CN102288705B - 一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学领域，公开了一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法，具体为取罗库溴铵样品，用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解，得到供试品溶液；取溴丙烯对照品，用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解，得到对照品溶液；将对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱法检测，外标法分析测定结果。本发明所述检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法能够检测罗库溴铵产品中溴丙烯含量，检测限为0.044ng。该方法的建立能够在制备罗库溴铵过程中，对溴丙烯残留进行检测，灵敏度高，专属性强，结果准确可靠，从而对罗库溴铵产品质量进行准确的评价，保证罗库溴铵产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体的说是涉及一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法。
背景技术
罗库溴铵，中文名为L-[(2B，3A，5A，16B，17B)-17-(乙酰氧基)-3-羟基-2-(4-吗啉基)雄甾-16-基]-1-丙烯基吡咯铵溴化物，英文名为RocuroniumBromide，简称Roc，分子式为C32H53BrN2O4，分子量为609.6782，其化学结构式如下：
罗库溴铵是目前起效最快的非去极化类肌松药，临床上用于全身麻醉辅助，方便气管插管，维持术中肌松。与其它非去极化药物一样，它竞争性地与运动神经末梢突触上的胆碱能受体结合，以拮抗乙酰胆碱的作用，比琥珀酰胆碱安全，起效快，一般在静脉注射60秒钟后就能为插管提供极好的条件，而且罗库溴铵持续时间比琥珀酰胆碱长，约30min，而琥珀酰胆碱仅10min。
目前罗库溴铵生产工艺中使用较大量的溴丙烯，并且其结构式中接有一分子的溴丙烯，在降解过程中也可能产生结合键断裂还原生成溴丙烯，而溴丙烯残留可能对人体造成伤害。但是，目前尚无针对溴丙烯的检测方法，故无法准确检测罗库溴铵中溴丙烯的含量，因此急需罗库溴铵中溴丙烯含量的检测方法，以对罗库溴铵产品质量进行准确的评价，以确保该产品的质量可靠及用药的安全性。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法，用以检测罗库溴铵中溴丙烯的含量，从而对罗库溴铵产品质量进行准确的评价，保证罗库溴铵产品的质量。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法，包括：
步骤1：取罗库溴铵样品，用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解，得到供试品溶液；
步骤2：取溴丙烯对照品，用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解，得到对照品溶液；
步骤3：将对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱法检测，外标法分析测定结果。
优选的，所述高效液相色谱法色谱条件为以十八烷基硅烷或八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.05mol/L pH5.0的四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，理论板数按溴丙烯峰计算不低于10000。
优选的，所述理论板数按溴丙烯峰计算不低于12000
优选的，所述供试品溶液的溶剂为乙腈和水体积比为6∶4的混合溶液。
优选的，所述供试品溶液的浓度为10mg/mL。
优选的，所述对照品溶液的溶剂为乙腈和水体积比为6∶4的混合溶液。
优选的，所述对照品溶液的浓度为10μg/mL。
经由上述的技术方案可知，本发明所述检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法能够检测罗库溴铵产品中溴丙烯含量，检测限为0.044ng。该方法的建立能够在制备罗库溴铵过程中，对溴丙烯残留进行检测，灵敏度高，专属性强，结果准确可靠，从而对罗库溴铵产品质量进行准确的评价，保证罗库溴铵产品的质量。
附图说明
图1所示为溴丙烯对照品紫外扫描图；
图2所示为本发明实施例2中溴丙烯检测的色谱图；
图3所示为本发明实施例3中以乙腈为溶剂对罗库溴铵样品进行检测的色谱图；
图4所示为本发明实施例3中以乙腈-水(9∶1)为溶剂对罗库溴铵样品进行检测的色谱图；
图5所示为本发明实施例3中以乙腈-水(6∶4)为溶剂对罗库溴铵样品进行检测的色谱图；
