CN102294208B - 一种聚乙烯醇和二氧化硅复合包被多孔磁珠的制备方法及应用 - Google Patents

一种聚乙烯醇和二氧化硅复合包被多孔磁珠的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多孔磁珠制备方法及其应用，目的在于提供一种有机材料和无机材料共同包被的多孔磁性微珠的制备方法，提高包覆体的稳定性和磁珠有效吸附面积，并增加被修饰活性基团的种类。

Description

一种聚乙烯醇和二氧化硅复合包被多孔磁珠的制备方法及应用
技术领域
本发明属于磁性微珠制备的技术领域，具体涉及一种聚乙烯醇和二氧化硅复合包被多孔磁珠的制备方法及其应用。
背景技术
磁性微珠是指通过适当的方法使各种含活性功能基团的有机高分子材料与无机磁性物质结合起来，形成具有一定磁性及特殊表面结构的微球。磁性微珠的研究始于20世纪70年代，它除了具有一般磁性微粒的性质外，还可以通过共聚合和表面改性等化学反应赋予磁性微珠表面多种活性功能基团，如COOH、COH、NH2、OH等，也可以通过共价键结合生物激素、细胞、抗体等生物活性物质，并可在外加磁场的作用下方便迅速地定位、导向和分离。与传统的分离技术相比，该方法将分离与富集结合于一体，其较大的比表面积大大提高了分离过程中反应物之间相互作用的动力学速度，具有高效、快速、非玷污等优点。磁性微珠已广泛应用于磁性材料、生物医学、生物工程、有机与生化合成等方面。
目前无机磁性微粒的种类很多，较常用的有：金属合金(Fe、Co、Ni)、氧化铁(γ Fe2O3，Fe3O4)、铁氧体(CoFe2O4，BaFe12O19)、氧化铬(CrO2)和氮化铁(Fe4N)等。其中Fe3O4是应用最多的磁性颗粒，它很容易在水溶液中通过共沉淀或氧化共沉淀法制备，其粒度、形状和组成可以通过调节反应条件得到控制。常用作提供活性功能基团的包覆材料有天然生物大分子材料、合成高分子材料和无机材料。天然生物大分子材料一般有纤维素及其衍生物、琼脂糖、乳清蛋白、牛血清蛋白、明胶、壳聚糖等；合成高分子材料有聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、硅烷衍生物等；无机材料有SiO2、Au等。其中天然高分子材料因具有价廉易得、生物相容性好、易被生物降解等优点，得到了广泛的研究和应用。
在磁性微珠制备中存在的几个相关而又急于解决的问题是：(1)发展和完善磁性微珠的制备方法，进一步研究不同结构的磁性微珠的制备方法，探索制备工艺、反应参数、原料配比等对所制备磁性微珠结构和性能的影响。在此基础上，探索各种用途的磁性微珠的最佳制备方法和工艺条件；(2)磁响应性与粒径的关系问题磁性微珠的突出特点是在外加磁场的作用下能定向移动，为了能够迅速、简便的分离，微珠本身应具有较高的磁响应性。提高磁响应性最简单的方法是制备大粒径的磁性微珠，但是粒径增大，微珠比表面积将降低，对蛋白质、酶等物质的吸附量将减少，而且在实际操作应用中易沉降；小粒径微珠虽具有高的比表面积，但进行磁分离时需较高的外加磁场。因此，高磁响应性、高比表面、低密度、单分散的微珠是未来磁性微珠制备的目标；(3)提高磁性微珠的稳定性目前开发出的磁性微珠用作固相载体存在着两大缺点。首先，因磁性微珠在不同的溶剂和温度下溶胀、收缩或溶解而使反应活性点容易被包理或失去；其次，在使用过程中，因外层包覆体不够稳定而失去部分磁性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有机材料和无机材料共同包被的多孔磁性微珠的制备方法，提高包覆体的稳定性和磁珠有效吸附面积，并增加被修饰活性基团的种类。
所述制备方法为：将聚合度为1500-2500的聚乙烯醇溶解在去离子水中，按重量比为聚乙烯醇∶水＝1-8g∶100g，40-100℃下搅拌混合20-60分钟，取SiO2溶胶，用HCl将其pH调节至4-5，以聚乙烯醇与二氧化硅的重量比为0.3-5的比例，把聚乙烯醇溶液和二氧化硅溶液配制在一起，40-100℃下搅拌混合20分钟-3小时，浓缩形成聚乙烯醇和二氧化硅的复合物溶胶，取四氧化三铁颗粒，平均粒径20nm，加入上述复合物溶胶，充分搅拌混合后，收集颗粒，用去离子水清洗两次，120℃电热鼓风干燥机中干燥。磁珠孔径大小可以通过聚乙烯醇聚合度以及与二氧化硅的比例调节，孔径为2-8nm，平均孔径6nm。
