1.04(t，3H，J＝7.05Hz，OCH2CH3).
13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ：15.31(OCH2 CH 3 )，21.35(CH 3 Ar-C6)，37.22(CH 2 Ar-C6)，64.32(OCH 2 CH3)，74.08(NCH 2 O)，91.68(C-5)，154.14(C-6)，155.67(C-2)，162.66(C-4)，138.47，134.99，128.89，125.48(Carom).
实施例15对所合成的化合物进行HIV-1逆转录酶的生物活性评价
一实验原理
1.逆转录酶：
逆转录酶是以单链RNA为模板，合成双链DNA的DNA聚合酶。是多功能酶，拥有分别以RNA或DNA为模板合成聚合酶及核糖核酸酶H活性。
2.核苷酸微孔板共价键交联
核酸分子杂交按作用环境分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸固定在固相支持物上，另一条核酸反应链游离在溶液中。本实验将作为引物的oligo(dT)15的5’端磷酸化后与NUNC公司的96孔氨基板的表面发生共价交联，从而使反应在固相支持物上进行。
CovaLinkTM NH：是一种在聚苯乙烯的表面附有NH2基团的微孔板。在微孔表面大约含有1014个NH2基团/cm2，蛋白质和多肽可以通过C端或N端结合到微孔板上，核苷酸的5’端磷酸化后可以结合到微孔板表面上，使得整个反应在固相支持物上进行。
3.反应原理：
以oligo(dT)15为引物，poly A(mRNA 3’端聚腺苷酸)为模板，dTTP和生物素标记的dUTP为底物，在逆转录酶的作用下，掺入合成DNA。生物素标记的dUTP和碱性磷脂酶(ALP)标记的链亲合素(SA)特异性结合，而与链亲和素共轭的碱性磷脂酶与PNPP能发生显色反应，在405nrn可根据吸光度的大小，判定逆转录酶的反应活性。
二材料与方法
2.1材料与仪器
HIV-1逆转录酶HIV-1 RT为基因工程重组酶；AMV逆转录酶(AMV-RT)由SIGMA公司提供；膦甲酸钠(PFA，由江苏正大天晴制药有限公司生产，批号：0406012)；奈韦拉平(NVP，上海迪赛诺制药有限公司，批号：DH027-4-0409016)。Oligo(dT)15(5’末端磷酸化的寡聚胸苷，由大连宝生物工程有限公司合成)；96孔酶标板(CovaLink NH，丹麦NUNC公司)；biotin-11-dUTP(生物素标记的三磷酸脱氧尿苷，上海申友)，其它试剂均为进口试剂。酶标仪(Bio-Rad，BenchmarkPlus，USA)。
2.2实验方法
2.2.1Oligo(dT)15包被板的制备
将Oligo(dT)15溶于100mM的1-甲基-咪唑的盐酸缓冲液中(pH 7.4)，加入96孔酶标板中，与水溶性碳化二亚胺混匀，于50℃水浴中反应4小时，反应结束后用洗液(50mmol/LTris-HCl，pH 7.5)洗三遍，除去未结合的Oligo(dT)15，将包被后的96孔板置4℃保存。
2.2.2HIV-1 RT活性检测
反应系统总体积为100ul，含50mmol/L Tris-HCl，pH8.3，3mmol/L MgCl2，75mmol/LKCl，5mmol/L DTT，0.13mg/ml BSA(小牛血清白蛋白)，10ug/ml poly(A)，0.75μMbiotin-11-dUTP，1.5μM dTTP及适量酶，37℃水浴1小时，用洗液(50mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.15mol/L NaCl，0.05mmol/L MgCl2，0.02％Tween20)洗三次，除去未结合的游离底物；每孔加入100ul 1％BSA，室温封闭30分钟，阻止生物素与链亲和素蛋白的非特异性结合，洗板；每孔加入50μl的SA-ALP稀释液(100ng/ml)，37℃水浴1小时，洗板；每孔加入50μl PNPP(1mg/ml，pH＝9.5)，37℃水浴30分钟；每孔加入0.5mol/L的NaOH终止反应，酶标仪测定405nm波长处A值，以确定HIV-1RT的活性；同时设置不加酶的阴性对照，计算实验孔A值/阴性孔A值(P/N值)。
三实验结果(见表1)
表1
| 化合物编号 | R | R1 | R2 | R3 | IC50(μM) |
| 9 | O | I | CH3 | OH | 0.1162 |
| 10 | O | I | Ph | OH | 0.0034 |
| 11 | O | Br | CH3 | OH | 0.2106 |
| 12 | O | Br | Ph | OH | 0.0439 |
| 13 | O | N(CH3)2 | CH3 | OH | 0.0399 |
| 14 | O | N(CH3)2 | Ph | OH | 0.0214 |
| 15 | O | I | CH3 | NH2 | 64.1731 |
| 16 | O | I | Ph | NH2 | 7.2176 |
| 17 | O | Br | CH3 | NH2 | 126.4628 |
| 18 | O | Br | Ph | NH2 | 16.3383 |
| NVP (奈韦拉平) | 7.9248 |
由上表实验结果可看出，C4位为羟基时活性比C4位为氨基普遍要好；进一步分析C4位为羟基的化合物：在C5位上的取代基相同时，N1位连有苄氧甲基的化合物比N1乙氧甲基化合物对HIV-1逆转录酶的抑制率高，从docking对接分析原因可能是苄氧甲基的苯环与周围氨基酸形成较强的共轭作用，使与HIV-1逆转录酶结合更加稳定；而当N1位上的取代基相同时，C5位连有碘时化合物的活性最高，二甲氨次之，溴相对较弱。在上述化合物中，化合物9、10、11、12、13、14这六个化合物的活性比奈韦拉平(NVP)高出38-2319倍。可深入研究此类化合物的构效关系，以便合成出活性更高的抗HIV-1逆转录酶的化合物。
Claims (4)
1.通式I化合物
其中，R1为I，Br，N(CH3)2；
R2为Me，Ph；
R3为OH；
R为O。
2.如权利要求1所述的通式I化合物，其选自如下化合物：
1-苄氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶，1-乙氧甲基-5-碘-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶，1-乙氧甲基-5-溴-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-N，N-二甲基氨基-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶，1-乙氧甲基-5-N，N-二甲基氨基-6-(3，5-二甲基)-苄基尿嘧啶。
3.如权利要求2所述化合物的制备方法：
4.如权利要求1或2所述化合物在制备抗HIV药物中的应用。
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