图6所示为本发明实施例3中以水为溶剂对罗库溴铵样品进行检测的色谱图；
图7所示为本发明实施例3中以pH5.0的0.05mol/L四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为溶剂对罗库溴铵样品进行检测的色谱图；
图8所示为本发明实施例4中以罗库溴铵样品进行强酸试验后制得的样品的色谱图；
图9所示为本发明实施例4中以罗库溴铵样品进行强碱试验后制得的样品的色谱图；
图10所示为本发明实施例4中以罗库溴铵样品进行氧化试验后制得的样品的色谱图；
图11所示为本发明实施例4中以罗库溴铵样品进行高温试验后制得的样品的色谱图；
图12所示为本发明实施例4中以罗库溴铵样品进行光照试验后制得的样品的色谱图；
图13所示为本发明实施例7中溴丙烯含量检测线性关系图；
图14所示为本发明实施例9中测定批号为081201的罗库溴铵样品中溴丙烯含量的色谱图；
图15所示为本发明实施例9中测定批号为081202的罗库溴铵样品中溴丙烯含量的色谱图；
图16所示为本发明实施例9中测定批号为090101的罗库溴铵样品中溴丙烯含量的色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明，所述一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法，包括：
步骤1：取罗库溴铵样品用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液溶解，得到供试品溶液；
步骤2：取溴丙烯对照品用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液溶解，得到对照品溶液；
步骤3：将对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱法检测，外标法分析测定结果。
高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱理论而迅速发展起来的，是目前应用最多的色谱分析方法。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱，又因分析速度快而称为高速液相色谱。HPLC检测具有检测速度快、分辨率和灵敏度高、应用范围广、色谱柱可反复使用、样品量少、容易回收等优点。
高效液相色谱系统中存在两相，一相是固定不动的叫做固定相，另一相则不断流过固定相叫做流动相。HPLC检测就是使用外力使含有待测样品的流动相通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面，待测样品中的各组分与固定相发生相互作用，然后利用待测样品中的组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，待测样品在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出，与适当的柱后检测方法结合，实现待测样品的检测。
按照本发明，所述高效液相色谱法色谱条件为以十八烷基硅烷或八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.05mol/L pH5.0的四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min。试验表明，以0.05mol/LpH5.0的四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min时，溴丙烯与前后峰之间的分离度最佳。
优选的，所述固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，此时溴丙烯峰形较好、保留时间恰当、与前后峰之间的分离度更符合要求。
理论塔板数(theoretical plate number，N)，用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。理论塔板数取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。实验表明，本发明所述检测方法所述理论板数按溴丙烯峰计算不低于10000。优选的，所述理论板数按溴丙烯峰计算不低于12000。
目前HPLC的检测器有紫外光度检测器、光电二极管阵列检测器、荧光检测器和差示折光检测器等，其中，紫外光度检测器是最常用的检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应。它基于待测样品组分对特定波长紫外光的选择性吸收，检测待测样品。紫外检测的关键是波长的选择。本发明所述检测方法采用紫外光度检测器，所述检测波长为210nm。