附图说明
图1磁珠提取100bp核酸片段凝胶电泳
M：Marker；1：100bp PCR产物；2-6：磁珠法回收的100bp PCR产物
图2磁珠提取500bp核酸片段凝胶电泳
M：Marker；1：500bp PCR产物；2、3：磁珠法回收的500bp PCR产物
具体实施方式
实施例1磁流体的制备
将二价铁盐和三价铁盐溶液以1∶2(或更大)比例混合。Fe2+容易被氧化成Fe3+，加入的Fe2+稍过量，可以避免由于Fe3+/Fe2+摩尔比偏离理论值，引起晶格发生畸变和粒径变大。在一定温度和pH值及氮气保护下加入2～3倍NH3·H2O或NaOH，高速搅拌进行沉淀，将沉淀洗涤、过滤、干燥、烘干，制得纳米微米级的Fe3O4颗粒。
实施例2聚乙烯醇和二氧化硅复合物溶胶的制备
将聚合度为1500的聚乙烯醇溶解在去离子水中，按重量比为聚乙烯醇∶水＝1.5g∶100g，50℃下搅拌混合60分钟，取SiO2溶胶，用HCl将其pH调节至4，以聚乙烯醇与二氧化硅的重量比为1∶1的比例，把聚乙烯醇溶液和二氧化硅溶液配制在一起，50℃下搅拌混合3小时，浓缩形成聚乙烯醇和二氧化硅的复合物溶胶。
将聚合度为2000的聚乙烯醇溶解在去离子水中，按重量比为聚乙烯醇∶水＝8g∶100g，100℃下搅拌混合30分钟，取SiO2溶胶，用HCl将其pH调节至5，以聚乙烯醇与二氧化硅的重量比为5∶1的比例，把聚乙烯醇溶液和二氧化硅溶液配制在一起，100℃下搅拌混合40分钟，浓缩形成聚乙烯醇和二氧化硅的复合物溶胶。
实施例3磁性微珠的制备
在制得分散性良好的磁流体后，将其重悬于pH＝5的乙酸溶液。以1∶1比例分别加入上述两种复合物溶胶中，充分搅拌混合后，收集颗粒，用去离子水清洗两次，120℃电热鼓风干燥机中干燥。
实施例4磁珠吸附核酸实验
1.结合液(Binding buffer)分别与100bp或500bp的PCR产物9∶1混合，总体积150ul，加入磁珠1mg；
2.室温孵育20min，磁分离，弃去上清液；
3.洗涤液(washing buffer)洗涤磁珠，磁分离，弃去上清液；
4.洗脱液(Elution buffer)洗脱DNA，56度孵育10min，收集洗脱液，1％agarose gel。
观察核酸提取效率，实验结果如附图1和图2所示。
实施例5磁珠稳定性实验
将磁珠置于60℃恒温干燥箱内14天后，同新制备的磁珠一起同时进行HBV(乙肝病毒)DNA提取并用荧光定量PCR检测，结果如表1所示：
表1
 PCR孔号   磁珠   Ct值
  1   Normal   21.1979
  2   Normal   21.5422
  3   Normal   21.4279
  4   Normal   21.8066
  5   60℃，2weeks   21.5894
  6   60℃，2weeks   21.9784
  7   60℃，2weeks   22.3042
  8   60℃，2weeks   22.0257
表中前四个为新制备磁珠，后四个为60℃干燥14天的磁珠，从定量PCR结果可以看出，磁珠并未发生任何变化，定量结果前后非常重复。

Claims (4)

1.一种多孔磁珠制备方法，其特征在于：将聚合度为1500-2500的聚乙烯醇溶解在去离子水中，按重量比为聚乙烯醇∶水＝1-8g∶100g，40-100℃下搅拌混合20-60分钟，取SiO2溶胶，用HCl将其pH调节至4-5，以聚乙烯醇与二氧化硅的重量比为0.3-5的比例，将聚乙烯醇溶液和二氧化硅溶液混合，40-100℃下搅拌20分钟-3小时，浓缩形成聚乙烯醇和二氧化硅的复合物溶胶，取四氧化三铁颗粒，平均粒径20nm，加入上述复合物溶胶，充分搅拌混合后，收集颗粒，用去离子水清洗两次，120℃电热鼓风干燥机中干燥。
2.根据权利要求1的制备方法得到的多孔磁珠，孔径为2-8nm，平均孔径6nm。
3.根据权利要求1的方法制备的多孔磁珠在生物物质吸附上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述生物物质是核酸。
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