高效液相色谱分析方法包括内标法、外标法、主成分自身对照法、面积归一化法等，其中，内标法、主成分自身对照法、面积归一化法主要用于测定供试品中杂质的总量限度，外标法用于分析供试品中某个杂质或主成分含量。本发明所述检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法用外标法分析测定结果，按下式计算溴丙烯含量：溴丙烯含量(cX)＝cR(AX/AR)。其中，cX为供试品溶液的浓度；cR为对照品溶液的浓度；AX为供试品峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高。
本发明所述检测方法所述供试品溶液为罗库溴铵样品用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解制得。试验表明，用水-乙腈(4∶6)作为溶剂时，罗库溴铵峰形较好，基线更稳定。因此，本发明所述检测方法所述供试品溶液的溶剂优选为乙腈和水体积比为6∶4的混合溶液。所述供试品溶液浓度为10mg/mL。
本发明所述检测方法所述对照品溶液为溴丙烯对照品用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解制得。试验表明，用水-乙腈(4∶6)作为溶剂时，溴丙烯峰形较好，基线更稳定。因此，本发明所述检测方法所述对照品溶液的溶剂优选为乙腈和水体积比为6∶4的混合溶液。所述对照品溶液的浓度为10μg/mL。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。以下实施例中所用仪器为LC-10ATvp SPD-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津公司)、TU-1800SPC紫外分光光度计(北京普析公司)，pHS-3C酸度计(上海精密科学仪器厂)。实施例中所用试剂包括罗库溴铵批号为081201、081202、090101，均由成都新恒创药业有限公司提供；溴丙烯对照品来源于SiGMA-ALDRICH；四甲基氢氧化铵、乙腈为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水。
实施例1：本发明所述检测方法检测波长的确定
精密称取溴丙烯对照品适量用乙腈-水(9∶1)配制成每1mL含20μg的溶液，按紫外分光光度法，在200～400nm范围内进行紫外扫描，结果见图1。
由图1可见溴丙烯仅在末端有较大吸收，故选择210nm为检测吸收波长。
实施例2：本发明所述检测方法系统适用性试验
对照品溶液的制备：精密称取溴丙烯对照品25.12mg置25mL量瓶中，用乙腈-水(9∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取1mL置100mL量瓶中，用乙腈-水(9∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀，做为对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取罗库溴铵(081201)104.01mg置10mL量瓶中，用乙腈∶水(9∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀，做为供试品溶液。
对溴丙烯的检测进行了流动相筛选，结果如下表1所示，其中，以0.05mol/L pH5.0的四甲基氢氧化铵溶液为流动相的水相，乙腈为流动相的有机相。
表1水相与有机相的配比实验
由表1可见以0.05mol/L的四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min时，溴丙烯与前后峰之间的分离度最佳。
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05mol/L pH5.0的四甲基氢氧化铵溶液为流动相的水相，乙腈为流动相的有机相，流速为1mL/min，对溴丙烯的检测的流动相中的水相PH进行筛选，结果如下表2所示。
表2流动相中的水相PH筛选实验
由表2结果可见，以pH5.0的0.05mol/L四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为流动相，溴丙烯峰与前后杂质峰的分离度为4.25/3.98，能达到完全的基线分离；理论塔板数按溴丙烯峰计达到了13460，如图2所示。因此，溴丙烯的色谱条件分离条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05mol/L pH5.0四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，理论塔板数按溴丙烯峰计算应不低于10000。
实施例3：本发明所述检测方法溶剂的选择
精密称取罗库溴铵样品适量，分别用乙腈、乙腈-水(9∶1)、乙腈-水(6∶4)、水、pH5.0的0.05mol/L四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为溶剂溶解作为供试品溶液，分别取5μL注入液相色谱仪，在实施例2所述色谱条件下检测，记录色谱图，结果如图3～7。
由图3～7可见，与其它溶剂相比，用乙腈-水(9∶1)和乙腈-水(6∶4)作为溶剂时，罗库溴铵峰与前后杂质峰的分离度好，无杂峰，其中，以乙腈-水(6∶4)作为溶剂时，罗库溴铵峰形较好，基线更稳定。因此，本发明所述检测方法所述供试品溶液为罗库溴铵样品用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解制得，优选为乙腈和水体积比为6∶4的混合溶液。
精密称取溴丙烯样品适量，分别用乙腈、乙腈-水(9∶1)、乙腈-水(6∶4)、水、pH5.0的0.05mol/L四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4∶6的混合溶液为溶剂溶解作为供试品溶液，分别取5μL注入液相色谱仪，在实施例2所述色谱条件下检测，记录色谱图，结果显示，与其它溶剂相比，用乙腈-水(9∶1)和乙腈-水(6∶4)作为溶剂时，溴丙烯峰与前后杂质峰的分离度好，无杂峰，其中，以乙腈-水(6∶4)作为溶剂时，溴丙烯峰形较好，基线更稳定。因此，本发明所述检测方法所述供试品溶液为溴丙烯样品用乙腈和水体积比为9～6∶1～4的混合溶液作为溶剂溶解制得，优选为乙腈和水体积比为6∶4的混合溶液。
实施例4：本发明所述检测方法专属性试验
精密称取溴丙烯适量，用乙腈-水(6∶4)制成每毫升含10μg的溶液，作为对照溶液；精密称取罗库溴铵(081201)样品适量，用乙腈-水(6∶4)制成每毫升含10.0mg的溶液，作为样品溶液；然后取对照溶液和样品溶液适量混合，制成混合溶液。
精密称取罗库溴铵样品适量，分别进行强酸、强碱、氧化、高温和光照破坏性试验，制得专属性试验样品，然后分别置10mL量瓶中，用乙腈∶水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，做为供试品溶液。
其中，各专属性试验样品的制备方法如下：
强酸破坏样品：精密称取罗库溴铵样品100.37mg于10mL量瓶中，加入10滴1mol/L的盐酸使样品充分湿润，放置20分钟，再加入10滴1mol/L的氢氧化钠溶液中和，用乙腈-水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为强酸破坏用样品。
强碱破坏样品：精密称取罗库溴铵样品100.80mg置10mL量瓶中，加入10滴1mol/L的氢氧化钠溶液使充分湿润，放置20分钟，再加入10滴1mol/L的盐酸中和，用乙腈-水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为强碱破坏样品。
氧化破坏样品：精密称取罗库溴铵样品于10mL量瓶中，加10％的双氧水10滴，放置20分钟，用乙腈-水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏用样品。
高温破坏样品：精密称取在高温60℃放置24小时的罗库溴铵样品100.44mg于10mL量瓶中，加乙腈-水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为高温破坏样品。
光照破坏样品：精密称取罗库溴铵100.17mg于10mL量瓶中，置254nm紫外光下照射24小时，用乙腈-水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为光照破坏样品。
分别取上述专属性试验供试品溶液，5μL注入液相色谱仪，在实施例2所述色谱条件下检测各样品，记录色谱图，至主成分峰保留时间的6倍，色谱图见图8～12，统计结果见表3。
表3溴丙烯检查破坏试验结果
由图8～12和表3可见，经强酸、强碱、氧化、高温和光照破坏性试验的供试品溶液中溴丙烯主峰与各杂质峰均能够得到很好的分离，表明所述色谱条件专属性良好。而且各实验条件下，溴丙烯的峰高都有所增加，氧化破坏增加最大，碱破坏最小，因此本品在生产和贮藏过程中应检测和控制溴丙烯的含量。
实施例5：本发明所述检测方法重复性和稳定性试验
精密称取溴丙烯对照品适量用乙腈-水(6∶4)配制成0.01mg/mL的溶液，作为供试品溶液。精密量取该溶液5μL进样，记录色谱图，并重复操作6次。计算其峰面积的相对标准偏差值为0.9％。
精密称取罗库溴铵(081201)适量用乙腈-水(6∶4)配制成10.0mg/mL的溶液，作为供试品溶液，分别于0h、1h、2h、4h、6h，各精密量取该溶液5μl进样测定，记录色谱图，计算罗库溴铵峰面积的相对标准偏差值(RSD)为1.5％。
结果表明，供试品溶液重复性良好并且在6小时内相对稳定。
实施例6：本发明所述检测方法检测限和定量限的确定
精密称取溴丙烯对照品适量分别加乙腈-水(6∶4)逐级稀释成101.28ng/mL、40.512ng/mL、20.256ng/mL、10.128ng/mL的溶液，作为供试品溶液。分别取上述溶液各5μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件进行检测。结果显示浓度为10.128ng/mL的溶液的峰高为噪音峰高的3.4倍，以S/N＝3时计算，得检测限为：0.044ng。浓度为40.512ng/ml的溶液的峰高为噪音峰高的10.0倍，以S/N＝10时计算，得定量限为0.203ng。
实施例7：本发明所述检测方法溴丙烯线性试验
精密称取溴丙烯对照品适量于用乙腈∶水(6∶4)制成不同浓度的溶液，分别取5μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件进行检测，记录主峰面积，结果见表4。
表4溴丙烯线性试验
根据表4中的数据，以峰面积(A)为纵坐标，以相对应的供试品浓度(C)μg/mL为横坐标，绘制线性图，并进行回归处理，结果见图8。
由图13可见，当溴丙烯浓度在0.528μg/mL～105.6μg/mL的浓度范围内，峰面积和浓度呈线性关系，线性方程为：A＝34337.41C-2682.68，相关系数r＝0.9999，表明溴丙烯在此浓度范围内线性关系良好。
实施例8：本发明所述检测方法加样回收率试验
对照品溶液：精密称取溴丙烯对照品适量，加乙腈-水(6∶4)配制成约为10μg/mL的溶液，摇匀即得。
供试品溶液：精密称取溴丙烯对照品适量，分别用乙腈∶水(6∶4)配制成76.12μg/mL、106.24μg/mL、128.72μg/mL的溶液，摇匀，作为储备液；再精密称取罗库溴铵(081201)样品11份，每份约100mg，分别置10mL量瓶中，其中9份分别用加入三种浓度的储备液各1.0mL，每个浓度各取3份并用乙腈-水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；其余两份分别用乙腈-水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液，用于测定样品中溴丙烯的含量。
分别取上述溶液各5μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件进行检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，结果见表5。
表5溴丙烯回收率试验结果
由表5结果可见，本发明所述检测方法样品回收率大于97.5％，表明本发明所述检测方法能准确的测定出罗库溴铵样品中溴丙烯的含量。
实施例9：本发明所述检测方法测定罗库溴铵样品
取溴丙烯对照品适量精密称定，加乙腈-水(6∶4)溶解并定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为对照品溶液。
取3批罗库溴铵样品加乙腈-水(6∶4)溶解并定量稀释制成每1ml中约含10.0mg的溶液，作为供试品溶液。
分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各5μl注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05mol/L pH5.0四甲基氢氧化铵溶液-乙腈体积比为4∶6的混合溶液为流动相；流速：1.0mL/min；检测波长为210nm，检测对照品溶液和供试品溶液，理论塔板数按溴丙烯峰计算应不低于10000，记录色谱图，结果见图14～16。按外标法以峰面积计算罗库溴铵中溴丙烯的量，结果见表6。
表6罗库溴铵样品中溴丙烯的含量测定结果
由表6结果可见，使用外标法通过计算所述供试品溶液和对照品溶液的峰面积的比值即得罗库溴铵中溴丙烯的含量，3批罗库溴铵样品中溴丙烯的含量分别为0.0009％、0.0021％、0.0014％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.一种检测罗库溴铵中溴丙烯含量的方法，其特征在于，包括：
步骤1：取罗库溴铵样品，用乙腈和水体积比为6：4的混合溶液作为溶剂溶解，得到供试品溶液；
步骤2：取溴丙烯对照品，用乙腈和水体积比为6：4的混合溶液作为溶剂溶解，得到对照品溶液；
步骤3：将对照品溶液和供试品溶液以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相分别进行高效液相色谱法检测，外标法分析测定结果；
其中，所述高效液相色谱法色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.05mol/L pH5.0的四甲基氢氧化铵溶液与乙腈体积比为4：6的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测器为紫外光度检测器，检测波长为210nm，理论板数按溴丙烯峰计算不低于10000；
所述供试品溶液的浓度为10mg/mL；
所述对照品溶液的浓度为10μg/mL。
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